JPH03289564A - プラバスタチンの免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体液中に含まれるプラバスタチンの測定方
法に関する。

〔従来技術〕

プラバスタチンナトリウムは下記式（１）で表わされる
化合物であり、抗高脂血症薬として用いられている（三
共研究所年報並、１−３８．（１９８８））　。

このものを投与したのちの体内動態を明らかにするため
には、生体液中のプラバスタチンの量を測定することが
必要であるが、従来にガスクロマトグラフィー・マスス
ペクトロメトリー法またはＨＰＬＣ法による測定が可能
であるだけであり、操作が煩雑で多数の検査試料を同時
に測定することは困難であった。

筒便な操作により多数の検査試料を同時に測定するため
には、プラバスタチンに対する抗血清をｍｌして免疫化
学的方法によることが好ましいが、その調製のためには
免疫原性を増大するためにプラパスクチンをキャリヤー
蛋白質に結合し、該結合体をハプテン免疫原として動物
に感作する必要がある。プラバスタチンをキャリヤー蛋
白質に結合させたものをハプテン免疫原として用いる場
合には、 ■ブラバスタチンが、主に、３′、５′、６′および４
　／　３位に代謝を受けること、■カルボキシル基以外
には直接に蛋白質とのアミド結合の形成を果たす官能基
がないこと、等の理由により、１位のカルボキシル基を
結合点とすることが望ましい。しかしながら、５位に存
在する水酸基が、１位のカルボキシル基と蛋白質のアミ
ノ酸との反応条件下においてはラクトン化を引き起こし
てしまうので、目的の免疫原性を有する結合体を得るこ
とは困難であった。

さらに、抗血清を調製した後に、プラバスタチンを免疫
化学的方法により測定する際に、プラバスタチンに酵素
蛋白質を標識した標識抗原を用いることが有効であるが
、この標識抗原の調製においても、上記と同じ理由によ
りプラバスタチンを用いて目的の抗原性を有する標識抗
原を得ることには困難な点があった。

〔発明が解決する課題〕

本発明者らは、プラバスタチンの５位の水酸基を水素に
置換した５−デヒドロキシプラバスタチンを合成し、キ
ャリヤー蛋白質と結合させることにより、上記の免疫原
［を有するハプテン免疫原を得て、このものを動物に感
作してプラバスタチンに高い親和性と特異性を有する抗
血清が得られることを見出し、また、同様の操作で５−
デヒドロキシプラバスタチンを酵素蛋白質に結合するこ
とにより、目的の抗原性を有する標識抗原が得られるこ
とを見出し、本発明を完成した。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明は、 免疫原として５−デヒドロキシプラバスタチンを用いて
抗血清を調製し、抗原プラバスタチンを測定する方法で
あって、 （イ）該抗血清の調製は、 ■５−デヒドロキシプラバスタチンをキャリヤー蛋白質
に結合し、 ■該結合体をハプテン免疫原として動物に感作すること
により成り、 （ロ）抗原プラバスタチンの測定は、 ■酵素で標識した標識抗原５−デヒドロキシプラバスタ
チン及び測定すべき抗原プラバスタチンを該抗血清と競
合反応させ、 ■該抗血清中に存する抗体が結合した標識抗原と該抗体
が結合していない標識抗原を分離し、■該抗体が結合し
た標識抗原の酵素活性を測定して、別に抗原プラバスタ
チンについて同様に操作して作成した標準曲線により、
測定すべき抗原プラバスタチンの量を求めることから成
る、ブラバスタチンの免疫化学的測定方法に関するもの
である。

５−デヒドロキシプラバスタチンをキャリヤー蛋白質に
結合することは、公知の方法（石川ら、「酵素免疫測定
法、第３版」１４３〜１５１頁、医学書院）に基づいて
行なうことができる。結合反応の前に、５−デヒドロキ
シプラバスタチンを活性エステルに導くことが必要であ
り、この操作により、キャリヤー蛋白質のアミノ基と反
応することが可能になる。未反応の活性エステルは透析
操作により除去する。キャリヤー蛋白質は、可溶性の蛋
白質を用いることが好ましく、特に、牛血清アルブミン
が好適に用いられる。

該結合体をハプテン抗原として動物に感作する方法は、
皮下注射等の常法による。動物は、ウサギ、マウス、ヒ
ツジ、ウマ等、通常免疫に用いられうるものならばいず
れのものも用いることができるが、特に、ウサギが好適
である。

５−デヒドロキシプラバスタチンを酵素で標識すること
は、上記と同様の方法に基づいて行なうことができる。

標識に用いる酵素は、ホースラディツシュパーオキシダ
ーゼやβ−ガラクトシダーゼ等、通常の酵素免疫測定法
に用いられるものならばいずれのものも用いることがで
きるが、特に、ホースラディツシュパーオキシダーゼが
好適に用いられる。

該標識抗原と測定すべき抗原プラバスタチンとの競合反
応は、通常３〜４０℃にて行なわれ得るが、好適には４
℃にて行なわれる。

測定すべき抗原プラバスタチンの検査試料としては、血
漿、尿、その他の生体液等のいずれのものも用いられう
る。

該抗血清中に存する抗体が結合した標識抗原と該抗体が
結合していない標識抗原を分離することは、固相法、液
相法のいずれによっても可能である。液相法による場合
は、二抗体法が好適であり、二次抗体としては前記の抗
血清に対する抗体や抗血清、又はプロティンＡを含有す
る死菌や樹脂等が用いられうる。

該抗体が結合した標識抗原の酵素活性を測定して、抗原
プラバスタチンの標準曲線を求めることは、公知の方法
（細田ら、Ｃｈｅｓ＋、Ｐｈａｒａｉ、Ｂｕｌｌ、　３
４４１７７−４１８２．　（１９８６つにしたがって行
なうことができる。

本発明のもっとも好ましい態様としては、キャリヤー蛋
白質として牛血清アルブミンを用い、動物としてウサギ
を用い、酵素としてホースラディツシュパーオキシダー
ゼを用いる上記測定方法である。

〔実施例〕

以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれに限定されない。

５−デヒドロキシプラバスタチンー牛血清アルブミン（
第１図−〇の）の合成は、第１図のフローチャートに従
って行なった。以下に詳細を記す。

■３，６′ジ（ｔ−ブチルジメチルシリル）ブラバスタ
チンメチルエステル（第１図−（４））の合成プラバス
タチンラクトン（第１図−（２）：特公昭６３−２１６
７２号）２．０３ｇおよびイミダゾール０．８２ｇを含
有するジメチルホルムアミド溶液１０ｍｊ＋に、水冷下
で、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド１．８１ｇを含
有するジメチルホルムアミド２ｍｌの溶液を滴下し、室
温で１２時間撹はんした。

反応液を水に注ぎ酢酸エチルで抽出し、抽出液を水洗後
無水硫酸ナトリウムで乾燥した、濃縮後シリカゲルカラ
ム（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０：メルク社製以下同じ。

）にてカラムクロマトグラフィー（溶離液ｉ酢酸エチル
：ヘキサン＝２：８）を行ない、ブラバスタチンのジシ
リル体（第１図−（３））を得た。

得られたジシリル体をアセトニトリル２５＋ｊ！と水２
０ｍ１！に溶解し、ＩＮ−水酸化ナトリウム水溶液５Ｉ
１１１を加え室温下３０分撹拌した０反応液を希塩酸で
酸性とし、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗し、無
水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧下で濃縮した。残渣をジ
アゾメタン−エーテル溶液で処理し濃縮後、シリカゲル
カラム（溶離液；酢酸エチル：へ牛すン＝５：９５〜３
０ニア０）で精製し、プラバスタチンのメチルエステル
体（第１図−（４））３．０ｇを得た。

”ＨＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤＣｌ　ｓ）　Ｓ　ｐｐｒｎ　：５
．９８（１８，ｄ、Ｊ＝９．９Ｈｚ）、　５．８５（Ｉ
Ｈ，ｄ、ｄ、Ｊ＝５．９．９９Ｈｚ）。

５．４６（１Ｎ、ブロード）、５．３８（ＩＨ，ブロー
ド）、３．６８（３）１゜５）、２．７０（ＩＨｄ、Ｊ
＝２．９Ｈｚ）、１．１２　（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝１１．７
）、０．８９（６Ｈ，Ｓ）　、　０．８８　（６Ｈ，Ｓ
）　、　０．１１　（３Ｈ，Ｓ）　、　０．０９　（３
Ｈ，Ｓ）　、　０．０７（３Ｈ、Ｓ）　、　０．０５　
（３Ｈ、Ｓ）■３．６′−ジ（ｔ−ブチルジメチルシリ
ル）−５−デヒドロキシプラバスタチンメチルエステル
（第１図−（６））の合成 ３．６′−ジ（ｔ−ブチルジメチルシリル）プラバスタ
チンメチルエステル（第１図−（４））　７６０■をピ
リジン７　ｒａｉｌに溶解後メタンスルフォニルクロリ
ド０．４４ｍｆ氷冷下加え九０室温で３時間撹拌後ピリ
ジンを減圧下で留去し酢酸エチルを残渣に加え、水洗し
た。無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮しシリカゲル
カラム（溶離液；ベンゼン：酢酸エチル＝１０：Ｏ〜９
：１）で精製し、３．６′−ジ（ｔ−ブチルジメチルシ
リル）−５−メタンスルフォニルオキシブラバスタチン
メチルエステル８２５■を得た。得られた３、６′ジ（
ｔ−ブチルジメチルシリル）−５−メタンスルフォニル
オキシブラバスタチンエステル８２５■をジメチルフォ
ルムアミド８　ｍｌに溶解し塩化リチウム８２５■とへ
キサメチルホスフォリンクトリアミド２　ｍｌを加え室
温で１２時間撹拌した。

反応液に酢酸エチルを加え、水洗酸無水硫酸ナトリウム
で乾燥し、シリカゲルカラム（溶離液；ヘキサン：酢酸
エチル＝９８：２〜７５：２５）で精製し、３，６′−
ジ（ｔ−ブチルジメチルシリル）−５−クロロブラバス
タチンメチルエステル（第１図−（５１）５３６ｍｇを
得た。

得られたクロル体（第１図−（５１）５３６■とα。

α′−アゾビスイソブチロニトリル２５．８■をベンゼ
ン５　ｍｌに溶解し、水素化トリーｎ−ブチルスズ０．
４２３ｍ　ｌを加え１時間加熱還流し減圧濃縮後シリカ
ゲルカラムクロマト（溶離液；ベンゼン：酢酸エチル＝
１００：Ｏ〜９５：５）で精製し３゜６′−ジ（ｔ−ブ
チルジメチルシリル）−５−デヒドロキシプラバスタチ
ンメチルエステル（第１図−（６））４７３■を得た。

’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤＣｌ　３）δｐｐｍ　：５．９
７（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝９．９）１ｚ）、　５．８４（ＩＨ
，ｄ、ｄ、Ｊ−５，９，９，９Ｈｚ）。

５．４６（ＩＨ，ブロード）、５．３３（ＩＨ，ブロー
ド）、３．６７（３Ｈ。

Ｓ）　、　１．１２（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝７．０）　、０．
８９（９Ｈ，Ｓ）　、０．８５（９Ｈ，Ｓ）　。

０．０７（３ＨＳ）、０．０５（３Ｈ，Ｓ）、０．０４
（３Ｈ，Ｓ）、０．０２（３Ｈ，Ｓ）■５−デヒドロキ
シプラバスタチンナトリウム塩（第１図−（８））の合
成 ３．６′−ジ（ｔ−ブチルジメチルシリル）５−デヒド
ロキシプラバスタチンメチルエステル（第１図−（６）
）　２．０　ｇを７１．４ｍｆのテトラヒドロフラン７
１．４ｍｊｌ！に溶解し、１モル濃度のテトラブチルア
ンモニウムフロリドのテトラヒドロフラン溶液３０．７
ｍｆと酢酸３．６ｍｊ２を加え、室温で１２２時間、５
０°Ｃで７時間攪拌した。反応液に酢酸エチルを加え、
炭酸水素ナトリウムに水溶液で洗浄後、水洗し、無水硫
酸ナトリウムで乾燥した。ろ過酸、減圧濃縮し、残渣を
シリカゲルカラム（溶離液；メチレンクロリド：メタノ
ール＝９９：１〜９４：６）で精製し、５−デヒドロキ
シプラバスタチンメチルエステル（第１図−（７））７
３０■を得た。

得られたデヒドロキシニスエル（第１図−（７））１０
０■をアセトニトリル５　ｃａｌに溶解しＩＮ水酸化ナ
トリウム水溶液０．３６ｍｊ２を加え、室温で１時間攪
拌した。反応液は減圧下アセトニトリルを留去し、ＣＨ
Ｐ−２０Ｐカラム（三菱化成■製、溶離液；水：アセト
ン＝１００：Ｏ〜８５：１５）で精製し、５−デヒドロ
キシプラバスタチンナトリウム塩（第１図−（８））９
３＋ａｇを得た。

’　Ｈ−Ｎ　ＨＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ５．９４
（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝９．８Ｈｚ）、　５．８４（ＩＨ，ｄ
、ｄ、Ｊ＝５．９，９．８Ｈｚ）＋５．２０（ＩＨ，ブ
ロード）、４．１４（ＬＨ，ｍ）、３．０６（ＩＨ，ｍ
）、１．０３（３８，ｄ　、　Ｊ＝６．８）１ｚ）　、
　０．８３　（３Ｈｄ、　Ｊ＝６．８Ｈｚ）　、　０．
８２　（３）１　、　ｔ＋Ｊ・７．３Ｈｚ） ■５−デヒドロキシプラバスタチンーＢＳＡ（第１図−
００））の合成 ５−デヒドロキシプラバスタチンナトリウム塩（第１図
−（８））１００ｍｇを水１　ｍｆ！、に溶解し、ＩＮ
塩酸０．２４ｍ１を加え減圧濃縮した。得られたカルボ
ン酸をアセトニトリル６　ｍｌとトリエチルアミン３３
．６ｍｊ２に溶解し、ジスクシンイミジルカーボネー）
　６１．４■を加え、室温で１時間攪拌した。反応液に
酢酸エチルを加え、水洗し無水硫酸ナトリウムで乾燥、
減圧濃縮後シリカゲルカラム（溶離液；メチレンクロリ
ド：メタノール＝９５：５）で精製し５−デヒドロキシ
プラバスタチンスクシンイミジルエステル（第１　図−
（９））　９２．７■を得ノこ。

’　　Ｈ−Ｎ　　Ｍ　　Ｒ（ｃｏｃ　１　３）　　　　
δ　ｐｐｍ：６．００（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ）、
　　　５．９０（ＩＨ，ｄ、ｄ、Ｊ＝４．０，９．５Ｈ
ｚ）。

５．５５（１Ｂ、ブロード）、４．３９（ＬＨ，フロー
ト）、４．１１（ＩＨ。

ブロード）、２．８６（４Ｈ，Ｓ） 得られた５−デヒドロキシプラバスタチンスクシンイミ
ジルエステル（第１図−（９））　１５．２■をピリジ
ン３０ｍ１に溶解し、水冷下５０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ
Ｈ７，４）　　３　ｒａｎに溶解させたＢ　ＳＡ６７ｍ
ｇを加えた。７時間攪拌後５−デヒドロキシプラバスタ
チンーＢＳＡ（第１図−００））を得た。反応液に５０
ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，４）　　６　ｍ　１．を加
え、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：水ｚ４：６の溶
液１！中で２回、水１！中で２回、０．９％ＮａＣ１溶
液で１回透析後、０．９％ＮａＣ１溶液３３．５ｍＩ！
。

に希釈した。

実施例２五１潅■且製 実施例の調製は、中部らの方法（中部ら、「新基礎生化
学実験法６．生物活性を用いる測定法ＪＰ１１６−１２
７．）によった。実施例（１）で得られた抗原をフロイ
ントの完全アジュバントと等量混合エマルジョンとし、
雄性日本白色ウサギの足しょ部および背部皮下に、１回
の感作量を１■タンパク／羽とし、隔週に４力月にわた
り感作した。最終感作１０日後に心臓採血を行い、室温
で６時間放置後、３０００ｒｐｍ、　１０分間の遠心に
より抗血清を得て、４゛Ｃにて保存した。

実施例（１）記載の化合物（第１図−（９））のジオキ
サン溶液（３，８ｍｇ／ｍｆ　）　０．２　ｍＪｌ！を
、５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，３）にて溶解したＨ
ＲＰ　（東洋紡■製ｇｒａｄｅ　Ｉ−Ｃ，５ｍｇ／　ｍ
ｌ２　）　０．４　ｍｌに水冷下加え、４　’Ｃにて４
時間攪拌した。ついで５ｏ％ＤＭＦ５００　ｍＥ、３０
％ＤＭＦ５００ｍｆおよび等張リン酸塩緩衝液（ＰＨ７
，４：以下ＰＢＳという）　５００ｍ１で２回透析し、
未反応の活性エステルを除去した。得られた標識体は酵
素タンパク量として５００　ｍｇ／　ｍｌ濃度で４°Ｃ
にて保存した。

実施例（４）血路　ブーバス　チンの 実施例（３）にて得られた標識抗原を酵素タンパク量と
して５０ｍｇ／ｎ＋ｐ、となるように、０．５％正常ウ
サギ血清（■第一ラジオアイソトープ研究所）を含む緩
衝液Ａ（０，１％ゼラチンを含むＰＢＳ）にて希釈し、
スピッツ管に０．Ｉｎ／！分注した。ついで既知量のプ
ラバスタチンを含有した検量線用血漿もしくはプラバス
タチン濃度を測定すべき血漿試料を緩衝液Ａにて１０倍
希釈したものを０．１ｍ２加えた。さらに実施例（２）
にて得られた抗血清を緩衝液Ａにて４０万倍希釈したも
のを０．１ｍｌ２加え、混和後４°Ｃにて４時間放置し
た。

ついで０．３％エチレンジアミン四酢酸・２Ｎａを含む
緩衝液Ａにて３０倍希釈したヤギ抗ウサギイムノグロブ
リンＧ抗血清（■第一ラジオアイソトープ研究断裂：０
．１ｍｌ２）を加え、混和後４°Ｃにて１６〜２４時間
放置した。上記反応終了後ＰＢＳ（１，５ｍ１）を加え
混和し、４°Ｃ、２５００ｒｐｍにて１０分間遠心して
、上清を吸引除去した。再び同様の操作を行い免疫沈降
物を得た。酵素活性の測定は、以下のように行った。０
．０１％３．３′５．５′−テトラメチルベンチジン（
東京化成工業■製）を含有する。５０ｍＭ酢酸−クエン
酸緩衝液（ＰＨ５，５，３％ジメチルスルホキシドおよ
び０．００２％ＨｚＯｚを含む）２ｍｌ２を加え、混和
後３７°Ｃにて３０分振とう保温した−　０．５　Ｍ　
ＨｚＳＯ４を２　ｍｌ添加して酵素反応を停止し、４５
０ｎｍの吸光度を測定することにより酵素活性を算定し
た。プラバスタチンの検量線は６００ｐｇ〜２００ｎｇ
／ｍｆｆ１の範囲で良好なものが得られ、Ｂｏの標準偏
差（Ｘ２．ｎ−１０）より求めた検出限界は６００　ｐ
ｇ／ｍｌ　、　！５０％置換点（ＩＣ９゜）はＬｏｎｇ
／ｎｌであった（第２図（１））。

また本発明で得られた抗血清のプラバスタチンに対する
特異性を見るために下記式に示すプラバスタチン血漿中
代謝物であるＲ−４１６，Ｒ−４１８（三共研究所年報
４０１−３８　（１９８８）　）について同様の操作を
行い検量線を作製した（第２図−（２）、　（３））。

牛血清アルブミンの合成のフローチャートを示す。

第２図は、抗血清によりプラバスタチンおよびその血清
中代謝物を測定した検量線を示す。

（Ｒ−４１６）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫原として５−デヒドロキシプラバスタチンを用
   いて抗血清を調製し、抗原プラバスタチンを測定する方
   法であって、 （イ）該抗血清の調製は、 （１）５−デヒドロキシプラバスタチンをキャリヤー蛋
   白質に結合し、 （２）該結合体をハプテン免疫原として動物に感作する
   ことにより成り、 （ロ）抗原プラバスタチンの測定は、 （１）酵素で標識した標識抗原５−デヒドロキシプラバ
   スタチン及び測定すべき抗原プラバスタチンを該抗血清
   と競合反応させ、 （２）該抗血清中に存する抗体が結合した標識抗原と該
   抗体が結合していない標識抗原を分離し、（３）該抗体
   が結合した標識抗原の酵素活性を測定して、別に抗原プ
   ラバスタチンについて同様に操作して作成した標準曲線
   により、測定すべき抗原プラバスタチンの量を求めるこ
   とから成る、 プラバスタチンの免疫化学的測定方法。 ２、キャリヤー蛋白質として牛血清アルブミンを用いる
   、請求項１記載の測定方法。 ３、動物としてウサギを用いる、請求項１記載の測定方
   法。 ４、酵素としてホースラディッシュパーオキシダーゼを
   用いる、請求項１記載の測定方法。