JP3190729B2 - イムノアッセイ用標識薬物ハプテン類似体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床化学、詳細にはイ
ムノアッセイに関する。

【０００２】

【従来の技術】天然の免疫学的反応を利用するイムノア
ッセイは、臨床化学における分析技術として広範な使用
が見い出されている。反応の特異性により、それらは生
物学的流体中に非常に低濃度で存在する生物学的分析物
（analyte ）を定量する際に特に有利である。このよう
な分析物（本明細書中ではリガンドと称する）として
は、例えば、抗体、治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン及
びタンパク質等が挙げられる。

【０００３】競合結合イムノアッセイでは、免疫応答性
誘導体及びリガンドの類似体をはじめとする標識リガン
ド類似体が、所定量の適当な結合性物質（本明細書中で
はレセプターと称する）との反応を目当てに未標識リガ
ンド競合した状態に置かれる。リガンドの未知濃度は、
結合もしくは未結合（すなわち遊離）の標識リガンドの
どちらか一方のシグナルを測定することより求めること
ができる。反応は以下のように進行する。

【０００４】 リガンド ＋ 標識リガンド ＋ レセプター→ リガンド−レセプター ＋ 標識リガンド−レセプター

【０００５】常用される標識としては、放射性標識、酵
素、発色団、蛍光団、安定な遊離基並びに酵素の補因
子、阻害剤及びアロステリックエフェクターが挙げられ
る。

【０００６】上述したことと矛盾することなく、血清中
の薬物誘導体（例えばフェノバルビタールやフェニトイ
ン）についてのイムノアッセイは、固定化抗体の結合部
位を目当てにした、そのような薬物の酵素標識類似体と
患者血清中の薬物との競合反応に基づくことができる。

【０００７】標識薬物ハプテン類似体（以下、ＬＤＨと
称することがある）についての特定の必要条件は、１）
少なくとも６５％のＬＤＨが過剰の固定化抗体により結
合されうること；２）固定化抗体に対するＬＤＨの親和
性が、所定量のＬＤＨと薬物との競合が治療に関連した
薬物濃度範囲で起こるようなものであること；及び３）
保存条件下におけるその酵素標識の加水分解に対するＬ
ＤＨの安定性；を含む。

【０００８】薬物ハプテン類似体に課せられる必要条件
は、１）酵素標識との結合後の固定化抗体に対する類似
体の接近しやすさ；２）薬物に対する抗体による、標識
類似体の特異的認識；及び３）酵素活性に悪影響を与え
ない条件下、直接に又は酵素もしくは類似体の活性化後
のいずれかでの、酵素標識との薬物類似体の十分な反応
性；を含む。

【０００９】米国特許第４，７５２，５６８号明細書に
開示されたグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）及びアル
カリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）酵素標識結合フェノバ
ルビタール及びフェニトインハプテン類似体は、所望の
フォーマットで有効な競合イムノアッセイを遂行するの
に適切な酵素標識類似体を提供した。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】標識として酵素西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いる場合に、前記
米国特許明細書に開示された標識フェノバルビタール及
びフェニトイン類似体が、競合イムノアッセイを遂行す
るのに不十分であることが課題である。このような類似
体とＨＲＰとのカプリング反応は、緩慢かつ不完全であ
った。更に、フェノバルビタール−ＨＲＰ標識及びフェ
ニトイン−ＨＲＰ標識は非常に弱い結合であったので、
判読可能なシグナルを得るのに非常に高濃度の標識又は
抗体結合部位が必要とされるであろう。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記の構造に
相当する、請求項１の標識薬物ヒダントインおよびバル
ビツレート類似体を提供する：

【００１２】

【化３】

【００１３】上式中、Ａは次式のヒダントイン核

【化４】 又は次式のバルビツレート核

【化５】 を表し、

【００１４】Ｒ¹ は各々独立して、水素、炭素原子数１
〜１０のアルキル、未置換又は置換フェニルを表し、Ｒ
² ，Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は各々独立して、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀ア
ルキレン基を表すか又は少なくとも１つ以上のエステル
基、アミド基、−Ｏ−，−Ｓ−もしくは−ＮＲ−を割り
込ませたＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキレン基を表し、Ｒ³ はＣ₁ 〜
Ｃ₃ アルキレンを表し、Ｚは−Ｏ−，−Ｓ−及び−ＮＲ
−（ここで、Ｒは水素又はＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキル、例えば
メチル、プロピル及びヘキシルを表す）を表し、

【００１５】ｍは０，１又は２であり ｎは０，１又は２であり ｍ＋ｎ＞０であり、そして ｍ，ｎ及びＲ² に含まれる原子の総数が５〜４０であ
り、標識は酵素であり、そして更に、

【００１６】（ｉ）Ｒ¹ 基の少なくとも１つが置換又は
未置換フェニルであり、（ii）Ｒ⁴，Ｒ⁵ 及びＲ⁶ のう
ちの１つがフェニレンであってもよく、（iii ）式Ｉの
角括弧中の成分がいずれの順序であってもよく、そして
（iv）連結基が、炭素原子数２〜１２の飽和又は不飽和
モノカルボン酸の誘導体以外のものであることを条件と
する。

【００１７】上記定義に従って、Ｒ¹ は水素、メチル、
プロピル、ヘキシル、デシル、未置換フェニルであるか
又は炭素原子数１〜６個のアルキルにより、ニトロによ
り、ハロゲンにより、シアノによりもしくは炭素原子数
１〜６個のアルコキシにより置換されたフェニルを表す
ことができ、Ｒ² ，Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は各々独立し
て、エチレン、ブチレン、ペンチレン、オクチレンから
選ばれるアルキレンであるか、又は少なくとも１つ以上
のエステル基、アミド基、−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−Ｎ
Ｒ−を割り込ませた前記のようなアルキレンを表し、Ｒ
³ はメチレン、エチレン又はトリメチレンを表し、Ｚは
各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ−（ここで、
Ｒは、少なくとも１つの水素、メチル、プロピル又はヘ
キシルを表す）を表し、そして標識は酵素を表す。

【００１８】標識薬物ハプテン類似体は、以下に記載さ
れる新規薬物ハプテン類似体より製造した。

【００１９】それらは一般的に下記を含んで成る。 （ａ）活性エステル基、例えば、スクシンイミドオキシ
カルボニル、 （ｂ）ヒダントイン核又はバルビツレート核、及び （ｃ）前記活性エステル基を前記ヒダントイン核又はバ
ルビツレート核に連結する連結鎖（ここで、連結鎖は前
に定義した通りである）。

【００２０】より具体的には、本発明の好ましい新規ヒ
ダントイン活性エステルは、次式の構造を有するもので
ある。

【００２１】

【化６】

【００２２】上式中、Ａ，Ｒ¹ ，Ｒ² ，Ｒ³ ，Ｒ⁴ ，Ｒ
⁵ ，Ｒ⁶ ，Ｚ，ｍ及びｎ並びにそれらに関連する条件
は、先に定義のとおりであり、そしてＲ⁷ は、エチレン
又はｏ−フェニレン基である。

【００２３】製造例 ヒダントイン薬物ハプテン類似体 ヒダントイン類似体は、ヒダントイン化合物のサブクラ
スであるフェニトイン類似体が製造される下記製造方法
に従って製造できる。

【００２４】例１−ＨＤ１：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチル｝
ヒダントインの製造。

【００２５】工程１：５，５−ジフェニル−３−〔４−
（２−ヒドロキシエチルアミノカルボニル）ブチル〕ヒ
ダントインの製造。

【００２６】パートＡ：最初に酸塩化物を製造する。 ３−（４−カルボキシブチル）−５，５−ジフェニル−
２，４−イミダゾリジンジオン（３．５２ｇ，０．０１
モル）、塩化チオニル（２０mL）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（２滴）及びクロロホルム（５０mL）の混合
物を、室温で３時間攪拌した。減圧下でロータリーエバ
ポレーター中で溶剤を留去し、その生成物を次のパート
Ｂに直接用いた。

【００２７】パートＢ：上記酸塩化物をエタノールアミ
ンと反応させる。 クロロホルム（５０mL）中の上記酸塩化物を、クロロホ
ルム１００（mL）中のエタノールアミン（１．２ｇ，
０．０２モル）及びトリエチルアミン（２．４ｇ，０．
０２４モル）の混合物に１５分間かけて滴下添加した。
次いで混合物を６０℃で２時間加熱し、そして室温で１
時間攪拌した。次いでその溶液を５％塩酸（１００mL×
２）で洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１００m
L）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして溶剤をロータリーエバポレーター中で留去し
た。次いで濾液を酸化アルミニウムカラムを用いるクロ
マトグラフィーにかけ、ＴＬＣ上に１つのスポットを示
す物質（３．０ｇ）を得た。この物質を次の製造方法に
直接使用した。

【００２８】工程２：３−｛４−〔２−（３−カルボキ
シプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニルヒダントインの製造。 クロロホルム（１００mL）中の工程１のヒドロキシ化合
物（３．０ｇ，０．００７５モル）、無水コハク酸
（１．０ｇ，０．０１モル）及びジメチルアミノピリジ
ン（０．９ｇ，０．００７５モル）の混合物を５０〜６
０℃で４時間加熱し、そして週末の間室温まで放冷し
た。

【００２９】ジクロロメタン（３００mL）を添加し、そ
して混合物を５％塩酸溶液（１００mL×３）で洗浄し、
飽和塩化ナトリウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫
酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶剤を留去し
てＴＬＣ上に１つのスポットを与える物質を得た。

【００３０】工程３：ＨＤ１：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝ヒダントインの製造。

【００３１】

【化７】

【００３２】クロロホルム（８０mL）中の工程２からの
酸（３．０ｇ，０．００６モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（１．５ｇ，０．００７モル）
及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７ｇ，０．０
０６モル）の混合物を室温で２０時間攪拌した。その混
合物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーター
中で濾液を濃縮した。次いで残渣をシリカを用いるクロ
マトグラフィーにかけ、生成物を１．３ｇ得た（収率４
０％）。Ｃ₃₀Ｈ₃₂Ｎ₄ Ｏ₉ についての分析計算値：Ｃ，
６０．８；Ｈ，５．４４；Ｎ，９．４５。実測値：Ｃ，
５９．６；Ｈ，５．５１，Ｎ；８．９１。

【００３３】例２−ＨＤ２：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝
−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００３４】工程１：５，５−ジフェニル−３−（１−
ピペラジニルカルボニルブチル）ヒダントインの製造。

【００３５】パートＡ：最初に、３−〔４−（４−ベン
ジルオキシカルボニルピペラジニルカルボニル）ブチ
ル〕−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンを製造した。

【００３６】上記ＨＤ１の製造のパートＡに記載される
ように製造した酸塩化物（０．０１モル）を、クロロホ
ルム（５０mL）中のベンジル１−ピペラジンカルボキシ
レート（２．４ｇ，０．０１１モル）及びトリエチルア
ミン（２．０ｇ，０．０２モル）の混合物に、１５分間
かけて滴下添加した。この混合物を室温で一晩攪拌し、
そしてジクロロメタン（３００mL）を添加した。その混
合物を５％塩酸（１００mL×２）で洗浄し、希炭酸ナト
リウム溶液（１００mL）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム
溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで溶
液を乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレ
ーター中で溶剤を留去した。次いで濾液をクロマトグラ
フィーにかけ、油状物４．３ｇを得た（収率７８％）。
これを次の工程に直接使用した。

【００３７】パートＢ：工程Ａの保護アミン（４．８
ｇ，０．００８モル）及び３０〜３５％臭化水素−酢酸
（ＨＢｒ／ＡｃＯＨ）溶液（２５mL）を室温で１．５時
間攪拌した。次いでこの混合物をジエチルエーテル（１
Ｌ）に注ぎ入れ、そして分離した油状物を新たなエーテ
ル（１Ｌ×３）で摩砕した。その油状物を１０％水性水
酸化ナトリウム溶液（pH＝１４）中に溶解し、そしてこ
の水性溶液をジクロロメタン（１００mL×４）で抽出し
た。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリウム溶液（１５
０mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして減圧下、ロータリーエバポレーター中で溶剤
を留去した。濾液は固化して白色固体を与えた（２．６
ｇ，収率７７％）。この物質を次の工程に直接用いた。

【００３８】工程２：３−｛４−〔４−（３−カルボキ
シプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。

【００３９】クロロホルム（１５mL）中のパートＢから
のアミン（２．１ｇ，０．００５モル）と無水コハク酸
（０．５４ｇ，０．００５４モル）の混合物を５０〜６
０℃で３０分間加熱し、そして周囲温度で２０時間放置
した。ジクロロメタン（１５０mL）を添加し、そして混
合物を５％塩酸（１００mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナ
トリウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエボパ
レーター中で溶剤を留去したところ、白色固体２．５ｇ
（９５％）が得られ、これを次の工程に直接用いた。

【００４０】工程３：ＨＤ２：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４１】

【化８】

【００４２】クロロホルム（４０mL）中の工程２からの
酸（１．５６ｇ，０．００３モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（０．６４ｇ，０．００３モ
ル）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３６ｇ，
０．００３モル）の混合物を室温で週末の間攪拌した。
その混合物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレ
ーターで濾液から溶剤を留去して生成物１．９ｇを得た
（収率１００％）。その固体をクロマトグラフィーにか
け、そして生成物画分をジクロロメタン（２００mL）に
溶解し、希炭酸ナトリウム溶液（１００mL×２）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そしてロ
ータリーエバポレーター中で溶剤を留去したところ、Ｔ
ＬＣ上に１つのスポットを与える白色固体が得られた。
Ｃ₃₂Ｈ₃₅Ｎ₅ Ｏ₈ の分析計算値：Ｃ，６２．２３；Ｈ，
５．７１；Ｎ，１１．３４。実測値：Ｃ，５９．０７；
Ｈ，５．４０；Ｎ，１０．４５。

【００４３】例３−ＨＤ３：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルカルボニ
ルプロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４４】工程１：３−〔４−（６−アミノヘキシル
アミノカルボニル）ブチル〕−５，５−ジフェニル−
２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４５】パートＡ：３−〔４−（６−ベンジルオキ
シカルボニルアミノヘキシルアミノカルボニル）ブチ
ル〕−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。 ＨＤ１の製造で中間体として生成された酸塩化物を、Ｈ
Ｄ２の製造の工程１に記載の方法により、Ｎ−ベンジル
オキシカルボニル−１，６−ヘキサンジアミンで処理し
たところ、保護アミン７．５ｇ、収率８５％が得られ
た。

【００４６】パートＢ：パートＡの保護アミンを、ＨＤ
２の製造の工程１、パートＢの方法により臭化水素酸−
酢酸で処理したところ遊離アミンが得られ、精製するこ
となくそれを工程２に用いた。

【００４７】工程２：３−｛４−〔６−（３−カルボキ
シプロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。 この化合物を、ＨＤ２の製造の工程２と同様の方法を用
いて製造した。Ｃ₃₀Ｈ₃₈Ｎ₄ Ｏ₆ についての分析計算
値：Ｃ，６５．４４；Ｈ，６．９６；Ｎ，１０．１７。
実測値：Ｃ，６３．２６；Ｈ，７．０１；Ｎ，９．３
９。

【００４８】工程３：ＨＤ３：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４９】

【化９】

【００５０】この物質を、ＨＤ２の製造の工程３の方法
を用いて製造したところ、生成物２．６ｇを得た（収率
８０％）。融点１３３〜１３４℃。Ｃ₃₄Ｈ₄₁Ｎ₅ Ｏ₈ に
ついての分析計算値：Ｃ，６３．０５；Ｈ，６．３８；
Ｎ，１０．８１。実測値：Ｃ，６２．９１；Ｈ，６．４
１；Ｎ，１０．６９。

【００５１】バルビツレート薬物類似体 以下の例４〜８は、フェノバルビタールについてのバル
ビツレート薬物ハプテン類似体の製造を具体的に説明す
るものである。一般的には、この類似体は、（１）バル
ビツレート誘導体、例えばフェノバルビタールを、ω−
ハロアルカンカルボキシレートエステルと縮合させる工
程、（２）前記エステルを、対応する酸にケン化させる
工程、（３）前記酸を、対応する酸塩化物に転化させる
工程、（４）前記酸塩化物をＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドと縮合させるか又は更に長い連結鎖を得るために、
アミン又はヒドロキシ基の１つが保護されたジアミン、
ジオール又はアミノアルコールと縮合させる工程、及び
（５）保護基を除去し、ジカルボン酸、例えばコハク酸
と縮合させ、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミドと縮
合させて、類似体を製造する工程、により製造される。

【００５２】所望であれば、半分保護されたジアミン、
ジオール又はアミノアルコールと縮合させ、次いで別の
二酸を１回又は２回以上繰り返して、連結鎖を更に長く
することできる。しかしながら、より長い鎖の二酸、ジ
オール、ジアミン、アミノアルコール又はハロアルカン
カルボキシレートエステルを用いることにより、より少
ない工程で同様の製造が達成できる。

【００５３】例４−ＰＢ１：５−エチル−５−フェニル
−１−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブ
チル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジン
トリオンの製造。

【００５４】工程１：５−エチル−６−ヒドロキシ−３
−（４−メトキシカルボニルブチル）−５−フェニル−
２，４（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオンの製造。 ジクロロメタン（５００mL）中のフェノバルビタール
（４６．５ｇ，０．２モル）と水酸化テトラブチルアン
モニウム（５００mL、０．２モル、０．４Ｍ水溶液）の
混合物を製造し、そしてそれに５−ブロモ吉草酸メチル
（３９．０ｇ，０．２モル）を添加した。その反応混合
物を一晩（２０時間）激しく攪拌した。この混合物に、
飽和塩化ナトリウム溶液（１００mL）を添加し、有機層
を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン（１００mL
×２）で洗浄した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリ
ウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で乾燥
し、濾過し、そして溶剤を留去した。

【００５５】工程２：３−（４−カルボキシブチル）−
５−エチル−６−ヒドロキシ−５−フェニル−２，４
（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオンの製造。 ジオキサン（５００mL）中の工程１の５−エチル−６−
ヒドロキシ−３−（４−メトキシカルボニルブチル）−
５−フェニル−２，４（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオ
ンエステル（５４．０ｇ，０．１５６モル）、濃塩酸
（５５mL）及び水（５５mL）の混合物を４時間加熱して
還流させ、そして室温で一晩放置した。ジオキサンを減
圧下で留去し、そして飽和塩化ナトリウム溶液（２５０
mL）とジクロロメタン（４００mL）を残渣に加えた。有
機層を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン（１５
０mL×３）で抽出した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナ
トリウム溶液（２００mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で
乾燥し、濾過し、そして溶剤を留去した。残渣にジエチ
ルエーテルを添加し、そしてその混合物を週末の間−１
６℃の冷凍庫に置き、次いで濾過した。

【００５６】工程３：１−（４−クロロカルボニルブチ
ル）−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 工程２からの酸（６．６ｇ，０．２モル）、塩化チオニ
ル（５０mL）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２滴）
及びクロロホルム（８０mL）の混合物を室温で１．５時
間攪拌した。減圧下ロータリーエバポレーターで溶剤を
留去し、そしてこの生成物を次の工程４に直接用いた。

【００５７】工程４：１−〔４−（４−ベンジルオキシ
カルボニル−１−ピペラジニルカルボニル）ブチル〕−
５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，
５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（７５mL）中の工程３の酸塩化物（０．２
モル）を、クロロホルム（１００mL）中のベンジル１−
ピペラジンカルボキシレート（６．０ｇ，０．０３０モ
ル）とトリエチルアミン（４．０ｇ，０．０４モル）の
混合物に１５分間かけて滴下添加した。この混合物を室
温で２０時間攪拌し、次いでジクロロメタン（３００m
L）を添加した。その混合物を１０％塩酸溶液（１００m
L×３）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（１００m
L）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして溶剤を留去した。次いで残渣をＳｉＯ₂ 上で
のクロマトグラフィーにかけて固体を得た。

【００５８】工程５：５−エチル−５−フェニル−１−
〔４−（１−ピペラジニルカルボニル）ブチル〕−２，
４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン臭化
水素酸塩の製造。 工程４からの保護アミン（６．５ｇ，０．０１２モル）
及び３０〜３５％臭化水素−酢酸溶液（３０mL）を室温
で１．５時間攪拌した。次いでその混合物を酢酸エチル
（２Ｌ）中に注ぎ入れ、１時間攪拌し、濾過し、そして
固体を酢酸エチル５００mLで洗浄した。

【００５９】工程６：１−｛４−〔４−（３−カルボキ
シプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（１５０mL）中の工程５のアミン（４．８
ｇ，０．０１モル）、無水コハク酸（１．２ｇ，０．０
１２モル）及びトリエチルアミン（２．２ｇ，０．０２
モル）の混合物を、５０〜６０℃（湯浴）で３０分間加
熱し、そして周囲温度で１６時間攪拌した。ジクロロメ
タン（２００mL）を添加し、混合物を１０％塩酸溶液
（１００mL×３）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液
（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーター中
で溶剤を留去すると、白色固体３．３ｇが得られた（収
率６６％）。この物質をＳｉＯ₂ カラムを用いるクロマ
トグラフィーにかけたところ、白色固体が得られた。

【００６０】工程７：５−エチル−５−フェニル−１−
｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝
−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオ
ンの製造。

【００６１】

【化１０】

【００６２】クロロホルム（７５mL）中の工程６からの
酸（３．４ｇ，０．００７モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（１．６ｇ，０．００８モル）
及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．０ｇ，０．０
０８モル）の混合物を室温で２０時間攪拌した。その混
合物を濾過し、そして酢酸エチル（１００mL）を添加し
た。その有機溶液を水（１００mL×２）で洗浄し、飽和
塩化ナトリウム溶液（５０mL）で洗浄し、無水硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエ
バポレーターで溶剤を留去した。固体の一部をクロマト
グラフィーにかけたところ、白色固体が得られた。

【００６３】例５−ＰＢ２：５−エチル−５−フェニル
−２−（４−スクシンイミドオキシカルボニルブチル−
２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン
の製造。

【００６４】

【化１１】

【００６５】工程２の酸と共に攪拌すること以外は、例
４の工程７の方法を用いてこの物質を製造した。その物
質をエチルエーテル／酢酸エチル（１：１）から結晶化
したところ、白色固体が得られた。

【００６６】例６−ＰＢ３：５−エチル−５−フェニル
−１−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブ
チル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジン
トリオンの製造。

【００６７】工程１：５−エチル−１−〔４−（２−ヒ
ドロキシエチルアミノカルボニル）ブチル〕−５−フェ
ニル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）ピリミジントリ
オンの製造。ベンジル１−ピペラジンカルボキシレート
の代わりに２−ヒドロキシエチルアミンを用いる以外
は、例４の工程４に概説されたようにこの物質を製造し
た。

【００６８】工程２：１−｛４−〔２−（３−カルボキ
シプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（１００mL）中の工程１からの生成物
（２．９ｇ，０．００７モル）、無水コハク酸（０．７
ｇ，０．００７モル）及びジメチルアミノピリジン
（０．９ｇ，０．００７モル）の混合物を湯浴（５０〜
６０℃）中で３０分間加熱し、次いで室温で３日間攪拌
した。ジクロロメタン（３００mL）を添加し、そして混
合物を１０％塩酸溶液（１００mL×２）で洗浄し、飽和
塩化ナトリウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶剤を留去したと
ころ、油状物が得られ、それを次の工程に直接用いた。

【００６９】工程３：ＰＢ３：５−エチル−５−フェニ
ル−１−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕
ブチル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジ
ントリオンの製造。

【００７０】

【化１２】

【００７１】例４の工程７に概略された方法を用いて、
本例の工程２の酸を用いて開始してこの物質を製造し
た。

【００７２】例７−ＰＢ４：５−エチル−５−フェニル
−１−｛４−〔３−（３−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブ
チル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジン
トリオンの製造。

【００７３】工程１：１−〔４−（３−ベンジルオキシ
カルボニルアミノプロピルアミノカルボニル）ブチル〕
−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，３
Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 ベンジル１−ピペラジンカルボキシレートの代わりにＮ
−ベンジルオキシカルボニル−１，３−プロパンジアミ
ンを用いる以外は、例４の工程４に概略された方法を用
いてこの物質を製造し、そして粗製物質を次の工程に用
いた。

【００７４】工程２：１−〔４−（３−アミノプロピル
アミノカルボニル）ブチル〕−５−エチル−５−フェニ
ル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリ
オン臭化水素酸塩の製造。例４の工程５のようにこの物
質を製造した（本例の工程１のアミドを用いて開始し、
エチルエーテル中に注ぎ入れると油状物が得られたこと
を除いて）。

【００７５】工程３：１−｛４−〔３−（３−カルボキ
シプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 本例の工程２からのアミンを用いて開始して酸を得たこ
と以外は、例４の工程６の方法により、この物質を製造
した。

【００７６】工程４：ＰＢ４：５−エチル−５−フェニ
ル−１−｛４−〔３−（３−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕
ブチル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジ
ントリオンの製造。

【００７７】

【化１３】

【００７８】本例の工程３の酸を用いて開始する以外
は、例４の工程７の方法を用いてこの物質を製造した。

【００７９】例８−ＰＢ５：５−エチル−５−フェニル
−１−｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルボ
ニルプロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブ
チル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジン
トリオンの製造。

【００８０】

【化１４】

【００８１】例７の工程１のＮ−ベンジルオキシカルボ
ニル−１，３−プロパンジアミンの代わりにＮ−ベンジ
ルオキシカルボニル−１，６−ヘキサンジアミンを使用
し、そしてその後の工程２，３及び４で各々それからの
反応生成物を用いること以外は、例７の反応順序に従っ
てこの化合物を製造した。

【００８２】

【具体的な態様】本発明者らは、上記で調製したバルビ
ツレート及びヒダントインの新規標識薬物ハプテン類似
体を製造した。それらはバルビツレート及びヒダントイ
ン薬物、特にフェノバルビタール及びフェニトインにつ
いての競合イムノアッセイにおいて有用である。標識
は、競合イムノアッセイにおいて分析物又は分析物類似
体と共に常用される、アミン又はスルフヒドリル基を有
するイムノアッセイ用の標識、例えば酵素、可視色素、
ロイコ色素、蛍光色素及び放射性物質等である。

【００８３】有用な標識は、酵素、例えばアルカリ性ホ
スファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（Ｇ
ＯＤ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）もし
くはアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＨＲ
Ｐ）である。

【００８４】標識薬物ハプテン類似体は、下記工程を含
んで成る新規方法を用いて製造される。 １）求核基、例えばアミン又はスルフヒドリル基を表面
上に担持する標識を、過剰の上記バルビツレート又はヒ
ダントイン薬物ハプテン類似体と接触させる工程。好ま
しくは類似体と標識を水混和性有機溶剤、例えばＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）又は溶剤と水（緩衝化したもの）の混合物に溶解
した後、一緒に混合する工程、及び ２）未使用活性エステル及び縮合副生成物を、好ましく
は透析により取り除く工程。

【００８５】

【実施例】本明細書の以下に提供される実施例は、本発
明の新規標識類似体の製造を実証するものである。標識
類似体は、フェニントイン及びフェノバルビタール薬物
ハプテン類似体を用いて製造した。

【００８６】実施例１−アミン富化ＨＲＰ標識ヒダント
インＨＤ１〔伸長連結鎖を含む；標識ＡＨＲＰ−ＨＤ１
（標識Ａ）〕の製造。

【００８７】ＨＤ１を、１０ mM ４′−ヒドロキシアセ
トアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（ＤＭＦ ４′−ＨＡ）
１．４５２mLに溶解した。

【００８８】アミン富化ＨＲＰを以下のように製造し
た。乾燥ＨＲＰを０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（pH 5.5）に
溶解して、緩衝液１０mL中の最終濃度が２．５×１０^-6
モル（１００mg）となるようにした〔ＭＥＳ＝２−（Ｎ
−モルホリノ）エタンスルホン酸〕。変換係数Ａ₄₀₃ １
mg／mL＝２．２４を用いてＡ₄₀₃ 測定値からタンパク質
濃度を求めた。ＨＲＰ溶液を、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液
（pH 5.5）１０mL中に溶解したＬ−リジン一塩酸塩１．
５×１０^-3モル（２７５mg）と合わせた。新たに調製し
たＭＥＳ緩衝液中の１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、５×１
０^-4モル、９６０mL）の溶液を添加した。容器に蓋を
し、そして室温で一晩混合した。その反応生成物を０．
０２Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（pH 7.0）（３Ｌ、１０℃）に
対して透析した。透析緩衝液を３回変えた。ＭＯＰＳ＝
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸。

【００８９】反応させる前に、アミン富化ＨＲＰの試料
を、３０，０００ＮＭＷＬ（呼称分子量限界カットオ
フ）のCentricells 遠心限外濾過膜を用いて、ＭＯＰＳ
緩衝液から０．１Ｍ ＥＰＰＳ緩衝液（pH 8.0）に交換
した。次いで、この試料を希釈して、最終濃度１０mg／
mLの溶液を得た。

【００９０】アミン富化ＨＲＰ（ＡＨＲＰ）（１mL）を
ジメチルホルムアミド中の４′−ヒドロキシアセトアニ
リドの１０mM溶液（ＤＭＦ ４′−ＨＡ）５００μＬと
渦動攪拌により混合し、次いでそれを４２℃の水浴中に
置いた。乾燥ＤＭＦ−４′−ＨＡ溶液１．４５２mL中に
２１mgのＨＤ１を溶解することにより調製したＨＤ１溶
液（５００μＬ）を、フェニトイン／ＨＲＰのモル比が
５０／１となるように、渦動攪拌により混合しながらＡ
ＨＲＰに滴下添加した。その反応混合物を４２℃の水浴
中で穏やかに振動させながら１時間インキュベーション
した。

【００９１】反応混合物を、更なるＤＭＦ ４′−ＨＡ
／０．１Ｍ ＥＰＰＳ（１：１）０．５mLを用いて反応
容器をすすいだすすぎ液と一緒に、Spectrapor #2 透析
チューブに入れた。

【００９２】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１），pH 8.0に対して４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）２Ｌの０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
む０．１Ｍ ＥＰＰＳ，pH 8.0に対して８℃で１５時
間、 ｄ）２Ｌの０．１Ｍ ＥＰＰＳ，pH 8.0に対して８℃で
３時間、 ｅ）３Ｌの０．０４Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン塩酸塩（トリスＨＣｌ）／０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，pH 7.5に対して８℃で３時間、そしてｆ）透析条
件ｅ）を用いて３時間、もう１回繰り返す。

【００９３】透析後、０．０２％メルチオレート（mert
hiolate ）（商標）を防腐剤として添加し、そしてＡＨ
ＲＰ−ＨＤ１を冷蔵保存した。

【００９４】実施例２−アミン富化ＨＲＰ標識ＨＤ２
〔アミド結合を有する伸長連結鎖を含む；標識ＡＨＲＰ
−ＨＤ２（標識Ｂ）〕の製造。

【００９５】ＨＤ２（１５．５mg）を、１０mM ４′−
ヒドロキシアセトアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（ＤＭＦ
４′−ＨＡ）１．０３１mLに溶解した。

【００９６】標識製造例１に記載されるように製造した
ＡＨＲＰの溶液（１０mg／mL、０．１Ｍ ＥＰＰＳ溶
液, pH 8．0 中、１mL）を、ＤＭＦ ４′−ＨＡ ５０
０μＬと渦動攪拌により混合し、次いでそれを４２℃の
水浴中に置いた。渦動攪拌により混合しながら、上記Ｈ
Ｄ２溶液（５００μＬ）を、モル比が５０／１となるよ
うにＡＨＲＰ溶液に滴下添加した。反応混合物を４２℃
の水浴中で穏やかに振盪させながら１時間インキュベー
ションした。

【００９７】反応生成物をSpectrapor #2 透析チューブ
に入れ、そして以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１）, pH 8.0に対して４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡ含有０．１Ｍ ＥＰＰ
Ｓ, pH 8.0に対して８℃で１．５時間、 ｄ）１．５Ｌの０．１Ｍ ＥＰＰＳ, pH 8.0に対して８
℃で１８時間、 ｅ）１．５Ｌの０．０４Ｍ トリスＨＣｌ／０．１５Ｍ
ＮａＣｌ, pH 7.5に対して８℃で２時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて４時間、もう１回繰り返す。

【００９８】透析後、０．０２％メルチオレートを防腐
剤として添加した。標識ヒダントイン誘導体を冷蔵庫に
保存した。

【００９９】実施例３−ＡＨＲＰ−ＨＤ３〔アミド結合
を有する伸長連結鎖を含む、標識ＡＨＲＰ−ＨＤ３（標
識Ｃ）〕の製造。

【０１００】ＨＤ３（９．２mg）を１０mM ４′−ヒド
ロキシアセトアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（ＤＭＦ ４′
−ＨＡ）１mLに溶解した。

【０１０１】標識製造例１に記載されるように調製した
ＡＨＲＰの溶液を、０．１Ｍ ＥＰＰＳ緩衝液（pH 8.
0）に対して透析した。最終濃度が５．７１mg／mLとな
るようにした。

【０１０２】ＡＨＲＰ（１mL）を渦動攪拌しながらＤＭ
Ｆ ４′−ＨＡ ５００μＬと混合し、次いでそれを４
２℃の水浴中に置いた。上記ＨＤ３溶液（５００μＬ）
を、ＨＤ３／ＡＨＲＰのモル比が５０／１となるよう
に、渦動攪拌により混合しながらＡＨＲＰに滴下添加し
た。反応混合物を４２℃の水浴中で穏やかに振盪させな
がら１時間インキュベーションした。反応混合物を、Ｄ
ＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ（１：１）０．
５mLを用いて反応容器をすすいだすすぎ液と一緒にSpec
trapor #2 透析チューブに入れた。

【０１０３】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１），pH 8.0に対して４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡ含有０．１Ｍ ＥＰＰ
Ｓ，pH 8.0に対して５℃で１５時間、 ｄ）１．５Ｌの０．１Ｍ ＥＰＰＳ，pH 8.0に対して８
時間、 ｅ）２Ｌの０．０２Ｍ ３−モルホリノプロパンスルホ
ン酸（ＭＯＰＳ），pH7.0に対して５℃で１３時間、そ
して ｆ）透析条件ｅ）を用いて２回繰り返す。

【０１０４】透析後、０．０２％メルチオレート（商
標）を防腐剤として添加し、そしてその標識生成物を冷
蔵保存した。

【０１０５】標識バルビツレート薬物ハプテン類似体 以下の実施例は、標識バルビツレート薬物ハプテン類似
体の製造を具体的に説明するものである。

【０１０６】実施例４−アミン富化ＨＲＰ標識ＰＢ２
（標識ＡＨＲＰ−ＰＢ２；標識Ｄ）の製造。 ＰＢ２をＤＭＳＯに溶解して１０．７mg／mL溶液（１．
２５×１０^-2Ｍ）を得た。次いでこの溶液の５００μＬ
を、渦動攪拌により混合しながらアミン富化ＨＲＰ／Ｄ
ＭＳＯ溶液（ＡＨＲＰ／ＤＭＦと同様に調製）に滴下添
加した。フェノバルビタール／ＨＲＰのモル比は５０／
１であった。

【０１０７】２４００rpm で振盪させながら室温で４時
間インキューベーションを行った。その試料をSpectrap
or #2 透析チューブに移し、更に透析液１mLを用いて反
応容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れ
た。標識を０．０２Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液，pH 7.0に対し
て５〜１０℃で透析した。この透析条件を、各回２〜３
Ｌの緩衝液を用いて３回繰り返した。透析後、０．０２
％メルチオレート（商標）を防腐剤として添加し、そし
て標識を冷蔵保存した。

【０１０８】例５−アミン富化ＨＲＰ−ＰＢ３〔伸長連
結鎖を含むＡＨＲＰ−ＰＢ３（標識Ｅ）〕の製造。 アミン富化ＨＲＰを、Centricell遠心限外濾過膜（３
０，０００呼称分子量限界）を用いてＭＯＰＳ緩衝液か
ら０．１Ｍ ＥＰＰＳ緩衝液，pH 8.0へと交換した。次
いでこの試料を４．６mL（０．７４３mg／mL）に希釈し
た。

【０１０９】ＨＲＰ１mLを小バイアルに入れた（１．８
５×１０^-5Ｍ）。１０mM ４′−ヒドロキシアセトアニ
リドを含むジメチルホルムアミド（Ardrich 22,705-6）
（ＤＭＦ ４′−ＨＡ）５００μＬをバイアルに添加
し、渦動攪拌により混合し、そして４２℃の水浴に置い
た。

【０１１０】その間に、ＰＢ−３をＤＭＦ ４′−ＨＡ
中に溶解して２．１２mg／mL溶液（３．７０×１０
^-3Ｍ）を得た。この溶液５００μＬを、渦動攪拌により
混合しながら、ＨＲＰ／ＤＭＦ ４′−ＨＡ溶液に滴下
添加した。フェノバルビタール／ＨＲＰのモル比は、１
００／１であった。

【０１１１】水浴中で穏やかに振盪させながら４２℃で
１時間インキュベーションを行った。試料を、反応容器
をすすぐのに使った追加のＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１
モルＥＰＰＳ（１：１）１mLと一緒にSpectrapor #2 透
析管に移した。

【０１１２】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１），pH 8.0に対して４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡ含有０．１Ｍ ＥＰＰ
Ｓ，pH 8.0に対して５℃で一晩、 ｄ）１．５Ｌの０．１Ｍ ＥＰＰＳ，pH 8.0に対して５
℃で８時間、 ｅ）２．０Ｌの０．０２Ｍ ＭＯＰＳ，pH 7.0に対して
５℃で少なくとも８時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を２回繰り返す。

【０１１３】透析後、０．０２％メルチオレート（商
標）を防腐剤として添加し、そして標識生成物を冷蔵保
存した。

【０１１４】例６−アミン富化ＨＲＰ−ＰＢ１〔標識Ａ
ＨＲＰ−ＰＢ１（標識Ｆ）；アミド結合を有する伸長連
結鎖を含むフェノバルビタールハプテン類似体の活性エ
ステル〕の製造。

【０１１５】製造したアミン富化ＨＲＰを、０．１Ｍ
ＥＰＰＳ緩衝液，pH 8.0へと緩衝液交換して１０mg／mL
の溶液（２．５×１０^-4Ｍ）を得た。標識Ｆは、アミン
富化ＨＲＰ５mL（５０mg）を用いて製造した。磁気攪拌
プレート上で攪拌しながら、２．５mLのＤＭＳＯをゆっ
くり添加した。その溶液を室温で１５分間攪拌した。

【０１１６】その間に、ＰＢ１をＤＭＳＯに溶解して１
４．９mg／mL溶液を得た。この溶液２．５mLを、攪拌下
でゆっくりＨＲＰ／ＤＭＳＯ溶液に添加した。フェノバ
ルビタール／ＨＲＰのモル比は５０／１であった。

【０１１７】２４００rpm で振盪させながら室温で５時
間インキュベーションを行った。その試料を、反応容器
をすすぐのに使った追加の透析液と一緒にSpectrapor #
2 透析管に移した。標識を０．０２Ｍ ＭＯＰＳ緩衝
液，pH 7.0に対して５〜１０℃で透析した。この透析条
件を、各回３Ｌの緩衝液を用いて３回繰り返した。透析
後、０．０２％メルチオレート（商標）を防腐剤として
添加し、そして標識を冷蔵保存した。

【０１１８】免疫応答性 以下の実施例は、上記標識Ａ〜Ｆの免疫応答性を具体的
に示すものである。

【０１１９】実施例７−標識ＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識
Ａ）の免疫応答性 本例では、標識製造例１からのＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識
Ａ）を結合する、数種の固定化抗体（ＤｉｌＡｓ₈ ，Ｄ
ｉｌＡｓ₉ ，ＤｉｌＡｓ₁₄，ＤｉｌＡｓ₁₆及びＤｉｌＡ
ｓ₂₁）の能力を調べる。

【０１２０】（ａ）ポリマービーズ試料（各試料には、
上述した種類の抗体の１つが共有結合されている）を、
１９８７年８月３日に出願された米国特許出願第０８
１，２０６号明細書（ＥＰ公開第８８ ３０７１７２．
２号）に記載された方法及び材料を用いて製造した。

【０１２１】（ｂ）ＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識Ａ）を結合
する固定化抗体の能力を以下のように測定した。各種の
抗体ビーズを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで系列希釈し
て、５００〜０．５ｎＭの抗体バインディング部位の濃
度となるようにした。ビーズ希釈液を、同容量の１０×
１０^-11 Ｍの標識と混合した。１時間インキュベーショ
ン後、遠心によりビーズをペレットにした。上清の試料
（１００μＬ）を、基質（ｏ−フェニレンジアミン／Ｈ
₂ Ｏ₂ ）１００μＬと混合した。４５０nmでの発色速度
を標準のものと比較して、溶液中に残存するフェニトイ
ン−ＨＲＰ標識の量を計算した。試験した最大抗体濃度
（２５０ｎＭの結合部位）において固定化抗体に結合し
た標識の量を報告する。

【０１２２】

【表１】

【０１２３】上記結果は、これらの抗体がＡＨＲＰ−Ｈ
Ｄ１標識（標識Ａ）を非常に良く認識することを示して
いる。

【０１２４】例８−ＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）の加水
分解安定性。 本例は、標識とフェニトイン核の間の連結鎖中にアミド
結合を有する本発明の標識フェニトイン誘導体〔ＡＨＲ
Ｐ−ＨＤ２（標識Ｂ）〕の加水分解安定性を具体的に説
明するものである。

【０１２５】固定化 Kallestad（カレスタッド）抗体が
固定化されたビーズは、１９８７年８月３日に出願され
た米国特許出願第０８１，２０６号明細書（公開ＥＰＡ
８８ ３０７１７２．２）に記載の通りに調製した。

【０１２６】ＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）を、pH 7.3又
は8.5 に調整した１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで中に１×１０
^-10 Ｍとなるまで希釈した。その標識を室温で６日間イ
ンキュベーションした。２日後及び６日後に、固定化抗
体による結合について、以下のように標識を試験した。

【０１２７】Kallestad 52-2 抗体ビーズを、１％ＢＳ
Ａ含有ＰＢＳで系列希釈して、５００〜０．５０ｎＭ抗
体結合部位濃度となるようにした。ビーズ希釈液を同容
量の１０×１０^-11 Ｍの標識と混合した。１時間インキ
ュベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。
上清の試料（１００μＬ）を基質（ｏ−フェニレンジア
ミン／Ｈ₂ Ｏ₂ ）１００μＬと混合した。速度を標準の
ものと比較して、溶液中に残存する標識の量を計算し
た。試験した最大抗体濃度（２５０ｎＭ結合部位）にお
いて固定化抗体に結合した標識の量を報告する。

【０１２８】

【表２】

【０１２９】これらの結果は、連結鎖中にアミド結合を
含むＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）の結合が、この時間に
渡って全く分解を示さなかったことを示す。これは、標
識Ｂが加水分解による分解に耐性であろうことを示す。
このような加水分解は、時間の経過と共にアッセイ応答
の変化を引き起こし得る。

【０１３０】実施例９−吉草酸エステルと伸長連結鎖を
用いて製造されたフェノバルビタール−ＨＲＰ標識の比
較。 本例では、吉草酸エステル連結鎖を有する標識（標識
Ｄ、ＡＨＲＰ−ＰＢ２）及び伸長連結鎖を有する標識
（標識Ｆ、ＡＨＲＰ−ＰＢ１）を結合する、数種の固定
化抗体（Kallestad 1571及びＰｂＡｓ₉ ）の能力を比較
した。

【０１３１】固定化抗体ビーズ試料を以下のようにして
製造した。ポリマービーズ（３０mg）〔ポリ（スチレン
−コ−Ｐ−ビニルベンジル２−クロロエチルスルホン）
（モル比９５：５）〕を、緩衝液（０．１Ｍ ＥＰＰ
Ｓ、pH 8.5）１mL中に分散し、そして抗体（Ｋａｌｌ
１５７１又はＰｂＡｓ₉ ）０．３mgを添加した。総容量
を１．５mLにした。混合物を室温で４時間転倒回転させ
た。次いでＢＳＡの１０％溶液０．３mLを添加し、そし
て上清を除去し、抗マウスＩｇＧを用いて未結合抗体に
ついて分析した。表面上に結合した抗体の量をＥＬＩＳ
Ａを用いて計算した。ＰＢＳ（pH 7.2）を使って、ペレ
ットを緩衝液中に再懸濁しそして遠心分離することによ
り３回洗浄した。最終再分散液はＰＢＳ１．８mL中であ
り、メルチオレート（商標）を０．０２％の濃度になる
ように添加し、そして生成物を使用するまで４℃で保存
した。

【０１３２】標識を結合する固定化抗体の能力を以下の
ように測定した。各種の抗体ビーズを、１％ＢＳＡ含有
ＰＢＳで系列希釈して、２００〜０．５０ｎＭ抗体結合
部位濃度となるようにした。ビーズ希釈液を、同容の１
０×１０^-11 Ｍのフェノバルビタール−ＨＲＰ標識と混
合した。１時間インキュベーション後、遠心分離により
ビーズをペレットにした。上清の試料（１００μＬ）を
基質（ｏ−フェニレンジアミン／Ｈ₂ Ｏ₂ ）１００μＬ
と混合した。４５０nmでの発色速度を標準のものと比較
して、溶液中に残存するフェノバルビタール−ＨＲＰ標
識の量を計算した。試験した最大抗体濃度（１００ｎＭ
結合部位）において固定化抗体に結合した標識の量を報
告する。

【０１３３】

【表３】

【０１３４】

【発明の効果】これらの結果は、本発明により提供され
る標識薬物ハプテン類似体に対する抗体の認識の改良を
示す。少なくとも６５％の標識薬物ハプテン類似体が、
過剰の固定化バルビツレート又はヒダントイン抗体によ
って結合されうる。伸長連結鎖を有する標識類似体、特
に連結鎖中にアミド結合を有するものは、本発明を実用
のものに変える際に用いられるどんなタイプの固定化抗
体によっても、同様に結合される。伸長連結鎖中にアミ
ドを有する誘導体類は、加水分解に対しても非常に安定
である。上記ヒダントイン誘導体の使用により、幾つか
の利点が認められる。ヒダントイン核又はフェノバルビ
タール核と活性エステル基の間に短い連結鎖を有するこ
れらのヒダントイン誘導体の活性エステルは、幾つかの
固定化抗体と共に使われる許容される酵素標識を製造す
るのに十分な程にＨＲＰと反応性であった。活性エステ
ル基とヒダントイン核の間に８〜２０個の原子から成る
長い連結基（Ｒ² と角括弧中の基）を有する誘導体は、
試験した全ての固定化抗体により結合できる標識を提供
した。各Ｚが、隣接するカルボニルと共にアミド基を形
成する−ＮＲ−であるような連結鎖は、加水分解に対し
て耐性である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーシャ ディー．ベイル エーニック アメリカ合衆国，ニューヨーク 14610, ロチェスター，サン ガブリエル ドラ イブ 44 (72)発明者 イグナツィオ サルバトーレ ポンティ チェロ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，コッパー ウッズ 21 (72)発明者 デビッド アラン ヒルボーン アメリカ合衆国， ニューヨーク 14467，ヘンリエッタ，サザーランド ヒルズ サークル 10 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記構造式（Ｉ）で表される標識薬物ハ
   プテン類似体： 【化１】 上式中、「標識」は、アミン又はスルフヒドリル基を有
   するイムノアッセイに用いられるタイプの標識であり、 Ａは下式のヒダントイン核： 【化２】 又は下式のバルビツレート核： 【化３】 を表し、 Ｒ ₁ は、各々独立して、水素、炭素原子数１〜
   １０のアルキル、又はフェニルを表し、 Ｒ ₂ は、Ｃ ₁ 〜Ｃ ₁₀ アルキレン基又は１以上のエステル
   基、アミド基、−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲ−（Ｒは
   水素もしくはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルを表す）によって中断さ
   れたＣ ₁ 〜Ｃ ₁₀ アルキレン基を表し、 Ｒ ₄ 、Ｒ ₅ 及びＲ ₆ は、各々独立に、Ｃ ₁ 〜Ｃ ₁₀ アルキレン
   基又はエステル基、アミド基、−Ｏ−、−Ｓ−もしくは
   −ＮＲ−（Ｒは水素もしくはＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルを表す）
   によって中断されたＣ ₁ 〜Ｃ ₁₀ アルキレン基、又はフェ
   ニレン基を表し、 Ｒ ₃ はＣ ₁ 〜Ｃ ₃ アルキレンを表し、 Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲ−（Ｒは水素もしく
   はＣ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルを表す）を表し、 ｍは０，１又は２であり、 ｎは０，１又は２であり、 ｍ＋ｎ＞０であり、そして ｍ、ｎ及びＲ ₂ に含まれる原子の総数は５〜４０である
   が、但し （１）Ｒ ₁ 基の少なくとも一つはフェニルであり、且つ （２）上記構造式（Ｉ）の括弧内の成分はいずれの順序
   で存在してもよい 。