JPH05172814A - イムノアッセイ用標識薬物ハプテン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、下記を含んで成る標識薬物ハプテ
ン類似体に向けられている。 （Ａ）アミンもしくはスルフヒドリル基を有する、イム
ノアッセイに用いられるタイプの標識、（Ｂ）ヒダント
イン核もしくはバルビツレート核より選ばれる薬物ハプ
テン核、及び（Ｃ）薬物ハプテン核の３位をカルボニル
橋を介して標識に連結する連結鎖。 【効果】 抗体により、確実に認識される標識薬物ハプ
テン類似体を提供する。上記標識薬物ハプテン類似体
は、加水分解に対して安定である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床化学、詳細にはイ
ムノアッセイに関する。

【０００２】

【従来の技術】天然の免疫学的反応を利用するイムノア
ッセイは、臨床化学における分析技術として広範な使用
が見い出されている。反応の特異性により、それらは、
生物学的流体中に非常に低濃度で存在する生物学的被検
体を定量する際に特に都合が良い。このような被検体と
しては、例えば、抗体類、治療薬物類、麻酔薬類、酵素
類、ホルモン類及びタンパク質類等が挙げられる。

【０００３】競合バインディングイムノアッセイでは、
免疫適格誘導体類及びリガンドの類似体類を含む標識リ
ガンドが、所定量の適当なバインディング材料（本明細
書ではレセプターと称される）を用いる反応において、
未標識リガンドと競合して存在する。未知濃度のリガン
ドは、結合もしくは未結合（すなわち、遊離）の標識リ
ガンドのどちらか一方のシグナルを測定することより求
めることができる。反応は以下のように進行する。

【０００４】リガンド＋標識リガンド＋レセプター→ リガンド−レセプター＋標識リガンド−レセプター

【０００５】伝統的な標識としては、放射性標識類、酵
素類、色素原類、蛍光団類、安定遊離基類及び酵素のコ
ファクター類、阻害剤類並びにアロステリックエフェク
ター類が挙げられる。

【０００６】前述に矛盾することなく、血清中の薬物誘
導体類（例えば、フェノバルビタール及びフェニトイ
ン）についてのイムノアッセイは、固定化抗体バインデ
ィング部位について、患者血清中の薬物とこのような薬
物の酵素標識類似体との競合に基づくことができる。

【０００７】標識薬物ハプテン類似体（以下、ＬＤＨと
称することが多い）についての特定の必要条件は、１）
少なくとも６５％のＬＤＨが過剰の固定化抗体により結
合されうること；２）固定化抗体についてのＬＤＨの親
和性が、所定量のＬＤＨと薬物との競合が治療に関連し
た薬物濃度範囲で発生するようなものであること；及び
３）保存条件下におけるその酵素標識の加水分解に対す
るＬＤＨの安定性；を含む。

【０００８】薬物ハプテン類似体に課せられる必要条件
は、１）酵素標識との結合後の固定化抗体に対する類似
体の接近しやすさ；２）薬物に対する抗体による、標識
類似体の特異的認識能；及び３）酵素活性に悪影響を与
えない条件下、直接又は酵素もしくは類似体の活性化後
のどちらかに、酵素標識を担持する類似体が有する十分
な反応性；を含む。

【０００９】米国特許第４，７５２，５６８号明細書に
開示されたグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）及びアル
カリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）酵素標識結合フェノバ
ルビタール及びフェニトインハプテン類似体類は、所望
のフォーマットで有効な競合イムノアッセイを遂行する
のに適切な酵素標識類似体を提供した。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】標識として酵素西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いる場合に、上記
特許に開示された標識フェノバルビタール及びフェニト
イン類似体類が、競合イムノアッセイを遂行するのに不
十分であることが課題である。このような類似体とＨＲ
Ｐ間のカプリング反応は、緩慢かつ不完全であった。更
に、フェノバルビタール及びフェニトインＨＲＰ標識は
非常に弱い結合であったので、判読可能なシグナルを得
るのに非常に高濃度の標識もしくは抗体結合部位が必要
とされるであろう。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、本明細書の請
求項１に記載される構造を有する標識薬物ハプテン類似
体を提供する。請求項１の標識薬物ヒダントイン及びバ
ルビツレート誘導体類は、次式に従うものを含む。

【００１２】

【化３】

【００１３】上式中、Ａは、次式のヒダントイン核

【００１４】

【化４】

【００１５】もしくは次式のバルビツレート核を表し、

【００１６】

【化５】

【００１７】Ｒ¹ は、各々独立して、水素、炭素原子数
１〜１０個のアルキル、未置換もしくは置換フェニルを
表し、Ｒ² ，Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、各々独立して、Ｃ
₁ 〜Ｃ₁₀のアルキレンもしくは少なくとも１つ以上のエ
ステル基、アミド基、−Ｏ−，−Ｓ−、又は−ＮＲ─を
割り込ませたこのようなアルキレン基を表し、Ｒ³ は、
Ｃ₁ 〜Ｃ₃ のアルキレンを表し、Ｚは、−Ｏ−，−Ｓ
−、及び−ＮＲ─（ここで、Ｒは、水素もしくはＣ₁ 〜
Ｃ ₆ のアルキル、例えば、メチルプロピル及びヘキシル
を表す）を表し、ｍは、０，１もしくは２でありｎは、
０，１もしくは２でありｍ＋ｎ＞０、そしてｍ，ｎ及び
Ｒ² に含まれる原子の総数が５〜４０であり、標識は、
酵素であり、そして更に、（ｉ）少なくとも１つのＲ¹
基が置換もしくは未置換フェニルであり、（ii）Ｒ⁴ ，
Ｒ⁵ 及びＲ⁶ の１つがフェニレンであってもよく、（ii
i ）構造Ｉの角型括弧成分類が、いずれかの順序でそこ
に表示でき、そして（iv）連結基が、炭素原子数２〜１
２個の飽和もしくは不飽和モノカルボン酸の誘導体以外
のものであることを条件とする。

【００１８】上記定義に従って、Ｒ¹ は、水素、メチ
ル、プロピル、ヘキシル、デシル、未置換フェニルもし
くは炭素原子数１〜６個のアルキル、ニトロ、ハロゲ
ン、シアノ及び炭素原子数１〜６個のアルコキシで置換
されたフェニルで表すことができ、Ｒ² ，Ｒ⁴ ，Ｒ⁵ 及
びＲ⁶ は、各々独立してエチレン、ブチレン、ペンチレ
ン、オクチレンもしくは少なくとも１つ以上のエステル
基、アミド基、−Ｏ−，−Ｓ−、及び−ＮＲ─を割り込
ませたこのようなアルキレンより選ばれるアルキレンを
表し、Ｒ³ は、メチレン、エチレンもしくはトリメチレ
ンを表し、Ｚは、各々独立して、−Ｏ−，−Ｓ−、もし
くは−ＮＲ─（ここで、Ｒは、少なくとも１つの水素、
メチル、プロピルもしくはヘキシルを表す）を表し、そ
して標識は、酵素を表す。

【００１９】標識薬物ハプテン類似体類は、以下に記載
される新規薬物ハプテン類似体類より製造した。

【００２０】それらは一般的に下記を含んで成る。
（ａ）活性エステル基、例えば、スクシンイミドオキシ
カルボニル、（ｂ）ヒダントイン核もしくはバルビツレ
ート核、及び（ｃ）活性エステル基をヒダントイン核も
しくはバルビツレート核に連結する連結鎖（ここで、連
結鎖は、先に定義のとおりである）。

【００２１】より詳細には、本発明の好ましい新規ヒダ
ントイン活性エステル類は、次式に従うものである。

【００２２】

【化６】

【００２３】上式中、Ａ，Ｒ¹ ，Ｒ² ，Ｒ³ ，Ｒ⁴ ，Ｒ
⁵ ，Ｒ⁶ ，Ｚ，ｍ及びｎ並びにそれらに関連する条件
は、先に定義のとおりであり、そしてＲ⁷ は、エチレン
もしくはｏ−フェニレン基である。

【００２４】製造例 ヒダントイン薬物ハプテン類似体類 ヒダントイン類似体類は、フェニトイン類似体類、ヒダ
ントイン化合物類の下位分類、が製造される下記製造方
法に従って製造できる。

【００２５】１．ＨＤ１：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチル｝
ヒダントインの製造。

【００２６】工程１：５，５−ジフェニル−３−〔４−
（２−ヒドロキシエチルアミノカルボニル）ブチル〕ヒ
ダントインの製造。

【００２７】パートＡ：最初に酸塩化物を製造する。３
−（４−カルボキシブチル）−５，５−ジフェニル−
２，４−イミダゾリジンジオン（３．５２ｇ，０．０１
モル）、塩化チオニル（２０mL）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（２滴）及びクロロホルム（５０mL）の混合
物を、室温で３時間攪拌した。減圧下、ロータリーエバ
ポレーターで溶剤を除去して、そしてこの生成物を次の
パートＢに直接用いた。

【００２８】パートＢ：酸塩化物をエタノールアミンと
反応させる。クロロホルム（５０mL）中の酸塩化物を、
クロロホルム１００（mL）中エタノールアミン（１．２
ｇ，０．０２モル）、及びトリエチルアミン（２．４
ｇ，０．０２４モル）の混合物に１５分間かけて滴下し
た。次いで混合物を６０℃で２時間加熱し、そして室温
で１時間攪拌した。次いでその溶液を５％塩酸（１００
mL×２）で洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１０
０mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥して濾過
し、そして溶剤をロータリーエバポレーターで除去し
た。次いで濾液を酸化アルミニウムカラムを用いるクロ
マトグラフィーにかけ、ＴＬＣ上に１つのスポットを示
す物質（３．０ｇ）を得た。この物質を次の製造方法に
直接使用した

【００２９】工程２：３−｛４−〔２−（３−カルボキ
シプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニルヒダントインの製造。 クロロホルム（１００mL）中工程１のヒドロキシ化合物
（３．０ｇ，０．００７５モル）、無水コハク酸（１．
０ｇ，０．０１モル）及びジメチルアミノピリジン
（０．９ｇ，０．００７５モル）を５０〜６０℃で４時
間加熱し、そして週末の間に室温まで冷却した。

【００３０】ジクロロメタン（３００mL）を添加し、そ
して混合物を５％塩酸溶液（１００mL×３）で洗浄し、
飽和塩化ナトリウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫
酸マグネシウムで乾燥して濾過し、そして溶剤を除去し
てＴＬＣ上に１つのスポットを与える物質を得た。

【００３１】工程３：ＨＤ１：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝ヒダントインの製造。

【００３２】

【化７】

【００３３】クロロホルム（８０mL）中工程２由来の酸
（３．０ｇ，０．００６モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド（１．５ｇ，０．００７モル）及
びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７ｇ，０．００
６モル）の混合物を室温で２０時間攪拌した。その混合
物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレーターで
濾液を濃縮した。次いで残渣をシリカを用いるクロマト
グラフィーにかけ、生成物を１．３ｇ得た（収率４０
％）。Ｃ₃₀Ｈ₃₂Ｎ₄ Ｏ₉ についての分析計算値：Ｃ，６
０．８；Ｈ，５．４４；Ｎ，９．４５。実験値：Ｃ，５
９．６；Ｈ，５．５１；Ｎ，８．９１。

【００３４】２．ＨＤ２：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝
−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００３５】工程１：５，５−ジフェニル−３−（１−
ピペラジニルカルボニルブチル）ヒダントインの製造。

【００３６】パートＡ：最初に、３−〔４−（４−ベン
ジルオキシカルボニルピペラジニルカルボニル）ブチ
ル〕−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンを製造した。上記ＨＤ１の製造のパートＡに記載さ
れるように製造した酸塩化物（０．０１モル）を、クロ
ロホルム（５０mL）中ベンジル１−ピペラジンカルボキ
シレート（２．４ｇ，０．０１１モル）及びトリエチル
アミン（２．０ｇ，０．０２モル）の混合物に、１５分
間かけて滴下した。この混合物を室温で一晩攪拌し、そ
してジクロロメタン（３００mL）を添加した。その混合
物を５％塩酸（１００mL×２）で洗浄し、希炭酸ナトリ
ウム溶液（１００mL）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶
液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで溶液
を乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレー
ターで溶剤を除去した。次いで濾液をクロマトグラフィ
ーにかけ、油状物４．３ｇを得た（収率７８％）。これ
を次の工程に直接使用した。

【００３７】工程Ｂ：工程Ａの保護アミン（４．８ｇ，
０．００８モル）及び３０〜３５％臭化水素酢酸溶液
（２５mL）を室温で１．５時間攪拌した。次いでこの混
合物をジエチルエーテル（１Ｌ）に注ぎ入れ、そして分
離した油状物を新たなエーテル（１Ｌ×３）で摩砕し
た。その油状物を１０％水性水酸化ナトリウム（pH＝１
４）に溶解し、そして水性溶液をジクロロメタン（１０
０mL×４）で抽出した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナ
トリウム溶液（１５０mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下、ロータリーエバ
ポレーターで溶剤を除去した。濾液を凝固させると白色
固体が得られた（２．６ｇ，収率７７％）。この物質を
次の工程に直接用いた。

【００３８】工程２：３−｛４−〔４−（３−カルボキ
シプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。

【００３９】クロロホルム（１５mL）中製造方法７由来
のアミン（２．１ｇ，０．００５モル）及び無水コハク
酸（０．５４ｇ，０．００５４モル）を５０〜６０℃で
３０分間加熱し、そして周囲温度で２０時間放置した。
ジクロロメタン（１５０mL）を添加し、そして混合物を
５％塩酸（１００mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナトリウ
ム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエボパレータ
ーで溶剤を除去したところ、白色固体２．５ｇ（９５
％）が得られ、これを次の工程に直接用いた。

【００４０】工程３：ＨＤ２：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４１】

【化８】

【００４２】クロロホルム（４０mL）中工程２由来の酸
（１．５６ｇ，０．００３モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（０．６４ｇ，０．００３モ
ル）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３６ｇ，
０．００３モル）の混合物を室温で週末の間攪拌した。
その混合物を濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレ
ーターで濾液から溶剤を除去して生成物１．９ｇを得た
（収率１００％）。その固体をクロマトグラフィーにか
け、そして生成物画分をジクロロメタン（２００mL）に
溶解し、希炭酸ナトリウム溶液（１００mL×２）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そしてロ
ータリーエバポレーターで溶剤を除去したところ、ＴＬ
Ｃ上に１つのスポットを与える白色固体が得られた。Ｃ
₃₂Ｈ₃₅Ｎ₅ Ｏ₈ の分析計算値：Ｃ，６２．２３；Ｈ，
５．７１；Ｎ，１１．３４。実験値：Ｃ，５９．０７；
Ｈ，５．４０；Ｎ，１０．４５。

【００４３】３．ＨＤ３：５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチル｝
−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４４】工程１：３−〔４−〔６−アミノヘキシル
アミノカルボニル）ブチル〕−５，５−ジフェニル−
２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４５】パートＡ：３−〔４−〔６−ベンジルオキ
シカルボニルアミノヘキシルアミノカルボニル）ブチ
ル〕−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。 ＨＤ１の製造で中間体として生成される酸塩化物を、Ｈ
Ｄ２の製造の工程１に記載の方法により、Ｎ−ベンジル
オキシカルボニル−１，６−ヘキサンジアミンで処理し
たところ、保護アミン７．５ｇ、収率８５％が得られ
た。

【００４６】パートＢ：パートＡの保護アミンを、ＨＤ
２の製造の工程１、パートＢの方法により臭化水素酸−
酢酸で処理したところ遊離アミンが得られ、精製するこ
となくそれを工程２に用いた。

【００４７】工程２：３−｛４−〔６−（３−カルボキ
シプロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オンの製造。 この化合物を、ＨＤ２の製造の工程２と同様の方法を用
いて製造した。Ｃ₃₀Ｈ ₃₈Ｎ₄ Ｏ₆ についての分析計算
値：Ｃ，６５．４４；Ｈ，６．９６；Ｎ，１０．１７。
実験値：Ｃ，６３．２６；Ｈ，７．０１；Ｎ，９．３
９。

【００４８】工程３：ＨＤ３：５，５−ジフェニル−３
−｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４−イミダゾリジンジオンの製造。

【００４９】

【化９】

【００５０】この物質を、ＨＤ２の製造の工程３の方法
を用いて製造したところ、生成物２．６ｇを得た（収率
８０％）。融点１３３〜１３４℃。Ｃ₃₄Ｈ₄₁Ｎ₅ Ｏ₈ に
ついての分析計算値：Ｃ，６３．０５；Ｈ，６．３８；
Ｎ，１０．８１。実験値：Ｃ，６２．９１；Ｈ，６．４
１；Ｎ，１０．６９。

【００５１】バルビツレート薬物類似体類 以下の製造例４〜８は、フェノバルビタールについての
バルビツレート薬物ハプテン類似体類の製造を具体的に
説明するものである。一般的には、類似体類は、（１）
バルビツレート誘導体、例えば、フェノバルビタール
を、オメガ−ハロアルカンカルボキシレートエステルと
縮合させる工程、（２）そのエステルを、対応する酸に
ケン化させる工程、（３）その酸を、対応する酸塩化物
に転化させる工程、及び（４）酸塩化物をＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドと縮合させる工程、又は更に長い連結
鎖を得るために、ブロックされたアミンもしくはヒドロ
キシ基を１つ有するジアミン、ジオールもしくはアミノ
アルコールと縮合させる工程、（５）ブロックを取り除
き、ジカルボン酸、例えばコハク酸と縮合させ、次いで
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと縮合させて、類似体を
製造する工程、により製造される。

【００５２】所望であれば、半ブロックのジアミン、ジ
オールもしくはアミノアルコールと縮合させ、次いで別
の二酸を一回もしくは２回以上繰り返し処理して、連結
鎖を更に長くできる。しかしながら、同様の製造が、よ
り長い鎖の二酸類、ジオール類、ジアミン類、アミノア
ルコール類もしくはハロアルカンカルボキシレートエス
テル類を用いることにより、より少ない工程で達成でき
る。

【００５３】４．ＰＢ１：５−エチル−５−フェニル−
１−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジント
リオンの製造。

【００５４】工程１：５−エチル−６−ヒドロキシ−３
−（４−メトキシカルボニルブチル）−５−フェニル−
２，４（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオンの製造。 ジクロロメタン（５００mL）中フェノバルビタール（４
６．５ｇ，０．２モル）及び水酸化テトラブチルアンモ
ニウム（５００mL、０．２モル、０．４Ｍ水溶液）の混
合物を製造し、そしてそれに５−ブロモ吉草酸メチル
（３９．０ｇ，０．２モル）を添加した。その反応混合
物を一晩（２０時間）激しく攪拌した。この混合物に、
飽和塩化ナトリウム溶液（１００mL）を添加し、有機層
を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン（１００mL
×２）で洗浄した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリ
ウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で乾燥
し、濾過し、そして溶剤を除去した。

【００５５】工程２：３−（４−カルボキシブチル）−
５−エチル−６−ヒドロキシ−５−フェニル−２，４
（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオンの製造。 ジオキサン（５００mL）中の工程１の５−エチル−６−
ヒドロキシ−３−（４−メトキシカルボニルブチル）−
５−フェニル−２，４（３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジンジオ
ンエステル（５４．０ｇ，０．１５６モル）、濃塩酸
（５５mL）及び水（５５mL）の混合物を４時間加熱還流
し、そして室温で一晩放置した。ジオキサンを減圧下で
除去し、そして飽和塩化ナトリウム溶液（２５０mL）及
びジクロロメタン（４００mL）を残渣に加えた。有機層
を分離し、そして水性溶液をジクロロメタン（１５０mL
×３）で抽出した。合わせた有機溶液を飽和塩化ナトリ
ウム溶液（２００mL）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で乾燥
し、濾過し、そして溶剤を取り除いた。残渣にジエチル
エーテルを添加し、そしてその混合物を週末の間−１６
℃の冷凍庫に置き、次いで濾過した。

【００５６】工程３：１−（４−クロロカルボニルブチ
ル）−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 製造２由来の酸（６．６ｇ，０．２モル）、塩化チオニ
ル（５０mL）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２滴）
及びクロロホルム（８０mL）の混合物を室温で１．５時
間攪拌した。減圧下ロータリーエバポレーターで溶剤を
除去し、そしてこの生成物を次の工程４に直接用いた。

【００５７】工程４：１−〔４−（４−ベンジルオキシ
カルボニル−１−ピペラジニルカルボニル）ブチル〕−
５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，
５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（７５mL）中工程３の酸塩化物（０．２モ
ル）を、クロロホルム（１００mL）中ベンジル１−ピペ
ラジンカルボキシレート（６．０ｇ，０．０３０モル）
及びトリエチルアミン（４．０ｇ，０．０４モル）の混
合物に１５分間かけて滴下した。この混合物を室温で２
０時間攪拌し、次いでジクロロメタン（３００mL）を添
加した。その混合物を１０％塩酸溶液（１００mL×３）
で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（１００mL）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶
剤を除去した。次いで残渣をＳｉＯ₂ でのクロマトグラ
フィーにかけて固体を得た。

【００５８】工程５：５−エチル−５−フェニル−１−
〔４−（１−ピペラジニルカルボニル）ブチル〕−２，
４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンヒド
ロブロミドの製造。 製造４由来の保護アミン（６．５ｇ，０．０１２モル）
及び３０〜３５％臭化水素酢酸溶液（３０mL）を室温で
１．５時間攪拌した。次いでその混合物を酢酸エチル
（２Ｌ）中に注ぎ入れ、１時間攪拌し、濾過し、そして
固体を酢酸エチル５００mLで洗浄した。

【００５９】工程６：１−｛４−〔４−（３−カルボキ
シプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチ
ル｝５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，３
Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（１５０mL）中、工程５のアミン（４．８
ｇ，０．０１モル）、無水コハク酸（１．２ｇ，０．０
１２モル）及びトリエチルアミン（２．２ｇ，０．０２
モル）を、５０〜６０℃で３０分間加熱し、（温水）そ
して周囲温度で１６時間攪拌した。ジクロロメタン（２
００mL）を添加し、その混合物を１０％塩酸溶液（１０
０mL×３）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（１００
mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、そして減圧下ロータリーエバポレーターで溶剤を除
去すると、白色固体３．３ｇが得られた（収率６６
％）。この物質をＳｉＯ₂ カラムを用いるクロマトグラ
フィーにかけたところ、白色固体が得られた。

【００６０】工程７：５−エチル−５−フェニル−１−
｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝
−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオ
ンの製造。

【００６１】

【化１０】

【００６２】クロロホルム（７５mL）中工程６由来の酸
（３．４ｇ，０．００７モル）、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド（１．６ｇ，０．００８モル）及
びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．０ｇ，０．００
８モル）を室温で２０時間攪拌した。その混合物を濾過
し、そして酢酸エチル（１００mL）を添加した。その有
機溶液を水（１００mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナトリ
ウム溶液（５０mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥し、濾過し、そして減圧下ロータリーエバポレータ
ーで溶剤を除去した。固体部分をクロマトグラフィーに
かけたところ、白色固体が得られた。

【００６３】５．ＰＢ２：５−エチル−５−フェニル−
２−（４−スクシンイミドオキシカルボニルブチル−
２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン
の製造。

【００６４】

【化１１】

【００６５】工程２の酸と攪拌すること以外は、製造例
４、工程７の方法を用いてこの物質を製造した。その物
質をエチルエーテル／酢酸エチル（１：１）から結晶化
したところ、白色固体が得られた。

【００６６】６．ＰＢ３：５−エチル−５−フェニル−
１−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジント
リオンの製造。

【００６７】工程１：５−エチル−１−〔４−（２−ヒ
ドロキシエチルアミノカルボニル）ブチル〕−５−フェ
ニル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジント
リオンの製造。 ベンジル１−ピペラジンカルボキシレートの代わりに２
−ヒドロキシエチルアミンを用いる以外は、製造例４の
工程４に概説されたようにこの物質を製造した。

【００６８】工程２：１−｛４−〔２−（３−カルボキ
シプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 クロロホルム（１００mL）中、工程１由来の生成物
（２．９ｇ，０．００７モル）、無水コハク酸（０．７
ｇ，０．００７モル）及びジメチルアミノピリジン
（０．９ｇ，０．００７モル）を温水（５０〜６０℃）
で３０分間加熱し、次いで室温で３日間攪拌した。ジク
ロロメタン（３００mL）を添加し、そして混合物を１０
％塩酸溶液（１００mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナトリ
ウム溶液（１００mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥し、濾過し、そして溶剤を除去したところ、油状
物が得られ、それを次の工程に直接用いた。

【００６９】工程３：ＰＢ３：５−エチル−５−フェニ
ル−１−｛４−〔２−（３−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオニルオキシ）エチルアミノカルボニル〕
ブチル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジ
ントリオンの製造。

【００７０】

【化１２】

【００７１】本例の工程２の酸を用いて開始する、製造
例４の工程７に概略された方法を用いて、この物質を製
造した。

【００７２】７．ＰＢ４：５−エチル−５−フェニル−
１−｛４−〔３−（３−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジント
リオンの製造。

【００７３】工程１：１−〔４−（３−ベンジルオキシ
カルボニルアミノプロピルアミノカルボニル）ブチル〕
−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，３
Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 ベンジル１−ピペラジンカルボキシレートの代わりにＮ
−ベンジルオキシカルボニル−１，３−プロパンジアミ
ンを用いる以外は、製造例４の工程４に概略された方法
を用いてこの物質を製造し、そして粗物質を次の工程に
用いた。

【００７４】工程２：１−〔４−（３−アミノプロピル
アミノカルボニル）ブチル〕−５−エチル−５−フェニ
ル−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリ
オンヒドロブロミドの製造。 製造例４の工程５のようにこの物質を製造した（本例の
工程１のアミドを用いて開始し、エチルエーテル中に注
ぎ入れた時に油状物が得られたことを除く）。

【００７５】工程３：１−｛４−〔３−（３−カルボキ
シプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−５−エチル−５−フェニル−２，４，６（１Ｈ，
３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオンの製造。 本例の工程２由来のアミンを用いて開始し、酸が得られ
たこと以外は、製造例４の工程６の方法により、この物
質を製造した。

【００７６】工程４：ＰＢ４：５−エチル−５−フェニ
ル−１−｛４−〔３−（３−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピオンアミド）プロピルアミノカルボニル〕
ブチル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジ
ントリオンの製造。

【００７７】

【化１３】

【００７８】本例の工程３の酸を用いて開始する以外
は、製造例４の工程７の方法を用いてこの物質を製造し
た。

【００７９】８．ＰＢ５：５−エチル−５−フェニル−
１−｛４−〔６−（３−スクシンイミドオキシカルボニ
ルプロピオンアミド）ヘキシルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジント
リオンの製造。

【００８０】

【化１４】

【００８１】工程１では、ベンジルオキシカルボニル−
１，３−プロパンジアミンの代わりにＮ−ベンジルオキ
シカルボニル−１，６−ヘキサンジアミンを使用し、そ
してその後の製造例７の工程２，３及び４では各々反応
生成物を用いること以外は、製造例７の反応順序に従っ
てこの化合物を製造した。

【００８２】

【具体的な態様】本発明者らは、バルビツレート類及び
ヒダントイン薬物類、特にフェノバルビタール及びフェ
ニトインについての競合イムノアッセイに有用である、
先に製造したバルビツレート及びヒダントイン類似体類
の新規標識薬物ハプテン類似体類を製造した。標識類
は、競合イムノアッセイで被検体もしくは被検体類似体
と共に通常用いられる、アミンもしくはスルフヒドリル
基を担持するイムノアッセイで常用されるもの、例え
ば、酵素類、可視色素類、ロイコ色素類、蛍光色素類及
び放射性物質類等である。

【００８３】有用な標識は、酵素類、例えば、アルカリ
性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
もしくはアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＨ
ＲＰ）である。

【００８４】標識薬物ハプテン類似体類は、下記工程を
含んで成る新規方法を用いて製造される。 １）求核基、例えばアミンもしくはスルフヒドリル基を
表面上に担持する標識を、過剰の上記バルビツレートも
しくはヒダントイン薬物ハプテン類似体と接触させる工
程。好ましくは類似体及び標識を水混和性有機溶剤、例
えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）もしくは溶剤及び水の混合物に溶解
し（緩衝化）、その後一緒に混合する工程、及び ２）未使用活性エステル及び縮合副生成物を、好ましく
は透析により取り除く工程。

【００８５】

【実施例】本明細書の以下に提供される例は、本発明の
新規標識類似体類の製造方法を具体的に説明するもので
ある。標識類似体類は、フェニントイン及びフェノバル
ビタール薬物ハプテン類似体類を用いて製造した。

【００８６】例１−アミン富化ＨＲＰ標識ヒダントイン
ＨＤ１（伸長連結鎖、標識ＡＨＲＰ−ＨＤ１、標識Ａを
含む）の製造。

【００８７】ＨＤ１を、１０ミリモル４′−ヒドロキシ
アセトアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（ＤＭＦ ４′−Ｈ
Ａ）１．４５２mLに溶解した。

【００８８】アミン富化ＨＲＰを以下のように製造し
た。乾燥ＨＲＰを０．１モルＭＥＳ緩衝液、pH５．５に
溶解して、緩衝液１０mL中の最終濃度が２．５×１０^-6
モル（１００mg）となるようにした（ＭＥＳ＝２−（Ｎ
−モルホリノ）エタンスルホン酸）。伝統的なファクタ
ーＡ₄₀₃ １mg／mL＝２．２４を用いてＡ₄₀₃ 測定法によ
りタンパク質濃度を求めた。ＨＲＰ溶液を、０．１モル
ＭＥＳ緩衝液pH５．５、１０mL中に溶解したＬ−リジン
一塩酸塩１．５×１０^-3モル（２７５mg）と合わせた。
新たに調整したＭＥＳ緩衝液中１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤ
Ｃ、５×１０^-4モル、９６０mL）の溶液を添加した。容
器にフタをし、そして室温で一晩混合した。その反応生
成物を再び０．０２モルＭＯＰＳ緩衝液、pH７．０（３
Ｌ、１０℃）で透析した。透析緩衝液を３回変えた。Ｍ
ＯＰＳ＝３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸。

【００８９】反応させる前に、アミン富化ＨＲＰの試料
を、３０，０００ＮＭＷＬ（呼称分子量制限分離）セン
トリセル（Ｃｅｎｔｒｉｃｅｌｌｓ）遠心用ウルトラフ
ィルターを用いて、ＭＯＰＳ緩衝液から０．１モルＥＰ
ＰＳ緩衝液、pH８．０に交換した。次いで、この試料を
希釈して、最終濃度１０mg／mLの溶液を得た。

【００９０】アミン富化ＨＲＰ（ＡＨＲＰ）（１mL）を
ジメチルホルムアミド中４′−ヒドロキシアセトアニリ
ドの１０ミリモル溶液（ＤＭＦ ４′−ＨＡ）５００μ
Ｌと、ボルテックスで混合しながら合わせ、次いでそれ
を４２℃の水浴中に設置した。乾燥ＤＭＦ ４′−ＨＡ
溶液１．４５２mL中にＨＤ１を２１mg溶解することによ
り調整したＨＤ１溶液（５００μＬ）を、ボルテックス
で混合しながらＡＨＲＰに滴下したので、フェニトイン
／ＨＲＰのモル比は、５０／１となった。その反応混合
物を、４２℃の水浴中で穏やかに振動させながら１時間
インキュベーションした。

【００９１】その反応混合物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ＃
２透析管に入れ、更なるＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モ
ルＥＰＰＳ（１：１）０．５mLを用いて反応容器をすす
ぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れた。

【００９２】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ
（１：１）、pH８．０を用いて４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）２Ｌの０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
む０．１モルＥＰＰＳ、pH８．０を用いて８℃で１５時
間 ｄ）２Ｌの０．１モルＥＰＰＳ、pH８．０を用いて８℃
で３時間、 ｅ）３Ｌの０．０４モル トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン塩酸塩（トリスＨＣｌ）／０．１５モルＮ
ａＣｌ、pH７．５を用いて８℃で３時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて３時間、もう１回繰り返す。

【００９３】透析後、０．０２％メルチオレート（ｍｅ
ｒｔｈｉｏｌａｔｅ）（商標）を防腐剤として添加し、
そしてＡＨＲＰ−ＨＤ１を冷蔵保存した。

【００９４】例２−アミン富化ＨＲＰ標識ＨＤ２（アミ
ド結合を伴う伸長連結鎖、標識ＡＨＲＰ−ＨＤ２、標識
Ｂを含む）の製造。

【００９５】ＨＤ２（１５．５mg）を、１０ミリモル
４′−ヒドロキシアセトアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（Ｄ
ＭＦ ４′−ＨＡ）１．０３１mLに溶解した。

【００９６】標識製造例１に記載されるように製造した
ＡＨＲＰの溶液（１０mg／mL、０．１モルＥＰＰＳ溶
液、pH８．０を１mL）を、ＤＭＦ ４′−ＨＡ ５００
μＬと、ボルテックスで混合しながら合わせ、次いでそ
れを４２℃の水浴中に設置した。上記ＨＤ２溶液（５０
０μＬ）を、ボルテックスで混合しながらＡＨＲＰに滴
下したので、モル比は５０／１となった。その反応混合
物を、４２℃の水浴中で穏やかに振動させながら１時間
インキュベーションした。

【００９７】その反応生成物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ＃
２透析管に入れ、そして以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ
（１：１）、pH８．０を用いて４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡを含む０．１モルＥＰＰ
Ｓ、pH８．０を用いて８℃で１．５時間 ｄ）１．５Ｌの０．１モルＥＰＰＳ、pH８．０を用いて
８℃で１８時間、 ｅ）１．５Ｌの０．０４モル トリスＨＣｌ／０．１５
モルＮａＣｌ、pH７．５を用いて８℃で２時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて４時間、もう１回繰り返す。

【００９８】透析後、０．０２％メルチオレート（商
標）を防腐剤として添加した。標識ヒダントイン誘導体
を冷蔵庫に保存した。

【００９９】例３−ＡＨＲＰ−ＨＤ３（アミド結合を伴
う伸長連結鎖、標識ＡＨＲＰ−ＨＤ３、標識Ｃを含む）
の製造。

【０１００】ＨＤ３（９．２mg）を、１０ミリモル４′
−ヒドロキシアセトアニリドを含む乾燥ＤＭＦ（ＤＭＦ
４′−ＨＡ）１mLに溶解した。

【０１０１】標識製造例１に記載されるように製造した
ＡＨＲＰの溶液を、０．１モルＥＰＰＳ緩衝液、pH８．
０で透析した。最終濃度が５．７１mg／mLとなるように
した。

【０１０２】ＡＨＲＰ（１mL）をボルテックスで混合し
ながらＤＭＦ ４′−ＨＡ ５００μＬと合わせ、次い
でそれを４２℃の水浴中に設置した。上記ＨＤ３溶液
（５００μＬ）を、ボルテックスで混合しながらＡＨＲ
Ｐに滴下したので、ＨＤ３／ＡＨＲＰのモル比は５０／
１となった。その反応混合物を４２℃の水浴中で穏やか
に振動させながら１時間インキュベーションした。その
反応混合物をＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ＃２透析管に入れ、
更なるＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ（１：
１）０．５mLを用いて反応容器をすすぎ、そのすすぎ液
も一緒に透析管に入れた。

【０１０３】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ
（１：１）、pH８．０を用いて４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡを含む０．１モルＥＰＰ
Ｓ、pH８．０を用いて５℃で１５時間 ｄ）１．５Ｌの０．１モルＥＰＰＳ、pH８．０を用いて
８時間、 ｅ）２Ｌの０．０２モル３−モルホリノプロパンスルホ
ン酸（ＭＯＰＳ）、pH７．０を用いて５℃で１３時間、
そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて２回繰り返す。

【０１０４】透析後、０．０２％メルチオレート（商
標）を防腐剤として添加し、そしてその標識生成物を冷
蔵保存した。

【０１０５】標識バルビツレート薬物ハプテン類似体類 以下の例は、標識バルビツレート薬物ハプテン類似体の
製造を具体的に説明するものである。

【０１０６】例４−アミン富化ＨＲＰ標識ＰＢ２（標識
ＡＨＲＰ−ＰＢ２、標識Ｄ）の製造。 ＰＢ２をＤＭＳＯに溶解して１０．７mg／mL溶液（１．
２５×１０^-2モル）を得た。次いでこの溶液の５００μ
Ｌを、ボルテックスで混合しながらアミン富化ＨＲＰ／
ＤＭＳＯ溶液（ＡＨＲＰ／ＤＭＦと同様に調整される）
に滴下した。フェノバルビタール／ＨＲＰのモル比は５
０／１であった。

【０１０７】２４００rpm で振動させながら室温で４時
間インキューベーションを行った。その試料をＳｐｅｃ
ｔｒａｐｏｒ＃２透析管に移し、更に透析後１mLを用い
て反応容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入
れた。標識を０．０２モルＭＯＰＳ緩衝液、pH７．０を
用いて５〜１０℃で透析した。この透析条件を、各回と
も２〜３Ｌの緩衝液を用いて３回繰り返した。透析後、
０．０２％メルチオレート（商標）を防腐剤として添加
し、そして標識を冷蔵保存した。

【０１０８】例５−アミン富化ＨＲＰ−ＰＢ３（伸長連
結鎖を含むＡＨＲＰ−ＰＢ３、標識Ｅ）の製造。 アミン富化ＨＲＰを、セントリセル（Ｃｅｎｔｒｉｃｅ
ｌｌ）遠心用ウルトラフィルター（３０，０００呼称分
子量制限）を用いてＭＯＰＳ緩衝液から０．１モルＥＰ
ＰＳ緩衝液、pH８．０に交換した。次いでこの試料を
４．６mL、０．７４３mg／mLまで希釈した。

【０１０９】ＨＲＰ１mLを小バイアルに入れた（１．８
５×１０^-5モル）。１０ミリモル４′−ヒドロキシアセ
トアニリドを含むジメチルホルムアミド（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ２２、７０５〜６）（ＤＭＦ ４′−ＨＡ）５００μ
Ｌをバイアルに添加し、ボルテックスで混合し、そして
４２℃の水浴に設置した。

【０１１０】一方、ＰＢ−３を、ＤＭＦ ４′−ＨＡに
溶解して２．１２mg／mL溶液（３．７０×１０^-3モル）
を得た。この溶液５００μＬを、ボルテックスで混合し
ながらＨＲＰ／ＤＭＦ ４′−ＨＡ溶液に滴下した。フ
ェノバルビタール／ＨＲＰのモル比は、１００／１であ
った。

【０１１１】水浴中で穏やかに振動させながら４２℃で
１時間インキュベーションを行った。その試料をＳｐｅ
ｃｔｒａｐｏｒ＃２透析管に移し、更にＤＭＦ ４′−
ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ（１：１）１mLを用いて反応
容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れた。

【０１１２】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）１ＬのＤＭＦ ４′−ＨＡ／０．１モルＥＰＰＳ
（１：１）、pH８．０を用いて４２℃で１時間、 ｂ）透析条件ａ）を用いてもう１回繰り返す、 ｃ）１．５Ｌの０．１％ＢＳＡを含む０．１モルＥＰＰ
Ｓ、pH８．０を用いて５℃で一晩 ｄ）１．５Ｌの０．１モルＥＰＰＳ、pH８．０を用いて
５℃で８時間、 ｅ）２Ｌの０．０２モルＭＯＰＳ、pH７．０を用いて５
℃で少なくとも８時間、そして ｆ）透析条件ｅ）を用いて２回繰り返す。

【０１１３】透析後、０．０２％メルチオレート（商
標）を防腐剤として添加し、そしてその標識生成物を冷
蔵保存した。

【０１１４】例６−アミン富化ＨＲＰ−ＰＢ１（標識Ａ
ＨＲＰ−ＰＢ１、標識Ｆ、アミド結合を伴う伸長連結鎖
を含むフェノバルビタールハプテン類似体の活性エステ
ル）の製造。

【０１１５】製造したアミン富化ＨＲＰを、０．１モル
ＥＰＰＳ緩衝液、pH８．０に交換して１０mg／mLの溶液
（２．５×１０^-4モル）を得た。標識Ｆを、アミン富化
ＨＲＰ５mL（５０mg）を用いて製造した。磁気攪拌プレ
ートで攪拌しながら、ＤＭＳＯ ２．５mLをゆっくりと
添加した。その溶液を室温で１５分間攪拌した。

【０１１６】一方、ＰＢ１をＤＭＳＯに溶解して１４．
９mg／mL溶液を得た。この溶液２．５mLを、ＨＲＰ／Ｄ
ＭＳＯ溶液に攪拌しながらゆっくり添加した。フェノバ
ルビタール／ＨＲＰのモル比は５０／１であった。

【０１１７】２４００rpm で振動させながら室温で５時
間インキュベーションを行った。その試料をＳｐｅｃｔ
ｒａｐｏｒ＃２透析管に移し、更に透析液を用いて反応
容器をすすぎ、そのすすぎ液も一緒に透析管に入れた。
標識を０．０２モルＭＯＰＳ緩衝液、pH７．０を用いて
５〜１０℃で透析した。この透析条件を、各回とも３Ｌ
の緩衝液を用いて３回繰り返した。透析後、０．０２％
メルチオレート（商標）を防腐剤として添加し、そして
標識を冷蔵保存した。

【０１１８】免疫適格性 以下の例は、上記標識１〜６の免疫適格性を具体的に示
すものである。

【０１１９】例７−標識ＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識Ａ）の
免疫適格性。 本例では、標識製造例１）由来のＡＨＲＰ−ＨＤ１（標
識Ａ）を結合する、数種の固定化抗体（ＤｉｌＡｓ₈ ，
ＤｉｌＡｓ₉ ，ＤｉｌＡｓ₁₄ ,ＤｉｌＡｓ₁₆及びＤｉｌ
Ａｓ₂₁）の能力を検討する。

【０１２０】（ａ）ポリマービーズ試料（各試料が、そ
れに共有結合した先に同定された型の抗体の１つを担持
する）を、１９８７年８月３日に出願された米国特許第
０８１，２０６号明細書（ＥＰＡ８８ ３０７１７２．
２発行）に記載される方法及び材料を用いて製造した。

【０１２１】（ｂ）ＡＨＲＰ−ＨＤ１（標識Ａ）を結合
する固定化抗体の能力を以下のように測定した。各種の
抗体ビーズを、各々１％ＢＳＡを含むＰＢＳで連続的に
希釈して、濃度が５００〜０．５ナノモル抗体バインデ
ィング部位となるようにした。ビーズ希釈液を、等量の
１０×１０^-11 モルの標識と混合した。１時間インキュ
ベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。上
清のサンプル（１００μＬ）を、基質（ｏ−フェニレン
ジアミン／Ｈ₂ Ｏ₂ ）１００μＬと混合した。４５０nm
での発色速度を標準のものと比較して、溶液中に残存す
るフェニトイン−ＨＲＰ標識の量を計算した。抗体最高
濃度（２５０ナノモル バインディング部位）で試験さ
れた固定化抗体に結合した標識の量を報告する。

【０１２２】

【表１】

【０１２３】これらの結果は、これらの抗体がＡＨＲＰ
−ＨＤ１標識（標識Ａ）を確実に認識することを示して
いる。

【０１２４】例８−ＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）の加水
分解安定性。 本例は、標識とフェニトイン核の間の連結鎖にアミド結
合を有する本発明の標識フェニトイン誘導体、ＡＨＲＰ
−ＨＤ２（標識Ｂ）の加水分解安定性を具体的に説明す
るものである。

【０１２５】固定化カレスタッド（Ｋａｌｌｅｓｔａ
ｄ）抗体を担持するビーズを、１９８７年８月３日に出
願された米国特許第０８１，２０６号明細書（ＥＰＡ
８８３０７１７２．２発行）に記載されるように製造し
た。

【０１２６】ＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）を、pH７．３
もしくは８．５に調整した１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１
×１０^-10 モルとなるまで希釈した。その標識を室温で
６日間インキュベーションした。その標識を、２日後及
び６日後に、固定化抗体によるバインディングについ
て、以下のように試験した。

【０１２７】カレスタッド（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ）５２
−２抗体ビーズを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで連続的に
希釈して、濃度が５００〜０．５０ナノモル抗体バイン
ディング部位となるようにした。ビーズ希釈液を、等量
の１０×１０^-11 モルの標識と混合した。１時間インキ
ュベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。
上清のサンプル（１００μＬ）を、基質（ｏ−フェニレ
ンジアミン／Ｈ₂ Ｏ₂ ）１００μＬと混合した。速度を
標準のものと比較して、溶液中に残存する標識の量を計
算した。抗体最高濃度（２５０ナノモル バインディン
グ部位）で試験された固定化抗体に結合した標識の量を
報告する。

【０１２８】

【表２】

【０１２９】これらの結果は、連結鎖中にアミド結合を
含むＡＨＲＰ−ＨＤ２（標識Ｂ）のバインディングが、
この時間内で全く分解を示さなかったことを示してい
る。これは、標識Ｂが加水分解による分解に耐性である
であろうことを示す。このような加水分解は、経過時間
に対応するアッセイ応答の変動の原因となったであろ
う。

【０１３０】例９−吉草酸エステル及び伸長連結鎖を用
いて製造されたフェノバルビタール−ＨＲＰ標識の比
較。 本例では、吉草酸エステル連結鎖を担持する標識（標識
Ｄ、ＡＨＲＰ−ＰＢ２）及び伸長連結鎖を担持する標識
（標識Ｆ、ＡＨＲＰ−ＰＢ１）を結合する、数種の固定
化抗体（Ｋａｌｌ １５７１及びＰｂＡｓ₉ ）の能力を
比較した。

【０１３１】固定化抗体ビーズ試料を、以下のように製
造した。ポリマービーズ（３０mg）〔ポリ（スチレン−
コ−Ｐ−ビニルベンジル２−クロロエチルスルホン）
（モル比９５：５）〕を、緩衝液（０．１モルＥＰＰ
Ｓ、pH８．５）１mLに分散し、そして抗体（Ｋａｌｌ
１５７１もしくはＰｂＡｓ₉ ）０．３mgを添加した。総
容量を１．５mLにした。その混合物を室温で４時間転倒
回転させた。次いで、ＢＳＡの１０％溶液０．３mLを添
加し、そして上清を取り除き、抗マウスＩｇＧを用いて
未結合抗体について分析した。表面上に結合した抗体の
量をＥＬＩＳＡを用いて計算した。そのペレットを、Ｐ
ＢＳ、pH７．２を用いて、緩衝液への再懸濁及び遠心に
より３回洗浄した。最終再分散液をＰＢＳ１．８mLで調
整し、メルチオレート（商標）を０．０２％の濃度で添
加し、そして生成物を使用するまで４℃で保存した。

【０１３２】標識を結合する固定化抗体の能力を以下の
ように測定した。各種の抗体ビーズを、各々１％ＢＳＡ
を含むＰＢＳで連続的に希釈して、濃度が２００〜０．
５０ナノモル抗体バインディング部位となるようにし
た。ビーズ希釈液を、等量の１０×１０^-11 モルのフェ
ノバルビタール−ＨＲＰ標識と混合した。１時間インキ
ュベーション後、遠心によりビーズをペレットにした。
上清のサンプル（１００μＬ）を、基質（ｏ−フェニレ
ンジアミン／Ｈ₂ Ｏ₂ ）１００μＬと混合した。４５０
nmでの発色速度を標準のものと比較して、溶液中に残存
するフェノバルビタール−ＨＲＰ標識の量を計算した。
抗体最高濃度（１００ナノモルバインディング部位）で
試験された固定化抗体に結合した標識の量を報告する。

【０１３３】

【表３】

【０１３４】

【発明の効果】これらの結果は、本発明により提供され
る標識薬物ハプテン類似体類に対する抗体類の認識が、
改良されていることを示す。少なくとも６５％の標識薬
物ハプテン類似体が、過剰の固定化バルビツレートもし
くはヒダントイン抗体によって結合されうる。伸長連結
鎖を担持する標識類似体類、特に連結鎖中にアミド結合
を有するものは、実際に本発明を低減するのに用いられ
るいかなるタイプの固定化抗体によっても、同様に結合
される。また、伸長連結鎖中にアミドを有する誘導体類
は、加水分解に対して非常に安定である。上記ヒダント
イン誘導体類の使用により、幾つかの利点が認められ
る。ヒダントインもしくはフェノバルビタール核と活性
エステル基の間に短い連結鎖を有するこれらのヒダント
イン誘導体類の活性エステルは、若干の固定化抗体との
使用に際して受け入れられる酵素標識を製造する場合に
は、ＨＲＰと十分に反応性であった。活性エステル基と
ヒダントイン核の間に８〜２０個の原子から成る長い連
結基（Ｒ² に加えて角型括弧基）を担持する誘導体類
は、試験されるすべての固定化抗体により結合できる標
識を提供した。連結鎖中の各Ｚが、隣接するカルボニル
とアミド基を形成する−ＮＲ−であるような鎖は加水分
解に対して耐性である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーシャ ディー．ベイル エーニック アメリカ合衆国，ニューヨーク 14610, ロチェスター，サン ガブリエル ドライ ブ 44 (72)発明者 イグナツィオ サルバトーレ ポンティチ ェロ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，コッパー ウッズ 21 (72)発明者 デビッド アラン ヒルボーン アメリカ合衆国， ニューヨーク 14467, ヘンリエッタ，サザーランド ヒルズ サ ークル 10

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ａ）アミンもしくはスルフヒドリル基
   を有する、イムノアッセイに用いられるタイプの標識、 （Ｂ）ヒダントイン核もしくはバルビツレート核より選
   ばれる薬物ハプテン核、及び （Ｃ）薬物ハプテン核の３位をカルボニル橋を介して標
   識に連結する連結鎖、を含んで成る標識薬物ハプテン類
   似体であって、上記連結鎖が、 （１）Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキレン基、 （２）フェニレン基、及び （３）環窒素原子を介して連結基に結合した５〜７員複
   素環、 から成る５〜４０個の原子を有し、上記基及び環が、 （ａ）エステル 【化１】 （上式中、ＺはＯもしくはＳである）、 （ｂ）アミド 【化２】 （ｃ）−Ｏ−，−Ｓ−、及び−ＮＲ−より選ばれるヘテ
   ロ原子（ここで、Ｒは、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルキルを表す）、
   並びに （ｄ）カルボニル より選ばれる化学基を介して互いに結合しており、連結
   基が、炭素原子数２〜１２個を有する飽和もしくは不飽
   和モノカルボン酸の誘導体以外のものであることを条件
   とする標識薬物ハプテン類似体。
2. 【請求項２】 （１）アミンもしくはスルフヒドリル基
   を有する標識を、 （ａ）活性エステル基、例えばスクシンイミドオキシカ
   ルボニル、 （ｂ）ヒダントイン核もしくはバルビツレート核より選
   ばれる薬物ハプテン核、及び （ｃ）活性エステル基をヒダントイン核もしくはバルビ
   ツレート核に連結する連結鎖（ここで、連結鎖は、請求
   項１に定義されるものである）を含んで成る過剰の薬物
   ハプテン類似体と接触させる工程、並びに （２）好ましくは透析により、未使用活性エステル及び
   縮合副生成物を取り除く工程、 を含んで成る先に特許請求したいずれか１つの標識薬物
   ハプテン類似体の製造方法。