JP3190730B2 - 新規標識薬物ハプテン類似体を用いるイムノアッセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床化学、詳細にはイ
ムノアッセイに関する。

【０００２】

【従来の技術】天然の免疫学的反応を利用するイムノア
ッセイは、臨床化学における分析技術として広範な使用
が見い出されている。反応の特異性により、それらは生
物学的流体中に非常に低濃度で存在する生物学的分析物
（analyte ）を定量する際に特に有利である。このよう
な分析物（本明細書中ではリガンドと称する）として
は、例えば、抗体、治療薬物、麻酔薬、酵素、ホルモン
及びタンパク質等が挙げられる。

【０００３】競合結合イムノアッセイでは、免疫応答性
誘導体及びリガンドの類似体をはじめとする標識リガン
ド類似体が、所定量の適当な結合性物質（本明細書中で
はレセプターと称する）との反応を目当てに未標識リガ
ンド競合した状態に置かれる。リガンドの未知濃度は、
結合もしくは未結合（すなわち遊離）の標識リガンドの
どちらか一方のシグナルを測定することより求めること
ができる。反応は以下のように進行する。

【０００４】 リガンド ＋ 標識リガンド ＋ レセプター→ リガンド−レセプター ＋ 標識リガンド−レセプター

【０００５】常用される標識としては、放射性標識、酵
素、発色団、蛍光団、安定な遊離基並びに酵素の補因
子、阻害剤及びアロステリックエフェクターが挙げられ
る。

【０００６】上述したことと矛盾することなく、血清中
の薬物又は薬物誘導体（例えばフェノバルビタールやフ
ェニトイン）についてのイムノアッセイは、固定化抗体
の結合部位を目当てにした、患者血清中の薬物とそのよ
うな薬物ハプテンの酵素標識類似体との競合反応に基づ
くことができる。

【０００７】標識薬物ハプテン類似体（以下、ＬＤＨと
称することがある）についての特定の必要条件は、１）
少なくとも６５％のＬＤＨが過剰の固定化抗体により結
合されうること；２）固定化抗体に対するＬＤＨの親和
性が、所定量のＬＤＨと薬物との競合が治療に関連した
薬物濃度範囲で起こるようなものであること；及び３）
保存条件下におけるその酵素標識の加水分解に対するＬ
ＤＨの安定性；を含む。

【０００８】薬物ハプテン類似体に課せられる必要条件
は、１）酵素標識との結合後の固定化抗体に対する該類
似体の接近しやすさ；２）薬物に対する抗体による、Ｌ
ＤＨの特異的認識能；及び３）酵素活性に悪影響を与え
ない条件下、直接又は酵素もしくは類似体の活性化後の
どちらかに、酵素標識を担持する類似体が十分な反応性
を有すること、を含む。

【０００９】米国特許第４，７５２，５６８号明細書に
開示されたグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）及びアル
カリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）酵素標識結合フェノバ
ルビタール及びフェニトインハプテン類似体は、所望の
フォーマットで有効な競合イムノアッセイを遂行するの
に適切な酵素標識類似体を提供した。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】標識として酵素西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いる場合に、上記
特許明細書に開示された標識フェノバルビタール及びフ
ェニトイン類似体が、競合イムノアッセイを遂行するの
に不十分であることが課題である。このような類似体と
ＨＲＰとのカプリング反応は、緩慢かつ不完全であっ
た。更に、フェノバルビタール−ＨＲＰ標識及びフェニ
トイン−ＨＲＰ標識は非常に弱い結合であったので、判
読可能なシグナルを得るのに非常に高濃度の標識又は抗
体結合部位が必要とされるであろう。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、請求項１に記
載される薬物についてのイムノアッセイ方法を提供す
る： 上記方法に有用な標識薬物ハプテン類似体は、次式
（Ｉ）の構造に従う態様を含む。

【００１２】

【化４】

【００１３】上式中、Ａは次式のヒダントイン核

【化５】

【００１４】又は次式のバルビツレート核

【化】

を表し、

【００１５】Ｒ¹ は各々独立して、水素、炭素原子数１
〜１０のアルキル、未置換又は置換フェニルを表し、Ｒ
² ，Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は各々独立して、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀ア
ルキレン基を表すか又は少なくとも１つ以上のエステル
基、アミド基、−Ｏ−，−Ｓ−もしくは−ＮＲ−によっ
て中断されたＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキレン基を表し、Ｒ³ はＣ
₁ 〜Ｃ₃ アルキレンを表し、Ｚは−Ｏ−，−Ｓ−及び−
ＮＲ−（ここで、Ｒは水素又はＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキル、例
えばメチル、プロピル及びヘキシルを表す）を表し、

【００１６】ｍは０，１又は２であり ｎは０，１又は２であり ｍ＋ｎ＞０であり、そして ｍ，ｎ及びＲ² に含まれる原子の総数が５〜４０であ
り、標識は酵素であり、そして更に、

【００１７】(i) Ｒ¹ 基の少なくとも１つが置換又は未
置換フェニルであり、(ii)Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及びＲ⁶ のうちの
１つがフェニレンであってもよく、(iii) 式Ｉの角括弧
中の成分がいずれの順序で存在してもよく、そして(iv)
連結基が、炭素原子数２〜１２の飽和又は不飽和モノカ
ルボン酸の誘導体以外のものであることを条件とする。

【００１８】本発明により提供されるイムノアッセイに
有用な薬物ハプテン類似体は、下記を含んで成るもので
ある。 （ａ）活性エステル基、例えばスクシンイミドオキシカ
ルボニル、 （ｂ）ヒダントイン又はバルビツレート誘導体より選ば
れる核、及び （ｃ）前記活性エステル基を前記ヒダントイン核又はバ
ルビツレート核に連結する連結鎖（ここで、連結鎖は前
に定義した通りである）。

【００１９】より詳細には、本発明に有用な好ましい新
規薬物ハプテン類似体類は、次式に従うものである。

【００２０】

【化７】

【００２１】上式中、Ａは次式のヒダントイン核

【化８】 又は次式のバルビツレート核

【化９】 を表し、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｚ、ｍ及びｎ
並びにそれらに関連する条件は前に定義した通りであ
り、そしてＲ₇は、エチレン又はｏ−フェニレン基であ
る。

【００２２】ヒダントイン薬物ハプテン類似体 新規ヒダントイン薬物ハプテン類似体は、本発明のイム
ノアッセイに用いられる標識類似体を製造するのに用い
られる。ヒダントイン核と活性エステル基との間に短い
連結鎖を有するこれらのヒダントイン誘導体の活性エス
テルは、幾つかの固定化抗体と共に使用するための許容
される酵素標識を調製するのに十分な位にＨＲＰと反応
性であった。活性エステル基とヒダントイン核の間に８
〜２０個の原子から成る長い連結基（Ｒ² と角括弧中の
基）を有する誘導体は、試験した全ての固定化抗体によ
り結合され得る標識を提供した。各Ｚが隣接のカルボニ
ルと共にアミド基を形成する−ＮＲ−であるような連結
鎖は、Ｚが隣接のカルボニルと共にエステル基を形成す
るような−Ｏ−もしくは−Ｓ−であるような連結鎖より
も、加水分解に対して耐性であるので、このような鎖を
含むヒダントイン誘導体は特に有用である。

【００２３】ヒダントイン類似体製造例 ヒダントイン類似体は、ヒダントイン化合物のサブクラ
スであるフェニトイン類似体が製造される下記製造方法
に従って調製できる。

【００２４】例１−ＨＤ１：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチル｝
ヒダントインの製造。

【００２５】工程１：５，５−ジフェニル−３−〔４−
（２−ヒドロキシエチルアミノカルボニル）ブチル〕ヒ
ダントインの製造。

【００２６】パートＡ：最初に酸塩化物を製造する。 ３−（４−カルボキシブチル）−５，５−ジフェニル−
２，４−イミダゾリジンジオン（３．５２ｇ，０．０１
モル）、塩化チオニル（２０mL）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（２滴）及びクロロホルム（５０mL）の混合
物を、室温で３時間攪拌した。減圧下でロータリーエバ
ポレーター中で溶剤を留去し、その生成物を次のパート
Ｂに直接用いた。

【００２７】パートＢ：上記酸塩化物をエタノールアミ
ンと反応させる。 クロロホルム（５０mL）中の上記酸塩化物を、クロロホ
ルム１００（mL）中のエタノールアミン（１．２ｇ，
０．０２モル）及びトリエチルアミン（２．４ｇ，０．
０２４モル）の混合物に１５分間かけて滴下添加した。
次いで混合物を６０℃で２時間加熱し、そして室温で１
時間攪拌した。次いでその溶液を５％塩酸（１００mL×
２）で洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１００m
L）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして溶剤をロータリーエバポレーター中で留去し
た。次いで濾液を酸化アルミニウムカラムを用いるクロ
マトグラフィーにかけ、ＴＬＣ上に１つのスポットを示
す物質（３．０ｇ）を得た。この物質を次の製造方法に
直接使用した。

【００２８】工程２：３−｛４−〔２−（３−カルボキ
シプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニルヒダントインの製造。 クロロホルム（１００mL）中の工程１のヒドロキシ化合
物（３．０ｇ，０．００７５モル）、無水コハク酸
（１．０ｇ，０．０１モル）及びジメチルアミノピリジ
ン（０．９ｇ，０．００７５モル）の混合物を５０〜６
０℃で４時間加熱し、そして週末の間室温まで放冷し
た。

【００２９】ジクロロメタン（３００mL）を添加し、そ
して混合物を５％塩酸溶液（１００mL×３）で洗浄し、
飽和塩化ナトリウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫
酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶剤を留去し
てＴＬＣ上に１つのスポットを与える物質を得た。

【００３０】工程３：ＨＤ１：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝ヒダントインの製造。

【００３１】

【化１０】

【００３２】クロロホルム（８０mL）中の工程２からの
酸（３．０ｇ，０．００６モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（１．５ｇ，０．００７モル）
及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７ｇ，０．０
０６モル）の混合物を室温で２０時間攪拌した。その混
合物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーター
中で濾液を濃縮した。次いで残渣をシリカを用いるクロ
マトグラフィーにかけ、生成物を１．３ｇ得た（収率４
０％）。Ｃ₃₀Ｈ₃₂Ｎ₄ Ｏ₉ についての分析計算値：Ｃ，
６０．８；Ｈ，５．４４；Ｎ，９．４５。実測値：Ｃ，
５９．６；Ｈ，５．５１，Ｎ；８．９１。

【００３３】例２−ＨＤ２：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝
−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００３４】工程１：５，５−ジフェニル−３−（１−
ピペラジニルカルボニルブチル）ヒダントインの製造。

【００３５】パートＡ：最初に、３−〔４−（４−ベン
ジルオキシカルボニルピペラジニルカルボニル）ブチ
ル〕−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンを製造した。 上記ＨＤ１の製造のパートＡに記載されるように製造し
た酸塩化物（０．０１モル）を、クロロホルム（５０m
L）中のベンジル１−ピペラジンカルボキシレート
（２．４ｇ，０．０１１モル）及びトリエチルアミン
（２．０ｇ，０．０２モル）の混合物に、１５分間かけ
て滴下添加した。この混合物を室温で一晩攪拌し、そし
てジクロロメタン（３００mL）を添加した。その混合物
を５％塩酸（１００mL×２）で洗浄し、希炭酸ナトリウ
ム溶液（１００mL）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液
（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで溶液を
乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレータ
ー中で溶剤を留去した。次いで濾液をクロマトグラフィ
ーにかけ、油状物４．３ｇを得た（収率７８％）。これ
を次の工程に直接使用した。

【００３６】パートＢ：工程Ａの保護アミン（４．８
ｇ，０．００８モル）及び３０〜３５％臭化水素−酢酸
（ＨＢｒ／ＡｃＯＨ）溶液（２５mL）を室温で１．５時
間攪拌した。次いでこの混合物をジエチルエーテル（１
Ｌ）に注ぎ入れ、そして分離した油状物を新たなエーテ
ル（１Ｌ×３）で摩砕した。その油状物を１０％水性水
酸化ナトリウム溶液（pH＝１４）中に溶解し、そしてこ
の水性溶液をジクロロメタン（１００mL×４）で抽出し
た。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリウム溶液（１５
０mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして減圧下、ロータリーエバポレーター中で溶剤
を留去した。濾液は固化して白色固体を与えた（２．６
ｇ，収率７７％）。この物質を次の工程に直接用いた。

【００３７】工程２：３−｛４−〔４−（３−カルボキ
シプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。

【００３８】クロロホルム（１５mL）中のパートＢから
のアミン（２．１ｇ，０．００５モル）と無水コハク酸
（０．５４ｇ，０．００５４モル）の混合物を５０〜６
０℃で３０分間加熱し、そして周囲温度で２０時間放置
した。ジクロロメタン（１５０mL）を添加し、そして混
合物を５％塩酸（１００mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナ
トリウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエボパ
レーター中で溶剤を留去したところ、白色固体２．５ｇ
（９５％）が得られ、これを次の工程に直接用いた。

【００３９】工程３：ＨＤ２：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４０】

【化１１】

【００４１】クロロホルム（４０mL）中の工程２からの
酸（１．５６ｇ，０．００３モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（０．６４ｇ，０．００３モ
ル）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３６ｇ，
０．００３モル）の混合物を室温で週末の間攪拌した。
その混合物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレ
ーターで濾液から溶剤を留去して生成物１．９ｇを得た
（収率１００％）。その固体をクロマトグラフィーにか
け、そして生成物画分をジクロロメタン（２００mL）に
溶解し、希炭酸ナトリウム溶液（１００mL×２）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そしてロ
ータリーエバポレーター中で溶剤を留去したところ、Ｔ
ＬＣ上に１つのスポットを与える白色固体が得られた。
Ｃ₃₂Ｈ₃₅Ｎ₅ Ｏ₈ の分析計算値：Ｃ，６２．２３；Ｈ，
５．７１；Ｎ，１１．３４。実測値：Ｃ，５９．０７；
Ｈ，５．４０；Ｎ，１０．４５。

【００４２】例３−ＨＤ３：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルカルボニ
ルプロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４３】工程１：３−〔４−（６−アミノヘキシル
アミノカルボニル）ブチル〕−５，５−ジフェニル−
２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４４】パートＡ：３−〔４−（６−ベンジルオキ
シカルボニルアミノヘキシルアミノカルボニル）ブチ
ル〕−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。 ＨＤ１の製造で中間体として生成された酸塩化物を、Ｈ
Ｄ２の製造の工程１に記載の方法により、Ｎ−ベンジル
オキシカルボニル−１，６−ヘキサンジアミンで処理し
たところ、保護アミン７．５ｇ、収率８５％が得られ
た。

【００４５】パートＢ：パートＡの保護アミンを、ＨＤ
２の製造の工程１、パートＢの方法により臭化水素酸−
酢酸で処理したところ遊離アミンが得られ、精製するこ
となくそれを工程２に用いた。

【００４６】工程２：３−｛４−〔６−（３−カルボキ
シプロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。この化合物を、ＨＤ２の製造の工程２と同
様の方法を用いて製造した。

【００４７】工程３：ＨＤ３：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４８】

【化１２】

【００４９】この物質を、ＨＤ２の製造の工程３の方法
を用いて製造したところ、生成物２．６ｇを得た（収率
８０％）。融点１３３〜１３４℃。Ｃ₃₄Ｈ₄₁Ｎ₅ Ｏ₈ に
ついての分析計算値：Ｃ，６３．０５；Ｈ，６．３８；
Ｎ，１０．８１。実測値：Ｃ，６２．９１；Ｈ，６．４
１；Ｎ，１０．６９。

【００５０】バルビツレート薬物類似体 以下の例４〜８は、フェノバルビタールについてのバル
ビツレート薬物ハプテン類似体の製造を具体的に説明す
るものである。一般的には、この類似体は、（１）バル
ビツレート誘導体、例えばフェノバルビタールを、ω−
ハロアルカンカルボキシレートエステルと縮合させる工
程、（２）前記エステルを、対応する酸にケン化させる
工程、（３）前記酸を、対応する酸塩化物に転化させる
工程、（４）前記酸塩化物をＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドと縮合させるか又は更に長い連結鎖を得るために、
アミン又はヒドロキシ基の１つが保護されたジアミン、
ジオール又はアミノアルコールと縮合させる工程、及び
（５）保護基を除去し、ジカルボン酸、例えばコハク酸
と縮合させ、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミドと縮
合させて、類似体を製造する工程、により製造される。

【００５１】所望であれば、半分保護されたジアミン、
ジオール又はアミノアルコールと縮合させ、次いで別の
二酸を１回又は２回以上繰り返して、連結鎖を更に長く
することできる。しかしながら、より長い鎖の二酸、ジ
オール、ジアミン、アミノアルコール又はハロアルカン
カルボキシレートエステルを用いることにより、より少
ない工程で同様の製造が達成できる。

【００５２】例４−ＰＢ１：５−エチル−５−フェニル
−１−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブ
チル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジン
トリオンの製造。

【００５３】工程１：５−エチル−６−ヒドロキシ−３
−（４−メトキシカルボニルブチル）−５−フェニル−
２，４（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオンの製造。 ジクロロメタン（５００mL）中のフェノバルビタール
（４６．５ｇ，０．２モル）と水酸化テトラブチルアン
モニウム（５００mL、０．２モル、０．４Ｍ水溶液）の
混合物を製造し、そしてそれに５−ブロモ吉草酸メチル
（３９．０ｇ，０．２モル）を添加した。その反応混合
物を一晩（２０時間）激しく攪拌した。この混合物に、
飽和塩化ナトリウム溶液（１００mL）を添加し、有機層
を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン（１００mL
×２）で洗浄した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリ
ウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で乾燥
し、濾過し、そして溶剤を留去した。

【００５４】工程２：３−（４−カルボキシブチル）−
５−エチル−６−ヒドロキシ−５−フェニル−２，４
（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオンの製造。 ジオキサン（５００mL）中の工程１の５−エチル−６−
ヒドロキシ−３−（４−メトキシカルボニルブチル）−
５−フェニル−２，４（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオ
ンエステル（５４．０ｇ，０．１５６モル）、濃塩酸
（５５mL）及び水（５５mL）の混合物を４時間加熱して
還流させ、そして室温で一晩放置した。ジオキサンを減
圧下で留去し、そして飽和塩化ナトリウム溶液（２５０
mL）とジクロロメタン（４００mL）を残渣に加えた。有
機層を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン（１５
０mL×３）で抽出した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナ
トリウム溶液（２００mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で
乾燥し、濾過し、そして溶剤を留去した。残渣にジエチ
ルエーテルを添加し、そしてその混合物を週末の間−１
６℃の冷凍庫に置き、次いで濾過した。

【００５５】工程３：１−（４−クロロカルボニルブチ
ル）−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 工程２からの酸（６．６ｇ，０．２モル）、塩化チオニ
ル（５０mL）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２滴）
及びクロロホルム（８０mL）の混合物を室温で１．５時
間攪拌した。減圧下ロータリーエバポレーターで溶剤を
留去し、そしてこの生成物を次の工程４に直接用いた。

【００５６】工程４：１−〔４−（４−ベンジルオキシ
カルボニル−１−ピペラジニルカルボニル）ブチル〕−
５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，
５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（７５mL）中の工程３の酸塩化物（０．２
モル）を、クロロホルム（１００mL）中のベンジル１−
ピペラジンカルボキシレート（６．０ｇ，０．０３０モ
ル）とトリエチルアミン（４．０ｇ，０．０４モル）の
混合物に１５分間かけて滴下添加した。この混合物を室
温で２０時間攪拌し、次いでジクロロメタン（３００m
L）を添加した。その混合物を１０％塩酸溶液（１００m
L×３）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（１００m
L）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして溶剤を留去した。次いで残渣をＳｉＯ₂ 上で
のクロマトグラフィーにかけて固体を得た。

【００５７】工程５：５−エチル−５−フェニル−１−
〔４−（１−ピペラジニルカルボニル）ブチル〕−２，
４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン臭化
水素酸塩の製造。 工程４からの保護アミン（６．５ｇ，０．０１２モル）
及び３０〜３５％臭化水素−酢酸溶液（３０mL）を室温
で１．５時間攪拌した。次いでその混合物を酢酸エチル
（２Ｌ）中に注ぎ入れ、１時間攪拌し、濾過し、そして
固体を酢酸エチル５００mLで洗浄した。

【００５８】工程６：１−｛４−〔４−（３−カルボキ
シプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（１５０mL）中の工程５のアミン（４．８
ｇ，０．０１モル）、無水コハク酸（１．２ｇ，０．０
１２モル）及びトリエチルアミン（２．２ｇ，０．０２
モル）の混合物を、５０〜６０℃（湯浴）で３０分間加
熱し、そして周囲温度で１６時間攪拌した。ジクロロメ
タン（２００mL）を添加し、混合物を１０％塩酸溶液
（１００mL×３）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液
（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーター中
で溶剤を留去すると、白色固体３．３ｇが得られた（収
率６６％）。この物質をＳｉＯ₂ カラムを用いるクロマ
トグラフィーにかけたところ、白色固体が得られた。

【００５９】工程７：５−エチル−５−フェニル−１−
｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝
−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオ
ンの製造。

【００６０】

【化１３】

【００６１】クロロホルム（７５mL）中の工程６からの
酸（３．４ｇ，０．００７モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（１．６ｇ，０．００８モル）
及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．０ｇ，０．０
０８モル）の混合物を室温で２０時間攪拌した。その混
合物を濾過し、そして酢酸エチル（１００mL）を添加し
た。その有機溶液を水（１００mL×２）で洗浄し、飽和
塩化ナトリウム溶液（５０mL）で洗浄し、無水硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエ
バポレーターで溶剤を留去した。固体の一部をクロマト
グラフィーにかけたところ、白色固体が得られた。

【００６２】例５−ＰＢ２：５−エチル−５−フェニル
−２−（４−スクシンイミドオキシカルボニルブチル−
２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン
の製造。

【００６３】

【化１４】

【００６４】工程２の酸と共に攪拌すること以外は、例
４の工程７の方法を用いてこの物質を製造した。その物
質をエチルエーテル／酢酸エチル（１：１）から結晶化
したところ、白色固体が得られた。

【００６５】例６−ＰＢ３：５−エチル−５−フェニル
−１−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブ
チル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジン
トリオンの製造。

【００６６】工程１：５−エチル−１−〔４−（２−ヒ
ドロキシエチルアミノカルボニル）ブチル〕−５−フェ
ニル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）ピリミジントリ
オンの製造。ベンジル１−ピペラジンカルボキシレート
の代わりに２−ヒドロキシエチルアミンを用いる以外
は、例４の工程４に概説されたようにこの物質を製造し
た。

【００６７】工程２：１−｛４−〔２−（３−カルボキ
シプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（１００mL）中の工程１からの生成物
（２．９ｇ，０．００７モル）、無水コハク酸（０．７
ｇ，０．００７モル）及びジメチルアミノピリジン
（０．９ｇ，０．００７モル）の混合物を湯浴（５０〜
６０℃）中で３０分間加熱し、次いで室温で３日間攪拌
した。ジクロロメタン（３００mL）を添加し、そして混
合物を１０％塩酸溶液（１００mL×２）で洗浄し、飽和
塩化ナトリウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶剤を留去したと
ころ、油状物が得られ、それを次の工程に直接用いた。

【００６８】工程３：ＰＢ３：５−エチル−５−フェニ
ル−１−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕
ブチル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジ
ントリオンの製造。

【００６９】

【化１５】

【００７０】例４の工程７に概略された方法を用いて、
本例の工程２の酸を用いて開始してこの物質を製造し
た。

【００７１】例７−ＰＢ４：５−エチル−５−フェニル
−１−｛４−〔３−（３−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブ
チル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジン
トリオンの製造。

【００７２】工程１：１−〔４−（３−ベンジルオキシ
カルボニルアミノプロピルアミノカルボニル）ブチル〕
−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，３
Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 ベンジル１−ピペラジンカルボキシレートの代わりにＮ
−ベンジルオキシカルボニル−１，３−プロパンジアミ
ンを用いる以外は、例４の工程４に概略された方法を用
いてこの物質を製造し、そして粗製物質を次の工程に用
いた。

【００７３】工程２：１−〔４−（３−アミノプロピル
アミノカルボニル）ブチル〕−５−エチル−５−フェニ
ル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリ
オン臭化水素酸塩の製造。 例４の工程５のようにこの物質を製造した（本例の工程
１のアミドを用いて開始し、エチルエーテル中に注ぎ入
れると油状物が得られたことを除いて）。

【００７４】工程３：１−｛４−〔３−（３−カルボキ
シプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 本例の工程２からのアミンを用いて開始して酸を得たこ
と以外は、例４の工程６の方法により、この物質を製造
した。

【００７５】工程４：ＰＢ４：５−エチル−５−フェニ
ル−１−｛４−〔３−（３−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕
ブチル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジ
ントリオンの製造。

【００７６】

【化１６】

【００７７】本例の工程３の酸を用いて開始する以外
は、例４の工程７の方法を用いてこの物質を製造した。

【００７８】例８−ＰＢ５：５−エチル−５−フェニル
−１−｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブ
チル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジン
トリオンの製造。

【００７９】

【化１７】

【００８０】例７の工程１のＮ−ベンジルオキシカルボ
ニル−１，３−プロパンジアミンの代わりにＮ−ベンジ
ルオキシカルボニル−１，６−ヘキサンジアミンを使用
し、そしてその後の工程２，３及び４で各々それからの
反応生成物を用いること以外は、例７の反応順序に従っ
てこの化合物を製造した。

【００８１】標識薬物ハプテン類似体 本発明者らは、上記で調製したバルビツレート及びヒダ
ントインの新規標識薬物ハプテン類似体を製造した。そ
れらはバルビツレート及びヒダントイン薬物、特にフェ
ノバルビタール及びフェニトインについての競合イムノ
アッセイにおいて有用である。標識は、競合イムノアッ
セイにおいて分析物又は分析物類似体と共に常用され
る、アミン又はスルフヒドリル基を有するイムノアッセ
イ用の標識、例えば酵素、可視色素、ロイコ色素、蛍光
色素及び放射性物質等である。

【００８２】有用な標識は、酵素、例えばアルカリ性ホ
スファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（Ｇ
ＯＤ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）もし
くはアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＨＲ
Ｐ）である。

【００８３】標識薬物ハプテン類似体は、下記工程を含
んで成る新規方法を用いて製造される。 １）求核基、例えばアミン又はスルフヒドリル基を表面
上に担持する標識を、過剰の上記バルビツレート又はヒ
ダントイン薬物ハプテン類似体と接触させる工程。好ま
しくは類似体と標識を水混和性有機溶剤、例えばＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）又は溶剤と水（緩衝化したもの）の混合物に溶解
した後、一緒に混合する工程、及び ２）未使用活性エステル及び縮合副生成物を、好ましく
は透析により取り除く工程。

【００８４】本明細書の以下に提供される例は、本発明
の新規標識類似体の製造方法を具体的に説明するもので
ある。標識類似体は、フェニントイン及びフェノバルビ
タール薬物ハプテン類似体を用いて製造した。

【００８５】標識ヒダントイン類似体 例１ −アミン富化ＨＲＰ標識ヒダントインＨＤ１〔伸長
連結鎖を含む；標識ＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識Ａ）〕の製
造。

【００８６】ＨＤ１を、１０ mM ４′−ヒドロキシアセ
トアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（ＤＭＦ ４′−ＨＡ）
１．４５２mLに溶解した。

【００８７】アミン富化ＨＲＰを以下のように製造し
た。乾燥ＨＲＰを０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（pH 5.5）に
溶解して、緩衝液１０mL中の最終濃度が２．５×１０^-6
モル（１００mg）となるようにした〔ＭＥＳ＝２−（Ｎ
−モルホリノ）エタンスルホン酸〕。変換係数Ａ₄₀₃ １
mg／mL＝２．２４を用いてＡ₄₀₃ 測定値からタンパク質
濃度を求めた。ＨＲＰ溶液を、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液
（pH 5.5）１０mL中に溶解したＬ−リジン一塩酸塩１．
５×１０^-3モル（２７５mg）と合わせた。新たに調製し
たＭＥＳ緩衝液中の１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、５×１
０^-4モル、９６０mL）の溶液を添加した。容器に蓋を
し、そして室温で一晩混合した。その反応生成物を０．
０２Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（pH 7.0）（３Ｌ、１０℃）に
対して透析した。透析緩衝液を３回変えた。ＭＯＰＳ＝
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸。

【００８８】反応させる前に、アミン富化ＨＲＰの試料
を、３０，０００ＮＭＷＬ（呼称分子量限界カットオ
フ）セントリセル（Ｃｅｎｔｒｉｃｅｌｌｓ）遠心限外
濾過膜を用いて、ＭＯＰＳ緩衝液から０．１Ｍ ＥＰＰ
Ｓ緩衝液（pH 8.0）に交換した。次いで、この試料を希
釈して、最終濃度１０mg／mLの溶液を得た。

【００８９】アミン富化ＨＲＰ（ＡＨＲＰ）（１mL）を
ジメチルホルムアミド中の４′−ヒドロキシアセトアニ
リドの１０mM溶液（ＤＭＦ ４′−ＨＡ）５００μＬと
渦動攪拌により混合し、次いでそれを４２℃の水浴中に
置いた。乾燥ＤＭＦ−４′−ＨＡ溶液１．４５２mL中に
２１mgのＨＤ１を溶解することにより調製したＨＤ１溶
液（５００μＬ）を、フェニトイン／ＨＲＰのモル比が
５０／１となるように、渦動攪拌により混合しながらＡ
ＨＲＰに滴下添加した。その反応混合物を４２℃の水浴
中で穏やかに振動させながら１時間インキュベーション
した。

【００９０】反応混合物を、更なるＤＭＦ ４′−ＨＡ
／０．１Ｍ ＥＰＰＳ（１：１）０．５mLを用いて反応
容器をすすいだすすぎ液と一緒に、Ｓｐｅｃｔｒａｐｏ
ｒ＃２透析チューブに入れた。

【００９１】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１），pH 8.0に対して４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）２Ｌの０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
む０．１Ｍ ＥＰＰＳ，pH 8.0に対して８℃で１５時
間、 ｄ）２Ｌの０．１Ｍ ＥＰＰＳ，pH 8.0に対して８℃で
３時間、 ｅ）３Ｌの０．０４Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン塩酸塩（トリスＨＣｌ）／０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，pH 7.5に対して８℃で３時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて３時間、もう１回繰り返す。

【００９２】透析後、０．０２％メルチオレート（ｍｅ
ｒｔｈｉｏｌａｔｅ）（商標）を防腐剤として添加し、
そしてＡＨＲＰ−ＨＤ１を冷蔵保存した。

【００９３】例２−アミン富化ＨＲＰ標識ＨＤ２〔アミ
ド結合を有する伸長連結鎖を含む；標識ＡＨＲＰ−ＨＤ
２（標識Ｂ）〕の製造。

【００９４】ＨＤ２（１５．５mg）を、１０mM ４′−
ヒドロキシアセトアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（ＤＭＦ
４′−ＨＡ）１．０３１mLに溶解した。

【００９５】標識製造例１に記載されるように製造した
ＡＨＲＰの溶液（１０mg／mL、０．１Ｍ ＥＰＰＳ溶
液, pH 8．0 中、１mL）を、ＤＭＦ ４′−ＨＡ ５０
０μＬと渦動攪拌により混合し、次いでそれを４２℃の
水浴中に置いた。渦動攪拌により混合しながら、上記Ｈ
Ｄ２溶液（５００μＬ）を、モル比が５０／１となるよ
うにＡＨＲＰ溶液に滴下添加した。反応混合物を４２℃
の水浴中で穏やかに振盪させながら１時間インキュベー
ションした。

【００９６】反応生成物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ＃２透
析チューブ管に入れ、そして以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１）, pH 8.0に対して４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡ含有０．１Ｍ ＥＰＰ
Ｓ, pH 8.0に対して８℃で１．５時間 ｄ）１．５Ｌの０．１Ｍ ＥＰＰＳ, pH 8.0に対して８
℃で１８時間、 ｅ）１．５Ｌの０．０４Ｍ トリスＨＣｌ／０．１５Ｍ
ＮａＣｌ, pH 7.5に対して８℃で２時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて４時間、もう１回繰り返す。

【００９７】透析後、０．０２％メルチオレートを防腐
剤として添加した。標識ヒダントイン誘導体を冷蔵庫に
保存した。

【００９８】例３−ＡＨＲＰ−ＨＤ３〔アミド結合を有
する伸長連結鎖を含む；標識ＡＨＲＰ−ＨＤ３（標識
Ｃ）〕の製造。

【００９９】ＨＤ３（９．２mg）を１０mM ４′−ヒド
ロキシアセトアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（ＤＭＦ ４′
−ＨＡ）１mLに溶解した。

【０１００】標識製造例１に記載されるように調製した
ＡＨＲＰの溶液を、０．１Ｍ ＥＰＰＳ緩衝液（pH 8.
0）に対して透析した。最終濃度が５．７１mg／mLとな
るようにした。

【０１０１】ＡＨＲＰ（１mL）を渦動攪拌しながらＤＭ
Ｆ ４′−ＨＡ ５００μＬと混合し、次いでそれを４
２℃の水浴中に置いた。上記ＨＤ３溶液（５００μＬ）
を、ＨＤ３／ＡＨＲＰのモル比が５０／１となるよう
に、渦動攪拌により混合しながらＡＨＲＰに滴下添加し
た。反応混合物を４２℃の水浴中で穏やかに振盪させな
がら１時間インキュベーションした。反応混合物を、Ｄ
ＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ（１：１）０．
５mLを用いて反応容器をすすいだすすぎ液と一緒にＳｐ
ｅｃｔｒａｐｏｒ＃２透析チューブに入れた。

【０１０２】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１），pH 8.0に対して４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡ含有０．１Ｍ ＥＰＰ
Ｓ，pH 8.0に対して５℃で１５時間、 ｄ）１．５Ｌの０．１Ｍ ＥＰＰＳ，pH 8.0に対して８
時間、 ｅ）２Ｌの０．０２Ｍ ３−モルホリノプロパンスルホ
ン酸（ＭＯＰＳ），pH7.0に対して５℃で１３時間、そ
して ｆ）透析条件ｅ）を用いて２回繰り返す。

【０１０３】透析後、０．０２％メルチオレート（商
標）を防腐剤として添加し、そしてその標識生成物を冷
蔵保存した。

【０１０４】標識バルビツレート薬物ハプテン類似体 以下の例は、標識バルビツレート薬物ハプテン類似体の
製造を具体的に説明するものである。

【０１０５】例４−アミン富化ＨＲＰ標識ＰＢ２（標識
ＡＨＲＰ−ＰＢ２；標識Ｄ）の製造。 ＰＢ２をＤＭＳＯに溶解して１０．７mg／mL溶液（１．
２５×１０^-2Ｍ）を得た。次いでこの溶液の５００μＬ
を、渦動攪拌により混合しながらアミン富化ＨＲＰ／Ｄ
ＭＳＯ溶液（ＡＨＲＰ／ＤＭＦと同様に調製）に滴下添
加した。フェノバルビタール／ＨＲＰのモル比は５０／
１であった。

【０１０６】２４００rpm で振盪させながら室温で４時
間インキューベーションを行った。その試料をＳｐｅｃ
ｔｒａｐｏｒ＃２透析チューブに移し、更に透析液１mL
を用いて反応容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析
管に入れた。標識を０．０２Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液，pH
7.0に対して５〜１０℃で透析した。この透析条件を、
各回２〜３Ｌの緩衝液を用いて３回繰り返した。透析
後、０．０２％メルチオレート（商標）を防腐剤として
添加し、そして標識を冷蔵保存した。

【０１０７】例５−アミン富化ＨＲＰ−ＰＢ３〔伸長連
結鎖を含む；ＡＨＲＰ−ＰＢ３（標識Ｅ）〕の製造。 アミン富化ＨＲＰを、セントリセル（Centricell）遠心
限外濾過膜（３０，０００呼称分子量限界）を用いてＭ
ＯＰＳ緩衝液から０．１Ｍ ＥＰＰＳ緩衝液，pH 8.0へ
と交換した。次いでこの試料を４．６mL（０．７４３mg
／mL）に希釈した。

【０１０８】ＨＲＰ１mLを小バイアルに入れた（１．８
５×１０^-5Ｍ）。１０mM ４′−ヒドロキシアセトアニ
リドを含むジメチルホルムアミド（Ardrich 22,705-6）
（ＤＭＦ ４′−ＨＡ）５００μＬをバイアルに添加
し、渦動攪拌により混合し、そして４２℃の水浴に置い
た。

【０１０９】その間に、ＰＢ−３をＤＭＦ ４′−ＨＡ
中に溶解して２．１２mg／mL溶液（３．７０×１０
^-3Ｍ）を得た。この溶液５００μＬを、渦動攪拌により
混合しながら、ＨＲＰ／ＤＭＦ ４′−ＨＡ溶液に滴下
添加した。フェノバルビタール／ＨＲＰのモル比は、１
００／１であった。

【０１１０】水浴中で穏やかに振盪させながら４２℃で
１時間インキュベーションを行った。試料を、反応容器
をすすぐのに使った追加のＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１
モルＥＰＰＳ（１：１）１mLと一緒にＳｐｅｃｔｒａｐ
ｏｒ＃２透析管に移した。

【０１１１】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１），pH 8.0に対して４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡ含有０．１Ｍ ＥＰＰ
Ｓ，pH 8.0に対して５℃で一晩、 ｄ）１．５Ｌの０．１Ｍ ＥＰＰＳ，pH 8.0に対して５
℃で８時間、 ｅ）２．０Ｌの０．０２Ｍ ＭＯＰＳ，pH 7.0に対して
５℃で少なくとも８時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を２回繰り返す。

【０１１２】透析後、０．０２％メルチオレート（商
標）を防腐剤として添加し、そして標識生成物を冷蔵保
存した。

【０１１３】例６−アミン富化ＨＲＰ−ＰＢ１〔標識Ａ
ＨＲＰ−ＰＢ１（標識Ｆ）、アミド結合を有する伸長連
結鎖を含むフェノバルビタールハプテン類似体の活性エ
ステル〕の製造。

【０１１４】製造したアミン富化ＨＲＰを、０．１Ｍ
ＥＰＰＳ緩衝液，pH 8.0へと緩衝液交換して１０mg／mL
の溶液（２．５×１０^-4Ｍ）を得た。標識Ｆは、アミン
富化ＨＲＰ５mL（５０mg）を用いて製造した。磁気攪拌
プレート上で攪拌しながら、２．５mLのＤＭＳＯをゆっ
くり添加した。その溶液を室温で１５分間攪拌した。

【０１１５】その間に、ＰＢ１をＤＭＳＯに溶解して１
４．９mg／mL溶液を得た。この溶液２．５mLを、攪拌下
でゆっくりＨＲＰ／ＤＭＳＯ溶液に添加した。フェノバ
ルビタール／ＨＲＰのモル比は５０／１であった。

【０１１６】２４００rpm で振盪させながら室温で５時
間インキュベーションを行った。その試料を、反応容器
をすすぐのに使った追加の透析液と一緒にＳｐｅｃｔｒ
ａｐｏｒ＃２透析管に移した。標識を０．０２Ｍ ＭＯ
ＰＳ緩衝液，pH 7.0に対して５〜１０℃で透析した。こ
の透析条件を、各回３Ｌの緩衝液を用いて３回繰り返し
た。透析後、０．０２％メルチオレート（商標）を防腐
剤として添加し、そして標識を冷蔵保存した。

【０１１７】免疫応答性 以下の試験は、上記標識Ａ〜Ｆの免疫応答性を具体的に
証明するものである。

【０１１８】試験１−標識ＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識Ａ）
の免疫応答性 本例では、標識製造例１からのＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識
Ａ）を結合する、数種の固定化抗体（ＤｉｌＡｓ₈ ，Ｄ
ｉｌＡｓ₉ ，ＤｉｌＡｓ₁₄，ＤｉｌＡｓ₁₆及びＤｉｌＡ
ｓ₂₁）の能力を調べる。

【０１１９】（ａ）ポリマービーズ試料（各試料には、
上述した種類の抗体の１つが共有結合されている）を、
１９８７年８月３日に出願された米国特許出願第０８
１，２０６号明細書（公開ＥＰＡ８８ ３０７１７２．
２）に記載された方法及び材料を用いて製造した。

【０１２０】（ｂ）ＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識Ａ）を結合
する固定化抗体の能力を以下のように測定した。 各種の抗体ビーズを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで系列希
釈して、５００〜０．５ｎＭの抗体結合部位の濃度とな
るようにした。ビーズ希釈液を、同容量の１０×１０
^-11 Ｍの標識と混合した。１時間インキュベーション
後、遠心によりビーズをペレットにした。上清の試料
（１００μＬ）を、基質（ｏ−フェニレンジアミン／Ｈ
₂ Ｏ₂ ）１００μＬと混合した。４５０nmでの発色速度
を標準のものと比較して、溶液中に残存するフェニトイ
ン−ＨＲＰ標識の量を計算した。試験した最大抗体濃度
（２５０ｎＭの結合部位）において固定化抗体に結合し
た標識の量を報告する。

【０１２１】

【表１】

【０１２２】上記結果は、これらの抗体がＡＨＲＰ−Ｈ
Ｄ１標識（標識Ａ）を非常に良く認識することを示して
いる。

【０１２３】試験２−ＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）の加
水分解安定性。 本例は、標識とフェニトイン核の間の連結鎖中にアミド
結合を有する本発明の標識フェニトイン誘導体〔ＡＨＲ
Ｐ−ＨＤ２（標識Ｂ）〕の加水分解安定性を具体的に説
明するものである。

【０１２４】固定化カレスタッド（Ｋａｌｌｅｓｔａ
ｄ）抗体が固定化されたビーズは、１９８７年８月３日
に出願された米国特許出願第０８１，２０６号明細書
（公開ＥＰＡ ８８ ３０７１７２．２）に記載の通り
に調製した。

【０１２５】ＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）を、pH 7.3又
は8.5 に調整した１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで中に１×１０
^-10 Ｍとなるまで希釈した。その標識を室温で６日間イ
ンキュベーションした。２日後及び６日後に、固定化抗
体による結合について、以下のように標識を試験した。

【０１２６】カレスタッド（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ）５２
−２抗体ビーズを、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで系列希釈し
て、５００〜０．５０ｎＭ抗体結合部位濃度となるよう
にした。ビーズ希釈液を同容量の１０×１０^-11 Ｍの標
識と混合した。１時間インキュベーション後、遠心によ
りビーズをペレットにした。上清の試料（１００μＬ）
を基質（ｏ−フェニレンジアミン／Ｈ₂ Ｏ₂ ）１００μ
Ｌと混合した。速度を標準のものと比較して、溶液中に
残存する標識の量を計算した。試験した最大抗体濃度
（２５０ｎＭ結合部位）において固定化抗体に結合した
標識の量を報告する。

【０１２７】

【表２】

【０１２８】これらの結果は、連結鎖中にアミド結合を
含むＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）の結合が、この時間に
渡って全く分解を示さなかったことを示す。これは、標
識Ｂが加水分解による分解に耐性であろうことを示す。
このような加水分解は、時間の経過と共にアッセイ応答
の変化を引き起こし得る。

【０１２９】試験３−吉草酸エステルと伸長連結鎖を用
いて製造されたフェノバルビタール−ＨＲＰ標識の比
較。 本例では、吉草酸エステル連結鎖を有する標識（標識
Ｄ、ＡＨＲＰ−ＰＢ２）及び伸長連結鎖を有する標識
（標識Ｆ、ＡＨＲＰ−ＰＢ１）を結合する、数種の固定
化抗体（Ｋａｌｌ １５７１及びＰｂＡｓ₉ ）の能力を
比較した。

【０１３０】固定化抗体ビーズ試料を以下のようにして
製造した。ポリマービーズ（３０mg）〔ポリ（スチレン
−コ−Ｐ−ビニルベンジル２−クロロエチルスルホン）
（モル比９５：５）〕を、緩衝液（０．１Ｍ ＥＰＰ
Ｓ、pH 8.5）１mL中に分散し、そして抗体（Ｋａｌｌ
１５７１又はＰｂＡｓ₉ ）０．３mgを添加した。総容量
を１．５mLにした。混合物を室温で４時間転倒回転させ
た。次いでＢＳＡの１０％溶液０．３mLを添加し、そし
て上清を除去し、抗マウスＩｇＧを用いて未結合抗体に
ついて分析した。表面上に結合した抗体の量をＥＬＩＳ
Ａを用いて計算した。ＰＢＳ（pH 7.2）を使って、ペレ
ットを緩衝液中に再懸濁しそして遠心分離することによ
り３回洗浄した。最終再分散液はＰＢＳ１．８mL中であ
り、メルチオレート（商標）を０．０２％の濃度になる
ように添加し、そして生成物を使用するまで４℃で保存
した。

【０１３１】標識を結合する固定化抗体の能力を以下の
ように測定した。各種の抗体ビーズを、１％ＢＳＡ含有
ＰＢＳで系列希釈して、２００〜０．５０ｎＭ抗体結合
部位濃度となるようにした。ビーズ希釈液を、同容の１
０×１０^-11 Ｍのフェノバルビタール−ＨＲＰ標識と混
合した。１時間インキュベーション後、遠心分離により
ビーズをペレットにした。上清の試料（１００μＬ）を
基質（ｏ−フェニレンジアミン／Ｈ₂ Ｏ₂ ）１００μＬ
と混合した。４５０nmでの発色速度を標準のものと比較
して、溶液中に残存するフェノバルビタール−ＨＲＰ標
識の量を計算した。試験した最大抗体濃度（１００ｎＭ
結合部位）において固定化抗体に結合した標識の量を報
告する。

【０１３２】

【表３】

【０１３３】これらの結果は、本発明により提供される
標識薬物ハプテン類似体に対する抗体の認識の改良を示
す。伸長連結鎖を有するハプテンは、フェノバルビター
ル酵素イムノアッセイの開発のためにそれらの抗体を検
討することを可能にするので、これは重要な利点を表
す。

【０１３４】イムノアッセイは、定義されるヒダントイ
ン及びバルビツレート誘導体に取り付けることができる
任意の適当な標識を用いて実施することができる。上述
の標識薬物ハプテン類似体を製造するのに使われた西洋
ワサビペルオキシダーゼに加えて、有用な標識として
は、放射性標識、色素、蛍光物質、別の酵素、酵素基
質、酵素阻害剤、酵素アロステリックエフェクター、酵
素補因子及び別の既知酵素モジュレーターが挙げられ
る。グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、例え
ば西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアミン富化西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、並び
にガラクトシダーゼのような酵素が好ましい標識であ
る。

【０１３５】酵素標識が用いられる場合には、酵素に対
する基質を要素に存在させるか、又は発色液中に添加す
る。基質は、液体試料の添加前に又は添加と同時に添加
してもよく、あるいは結合反応の完了後に添加してもよ
い。ある与えられた標識に適する基質を決定すること
は、臨床化学の当業者の技術範囲内である。基質は酵素
標識によって直接作用を受ける物質、又は標識の酵素反
応を伴う一連の反応に関与する物質であることができ
る。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼであれば、基
質は過酸化水素である。一例としてグルコースオキシダ
ーゼを用いる時には、通常０．０１モル／ｍ² 、好まし
くは約０．００１〜約０．１モル／ｍ² となるように、
基質を試薬層に存在させるか、又は発色液に添加する。
アッセイに使われる酵素標識の量に対して特定の基質の
量をどのように調節すればよいのかは、当業者には既知
であろう。

【０１３６】特定の標識を用いる場合、例えば酵素、補
因子、酵素基質又は酵素モジュレーターを用いる場合に
は、試薬層は、標識の反応の結果として検出可能な種を
提供する試薬を１つ以上含んで成る指示組成物を含有す
る。好ましくは、指示組成物は、基質と酵素標識リガン
ド類似体との酵素反応の結果として比色定量的に検出可
能な種を提供する比色定量指示組成物である。

【０１３７】指示組成物は、酵素反応によって検出可能
な色素を生成する単一化合物であるか、又は色素を生成
する試薬の組合せであってもよい。例えば、基質として
グルコースが用いられそして酵素標識としてグルコース
オキシダーゼが用いられる場合、比色定量指示組成物
は、反応して色素を提供するカプラー及び被酸化性化合
物を含むことができる。あるいは、該組成物はロイコ色
素及びペルオキシダーゼ又は別の適当な過酸化性化合物
（グルコースオキシダーゼがグルコースをグルコン酸に
転化する時に生じる過酸化水素の生成の結果として検出
可能な色素を生成する過酸化性化合物など）を含むこと
ができる。有用なロイコ色素は、当該技術分野で既知で
あり、そして例えば、米国特許第４，０８９，７４７号
及び米国特許出願第６１２，５０９号明細書に記載され
るものが挙げられる。比色定量指示組成物の量及びその
各種の成分は、当業者の技術範囲内である。

【０１３８】イムノアッセイは手動又は自動であっても
よい。一般に、液体中のリガンドの量は、供給ロール、
チップパケット又は別の供給源から要素を取り出し、そ
して展開層の限定領域を前記液体の試料（例えば１〜１
００μｌ）と物理的に接触させることによって測定され
る。接触させる限定領域は、通常約１００mm² 以下であ
る。

【０１３９】リガンドの量は、複合体形成したリガンド
類似体を直接に又は酵素標識と基質との酵素的反応の結
果として生成する検出可能な種を検出するのに適した装
置に要素を通過させることにより検出される。例えば、
前記種は周知の方法を用いて適当な放射計、蛍光計もし
くは分光光度計により検出できる。酵素反応では、例え
ば、試験試料と接触させた限定領域の中心における反射
もしくは透過濃度又は蛍光を測定することにより、生じ
た反応生成物が測定される。測定される領域は、競合ア
ッセイの場合、通常約３〜５mmである。液体試料中のリ
ガンドの量は、限定領域の中心において測定される標識
の量に反比例する。好ましい態様では、複合体形成しな
かったリガンドから複合体形成したリガンドを最大限に
分離するために、別個の発色工程を必要とする。一般的
には、試料接触に続き展開又は発色液適用の後、約５秒
〜約１８０秒後に標識の測定が実施される。

【０１４０】

【実施例】以下の実施例は、上述した標識薬物ハプテン
類似体を用いて乾式イムノアッセイ要素上で好都合に行
われるイムノアッセイを具体的に説明する。これらの実
施例は、フェニトイン及びフェノバルビタールについて
のアッセイを実施することにより本発明を証明する。し
かしながら、本発明が、別のバルビツレート及びヒダン
トイン薬物誘導体にも適用されることは明らかであろ
う。

【０１４１】これらの実施例では、以下のプロトコール
に従い段階的にアッセイを実施した。１０μＬの試料を
本発明の乾式イムノアッセイ要素の表面上にスポットし
た。次いで試料をスポットした要素を、３７℃で５分間
インキュベーションした。このインキュベーション時間
の後、要素をインキュベーターから取り出し、そして酵
素基質溶液１０μＬを使って発色させた。実施例のアッ
セイでは、標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）であり、そして発色溶液に使用した基質は約０．３
重量％Ｈ₂ Ｏ₂ であった。発色溶液はリン酸ナトリウム
緩衝液（pH 6.8）０．０１Ｍ、４′−ヒドロキシアセト
アニリド（電子移動剤）０．００５Ｍ、ジエチレントリ
アミンペンタ酢酸１０μＭ及び界面活性剤を含んだ。発
色溶液は検出可能な種の発色を引き起こす。結合型ＨＲ
Ｐ−標識リガンドは無色ロイコ色素から着色形への酸化
を触媒する。このような色素は乾式分析要素技術分野で
は周知であるので、本明細書には詳細に記載しない。こ
こに記載される実施例において、ロイコ色素はトリアリ
ールイミダゾールである。触媒反応の速度は、３７℃で
反射濃度の経時変化により測定した。反射濃度の測定方
法及び手段は分析技術分野で周知である。

【０１４２】実施例１：フェニトインについてのイムノ
アッセイにおける標識フェニトイン類似体（ＡＨＲＰ−
ＨＤ１；標識Ａ）の使用。 既知技術を用いて下記層構造を有するように分析要素を
製造した。

【０１４３】

【表４】

【０１４４】フェニトイン及びＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識
Ａ）を含む一連のヒト血清ベースキャリブレーターを調
製した。凍結乾乾血清ベースキャリブレーター（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）をイオン交換水３mLで再水和せしめた。フェニ
トインの濃度は０．５〜１２８μｇ／mLの範囲で異なっ
た。１ｎＭの最終濃度を与えるように標識Ａを添加し
た。

【０１４５】一連のフェニトイン標準溶液（アリコート
１０μＬ）を、上記構成を有する一連の同一の分析要素
の展開層上にスポットした。３７℃で５分間インキュベ
ーションした後、過酸化水素（０．０３％）、リン酸ナ
トリウム緩衝剤（０．０１Ｍ、pH 6.8）、４′−ヒドロ
キシアセトアニリド（５ｍＭ）及びジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸（１０μＭ）を含む発色溶液（１０μＬ）
を添加して色素生成を開始させた。約１分間経過後、３
７℃、６８０nmにおいて領域の中心における反射濃度
（Dr）を測定した。クラッパー−ウィリアムズ（Ｃｌａ
ｐｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ）変換により、Dr値をDtに
変換した。３０秒間に亘るDtの変化を計算した。結果を
以下に示す。

【０１４６】

【表５】

【０１４７】これらの結果は、所望の動的範囲に亘って
十分な速度変化があることを示している。療法上領域は
１０〜２０μｇ／mLである。本例は、本発明により提供
されるイムノアッセイ方法に有用な分析要素、及び薬物
フェニトインを検出するための競合結合アッセイにおけ
るそれの使用を例証する。

【０１４８】実施例２：フェニトインについてのイムノ
アッセイにおける伸長連結鎖とアミド結合を有するＡＨ
ＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）の使用。 本例は、本発明により提供される別の分析要素及び薬物
フェニトインを検出するための競合結合アッセイにおけ
る本発明の標識ヒダントイン誘導体としてのそれの使用
を例証する。既知技術を用いて下記構造を有するように
分析要素を製造した。

【０１４９】

【表６】

【０１５０】フェニトイン及び標識Ｂ（ＡＨＲＰ−ＨＤ
２）を含む一連のヒト血清ベースキャリブレーターを調
製した。凍結血清ベースキャリブレーターに、０〜７０
μｇ／mLの濃度でフェニトインを含ませた。１ｎＭの最
終濃度を与えるように標識Ｂを添加した。

【０１５１】一連のフェニトイン標準溶液（アリコート
１０μＬ）を、上記構成を有する一連の同一の分析要素
の展開層上にスポットした。３７℃で５分間インキュベ
ーションした後、過酸化水素（０．０３％）、リン酸ナ
トリウム緩衝剤（０．０１Ｍ，pH 6.8）、４′−ヒドロ
キシアセトアニリド（５ｍＭ）及びジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸（１０μＭ）を含む発色溶液（１０μＬ）
を添加して色素生成を開始させた。約１分間経過後、３
７℃、６８０nmにおいて領域の中心における反射濃度
（Dr）を測定した。クラッパー−ウィリアムズ（Ｃｌａ
ｐｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ）変換により、Dr値をDtに
変換した。３０秒間に亘るDtの変化を計算した。結果を
以下に示す。

【０１５２】

【表７】

【０１５３】これらの結果は、所望の動的範囲に亘って
十分な速度変化があることを示している。療法上の範囲
は１０〜２０μｇ／mLである。

【０１５４】実施例３：フェニトインについてのイムノ
アッセイにおける、アミド結合を有するヘキサンジアミ
ンより製造された伸長連結鎖を有するる標識フェニトイ
ン誘導体、ＡＨＲＰ−ＨＤ３（標識Ｃ）の使用。

【０１５５】本例は、薬物フェニトインを検出するため
の競合結合アッセイにおける、本発明の異なる標識ヒダ
ントイン誘導体を用いた実施例２に記載の分析要素の使
用を例証する。

【０１５６】フェニトイン及び標識製造例３からの標識
Ｃを含む一連のヒト血清ベースキャリブレーターを調製
した。凍結血清ベースキャリブレーターに、０〜７０μ
ｇ／mLの濃度でフェニトインを含めた。１ｎＭの最終濃
度を与えるように標識Ｃを添加した。

【０１５７】標識Ｂの代わりに標識Ｃを含むことを除い
て実施例２に記載のものと同一の一連の分析要素の展開
層上に、一連のフェニトイン標準溶液（アリコート１０
μＬ）をスボットした。３７℃で５分間インキュベーシ
ョンした後、過酸化水素（０．０３％）、リン酸ナトリ
ウム緩衝液（０．０１Ｍ，pH 6.8）、４′−ヒドロキシ
アセトアニリド（５ｍＭ）及びジエチレントリアミンペ
ンタ酢酸（１０μＭ）を含む発色溶液（１０μＬ）を添
加して色素生成を開始させた。約１分間経過後、３７
℃、６８０nmにおいて領域の中心における反射濃度（D
r）を測定した。クラッパー−ウィリアムズ（Ｃｌａｐ
ｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ）変換により、Dr値をDtに変
換した。３０秒間に亘るDtの変化を計算した。結果を以
下に示す。

【０１５８】

【表８】

【０１５９】これらの結果は、所望の動的範囲に亘って
十分な速度変化があることを示す。

【０１６０】実施例４：フェノバルビタールについての
エンザイムイムノアッセイにおける、伸長連結鎖を用い
て製造されたフェノバルビタール−ＨＲＰ標識の使用。

【０１６１】本例は、本発明の分析要素の製造及び薬物
フェノバルビタールを検出するための競合結合アッセイ
におけるそれの使用を例証する。既知技術を用いて下記
構造を有するように分析要素を製造した。

【０１６２】

【表９】

【０１６３】フェノバルビタール及びフェノバルビター
ル−ＨＲＰ標識（標識製造例６のＰＢ−３からの標識Ａ
ＨＲＰ−ＰＢ３又は標識Ｅ）を含む一連のヒト血清ベー
スキャリブレーターを調製した。フェノバルビタールの
濃度は０〜８０μｇ／mLに及んだ。６ｎＭの最終濃度を
与えるようにフェノバルビタール−ＨＲＰ標識を添加し
た。

【０１６４】一連のフェノバルビタール標準溶液（アリ
コート１０μＬ）を一連の分析要素の展開層上にスポッ
トした。３７℃で５分間インキュベーションした後、過
酸化水素（０．０３％）、リン酸ナトリウム緩衝液
（０．０１Ｍ，pH 6.8）、４′−ヒドロキシアセトアニ
リド（５ｍＭ）及びジエチレントリアミンペンタ酢酸
（１０μＭ）を含む洗浄溶液（１０μＬ）を添加して、
フェノバルビタール標準溶液が塗布された領域の中心か
ら未結合の複合体を洗い流し、そして色素生成を開始さ
せた。約１分間経過後、３７℃、６８０nmにおいて領域
の中心における反射濃度（Dr）を測定した。クラッパー
−ウィリアムズ（Ｃｌａｐｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ）
変換により、Dr値をDtに変換した。３０秒間に亘るDtの
変化を計算した。結果を以下に示す。

【０１６５】

【表１０】

【０１６６】これらの結果は、所望の動的範囲に亘って
十分な速度変化があることを示す。療法上の範囲は２０
〜４０μｇ／mLである。

【０１６７】実施例５：フェノバルビタールについての
エンザイムイムノアッセイにおける、アミド結合を有す
る伸長連結鎖を用いて製造されたフェノバルビタール−
ＨＲＰ標識の使用。 本例は、本発明の分析要素の製造及び薬物フェノバルビ
タールを検出するための競合結合アッセイにおけるそれ
の使用を例証する。既知技術を用いて下記構造を有する
ように分析要素を製造した。

【０１６８】

【表１１】

【０１６９】フェノバルビタール及びフェノバルビター
ル−ＨＲＰ標識（ＡＨＲＰ−ＰＢ−１、標識製造例６か
らの標識Ｆ）を含む一連のヒト血清ベースキャリブレー
ターを調製した。凍結血清ベースキャリブレーターに０
〜８０μｇ／mLの濃度でフェノバルビタールを含めた。
８ｎＭの最終濃度を与えるようにフェノバルビタール−
ＨＲＰ標識を添加した。

【０１７０】一連のフェノバルビタール標準溶液（アリ
コート１０μＬ）を一連の分析要素の展開層上にスポッ
トした。３７℃で５分間インキュベーションした後、過
酸化水素（０．０３％）、リン酸ナトリウム緩衝液
（０．０１Ｍ、pH 6.8）、４′−ヒドロキシアセトアニ
リド（５ｍＭ）及びジエチレントリアミンペンタ酢酸
（１０μＭ）を含む洗浄溶液（１０μＬ）を添加して、
フェノバルビタール標準溶液が塗布された領域の中心か
ら未結合の複合体を洗い流し、そして色素生成を開始さ
せた。約１分間経過後、３７℃、６８０nmにおいて領域
の中心における反射濃度（Dr）を測定した。クラッパー
−ウィリアムズ（Ｃｌａｐｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ）
変換により、Dr値をDtに変換した。３０秒間に亘るDtの
変化を計算した。結果を以下に示す。

【０１７１】

【表１２】

【０１７２】これらの結果は、所望の動的範囲に亘って
十分な速度変化があることを示している。療法上の範囲
は２０〜４０μｇ／mLである。本発明の実施例の要素で
は、標識薬物ハプテン誘導体は試料と共に要素上にスポ
ットされる。あるいは、標識薬物ハプテン類似体は、分
析要素の展開層上にグラビアコーティングすることがで
きる。

【０１７３】本発明の更なる態様を、請求項１との関連
で以下に列挙する。

【０１７４】２．連結鎖が、１，４−ピペラジニレン、
２，５−ジメチル−１，４−ピペラジニレン、１，３−
イミダゾリジニレン及び１，３−ヘキサヒドロジアゼピ
ニレンより選ばれる複素環式基を含む、請求項１のイム
ノアッセイ方法。

【０１７５】３．標識薬物ハプテン類似体が上記に定義
された構造Ｉに従う、請求項１のイムノアッセイ方法。

【０１７６】４．Ｒ¹ が各々独立して、水素、メチル、
プロピル、ヘキシル、デシル、未置換フェニルであるか
又は炭素原子数１〜６のアルキルにより、ニトロによ
り、ハロゲンにより、シアノによりもしくは炭素原子数
１〜６のアルコキシにより置換されたフェニルを表し、
Ｒ² ，Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及びＲ⁶ が各々独立して、エチレン、
ブチレン、ペンチレン、オクチレン又は少なくとも１つ
以上のエステル基、アミド基、−Ｏ−，−Ｓ−もしくは
−ＮＲ−で中断された前記のようなアルキレンより選ば
れるアルキレンを表し、Ｒ³ がメチレン、エチレン又は
トリメチレンを表し、Ｚが−ＮＲ−（ここで、Ｒは、水
素、メチル、プロピルもしくはヘキシルを表す）を表
し、そして標識が酵素を表す、前記具体的な態様３のイ
ムノアッセイ方法。

【０１７７】５．Ｒ¹ が各々独立してフェニル又はエチ
ルを表し、Ｒ² がテトラメチレンを表し、Ｒ³ がエチレ
ンを表し、Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及びＲ⁶ が各々独立してエチレン
又はヘキシレンを表し、Ｚが−Ｏ−又は−ＮＨ−であ
り、そして標識が酵素である、前記具体的な態様４のイ
ムノアッセイ方法。

【０１７８】６．標識が西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）又はアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＡＨＲＰ）であり、標識薬物ハプテン類似体が標識フ
ェニトインもしくはフェノバルビタール類似体であり、
そして前記薬物ハプテン類似体を前記西洋ワサビペルオ
キシダーゼに連結する連結基がテトラメチレンカルボニ
ルイミノヘキサメチレンイミノカルボニルエチレンカル
ボニル、テトラメチレンカルボニル−１，４−ピペラジ
ニレンカルボニルエチレンカルボニル及びテトラメチレ
ンカルボニルイミノエチレンオキシカルボニルエチレン
カルボニルより選ばれる、前記具体的な態様５のイムノ
アッセイ。

【０１７９】７．イムノアッセイ要素を使って実施され
る、請求項１及び上記具体的な態様２〜６のいずれか１
つに記載の方法。

【０１８０】８．方法が、標識薬物ハプテン類似体を含
むイムノアッセイ要素を使って実施される、請求項１及
び具体的な態様２〜６のいずれか１つに記載の方法。

【０１８１】９．いずれかの層もしくは区画に抗体を含
み、そして展開層もしくは区画に標識ヒダントイン誘導
体を含むイムノアッセイ要素を使って実施される、請求
項１及び具体的な態様２〜６のいずれか１つの方法。

【０１８２】１０．抗体が特定の層中のビーズ上に固定
化され、そして標識薬物ハプテン類似体が抗体を含む層
の上に直接コーティングされているイムノアッセイ要素
を使って実施される、請求項１及び具体的な態様２〜６
のいずれか１つの方法。

【０１８３】１１．請求項１及び具体的な態様２〜６の
いずれか１つに記載の、フェニトイン又はフェノバルビ
タール類似体から選ばれる標識ハプテンの層、区画もし
くはコーティングを有するイムノアッセイ要素。

【０１８４】１２．薬物がフェニトイン又はフェノバル
ビタールであるアッセイを行うための、請求項１及び具
体的な態様２〜６のいずれか１つのイムノアッセイ方
法。

【０１８５】

【発明の効果】標識薬物ハプテン類似体の少なくとも６
５％が、薬物に対する過剰の固定化抗体によって結合さ
れうる。伸長連結鎖を有する標識類似体、特に連結鎖中
にアミド結合を有するものは、本発明を実用可能にする
どんなタイプの固定化抗体によっても、同様に結合され
る。伸長連結鎖中にアミドを有する誘導体類は、加水分
解に対しても非常に安定である。標識薬物類似体を含む
分析要素を用いて行われる競合型イムノアッセイは、療
法を目的とする通常の薬物濃度範囲において、十分な反
射濃度変化を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スーザン ジーン ダニエルソン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14609, ロチェスター，ラクロワ コート ９ (72)発明者 バーバラ エー．ブラモンド アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，スウィート アクレス ドライブ 14 (72)発明者 デビッド アラン ヒルボーン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14467, ヘンリエッタ，サザーランド ヒルズ サークル 10 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒダントイン又はバルビツレート薬物に
   ついてのイムノアッセイ方法であって、 Ａ．前記薬物に対する抗体の存在下でかつ抗体−薬物免
   疫複合体の生成を促進する条件下で、前記薬物又はその
   誘導体を含む液体試料を、前記薬物又は薬物誘導体の標
   識類似体と接触させる工程、及び Ｂ．結合した又は未結合の標識薬物類似体を測定するこ
   とにより、前記液体中の前記薬物の量を測定する工程を
   含んで成り、前記標識薬物類似体が下記構造式（Ｉ）で
   表されることを特徴とする方法： 【化１】 上式中、 Ａは下式のヒダントイン核： 【化２】 又は下式のバルビツレート核： 【化３】 を表し、 Ｒ ₁ は、各々独立して、水素、炭素原子数１〜１０のア
   ルキル、又はフェニルを表し、 Ｒ ₂ は、Ｃ ₁ 〜Ｃ ₁₀ アルキレン基又は１以上のエステル
   基、アミド基、−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲ−（Ｒは
   水素もしくはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルを表す）によって中断さ
   れたＣ ₁ 〜Ｃ ₁₀ アルキレン基を表し、 Ｒ ₄ 、Ｒ ₅ 及びＲ ₆ は、各々独立に、Ｃ ₁ 〜Ｃ ₁₀ アルキレン
   基又はエステル基、アミド基、−Ｏ−、−Ｓ−もしくは
   −ＮＲ−（Ｒは水素もしくはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルを表す）
   によって中断されたＣ ₁ 〜Ｃ ₁₀ アルキレン基を表し、 Ｒ ₃ はＣ ₁ 〜Ｃ ₃ アルキレンを表し、 Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲ−（Ｒは水素もしく
   はＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルを表す）を表し、 「標識」は酵素を表し、 ｍは０，１又は２であり、 ｎは０，１又は２であり、そして ｍ＋ｎ＞０であるが、但し、 （１）Ｒ ₁ 基の少なくとも一つはフェニルであり、且つ （２）上記構造式（Ｉ）の括弧内の成分はいずれの順序
   で存在してもよい 。