JP3190729B2 - イムノアッセイ用標識薬物ハプテン類似体 - Google Patents
イムノアッセイ用標識薬物ハプテン類似体Info
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Description
ムノアッセイに関する。
ッセイは、臨床化学における分析技術として広範な使用
が見い出されている。反応の特異性により、それらは生
物学的流体中に非常に低濃度で存在する生物学的分析物
(analyte )を定量する際に特に有利である。このよう
な分析物(本明細書中ではリガンドと称する)として
は、例えば、抗体、治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン及
びタンパク質等が挙げられる。
誘導体及びリガンドの類似体をはじめとする標識リガン
ド類似体が、所定量の適当な結合性物質(本明細書中で
はレセプターと称する)との反応を目当てに未標識リガ
ンド競合した状態に置かれる。リガンドの未知濃度は、
結合もしくは未結合(すなわち遊離)の標識リガンドの
どちらか一方のシグナルを測定することより求めること
ができる。反応は以下のように進行する。
素、発色団、蛍光団、安定な遊離基並びに酵素の補因
子、阻害剤及びアロステリックエフェクターが挙げられ
る。
の薬物誘導体(例えばフェノバルビタールやフェニトイ
ン)についてのイムノアッセイは、固定化抗体の結合部
位を目当てにした、そのような薬物の酵素標識類似体と
患者血清中の薬物との競合反応に基づくことができる。
称することがある)についての特定の必要条件は、1)
少なくとも65%のLDHが過剰の固定化抗体により結
合されうること;2)固定化抗体に対するLDHの親和
性が、所定量のLDHと薬物との競合が治療に関連した
薬物濃度範囲で起こるようなものであること;及び3)
保存条件下におけるその酵素標識の加水分解に対するL
DHの安定性;を含む。
は、1)酵素標識との結合後の固定化抗体に対する類似
体の接近しやすさ;2)薬物に対する抗体による、標識
類似体の特異的認識;及び3)酵素活性に悪影響を与え
ない条件下、直接に又は酵素もしくは類似体の活性化後
のいずれかでの、酵素標識との薬物類似体の十分な反応
性;を含む。
開示されたグルコースオキシダーゼ(GOD)及びアル
カリ性ホスファターゼ(ALP)酵素標識結合フェノバ
ルビタール及びフェニトインハプテン類似体は、所望の
フォーマットで有効な競合イムノアッセイを遂行するの
に適切な酵素標識類似体を提供した。
サビペルオキシダーゼ(HRP)を用いる場合に、前記
米国特許明細書に開示された標識フェノバルビタール及
びフェニトイン類似体が、競合イムノアッセイを遂行す
るのに不十分であることが課題である。このような類似
体とHRPとのカプリング反応は、緩慢かつ不完全であ
った。更に、フェノバルビタール−HRP標識及びフェ
ニトイン−HRP標識は非常に弱い結合であったので、
判読可能なシグナルを得るのに非常に高濃度の標識又は
抗体結合部位が必要とされるであろう。
相当する、請求項1の標識薬物ヒダントインおよびバル
ビツレート類似体を提供する:
〜10のアルキル、未置換又は置換フェニルを表し、R
2 ,R4 ,R5 及びR6 は各々独立して、C1 〜C10ア
ルキレン基を表すか又は少なくとも1つ以上のエステル
基、アミド基、−O−,−S−もしくは−NR−を割り
込ませたC1 〜C10アルキレン基を表し、R3 はC1 〜
C3 アルキレンを表し、Zは−O−,−S−及び−NR
−(ここで、Rは水素又はC1 〜C6 アルキル、例えば
メチル、プロピル及びヘキシルを表す)を表し、
り、標識は酵素であり、そして更に、
未置換フェニルであり、(ii)R4,R5 及びR6 のう
ちの1つがフェニレンであってもよく、(iii )式Iの
角括弧中の成分がいずれの順序であってもよく、そして
(iv)連結基が、炭素原子数2〜12の飽和又は不飽和
モノカルボン酸の誘導体以外のものであることを条件と
する。
プロピル、ヘキシル、デシル、未置換フェニルであるか
又は炭素原子数1〜6個のアルキルにより、ニトロによ
り、ハロゲンにより、シアノによりもしくは炭素原子数
1〜6個のアルコキシにより置換されたフェニルを表す
ことができ、R2 ,R4 ,R5 及びR6 は各々独立し
て、エチレン、ブチレン、ペンチレン、オクチレンから
選ばれるアルキレンであるか、又は少なくとも1つ以上
のエステル基、アミド基、−O−、−S−もしくは−N
R−を割り込ませた前記のようなアルキレンを表し、R
3 はメチレン、エチレン又はトリメチレンを表し、Zは
各々独立して、−O−、−S−又は−NR−(ここで、
Rは、少なくとも1つの水素、メチル、プロピル又はヘ
キシルを表す)を表し、そして標識は酵素を表す。
れる新規薬物ハプテン類似体より製造した。
カルボニル、 (b)ヒダントイン核又はバルビツレート核、及び (c)前記活性エステル基を前記ヒダントイン核又はバ
ルビツレート核に連結する連結鎖(ここで、連結鎖は前
に定義した通りである)。
ダントイン活性エステルは、次式の構造を有するもので
ある。
5 ,R6 ,Z,m及びn並びにそれらに関連する条件
は、先に定義のとおりであり、そしてR7 は、エチレン
又はo−フェニレン基である。
スであるフェニトイン類似体が製造される下記製造方法
に従って製造できる。
{4−〔2−(3−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕ブチル}
ヒダントインの製造。
(2−ヒドロキシエチルアミノカルボニル)ブチル〕ヒ
ダントインの製造。
2,4−イミダゾリジンジオン(3.52g,0.01
モル)、塩化チオニル(20mL)、N,N−ジメチルホ
ルムアミド(2滴)及びクロロホルム(50mL)の混合
物を、室温で3時間攪拌した。減圧下でロータリーエバ
ポレーター中で溶剤を留去し、その生成物を次のパート
Bに直接用いた。
ンと反応させる。 クロロホルム(50mL)中の上記酸塩化物を、クロロホ
ルム100(mL)中のエタノールアミン(1.2g,
0.02モル)及びトリエチルアミン(2.4g,0.
024モル)の混合物に15分間かけて滴下添加した。
次いで混合物を60℃で2時間加熱し、そして室温で1
時間攪拌した。次いでその溶液を5%塩酸(100mL×
2)で洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(100m
L)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして溶剤をロータリーエバポレーター中で留去し
た。次いで濾液を酸化アルミニウムカラムを用いるクロ
マトグラフィーにかけ、TLC上に1つのスポットを示
す物質(3.0g)を得た。この物質を次の製造方法に
直接使用した。
シプロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−5,5−ジフェニルヒダントインの製造。 クロロホルム(100mL)中の工程1のヒドロキシ化合
物(3.0g,0.0075モル)、無水コハク酸
(1.0g,0.01モル)及びジメチルアミノピリジ
ン(0.9g,0.0075モル)の混合物を50〜6
0℃で4時間加熱し、そして週末の間室温まで放冷し
た。
して混合物を5%塩酸溶液(100mL×3)で洗浄し、
飽和塩化ナトリウム溶液(100mL)で洗浄し、無水硫
酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶剤を留去し
てTLC上に1つのスポットを与える物質を得た。
−{4−〔2−(3−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル}ヒダントインの製造。
酸(3.0g,0.006モル)、N,N′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド(1.5g,0.007モル)
及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.7g,0.0
06モル)の混合物を室温で20時間攪拌した。その混
合物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーター
中で濾液を濃縮した。次いで残渣をシリカを用いるクロ
マトグラフィーにかけ、生成物を1.3g得た(収率4
0%)。C30H32N4 O9 についての分析計算値:C,
60.8;H,5.44;N,9.45。実測値:C,
59.6;H,5.51,N;8.91。
{4−〔4−(3−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチル}
−2,4−イミダゾリジンジオンの製造。
ピペラジニルカルボニルブチル)ヒダントインの製造。
ジルオキシカルボニルピペラジニルカルボニル)ブチ
ル〕−5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジンジ
オンを製造した。
ように製造した酸塩化物(0.01モル)を、クロロホ
ルム(50mL)中のベンジル1−ピペラジンカルボキシ
レート(2.4g,0.011モル)及びトリエチルア
ミン(2.0g,0.02モル)の混合物に、15分間
かけて滴下添加した。この混合物を室温で一晩攪拌し、
そしてジクロロメタン(300mL)を添加した。その混
合物を5%塩酸(100mL×2)で洗浄し、希炭酸ナト
リウム溶液(100mL)で洗浄し、飽和塩化ナトリウム
溶液(100mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで溶
液を乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレ
ーター中で溶剤を留去した。次いで濾液をクロマトグラ
フィーにかけ、油状物4.3gを得た(収率78%)。
これを次の工程に直接使用した。
g,0.008モル)及び30〜35%臭化水素−酢酸
(HBr/AcOH)溶液(25mL)を室温で1.5時
間攪拌した。次いでこの混合物をジエチルエーテル(1
L)に注ぎ入れ、そして分離した油状物を新たなエーテ
ル(1L×3)で摩砕した。その油状物を10%水性水
酸化ナトリウム溶液(pH=14)中に溶解し、そしてこ
の水性溶液をジクロロメタン(100mL×4)で抽出し
た。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリウム溶液(15
0mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして減圧下、ロータリーエバポレーター中で溶剤
を留去した。濾液は固化して白色固体を与えた(2.6
g,収率77%)。この物質を次の工程に直接用いた。
シプロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル}−5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジンジ
オンの製造。
のアミン(2.1g,0.005モル)と無水コハク酸
(0.54g,0.0054モル)の混合物を50〜6
0℃で30分間加熱し、そして周囲温度で20時間放置
した。ジクロロメタン(150mL)を添加し、そして混
合物を5%塩酸(100mL×2)で洗浄し、飽和塩化ナ
トリウム溶液(100mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエボパ
レーター中で溶剤を留去したところ、白色固体2.5g
(95%)が得られ、これを次の工程に直接用いた。
−{4−〔4−(3−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル}−2,4−イミダゾリジンジオンの製造。
酸(1.56g,0.003モル)、N,N′−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド(0.64g,0.003モ
ル)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.36g,
0.003モル)の混合物を室温で週末の間攪拌した。
その混合物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレ
ーターで濾液から溶剤を留去して生成物1.9gを得た
(収率100%)。その固体をクロマトグラフィーにか
け、そして生成物画分をジクロロメタン(200mL)に
溶解し、希炭酸ナトリウム溶液(100mL×2)で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そしてロ
ータリーエバポレーター中で溶剤を留去したところ、T
LC上に1つのスポットを与える白色固体が得られた。
C32H35N5 O8 の分析計算値:C,62.23;H,
5.71;N,11.34。実測値:C,59.07;
H,5.40;N,10.45。
{4−〔6−(3−スクシンイミドオキシカルカルボニ
ルプロピオンアミド)ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−2,4−イミダゾリジンジオンの製造。
アミノカルボニル)ブチル〕−5,5−ジフェニル−
2,4−イミダゾリジンジオンの製造。
シカルボニルアミノヘキシルアミノカルボニル)ブチ
ル〕−5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジンジ
オンの製造。 HD1の製造で中間体として生成された酸塩化物を、H
D2の製造の工程1に記載の方法により、N−ベンジル
オキシカルボニル−1,6−ヘキサンジアミンで処理し
たところ、保護アミン7.5g、収率85%が得られ
た。
2の製造の工程1、パートBの方法により臭化水素酸−
酢酸で処理したところ遊離アミンが得られ、精製するこ
となくそれを工程2に用いた。
シプロピオンアミド)ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジンジ
オンの製造。 この化合物を、HD2の製造の工程2と同様の方法を用
いて製造した。C30H38N4 O6 についての分析計算
値:C,65.44;H,6.96;N,10.17。
実測値:C,63.26;H,7.01;N,9.3
9。
−{4−〔6−(3−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオンアミド)ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−2,4−イミダゾリジンジオンの製造。
を用いて製造したところ、生成物2.6gを得た(収率
80%)。融点133〜134℃。C34H41N5 O8 に
ついての分析計算値:C,63.05;H,6.38;
N,10.81。実測値:C,62.91;H,6.4
1;N,10.69。
ビツレート薬物ハプテン類似体の製造を具体的に説明す
るものである。一般的には、この類似体は、(1)バル
ビツレート誘導体、例えばフェノバルビタールを、ω−
ハロアルカンカルボキシレートエステルと縮合させる工
程、(2)前記エステルを、対応する酸にケン化させる
工程、(3)前記酸を、対応する酸塩化物に転化させる
工程、(4)前記酸塩化物をN−ヒドロキシスクシンイ
ミドと縮合させるか又は更に長い連結鎖を得るために、
アミン又はヒドロキシ基の1つが保護されたジアミン、
ジオール又はアミノアルコールと縮合させる工程、及び
(5)保護基を除去し、ジカルボン酸、例えばコハク酸
と縮合させ、次いでN−ヒドロキシスクシンイミドと縮
合させて、類似体を製造する工程、により製造される。
ジオール又はアミノアルコールと縮合させ、次いで別の
二酸を1回又は2回以上繰り返して、連結鎖を更に長く
することできる。しかしながら、より長い鎖の二酸、ジ
オール、ジアミン、アミノアルコール又はハロアルカン
カルボキシレートエステルを用いることにより、より少
ない工程で同様の製造が達成できる。
−1−{4−〔4−(3−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブ
チル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジン
トリオンの製造。
−(4−メトキシカルボニルブチル)−5−フェニル−
2,4(3H,5H)−ピリミジンジオンの製造。 ジクロロメタン(500mL)中のフェノバルビタール
(46.5g,0.2モル)と水酸化テトラブチルアン
モニウム(500mL、0.2モル、0.4M水溶液)の
混合物を製造し、そしてそれに5−ブロモ吉草酸メチル
(39.0g,0.2モル)を添加した。その反応混合
物を一晩(20時間)激しく攪拌した。この混合物に、
飽和塩化ナトリウム溶液(100mL)を添加し、有機層
を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン(100mL
×2)で洗浄した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリ
ウム溶液(100mL)で洗浄し、無水MgSO4 で乾燥
し、濾過し、そして溶剤を留去した。
5−エチル−6−ヒドロキシ−5−フェニル−2,4
(3H,5H)−ピリミジンジオンの製造。 ジオキサン(500mL)中の工程1の5−エチル−6−
ヒドロキシ−3−(4−メトキシカルボニルブチル)−
5−フェニル−2,4(3H,5H)−ピリミジンジオ
ンエステル(54.0g,0.156モル)、濃塩酸
(55mL)及び水(55mL)の混合物を4時間加熱して
還流させ、そして室温で一晩放置した。ジオキサンを減
圧下で留去し、そして飽和塩化ナトリウム溶液(250
mL)とジクロロメタン(400mL)を残渣に加えた。有
機層を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン(15
0mL×3)で抽出した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナ
トリウム溶液(200mL)で洗浄し、無水MgSO4 で
乾燥し、濾過し、そして溶剤を留去した。残渣にジエチ
ルエーテルを添加し、そしてその混合物を週末の間−1
6℃の冷凍庫に置き、次いで濾過した。
ル)−5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,
3H,5H)−ピリミジントリオンの製造。 工程2からの酸(6.6g,0.2モル)、塩化チオニ
ル(50mL)、N,N−ジメチルホルムアミド(2滴)
及びクロロホルム(80mL)の混合物を室温で1.5時
間攪拌した。減圧下ロータリーエバポレーターで溶剤を
留去し、そしてこの生成物を次の工程4に直接用いた。
カルボニル−1−ピペラジニルカルボニル)ブチル〕−
5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,3H,
5H)−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム(75mL)中の工程3の酸塩化物(0.2
モル)を、クロロホルム(100mL)中のベンジル1−
ピペラジンカルボキシレート(6.0g,0.030モ
ル)とトリエチルアミン(4.0g,0.04モル)の
混合物に15分間かけて滴下添加した。この混合物を室
温で20時間攪拌し、次いでジクロロメタン(300m
L)を添加した。その混合物を10%塩酸溶液(100m
L×3)で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液(100m
L)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして溶剤を留去した。次いで残渣をSiO2 上で
のクロマトグラフィーにかけて固体を得た。
〔4−(1−ピペラジニルカルボニル)ブチル〕−2,
4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリオン臭化
水素酸塩の製造。 工程4からの保護アミン(6.5g,0.012モル)
及び30〜35%臭化水素−酢酸溶液(30mL)を室温
で1.5時間攪拌した。次いでその混合物を酢酸エチル
(2L)中に注ぎ入れ、1時間攪拌し、濾過し、そして
固体を酢酸エチル500mLで洗浄した。
シプロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル}−5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,
3H,5H)−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム(150mL)中の工程5のアミン(4.8
g,0.01モル)、無水コハク酸(1.2g,0.0
12モル)及びトリエチルアミン(2.2g,0.02
モル)の混合物を、50〜60℃(湯浴)で30分間加
熱し、そして周囲温度で16時間攪拌した。ジクロロメ
タン(200mL)を添加し、混合物を10%塩酸溶液
(100mL×3)で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液
(100mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーター中
で溶剤を留去すると、白色固体3.3gが得られた(収
率66%)。この物質をSiO2 カラムを用いるクロマ
トグラフィーにかけたところ、白色固体が得られた。
{4−〔4−(3−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル)−1−ピペラジニルカルボニル〕ブチル}
−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリオ
ンの製造。
酸(3.4g,0.007モル)、N,N′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド(1.6g,0.008モル)
及びN−ヒドロキシスクシンイミド(1.0g,0.0
08モル)の混合物を室温で20時間攪拌した。その混
合物を濾過し、そして酢酸エチル(100mL)を添加し
た。その有機溶液を水(100mL×2)で洗浄し、飽和
塩化ナトリウム溶液(50mL)で洗浄し、無水硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエ
バポレーターで溶剤を留去した。固体の一部をクロマト
グラフィーにかけたところ、白色固体が得られた。
−2−(4−スクシンイミドオキシカルボニルブチル−
2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリオン
の製造。
4の工程7の方法を用いてこの物質を製造した。その物
質をエチルエーテル/酢酸エチル(1:1)から結晶化
したところ、白色固体が得られた。
−1−{4−〔2−(3−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕ブ
チル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジン
トリオンの製造。
ドロキシエチルアミノカルボニル)ブチル〕−5−フェ
ニル−2,4,6(1H,3H,5H)ピリミジントリ
オンの製造。ベンジル1−ピペラジンカルボキシレート
の代わりに2−ヒドロキシエチルアミンを用いる以外
は、例4の工程4に概説されたようにこの物質を製造し
た。
シプロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,
3H,5H)−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム(100mL)中の工程1からの生成物
(2.9g,0.007モル)、無水コハク酸(0.7
g,0.007モル)及びジメチルアミノピリジン
(0.9g,0.007モル)の混合物を湯浴(50〜
60℃)中で30分間加熱し、次いで室温で3日間攪拌
した。ジクロロメタン(300mL)を添加し、そして混
合物を10%塩酸溶液(100mL×2)で洗浄し、飽和
塩化ナトリウム溶液(100mL)で洗浄し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶剤を留去したと
ころ、油状物が得られ、それを次の工程に直接用いた。
ル−1−{4−〔2−(3−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオニルオキシ)エチルアミノカルボニル〕
ブチル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジ
ントリオンの製造。
本例の工程2の酸を用いて開始してこの物質を製造し
た。
−1−{4−〔3−(3−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオンアミド)プロピルアミノカルボニル〕ブ
チル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジン
トリオンの製造。
カルボニルアミノプロピルアミノカルボニル)ブチル〕
−5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,3
H,5H)−ピリミジントリオンの製造。 ベンジル1−ピペラジンカルボキシレートの代わりにN
−ベンジルオキシカルボニル−1,3−プロパンジアミ
ンを用いる以外は、例4の工程4に概略された方法を用
いてこの物質を製造し、そして粗製物質を次の工程に用
いた。
アミノカルボニル)ブチル〕−5−エチル−5−フェニ
ル−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリ
オン臭化水素酸塩の製造。例4の工程5のようにこの物
質を製造した(本例の工程1のアミドを用いて開始し、
エチルエーテル中に注ぎ入れると油状物が得られたこと
を除いて)。
シプロピオンアミド)プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル}−5−エチル−5−フェニル−2,4,6(1H,
3H,5H)−ピリミジントリオンの製造。 本例の工程2からのアミンを用いて開始して酸を得たこ
と以外は、例4の工程6の方法により、この物質を製造
した。
ル−1−{4−〔3−(3−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオンアミド)プロピルアミノカルボニル〕
ブチル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジ
ントリオンの製造。
は、例4の工程7の方法を用いてこの物質を製造した。
−1−{4−〔6−(3−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオンアミド)ヘキシルアミノカルボニル〕ブ
チル}−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジン
トリオンの製造。
ニル−1,3−プロパンジアミンの代わりにN−ベンジ
ルオキシカルボニル−1,6−ヘキサンジアミンを使用
し、そしてその後の工程2,3及び4で各々それからの
反応生成物を用いること以外は、例7の反応順序に従っ
てこの化合物を製造した。
ツレート及びヒダントインの新規標識薬物ハプテン類似
体を製造した。それらはバルビツレート及びヒダントイ
ン薬物、特にフェノバルビタール及びフェニトインにつ
いての競合イムノアッセイにおいて有用である。標識
は、競合イムノアッセイにおいて分析物又は分析物類似
体と共に常用される、アミン又はスルフヒドリル基を有
するイムノアッセイ用の標識、例えば酵素、可視色素、
ロイコ色素、蛍光色素及び放射性物質等である。
スファターゼ(ALP)、グルコースオキシダーゼ(G
OD)及び西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)もし
くはアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ(AHR
P)である。
んで成る新規方法を用いて製造される。 1)求核基、例えばアミン又はスルフヒドリル基を表面
上に担持する標識を、過剰の上記バルビツレート又はヒ
ダントイン薬物ハプテン類似体と接触させる工程。好ま
しくは類似体と標識を水混和性有機溶剤、例えばN,N
−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド(DM
SO)又は溶剤と水(緩衝化したもの)の混合物に溶解
した後、一緒に混合する工程、及び 2)未使用活性エステル及び縮合副生成物を、好ましく
は透析により取り除く工程。
明の新規標識類似体の製造を実証するものである。標識
類似体は、フェニントイン及びフェノバルビタール薬物
ハプテン類似体を用いて製造した。
インHD1〔伸長連結鎖を含む;標識AHRP−HD1
(標識A)〕の製造。
トアニリドを含む乾燥DMF(DMF 4′−HA)
1.452mLに溶解した。
た。乾燥HRPを0.1M MES緩衝液(pH 5.5)に
溶解して、緩衝液10mL中の最終濃度が2.5×10-6
モル(100mg)となるようにした〔MES=2−(N
−モルホリノ)エタンスルホン酸〕。変換係数A403 1
mg/mL=2.24を用いてA403 測定値からタンパク質
濃度を求めた。HRP溶液を、0.1M MES緩衝液
(pH 5.5)10mL中に溶解したL−リジン一塩酸塩1.
5×10-3モル(275mg)と合わせた。新たに調製し
たMES緩衝液中の1−エチル−3−(3−ジメチルア
ミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC、5×1
0-4モル、960mL)の溶液を添加した。容器に蓋を
し、そして室温で一晩混合した。その反応生成物を0.
02M MOPS緩衝液(pH 7.0)(3L、10℃)に
対して透析した。透析緩衝液を3回変えた。MOPS=
3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸。
を、30,000NMWL(呼称分子量限界カットオ
フ)のCentricells 遠心限外濾過膜を用いて、MOPS
緩衝液から0.1M EPPS緩衝液(pH 8.0)に交換
した。次いで、この試料を希釈して、最終濃度10mg/
mLの溶液を得た。
ジメチルホルムアミド中の4′−ヒドロキシアセトアニ
リドの10mM溶液(DMF 4′−HA)500μLと
渦動攪拌により混合し、次いでそれを42℃の水浴中に
置いた。乾燥DMF−4′−HA溶液1.452mL中に
21mgのHD1を溶解することにより調製したHD1溶
液(500μL)を、フェニトイン/HRPのモル比が
50/1となるように、渦動攪拌により混合しながらA
HRPに滴下添加した。その反応混合物を42℃の水浴
中で穏やかに振動させながら1時間インキュベーション
した。
/0.1M EPPS(1:1)0.5mLを用いて反応
容器をすすいだすすぎ液と一緒に、Spectrapor #2 透析
チューブに入れた。
(1:1),pH 8.0に対して42℃で1時間、 b)透析条件a)を用いてもう1回繰り返す、 c)2Lの0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含
む0.1M EPPS,pH 8.0に対して8℃で15時
間、 d)2Lの0.1M EPPS,pH 8.0に対して8℃で
3時間、 e)3Lの0.04M トリス(ヒドロキシメチル)ア
ミノメタン塩酸塩(トリスHCl)/0.15M Na
Cl,pH 7.5に対して8℃で3時間、そしてf)透析条
件e)を用いて3時間、もう1回繰り返す。
hiolate )(商標)を防腐剤として添加し、そしてAH
RP−HD1を冷蔵保存した。
〔アミド結合を有する伸長連結鎖を含む;標識AHRP
−HD2(標識B)〕の製造。
ヒドロキシアセトアニリドを含む乾燥DMF(DMF
4′−HA)1.031mLに溶解した。
AHRPの溶液(10mg/mL、0.1M EPPS溶
液, pH 8.0 中、1mL)を、DMF 4′−HA 50
0μLと渦動攪拌により混合し、次いでそれを42℃の
水浴中に置いた。渦動攪拌により混合しながら、上記H
D2溶液(500μL)を、モル比が50/1となるよ
うにAHRP溶液に滴下添加した。反応混合物を42℃
の水浴中で穏やかに振盪させながら1時間インキュベー
ションした。
に入れ、そして以下のように透析した。 a)1LのDMF 4′−HA/0.1M EPPS
(1:1), pH 8.0に対して42℃で1時間、 b)透析条件a)を用いてもう1回繰り返す、 c)1.5Lの0.1%BSA含有0.1M EPP
S, pH 8.0に対して8℃で1.5時間、 d)1.5Lの0.1M EPPS, pH 8.0に対して8
℃で18時間、 e)1.5Lの0.04M トリスHCl/0.15M
NaCl, pH 7.5に対して8℃で2時間、そして f)透析条件e)を用いて4時間、もう1回繰り返す。
剤として添加した。標識ヒダントイン誘導体を冷蔵庫に
保存した。
を有する伸長連結鎖を含む、標識AHRP−HD3(標
識C)〕の製造。
ロキシアセトアニリドを含む乾燥DMF(DMF 4′
−HA)1mLに溶解した。
AHRPの溶液を、0.1M EPPS緩衝液(pH 8.
0)に対して透析した。最終濃度が5.71mg/mLとな
るようにした。
F 4′−HA 500μLと混合し、次いでそれを4
2℃の水浴中に置いた。上記HD3溶液(500μL)
を、HD3/AHRPのモル比が50/1となるよう
に、渦動攪拌により混合しながらAHRPに滴下添加し
た。反応混合物を42℃の水浴中で穏やかに振盪させな
がら1時間インキュベーションした。反応混合物を、D
MF 4′−HA/0.1モルEPPS(1:1)0.
5mLを用いて反応容器をすすいだすすぎ液と一緒にSpec
trapor #2 透析チューブに入れた。
(1:1),pH 8.0に対して42℃で1時間、 b)透析条件a)を用いてもう1回繰り返す、 c)1.5Lの0.1%BSA含有0.1M EPP
S,pH 8.0に対して5℃で15時間、 d)1.5Lの0.1M EPPS,pH 8.0に対して8
時間、 e)2Lの0.02M 3−モルホリノプロパンスルホ
ン酸(MOPS),pH7.0に対して5℃で13時間、そ
して f)透析条件e)を用いて2回繰り返す。
標)を防腐剤として添加し、そしてその標識生成物を冷
蔵保存した。
体の製造を具体的に説明するものである。
(標識AHRP−PB2;標識D)の製造。 PB2をDMSOに溶解して10.7mg/mL溶液(1.
25×10-2M)を得た。次いでこの溶液の500μL
を、渦動攪拌により混合しながらアミン富化HRP/D
MSO溶液(AHRP/DMFと同様に調製)に滴下添
加した。フェノバルビタール/HRPのモル比は50/
1であった。
間インキューベーションを行った。その試料をSpectrap
or #2 透析チューブに移し、更に透析液1mLを用いて反
応容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れ
た。標識を0.02M MOPS緩衝液,pH 7.0に対し
て5〜10℃で透析した。この透析条件を、各回2〜3
Lの緩衝液を用いて3回繰り返した。透析後、0.02
%メルチオレート(商標)を防腐剤として添加し、そし
て標識を冷蔵保存した。
結鎖を含むAHRP−PB3(標識E)〕の製造。 アミン富化HRPを、Centricell遠心限外濾過膜(3
0,000呼称分子量限界)を用いてMOPS緩衝液か
ら0.1M EPPS緩衝液,pH 8.0へと交換した。次
いでこの試料を4.6mL(0.743mg/mL)に希釈し
た。
5×10-5M)。10mM 4′−ヒドロキシアセトアニ
リドを含むジメチルホルムアミド(Ardrich 22,705-6)
(DMF 4′−HA)500μLをバイアルに添加
し、渦動攪拌により混合し、そして42℃の水浴に置い
た。
中に溶解して2.12mg/mL溶液(3.70×10
-3M)を得た。この溶液500μLを、渦動攪拌により
混合しながら、HRP/DMF 4′−HA溶液に滴下
添加した。フェノバルビタール/HRPのモル比は、1
00/1であった。
1時間インキュベーションを行った。試料を、反応容器
をすすぐのに使った追加のDMF 4′−HA/0.1
モルEPPS(1:1)1mLと一緒にSpectrapor #2 透
析管に移した。
(1:1),pH 8.0に対して42℃で1時間、 b)透析条件a)を用いてもう1回繰り返す、 c)1.5Lの0.1%BSA含有0.1M EPP
S,pH 8.0に対して5℃で一晩、 d)1.5Lの0.1M EPPS,pH 8.0に対して5
℃で8時間、 e)2.0Lの0.02M MOPS,pH 7.0に対して
5℃で少なくとも8時間、そして f)透析条件e)を2回繰り返す。
標)を防腐剤として添加し、そして標識生成物を冷蔵保
存した。
HRP−PB1(標識F);アミド結合を有する伸長連
結鎖を含むフェノバルビタールハプテン類似体の活性エ
ステル〕の製造。
EPPS緩衝液,pH 8.0へと緩衝液交換して10mg/mL
の溶液(2.5×10-4M)を得た。標識Fは、アミン
富化HRP5mL(50mg)を用いて製造した。磁気攪拌
プレート上で攪拌しながら、2.5mLのDMSOをゆっ
くり添加した。その溶液を室温で15分間攪拌した。
4.9mg/mL溶液を得た。この溶液2.5mLを、攪拌下
でゆっくりHRP/DMSO溶液に添加した。フェノバ
ルビタール/HRPのモル比は50/1であった。
間インキュベーションを行った。その試料を、反応容器
をすすぐのに使った追加の透析液と一緒にSpectrapor #
2 透析管に移した。標識を0.02M MOPS緩衝
液,pH 7.0に対して5〜10℃で透析した。この透析条
件を、各回3Lの緩衝液を用いて3回繰り返した。透析
後、0.02%メルチオレート(商標)を防腐剤として
添加し、そして標識を冷蔵保存した。
に示すものである。
A)の免疫応答性 本例では、標識製造例1からのAHRP−HD1(標識
A)を結合する、数種の固定化抗体(DilAs8 ,D
ilAs9 ,DilAs14,DilAs16及びDilA
s21)の能力を調べる。
上述した種類の抗体の1つが共有結合されている)を、
1987年8月3日に出願された米国特許出願第08
1,206号明細書(EP公開第88 307172.
2号)に記載された方法及び材料を用いて製造した。
する固定化抗体の能力を以下のように測定した。各種の
抗体ビーズを、1%BSAを含むPBSで系列希釈し
て、500〜0.5nMの抗体バインディング部位の濃
度となるようにした。ビーズ希釈液を、同容量の10×
10-11 Mの標識と混合した。1時間インキュベーショ
ン後、遠心によりビーズをペレットにした。上清の試料
(100μL)を、基質(o−フェニレンジアミン/H
2 O2 )100μLと混合した。450nmでの発色速度
を標準のものと比較して、溶液中に残存するフェニトイ
ン−HRP標識の量を計算した。試験した最大抗体濃度
(250nMの結合部位)において固定化抗体に結合し
た標識の量を報告する。
D1標識(標識A)を非常に良く認識することを示して
いる。
分解安定性。 本例は、標識とフェニトイン核の間の連結鎖中にアミド
結合を有する本発明の標識フェニトイン誘導体〔AHR
P−HD2(標識B)〕の加水分解安定性を具体的に説
明するものである。
固定化されたビーズは、1987年8月3日に出願され
た米国特許出願第081,206号明細書(公開EPA
88 307172.2)に記載の通りに調製した。
は8.5 に調整した1%BSA含有PBSで中に1×10
-10 Mとなるまで希釈した。その標識を室温で6日間イ
ンキュベーションした。2日後及び6日後に、固定化抗
体による結合について、以下のように標識を試験した。
A含有PBSで系列希釈して、500〜0.50nM抗
体結合部位濃度となるようにした。ビーズ希釈液を同容
量の10×10-11 Mの標識と混合した。1時間インキ
ュベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。
上清の試料(100μL)を基質(o−フェニレンジア
ミン/H2 O2 )100μLと混合した。速度を標準の
ものと比較して、溶液中に残存する標識の量を計算し
た。試験した最大抗体濃度(250nM結合部位)にお
いて固定化抗体に結合した標識の量を報告する。
含むAHRP−HD2(標識B)の結合が、この時間に
渡って全く分解を示さなかったことを示す。これは、標
識Bが加水分解による分解に耐性であろうことを示す。
このような加水分解は、時間の経過と共にアッセイ応答
の変化を引き起こし得る。
用いて製造されたフェノバルビタール−HRP標識の比
較。 本例では、吉草酸エステル連結鎖を有する標識(標識
D、AHRP−PB2)及び伸長連結鎖を有する標識
(標識F、AHRP−PB1)を結合する、数種の固定
化抗体(Kallestad 1571及びPbAs9 )の能力を比較
した。
製造した。ポリマービーズ(30mg)〔ポリ(スチレン
−コ−P−ビニルベンジル2−クロロエチルスルホン)
(モル比95:5)〕を、緩衝液(0.1M EPP
S、pH 8.5)1mL中に分散し、そして抗体(Kall
1571又はPbAs9 )0.3mgを添加した。総容量
を1.5mLにした。混合物を室温で4時間転倒回転させ
た。次いでBSAの10%溶液0.3mLを添加し、そし
て上清を除去し、抗マウスIgGを用いて未結合抗体に
ついて分析した。表面上に結合した抗体の量をELIS
Aを用いて計算した。PBS(pH 7.2)を使って、ペレ
ットを緩衝液中に再懸濁しそして遠心分離することによ
り3回洗浄した。最終再分散液はPBS1.8mL中であ
り、メルチオレート(商標)を0.02%の濃度になる
ように添加し、そして生成物を使用するまで4℃で保存
した。
ように測定した。各種の抗体ビーズを、1%BSA含有
PBSで系列希釈して、200〜0.50nM抗体結合
部位濃度となるようにした。ビーズ希釈液を、同容の1
0×10-11 Mのフェノバルビタール−HRP標識と混
合した。1時間インキュベーション後、遠心分離により
ビーズをペレットにした。上清の試料(100μL)を
基質(o−フェニレンジアミン/H2 O2 )100μL
と混合した。450nmでの発色速度を標準のものと比較
して、溶液中に残存するフェノバルビタール−HRP標
識の量を計算した。試験した最大抗体濃度(100nM
結合部位)において固定化抗体に結合した標識の量を報
告する。
る標識薬物ハプテン類似体に対する抗体の認識の改良を
示す。少なくとも65%の標識薬物ハプテン類似体が、
過剰の固定化バルビツレート又はヒダントイン抗体によ
って結合されうる。伸長連結鎖を有する標識類似体、特
に連結鎖中にアミド結合を有するものは、本発明を実用
のものに変える際に用いられるどんなタイプの固定化抗
体によっても、同様に結合される。伸長連結鎖中にアミ
ドを有する誘導体類は、加水分解に対しても非常に安定
である。上記ヒダントイン誘導体の使用により、幾つか
の利点が認められる。ヒダントイン核又はフェノバルビ
タール核と活性エステル基の間に短い連結鎖を有するこ
れらのヒダントイン誘導体の活性エステルは、幾つかの
固定化抗体と共に使われる許容される酵素標識を製造す
るのに十分な程にHRPと反応性であった。活性エステ
ル基とヒダントイン核の間に8〜20個の原子から成る
長い連結基(R2 と角括弧中の基)を有する誘導体は、
試験した全ての固定化抗体により結合できる標識を提供
した。各Zが、隣接するカルボニルと共にアミド基を形
成する−NR−であるような連結鎖は、加水分解に対し
て耐性である。
Claims (1)
- 【請求項1】 下記構造式(I)で表される標識薬物ハ
プテン類似体: 【化1】 上式中、「標識」は、アミン又はスルフヒドリル基を有
するイムノアッセイに用いられるタイプの標識であり、 Aは下式のヒダントイン核: 【化2】 又は下式のバルビツレート核: 【化3】 を表し、 R 1 は、各々独立して、水素、炭素原子数1〜
10のアルキル、又はフェニルを表し、 R 2 は、C 1 〜C 10 アルキレン基又は1以上のエステル
基、アミド基、−O−、−S−もしくは−NR−(Rは
水素もしくはC 1 〜C 6 アルキルを表す)によって中断さ
れたC 1 〜C 10 アルキレン基を表し、 R 4 、R 5 及びR 6 は、各々独立に、C 1 〜C 10 アルキレン
基又はエステル基、アミド基、−O−、−S−もしくは
−NR−(Rは水素もしくはC 1 〜C 6 アルキルを表す)
によって中断されたC 1 〜C 10 アルキレン基、又はフェ
ニレン基を表し、 R 3 はC 1 〜C 3 アルキレンを表し、 Zは−O−、−S−もしくは−NR−(Rは水素もしく
はC 1 〜C 6 アルキルを表す)を表し、 mは0,1又は2であり、 nは0,1又は2であり、 m+n>0であり、そして m、n及びR 2 に含まれる原子の総数は5〜40である
が、但し (1)R 1 基の少なくとも一つはフェニルであり、且つ (2)上記構造式(I)の括弧内の成分はいずれの順序
で存在してもよい 。
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