JP2726793B2 - 免疫アッセイ - Google Patents
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- methamphetamine
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- immunoassay
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/946—CNS-stimulants, e.g. cocaine, amphetamines
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
- Y10S436/816—Alkaloids, amphetamines, and barbiturates
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、同時に２種以上の分析
対象物を検出するために使用される生物学的液体試料の
診断用免疫アッセイに関するものである。２元作用アッ
セイは、過去において開発されている（例えば、米国特
許第４，３２９，２８１号、ヨーロッパ特許出願第１６
５，７１６号、アンフェタミン（Amphetamine ）／メト
アンフェタミン（Methamphetamine ）用のＳｙｖａ Ｅ
ｍｉｔモノクローナルアッセイおよびアンフェタミン／
メトアンフェタミン用Ｒｏｃｈｅ Ａｂｕｓｃｒｅｅｎ
放射免疫アッセイ参照）。これらのアッセイは、２種類
の標識および各標識に特異的な２種類以上の抗体または
抗体群を使用することによって構成されている。
対象物を検出するために使用される生物学的液体試料の
診断用免疫アッセイに関するものである。２元作用アッ
セイは、過去において開発されている（例えば、米国特
許第４，３２９，２８１号、ヨーロッパ特許出願第１６
５，７１６号、アンフェタミン（Amphetamine ）／メト
アンフェタミン（Methamphetamine ）用のＳｙｖａ Ｅ
ｍｉｔモノクローナルアッセイおよびアンフェタミン／
メトアンフェタミン用Ｒｏｃｈｅ Ａｂｕｓｃｒｅｅｎ
放射免疫アッセイ参照）。これらのアッセイは、２種類
の標識および各標識に特異的な２種類以上の抗体または
抗体群を使用することによって構成されている。
【０００２】本発明は、抗体の組合わせおよびそれらの
対応する分析対象と相互作用し得る１つの標識結合パー
トナーが使用され、しかして分析対象の存在が、選択さ
れた閾値をもって単一または組合わせにおいて検出され
る、生物学的液体試料の多種分析対象物免疫アッセイの
新規な構成を提供する。アッセイは、メトアンフェタミ
ンおよびアンフェタミン抗体ならびに２種の分析対象物
のひとつ、最も好ましくは、アンフェタミンの単一の標
識誘導体を使用して提供される。
対応する分析対象と相互作用し得る１つの標識結合パー
トナーが使用され、しかして分析対象の存在が、選択さ
れた閾値をもって単一または組合わせにおいて検出され
る、生物学的液体試料の多種分析対象物免疫アッセイの
新規な構成を提供する。アッセイは、メトアンフェタミ
ンおよびアンフェタミン抗体ならびに２種の分析対象物
のひとつ、最も好ましくは、アンフェタミンの単一の標
識誘導体を使用して提供される。
【０００３】本発明においては、１種類のみの分析対象
物誘導体が、微小粒子等の標識部分により標識される。
この標識は、それが関連する両分析対象物の抗体に対し
てある程度のアフィニティを有するように構築される。
次いで、２種類の分析対象物から誘導される免疫原が２
種類の抗体を作成するために使用される。該免疫原は、
関連する分析対象物の特徴ある構造的特質からは離れ
て、ある種の共通する特徴を有するように構築される。
従って、両抗体は、標識に結合可能である。しかしなが
ら、各抗体は、その対応する分析対象物結合パートナー
によってのみ置換され、すなわち他の分析対象物に対し
て交差反応性でないように選択される。
物誘導体が、微小粒子等の標識部分により標識される。
この標識は、それが関連する両分析対象物の抗体に対し
てある程度のアフィニティを有するように構築される。
次いで、２種類の分析対象物から誘導される免疫原が２
種類の抗体を作成するために使用される。該免疫原は、
関連する分析対象物の特徴ある構造的特質からは離れ
て、ある種の共通する特徴を有するように構築される。
従って、両抗体は、標識に結合可能である。しかしなが
ら、各抗体は、その対応する分析対象物結合パートナー
によってのみ置換され、すなわち他の分析対象物に対し
て交差反応性でないように選択される。
【０００４】本発明の多種分析対象物アッセイの優位点
は、通常の一対のものとは異なって、構成中に１種類の
みの標識結合パートナーが含まれることである。このこ
とは、製造方法の単純化を可能とする。更には、アッセ
イの特異性は高く保たれ、また該アッセイは、一方の分
析対象物が他方よりも選択的に高感度となるように構成
され得る標準曲線を与えることが可能である。従って、
本発明の最も好ましい実施態様においては、単一の微小
粒子標識誘導体は、アンフェタミン誘導体であって、こ
れはアンフェタミン抗体に結合するのみならずメトアン
フェタミン抗体にもより低い程度で結合する。メトアン
フェタミンに対するより低いアフィニティは、閾値の設
定を可能とし、また薬物乱用の検出にかかる政府指針に
従って２種類の薬物の相対量について、アッセイの感度
を非対称的にすることを可能とする。
は、通常の一対のものとは異なって、構成中に１種類の
みの標識結合パートナーが含まれることである。このこ
とは、製造方法の単純化を可能とする。更には、アッセ
イの特異性は高く保たれ、また該アッセイは、一方の分
析対象物が他方よりも選択的に高感度となるように構成
され得る標準曲線を与えることが可能である。従って、
本発明の最も好ましい実施態様においては、単一の微小
粒子標識誘導体は、アンフェタミン誘導体であって、こ
れはアンフェタミン抗体に結合するのみならずメトアン
フェタミン抗体にもより低い程度で結合する。メトアン
フェタミンに対するより低いアフィニティは、閾値の設
定を可能とし、また薬物乱用の検出にかかる政府指針に
従って２種類の薬物の相対量について、アッセイの感度
を非対称的にすることを可能とする。
【０００５】この発明は、いずれの免疫アッセイの様式
（例えば、濁度測定式凝集アッセイ、放射免疫アッセイ
（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光偏光ア
ッセイ等）においても使用され得る。要求されること
は、該標識構造が、多種分析対象物、多種抗体の単一標
識試薬との相互作用を与えるために、対応する抗体を生
成させるために使用される免疫原のそれぞれに対し相同
的な部分を含むことである。
（例えば、濁度測定式凝集アッセイ、放射免疫アッセイ
（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光偏光ア
ッセイ等）においても使用され得る。要求されること
は、該標識構造が、多種分析対象物、多種抗体の単一標
識試薬との相互作用を与えるために、対応する抗体を生
成させるために使用される免疫原のそれぞれに対し相同
的な部分を含むことである。
【０００６】単一標識試薬は、選択される分析対象物
（例えばアンフェタミン）と標識基（例えば発色剤、ポ
リアミノ連結微小粒子または酵素等）との間の連結アー
ムに、他方の分析対象物と共通する特徴（例えばアンフ
ェタミンのベンゼン環）を有する分析対象物の側部であ
って、その構造的に特徴的部分から離れた部位に重要な
部分を含み、前記連結アームのこの部分は、標的分析対
象物に対する抗体を生成させる為に使用される免疫原に
存在する連結アームに対して少なくとも相同的、好まし
くは同じである。
（例えばアンフェタミン）と標識基（例えば発色剤、ポ
リアミノ連結微小粒子または酵素等）との間の連結アー
ムに、他方の分析対象物と共通する特徴（例えばアンフ
ェタミンのベンゼン環）を有する分析対象物の側部であ
って、その構造的に特徴的部分から離れた部位に重要な
部分を含み、前記連結アームのこの部分は、標的分析対
象物に対する抗体を生成させる為に使用される免疫原に
存在する連結アームに対して少なくとも相同的、好まし
くは同じである。
【０００７】連結アームの残る部分は、標識部分を連結
するためにこの技術分野で典型的に使用される、例えば
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルまたはイソチオシアナ
ト基等から選択される反応性スペースリンカー基であっ
てよい。標識構造物の蛋白質部分に結合する場合に典型
的な好ましい方法は、蛋白質上のリジンのアミノ基と、
イソチオシアナト基：
するためにこの技術分野で典型的に使用される、例えば
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルまたはイソチオシアナ
ト基等から選択される反応性スペースリンカー基であっ
てよい。標識構造物の蛋白質部分に結合する場合に典型
的な好ましい方法は、蛋白質上のリジンのアミノ基と、
イソチオシアナト基：
【０００８】
【化９】
【０００９】式中、Ｘは場合によりアルキルＣ１−１０
またはフェニル低級（Ｃ１−４）アルキル基等の付加的
なスペーサ基である、 を介して形成されるチオ尿素結合である。
またはフェニル低級（Ｃ１−４）アルキル基等の付加的
なスペーサ基である、 を介して形成されるチオ尿素結合である。
【００１０】本発明によるメトアンフェタミン／アンフ
ェタミンラテックス凝集免疫アッセイのためには、免疫
学的に反応性の連結アームは、アンフェタミンまたはメ
トアンフェタミンのベンゼン環のパラ位に結合されるべ
きである。いずれの分析対象物の単一分析対象物標識分
子に対する選択的抗体についても充分な共通的認識を生
じさせるために、連結アームは、少なくとも１個の複素
原子官能基を有さなければならない。本発明の標識分子
の連結アームは、好ましくは、免疫原分子のアミド結合
部分に似せるために選択される蛋白質の結合基に対し
て、結合される末端アミノ基を含む。従って、標識分析
対象物誘導体の好ましい連結アームは、式、 −ＮＨ−ＣＸ（ＣＨ2 ）n 式中、Ｘ＝Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮであり、ｎ＝１−６で
ある、 により表され、また免疫原に対する連結基は、−ＣＸ−
（ＣＨ2 ）n であり、ここで式中ｍは、各免疫原につい
て独立してｎと同じであるか、その±１である。
ェタミンラテックス凝集免疫アッセイのためには、免疫
学的に反応性の連結アームは、アンフェタミンまたはメ
トアンフェタミンのベンゼン環のパラ位に結合されるべ
きである。いずれの分析対象物の単一分析対象物標識分
子に対する選択的抗体についても充分な共通的認識を生
じさせるために、連結アームは、少なくとも１個の複素
原子官能基を有さなければならない。本発明の標識分子
の連結アームは、好ましくは、免疫原分子のアミド結合
部分に似せるために選択される蛋白質の結合基に対し
て、結合される末端アミノ基を含む。従って、標識分析
対象物誘導体の好ましい連結アームは、式、 −ＮＨ−ＣＸ（ＣＨ2 ）n 式中、Ｘ＝Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮであり、ｎ＝１−６で
ある、 により表され、また免疫原に対する連結基は、−ＣＸ−
（ＣＨ2 ）n であり、ここで式中ｍは、各免疫原につい
て独立してｎと同じであるか、その±１である。
【００１１】免疫原および抗体は、この技術分野で既知
の方法、例えば、米国特許第４，３２９，２８１号等に
従って調製される。式１および２は、本発明において使
用される好適なアンフェタミンおよびメトアンフェタミ
ン免疫原をそれぞれ示し、また式３は、好適なアンフェ
タミン微粒子標識試薬を示す。蛋白質に対するアミド結
合中に示されるアミノ基は、タンパク質から提供され
る。
の方法、例えば、米国特許第４，３２９，２８１号等に
従って調製される。式１および２は、本発明において使
用される好適なアンフェタミンおよびメトアンフェタミ
ン免疫原をそれぞれ示し、また式３は、好適なアンフェ
タミン微粒子標識試薬を示す。蛋白質に対するアミド結
合中に示されるアミノ基は、タンパク質から提供され
る。
【００１２】
【化１０】
【００１３】次いで、アンフェタミンおよびメトアンフ
ェタミン等の分析対象物の薬剤誘導体は、担体蛋白質に
対してこの分野で既知の方法によって、適当な連結アー
ムを介して共有的に結合され、そしてこれらの接合体
は、抗体形成を起こさせるために動物に注射される。ポ
リクローナルおよびモノクローナル抗体の両者ともに本
発明において使用されてよい。
ェタミン等の分析対象物の薬剤誘導体は、担体蛋白質に
対してこの分野で既知の方法によって、適当な連結アー
ムを介して共有的に結合され、そしてこれらの接合体
は、抗体形成を起こさせるために動物に注射される。ポ
リクローナルおよびモノクローナル抗体の両者ともに本
発明において使用されてよい。
【００１４】モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒおよ
びＭｉｌｓｔｅｉｎのＮａｔｕｒｅ，２５６，４９５−
４９７（１９７５）に記載の方法等、この分野で既知の
方法に従って創製されてよい。モノクローナル抗体を含
むハイブリドーマ細胞培養物上澄は、アンフェタミン／
メトアンフェタミンアッセイの場合において、アンフェ
タミンモノクローナル抗体に対しては、アンフェタミン
−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）被覆ポリスチレンマイ
クロタイタープレート、またメトアンフェタミンモノク
ローナルに対しては、メトアンフェタミン−ＢＳＡ被覆
ポリスチレンマイクロタイタープレートを使用する典型
的ＥＬＩＳＡ法によって選択される。ＢＳＡ被覆と共に
使用されるアンフェタミンおよびメトアンフェタミン誘
導体類は、免疫原と共に使用されるものと同じである。
モノクローナル抗体類は、アルカリホスファターゼに接
合される抗−マウス抗体を用いたスクリーニング等の既
知方法によって検出される。モノクローナル抗体の最終
的スクリーニングは、ＥＬＩＳＡ法およびそれに続く該
アッセイ系における分析によって達成される。
びＭｉｌｓｔｅｉｎのＮａｔｕｒｅ，２５６，４９５−
４９７（１９７５）に記載の方法等、この分野で既知の
方法に従って創製されてよい。モノクローナル抗体を含
むハイブリドーマ細胞培養物上澄は、アンフェタミン／
メトアンフェタミンアッセイの場合において、アンフェ
タミンモノクローナル抗体に対しては、アンフェタミン
−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）被覆ポリスチレンマイ
クロタイタープレート、またメトアンフェタミンモノク
ローナルに対しては、メトアンフェタミン−ＢＳＡ被覆
ポリスチレンマイクロタイタープレートを使用する典型
的ＥＬＩＳＡ法によって選択される。ＢＳＡ被覆と共に
使用されるアンフェタミンおよびメトアンフェタミン誘
導体類は、免疫原と共に使用されるものと同じである。
モノクローナル抗体類は、アルカリホスファターゼに接
合される抗−マウス抗体を用いたスクリーニング等の既
知方法によって検出される。モノクローナル抗体の最終
的スクリーニングは、ＥＬＩＳＡ法およびそれに続く該
アッセイ系における分析によって達成される。
【００１５】ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートスク
リーニングによって選択された抗体類は、プレート上の
抗原に対して強い結合を示す。強い結合に加えて、抗体
類は、アンフェタミン抗体類については遊離のアンフェ
タミン、メトアンフェタミン抗体類については遊離のメ
トアンフェタミンの存在下で良好な置換を示さなければ
ならない。最後に、選択される抗体類は、遊離のアンフ
ェタミン関連市販薬（ＯＴＣ）に対して低い交差反応性
を示すものでなければならない。
リーニングによって選択された抗体類は、プレート上の
抗原に対して強い結合を示す。強い結合に加えて、抗体
類は、アンフェタミン抗体類については遊離のアンフェ
タミン、メトアンフェタミン抗体類については遊離のメ
トアンフェタミンの存在下で良好な置換を示さなければ
ならない。最後に、選択される抗体類は、遊離のアンフ
ェタミン関連市販薬（ＯＴＣ）に対して低い交差反応性
を示すものでなければならない。
【００１６】本発明の好ましい実施態様において、微粒
子試薬が使用され、これは興味ある物質に対して診断的
に選択性のある免疫学的結合対の一方の成分によって被
覆された微粒子を導入するものである。該微粒子は、均
質に分散して保たれる。相補的結合パートナーの存在下
での動力学的相互作用によって、該微粒子は凝集して光
学密度の変化を生じる。
子試薬が使用され、これは興味ある物質に対して診断的
に選択性のある免疫学的結合対の一方の成分によって被
覆された微粒子を導入するものである。該微粒子は、均
質に分散して保たれる。相補的結合パートナーの存在下
での動力学的相互作用によって、該微粒子は凝集して光
学密度の変化を生じる。
【００１７】蛍光偏光免疫アッセイのためには、抗体類
は、米国特許第４，８６８，１３２号に従って、調製さ
れ、対応する蛍光標識は、免疫原を形成するために使用
されたものと同様な誘導体から合成される。ＲＩＡの場
合には、抗体類は米国特許第４，３２９，２８１号に従
って調製される。対応する標識は、チラミンを米国特許
第４，３２９，２８１号に記述される保護された活性ア
ンフェタミン誘導体に結合し、保護機を除去し、米国特
許第４，０４１０７６号に従って、125 Ｉによりヨウ素
化することによって創製される。ＥＩＡの場合には、免
疫原は、米国特許第３，８７８，１８７号および第４，
０６９，１０５号に従って生成される。対応する標識
は、それらが酵素（すなわちグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、リゾチーム等）に結合されるものでは
あるが、同様な誘導体が採用される。それぞれの場合
に、標識は対応する抗体の生成に使用する免疫原のそれ
ぞれに相同的な連結部分を含み、またアッセイの展開
は、上述したスクリーニング法に従う。
は、米国特許第４，８６８，１３２号に従って、調製さ
れ、対応する蛍光標識は、免疫原を形成するために使用
されたものと同様な誘導体から合成される。ＲＩＡの場
合には、抗体類は米国特許第４，３２９，２８１号に従
って調製される。対応する標識は、チラミンを米国特許
第４，３２９，２８１号に記述される保護された活性ア
ンフェタミン誘導体に結合し、保護機を除去し、米国特
許第４，０４１０７６号に従って、125 Ｉによりヨウ素
化することによって創製される。ＥＩＡの場合には、免
疫原は、米国特許第３，８７８，１８７号および第４，
０６９，１０５号に従って生成される。対応する標識
は、それらが酵素（すなわちグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、リゾチーム等）に結合されるものでは
あるが、同様な誘導体が採用される。それぞれの場合
に、標識は対応する抗体の生成に使用する免疫原のそれ
ぞれに相同的な連結部分を含み、またアッセイの展開
は、上述したスクリーニング法に従う。
【００１８】選択方法は、アンフェタミン−ＢＳＡ感受
化マイクロビーズに結合可能であり、かつ診断的に重要
な範囲において１００ミリ吸光度単位（ｍＭ）以上の置
換を与え得るアンフェタミン抗体の選択を含む。
化マイクロビーズに結合可能であり、かつ診断的に重要
な範囲において１００ミリ吸光度単位（ｍＭ）以上の置
換を与え得るアンフェタミン抗体の選択を含む。
【００１９】加えて、選択される抗体は、アンフェタミ
ン関連類似体に対してアンフェタミンに相対的に５％未
満の交差反応性を有するべきである。
ン関連類似体に対してアンフェタミンに相対的に５％未
満の交差反応性を有するべきである。
【００２０】メトアンフェタミン抗体の選択に関する選
択方法は、アンフェタミンでの方法に使用されたものと
同様である。異なる点は、微粒子上で使用される誘導体
がメトアンフェタミン誘導体であり、かつ抗体の置換が
メトアンフェタミンによって行われることのみである。
択方法は、アンフェタミンでの方法に使用されたものと
同様である。異なる点は、微粒子上で使用される誘導体
がメトアンフェタミン誘導体であり、かつ抗体の置換が
メトアンフェタミンによって行われることのみである。
【００２１】アンフェタミンおよびメトアンフェタミン
の場合の両者において、免疫およびスクリーニング出使
用される誘導体は、連結アーム中に構造的類似性を有し
ていた。このことは、式１を式３と比較することによっ
て分かる。
の場合の両者において、免疫およびスクリーニング出使
用される誘導体は、連結アーム中に構造的類似性を有し
ていた。このことは、式１を式３と比較することによっ
て分かる。
【００２２】表１は、式１および式２の免疫原を使用し
て本発明に従って選択されたアンフェタミンおよびメト
アンフェタミンモノクローナル抗体の典型的な低い交差
反応性を例示している。
て本発明に従って選択されたアンフェタミンおよびメト
アンフェタミンモノクローナル抗体の典型的な低い交差
反応性を例示している。
【００２３】
【表１】
【００２４】一旦適切な抗体が選択された後には、アッ
セイはメトアンフェタミン抗体がアンフェタミン標識に
結合するか、あるいはアンフェタミン抗体がメトアンフ
ェタミン標識に結合するか否かを測定することによって
作り上げられる。本発明の好適なアッセイにおいて、メ
トアンフェタミン抗体は、微粒子の凝集を生じるために
充分な程度にアンフェタミン標識に結合し、かつアンフ
ェタミン抗体は微粒子の凝集を生じるために充分な程度
にはアンフェタミン標識に結合しなかった。
セイはメトアンフェタミン抗体がアンフェタミン標識に
結合するか、あるいはアンフェタミン抗体がメトアンフ
ェタミン標識に結合するか否かを測定することによって
作り上げられる。本発明の好適なアッセイにおいて、メ
トアンフェタミン抗体は、微粒子の凝集を生じるために
充分な程度にアンフェタミン標識に結合し、かつアンフ
ェタミン抗体は微粒子の凝集を生じるために充分な程度
にはアンフェタミン標識に結合しなかった。
【００２５】従って、微粒子をアンフェタミン誘導体と
共に使用することにより、２元作用アッセイは、アンフ
ェタミンおよびメトアンフェタミン抗体を使用して形成
される。
共に使用することにより、２元作用アッセイは、アンフ
ェタミンおよびメトアンフェタミン抗体を使用して形成
される。
【００２６】抗体類は、アッセイにおいて希釈して使用
され、これにより測定される分析対象物のそれぞれにつ
いて適切な感度を許容する。この特定のアッセイにおい
て、抗体濃度は、アッセイに添加されるメトアンフェタ
ミン含有試料が、それ自体では通常正の読み取り値を与
えないように調整される。検量線はｄ−アンフェタミン
標準（０〜２０００ｎｇ／ｍｌ）に基づき、また、正の
結果は、試料がアンフェタミンのみを含むか、または少
量のアンフェタミンの存在下にメトアンフェタミンを含
む場合にのみ達成される。
され、これにより測定される分析対象物のそれぞれにつ
いて適切な感度を許容する。この特定のアッセイにおい
て、抗体濃度は、アッセイに添加されるメトアンフェタ
ミン含有試料が、それ自体では通常正の読み取り値を与
えないように調整される。検量線はｄ−アンフェタミン
標準（０〜２０００ｎｇ／ｍｌ）に基づき、また、正の
結果は、試料がアンフェタミンのみを含むか、または少
量のアンフェタミンの存在下にメトアンフェタミンを含
む場合にのみ達成される。
【００２７】この構成は、メトアンフェタミンに構造的
に関連する多くの市販薬の交差反応正を低減することに
よって低い擬陽性率を与える。図１は、アンフェタミン
単独、およびアンフェタミンの存在下でのメトアンフェ
タミンに対するアッセイの投与量応答性を示している。
投与量応答曲線は、ラテックス凝集免疫アッセイを使用
して、アンフェタミン単独、および５００ｎｇ／ｍｌの
メトアンフェタミンとの組合わせにおけるアンフェタミ
ンにたいして作成された。メトアンフェタミン単独に対
する投与量応答性が極めて低いのに対し、アンフェタミ
ンの存在下でのメトアンフェタミンに対する投与量応答
性は極めて高い。
に関連する多くの市販薬の交差反応正を低減することに
よって低い擬陽性率を与える。図１は、アンフェタミン
単独、およびアンフェタミンの存在下でのメトアンフェ
タミンに対するアッセイの投与量応答性を示している。
投与量応答曲線は、ラテックス凝集免疫アッセイを使用
して、アンフェタミン単独、および５００ｎｇ／ｍｌの
メトアンフェタミンとの組合わせにおけるアンフェタミ
ンにたいして作成された。メトアンフェタミン単独に対
する投与量応答性が極めて低いのに対し、アンフェタミ
ンの存在下でのメトアンフェタミンに対する投与量応答
性は極めて高い。
【００２８】薬剤試験の基準は、試料が正であるという
ためにはメトアンフェタミン含有尿中にアンフェタミン
の存在を要求している。このことは、擬陽性を最少と
し、またメトアンフェタミンが部分的にアンフェタミン
に代謝されるという認識のために必要とされる（Ｂａｓ
ａｌｔ, Ｒ. Ｃ.,Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏ
ｘｉｃ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｉ
ｎ Ｍａｎ, ３版 Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｉｎｃ.,１９８９）。
ためにはメトアンフェタミン含有尿中にアンフェタミン
の存在を要求している。このことは、擬陽性を最少と
し、またメトアンフェタミンが部分的にアンフェタミン
に代謝されるという認識のために必要とされる（Ｂａｓ
ａｌｔ, Ｒ. Ｃ.,Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏ
ｘｉｃ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｉ
ｎ Ｍａｎ, ３版 Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｉｎｃ.,１９８９）。
【００２９】驚くべきことに、メトアンフェタミン抗体
の遊離のアンフェタミンに対する交差反応性が極めて低
いにもかかわらず、メトアンフェタミン抗体は、式１の
アンフェタミン標識に対して有意な結合を示した（表
１）。
の遊離のアンフェタミンに対する交差反応性が極めて低
いにもかかわらず、メトアンフェタミン抗体は、式１の
アンフェタミン標識に対して有意な結合を示した（表
１）。
【００３０】実際、メトアンフェタミン抗体のアンフェ
タミン標識に対する、凝集を生じるために有意な結合が
存在する。本発明の範囲をいずれの理論的機構に限定す
る意図は無くして、この結合は、メトアンフェタミン免
疫原（式２）の構造を試験し、それをアンフェタミン標
識と比較することによって説明されるであろう。アンフ
ェタミンそれ自体は、添加されるメトアンフェタミン抗
体に認識可能な程度には結合しないが、アンフェタミン
誘導体を蛋白質に結合する側鎖の認識が起こるであろ
う。しかしながら、メトアンフェタミン抗体の得意性は
メトアンフェタミンに対して高く保たれる。
タミン標識に対する、凝集を生じるために有意な結合が
存在する。本発明の範囲をいずれの理論的機構に限定す
る意図は無くして、この結合は、メトアンフェタミン免
疫原（式２）の構造を試験し、それをアンフェタミン標
識と比較することによって説明されるであろう。アンフ
ェタミンそれ自体は、添加されるメトアンフェタミン抗
体に認識可能な程度には結合しないが、アンフェタミン
誘導体を蛋白質に結合する側鎖の認識が起こるであろ
う。しかしながら、メトアンフェタミン抗体の得意性は
メトアンフェタミンに対して高く保たれる。
【００３１】本発明の免疫アッセイ試薬および方法は、
凝集反応によってもたらされる変化を測定するための装
置的方法に許容される任意の凝集測定様式において便利
に使用されるであろう。人的操作および自動化装置試験
の両者共に、そのような凝集測定分析に好適に使用され
るであろう。典型的には自動装置は、適量の各試薬を試
料に添加する為にピッペト分取する多種の試薬容器また
は貯蔵容器を使用して操作を行う。標記の凝集アッセイ
等の免疫アッセイのために、これは通常少なくとも、一
つには抗体試薬、他方には対応する抗原決定基に結合さ
れる微粒子の為の２種類の容器を含む。試料の適切な処
理のための希釈剤、緩衝溶液および／または他の添加剤
を含む付加的な容器／貯蔵器がある種の装置内にあって
もよい。
凝集反応によってもたらされる変化を測定するための装
置的方法に許容される任意の凝集測定様式において便利
に使用されるであろう。人的操作および自動化装置試験
の両者共に、そのような凝集測定分析に好適に使用され
るであろう。典型的には自動装置は、適量の各試薬を試
料に添加する為にピッペト分取する多種の試薬容器また
は貯蔵容器を使用して操作を行う。標記の凝集アッセイ
等の免疫アッセイのために、これは通常少なくとも、一
つには抗体試薬、他方には対応する抗原決定基に結合さ
れる微粒子の為の２種類の容器を含む。試料の適切な処
理のための希釈剤、緩衝溶液および／または他の添加剤
を含む付加的な容器／貯蔵器がある種の装置内にあって
もよい。
【００３２】
【実施例】例１ アンフェタミン標識の調製（Ｓ）−Ｎ−（１−メチル−２−フェニルエチル）フル
オロ−アセトアミド（１）の調製 アルゴンにより掃気し、氷浴中で冷却したトリエチルア
ミン（７５ｍｌ）中のｄ−アンフェタミンサルフェート
（２０．０ｇ，０．１０８ｍｏｌ）の混合物に、無水ト
リフルオロ酢酸（３１ｍｌ）を１５分間で滴々添加し
た。該反応物を、環境温度にて一夜撹拌した。次いで、
溶媒を減圧下で留去し、残渣をメチレンクロライド（２
００ｍｌ）中に溶解し、５％酒石酸水溶液（３ｘ２５０
ｍｌ）にて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、ろ過お
よび減圧下で濃縮して黄色油状物を得た。この物質をヘ
キサンエーテル混合物中で結晶化して、１４ｇの生成物
を得た。ＮＭＲは、予想される構造に一致した。
オロ−アセトアミド（１）の調製 アルゴンにより掃気し、氷浴中で冷却したトリエチルア
ミン（７５ｍｌ）中のｄ−アンフェタミンサルフェート
（２０．０ｇ，０．１０８ｍｏｌ）の混合物に、無水ト
リフルオロ酢酸（３１ｍｌ）を１５分間で滴々添加し
た。該反応物を、環境温度にて一夜撹拌した。次いで、
溶媒を減圧下で留去し、残渣をメチレンクロライド（２
００ｍｌ）中に溶解し、５％酒石酸水溶液（３ｘ２５０
ｍｌ）にて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、ろ過お
よび減圧下で濃縮して黄色油状物を得た。この物質をヘ
キサンエーテル混合物中で結晶化して、１４ｇの生成物
を得た。ＮＭＲは、予想される構造に一致した。
【００３３】（Ｓ）−４−［２−メチル−２−［（トリ
フルオロアセチル）アミノ］−エチル］−ｐ−オキソ−
ベンゼン酪酸（２）の調製：メチレンクロライド（２１
０ｍｌ）中の（１）（１２．０ｇ、０．０５ｍｏｌ）の
溶液に、アルゴン下で撹拌しつつ、無水コハク酸（８．
０ｇ，０．０８ｍｏｌ）を添加した。該反応物を氷浴中
で冷却し、次いで塩化アルミニウム（２８．０ｇ，０．
２１ｍｏｌ）を５分間で一部づつ添加した。該反応物
を、０−５℃にて２時間、次いで室温にて一夜撹拌し
た。次いで塩酸（３Ｎ、１２０ｍｌ）を徐々に添加し、
溶液を更に１時間撹拌した。メチレンクロライドを減圧
下で除去し、水性相を酢酸エチルにて抽出した。有機相
を乾燥させ（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、ろ過し、および減圧下で
溶媒を除去して黄褐色残渣を得、これをエーテルにて粉
砕して、１０．５ｇの生成物を得た。ＩＲ，ＮＭＲおよ
び質量分析は、予想される構造とすべて一致した。
フルオロアセチル）アミノ］−エチル］−ｐ−オキソ−
ベンゼン酪酸（２）の調製：メチレンクロライド（２１
０ｍｌ）中の（１）（１２．０ｇ、０．０５ｍｏｌ）の
溶液に、アルゴン下で撹拌しつつ、無水コハク酸（８．
０ｇ，０．０８ｍｏｌ）を添加した。該反応物を氷浴中
で冷却し、次いで塩化アルミニウム（２８．０ｇ，０．
２１ｍｏｌ）を５分間で一部づつ添加した。該反応物
を、０−５℃にて２時間、次いで室温にて一夜撹拌し
た。次いで塩酸（３Ｎ、１２０ｍｌ）を徐々に添加し、
溶液を更に１時間撹拌した。メチレンクロライドを減圧
下で除去し、水性相を酢酸エチルにて抽出した。有機相
を乾燥させ（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、ろ過し、および減圧下で
溶媒を除去して黄褐色残渣を得、これをエーテルにて粉
砕して、１０．５ｇの生成物を得た。ＩＲ，ＮＭＲおよ
び質量分析は、予想される構造とすべて一致した。
【００３４】（Ｓ）−４−［２−メチル−２−［（トリ
フルオロアセチル）アミノ］−エチル］−ベンゼン酪酸
（３）の調製：酢酸（４００ｍｌ）中の（２）（９．２
ｇ，０．０２７ｍｏｌ）および１０％の活性炭上パラジ
ウム（４．０ｇ）の混合物を，５０ｐｓｉにて２４時間
水素添加した。触媒をろ過により除去し、ろ液を減圧下
で濃縮し、残渣をエーテルにて粉砕して、７．０ｇの白
色生成物を得た。ＩＲ，ＮＭＲおよび質量分析（ＭＳ）
は、構造と一致した。
フルオロアセチル）アミノ］−エチル］−ベンゼン酪酸
（３）の調製：酢酸（４００ｍｌ）中の（２）（９．２
ｇ，０．０２７ｍｏｌ）および１０％の活性炭上パラジ
ウム（４．０ｇ）の混合物を，５０ｐｓｉにて２４時間
水素添加した。触媒をろ過により除去し、ろ液を減圧下
で濃縮し、残渣をエーテルにて粉砕して、７．０ｇの白
色生成物を得た。ＩＲ，ＮＭＲおよび質量分析（ＭＳ）
は、構造と一致した。
【００３５】（Ｓ）−Ｎ−［２−｛４−｛４−｛（２，
５−ジオキソ−１−ピロリジニル）−オキソ］−４−オ
キソブチル］フェニル］−１−メチルエチル］−２−ト
リフルオロアセタミド（４）の調製： メチレンクロライド（１５０ｍｌ）中の（３）（５．４
ｇ、０．０１９ｍｏｌ）の撹拌溶液に、テトラヒドロフ
ラン（１５０ｍｌ）、ジメチルホルムアミド（５０ｍ
ｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．７ｇ、０．
０２３ｍｏｌ）および１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチル カルボジイミド ハイドロクロライ
ド（６．０ｇ、０．０３１ｍｏｌ）を添加した。該反応
物を室温にて一夜撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。得
られた残渣をメチレンクロライドに溶解し、ろ過し、シ
リカゲルクロマトグラフィ（溶離液として、７％エーテ
ル−メチレンクロライド）により精製して、黄色油状物
を得、これをエーテルから結晶化して、３．７ｇの白色
生成物を得た。ＩＲ，ＮＭＲおよびＭＳは、構造と一致
した。
５−ジオキソ−１−ピロリジニル）−オキソ］−４−オ
キソブチル］フェニル］−１−メチルエチル］−２−ト
リフルオロアセタミド（４）の調製： メチレンクロライド（１５０ｍｌ）中の（３）（５．４
ｇ、０．０１９ｍｏｌ）の撹拌溶液に、テトラヒドロフ
ラン（１５０ｍｌ）、ジメチルホルムアミド（５０ｍ
ｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．７ｇ、０．
０２３ｍｏｌ）および１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチル カルボジイミド ハイドロクロライ
ド（６．０ｇ、０．０３１ｍｏｌ）を添加した。該反応
物を室温にて一夜撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。得
られた残渣をメチレンクロライドに溶解し、ろ過し、シ
リカゲルクロマトグラフィ（溶離液として、７％エーテ
ル−メチレンクロライド）により精製して、黄色油状物
を得、これをエーテルから結晶化して、３．７ｇの白色
生成物を得た。ＩＲ，ＮＭＲおよびＭＳは、構造と一致
した。
【００３６】（Ｓ）−Ｎ−（４−イソチオシアナトノフ
ェニル）エチル）−４−４−（２−（トリフルオロアセ
タミド）プロピル）ベンゼンブトアミドの調製：８ｍｌ
のＣＨ2 Ｃｌ2 中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導
体（４）（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）にｐ−アミ
ノフェネチルアミン（６５．７ｍｇ、０．４８ｍｍｏ
ｌ）および０．５ｍｌのピリジンを添加した。該反応混
合物を２４時間撹拌し、次いでＣＨ2 Ｃｌ2 を減圧下で
除去し、ベージュの固体を得た。この固体を調製用シリ
カゲルプレート（厚さ２．０ｍｍ）に載せ、ＣＨ2 Ｃｌ
2 ／ＭｅＯＨ（９５：５）混合物にて展開した。所望の
バンドを単離し、シリカゲルを無水エチルアルコールに
てブフナー漏斗を用いて数回抽出し、溶媒を減圧下で除
去してベージュの固体、１２５ｍｇ（６０％）を得た。
Ｒｆ：０．３５（９５：５ ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯ
Ｈ）。
ェニル）エチル）−４−４−（２−（トリフルオロアセ
タミド）プロピル）ベンゼンブトアミドの調製：８ｍｌ
のＣＨ2 Ｃｌ2 中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導
体（４）（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）にｐ−アミ
ノフェネチルアミン（６５．７ｍｇ、０．４８ｍｍｏ
ｌ）および０．５ｍｌのピリジンを添加した。該反応混
合物を２４時間撹拌し、次いでＣＨ2 Ｃｌ2 を減圧下で
除去し、ベージュの固体を得た。この固体を調製用シリ
カゲルプレート（厚さ２．０ｍｍ）に載せ、ＣＨ2 Ｃｌ
2 ／ＭｅＯＨ（９５：５）混合物にて展開した。所望の
バンドを単離し、シリカゲルを無水エチルアルコールに
てブフナー漏斗を用いて数回抽出し、溶媒を減圧下で除
去してベージュの固体、１２５ｍｇ（６０％）を得た。
Ｒｆ：０．３５（９５：５ ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯ
Ｈ）。
【００３７】上記のアミノフェネチルアミド付加物（９
４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、３ｍｌのＴＨＦ、３ｍ
ｌのＨ2 Ｏおよび１ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3 に溶解し
た。氷浴にて１５分間冷却した後、チオホスゲン（３３
ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。これを
更に３０分間撹拌した後、該溶液のｐＨが３．０に達す
るまで希釈ＨＣｌ（０．１Ｎ）を添加した。次いでＴＨ
Ｆを減圧下で除去した。該水溶液を、ＣＨＣｌ3 にて３
回抽出し、合わせた有機相をＨ2 Ｏにて洗浄し、無水Ｎ
ａ2 ＳＯ4 にて乾燥させた。溶媒の除去により、ベージ
ュの固体６３ｍｇ（６０％）を得た。Ｒｆ：０．５９
（９５：５ ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ）ＮＭＲは、予想
される構造と一致した。
４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、３ｍｌのＴＨＦ、３ｍ
ｌのＨ2 Ｏおよび１ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3 に溶解し
た。氷浴にて１５分間冷却した後、チオホスゲン（３３
ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。これを
更に３０分間撹拌した後、該溶液のｐＨが３．０に達す
るまで希釈ＨＣｌ（０．１Ｎ）を添加した。次いでＴＨ
Ｆを減圧下で除去した。該水溶液を、ＣＨＣｌ3 にて３
回抽出し、合わせた有機相をＨ2 Ｏにて洗浄し、無水Ｎ
ａ2 ＳＯ4 にて乾燥させた。溶媒の除去により、ベージ
ュの固体６３ｍｇ（６０％）を得た。Ｒｆ：０．５９
（９５：５ ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ）ＮＭＲは、予想
される構造と一致した。
【００３８】アンフェタミン−ＢＳＡ接合体の調製 材料： ＢＳＡ、フラクションＶ、試薬級、アンフェタミ
ン誘導体、分子量４７７．５５ｍｇ／ｍＭ、ジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
溶液 ｐＨ＝８．０（ＫＰｉ緩衝溶液）、５０ｍＭの炭
酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ１１．３）、アンフェタミ
ンの保存溶液（５ｍｇ／ｍｌ）：１．０ｍｌのＤＭＳＯ
中に５ｍｇのアンフェタミン、透析膜 ２５，０００Ｍ
ＷＣＯ。
ン誘導体、分子量４７７．５５ｍｇ／ｍＭ、ジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
溶液 ｐＨ＝８．０（ＫＰｉ緩衝溶液）、５０ｍＭの炭
酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ１１．３）、アンフェタミ
ンの保存溶液（５ｍｇ／ｍｌ）：１．０ｍｌのＤＭＳＯ
中に５ｍｇのアンフェタミン、透析膜 ２５，０００Ｍ
ＷＣＯ。
【００３９】方法 接合されるＢＳＡを、６９ｍｇを１．２４ｍｌのリン酸
緩衝溶液（ｐＨ８）に溶解することによって調製した。
蛋白質を完全に溶解した後に、該溶液を氷浴中で冷却し
た。撹拌しつつ、ＤＭＳＯ（１．５１ｍｌ）を蛋白質溶
液に滴々添加し、次いでこれを室温にした。この時点
で、アンフェタミン誘導体の保存溶液が新たに調製され
てよい（上記参照）。アンフェタミン誘導体の該保存溶
液（０．１０ｍｌ）は、ＤＭＳＯ／緩衝溶液中の蛋白質
に添加される。該反応は、室温にて一夜撹拌して継続さ
れる。接合体は、最初に３５ｍｌのＫＰｉ緩衝溶液（ｐ
Ｈ７．５）にて希釈された１５ｍｌのＤＭＳＯに対して
室温にて透析され、次いで４５ｍｌのＫＰｉ緩衝溶液に
て希釈された５ｍｌのＤＭＳＯに対して透析される。次
いで透析が、ＫＰｉ緩衝溶液に対して４℃にて継続され
る。回収される接合体は、８０ｎｍにて蛋白質濃度が評
価される。
緩衝溶液（ｐＨ８）に溶解することによって調製した。
蛋白質を完全に溶解した後に、該溶液を氷浴中で冷却し
た。撹拌しつつ、ＤＭＳＯ（１．５１ｍｌ）を蛋白質溶
液に滴々添加し、次いでこれを室温にした。この時点
で、アンフェタミン誘導体の保存溶液が新たに調製され
てよい（上記参照）。アンフェタミン誘導体の該保存溶
液（０．１０ｍｌ）は、ＤＭＳＯ／緩衝溶液中の蛋白質
に添加される。該反応は、室温にて一夜撹拌して継続さ
れる。接合体は、最初に３５ｍｌのＫＰｉ緩衝溶液（ｐ
Ｈ７．５）にて希釈された１５ｍｌのＤＭＳＯに対して
室温にて透析され、次いで４５ｍｌのＫＰｉ緩衝溶液に
て希釈された５ｍｌのＤＭＳＯに対して透析される。次
いで透析が、ＫＰｉ緩衝溶液に対して４℃にて継続され
る。回収される接合体は、８０ｎｍにて蛋白質濃度が評
価される。
【００４０】次いで、蛋白質接合体は、ＫＰｉ緩衝溶液
（ｐＨ７．５）中に１２．０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈さ
れ、炭酸緩衝溶液（ｐＨ１１．３）中で透析される（８
倍の体積、３日間にわたって９回）。次いで接合体は、
第２の炭酸緩衝溶液に対して透析される（９倍の体積、
３日間にわたって６回）。
（ｐＨ７．５）中に１２．０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈さ
れ、炭酸緩衝溶液（ｐＨ１１．３）中で透析される（８
倍の体積、３日間にわたって９回）。次いで接合体は、
第２の炭酸緩衝溶液に対して透析される（９倍の体積、
３日間にわたって６回）。
【００４１】アンフェタミン−ＢＳＡ接合体を含む感作
微粒子の調製： 材料： カルボキシル化ポリスチレン微粒子（直径０．１
−０．１３ｕｍ，Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．製造）、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（ＮＨＢ；Ｈ2 Ｏ）、１−シク
ロヘキシル−３（２−モルホリノエチル）カルボジイミ
ド メト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）、トラ
イトンＸ−１００、アンフェタミン−ＢＳＡ接合体、５
０ｍＭ重炭酸ナトリウム ｐＨ８．６、ＢＳＡフラクシ
ョンＶ 試薬級、１０ｍＭのＫＰｉ緩衝溶液、ｐＨ７．
５、０．１％アジ化ナトリウム、および０．１％トライ
トンＸ−１００（微粒子保存緩衝溶液）。
微粒子の調製： 材料： カルボキシル化ポリスチレン微粒子（直径０．１
−０．１３ｕｍ，Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．製造）、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（ＮＨＢ；Ｈ2 Ｏ）、１−シク
ロヘキシル−３（２−モルホリノエチル）カルボジイミ
ド メト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）、トラ
イトンＸ−１００、アンフェタミン−ＢＳＡ接合体、５
０ｍＭ重炭酸ナトリウム ｐＨ８．６、ＢＳＡフラクシ
ョンＶ 試薬級、１０ｍＭのＫＰｉ緩衝溶液、ｐＨ７．
５、０．１％アジ化ナトリウム、および０．１％トライ
トンＸ−１００（微粒子保存緩衝溶液）。
【００４２】方法：製造者から供給を受けたままのカル
ボキシル化微粒子（８．０ｍｌ中に１０％の固体）を、
洗浄剤を置換するために洗浄した。脱イオン水中の０．
１％トライトンＸ−１００を、体積で１：１，０００，
０００以上の全希釈の為に使用した。０．１％トライト
ンＸ−１００中の洗浄ラテックスを、５００ｎｍにおけ
るラテックス濃度標準曲線から、０．１％トライトンＸ
−１００中、固体３％となるように調整した。
ボキシル化微粒子（８．０ｍｌ中に１０％の固体）を、
洗浄剤を置換するために洗浄した。脱イオン水中の０．
１％トライトンＸ−１００を、体積で１：１，０００，
０００以上の全希釈の為に使用した。０．１％トライト
ンＸ−１００中の洗浄ラテックスを、５００ｎｍにおけ
るラテックス濃度標準曲線から、０．１％トライトンＸ
−１００中、固体３％となるように調整した。
【００４３】ＮＨＢの保存溶液を、３１ｍｇのＮＨＢを
０．５ｍｌのＤＭＦに溶解し、これに脱イオン水（０．
７５ｍｌ）を添加することによって調整した（２５ｍｇ
ＮＨＢ／ｍｌ）。調製した微粒子溶液（２０ｍｌ）を急
速に撹拌しつつ、これに室温にてＮＨＢ溶液（１．２５
ｍｌ）を急速に滴下して添加した。該溶液を１０分間撹
拌し、この間にＣＭＣの保存溶液を調製した。
０．５ｍｌのＤＭＦに溶解し、これに脱イオン水（０．
７５ｍｌ）を添加することによって調整した（２５ｍｇ
ＮＨＢ／ｍｌ）。調製した微粒子溶液（２０ｍｌ）を急
速に撹拌しつつ、これに室温にてＮＨＢ溶液（１．２５
ｍｌ）を急速に滴下して添加した。該溶液を１０分間撹
拌し、この間にＣＭＣの保存溶液を調製した。
【００４４】ＣＭＣの保存溶液を、８６ｍｇのＣＭＣを
１．７３ｍｌの脱イオン水に溶解することによって調製
した（５０ｍｇＣＭＣ／ｍｌ）。急速に撹拌しつつ、上
記で調製された微粒子溶液に１．７３ｍｌを急速に添加
した。この添加に続いて、該反応物を室温にて３時間撹
拌した。過剰の活性化試薬を、該微粒子調製物を再度
０．１％トライトンＸ−１００にて全希釈１：１，００
０，０００となるように洗浄することによって除去し
た。微粒子を、５００ｎｍにおけるラテックス濃度標準
曲線との比較によって、固体２％となるように調整し
た。
１．７３ｍｌの脱イオン水に溶解することによって調製
した（５０ｍｇＣＭＣ／ｍｌ）。急速に撹拌しつつ、上
記で調製された微粒子溶液に１．７３ｍｌを急速に添加
した。この添加に続いて、該反応物を室温にて３時間撹
拌した。過剰の活性化試薬を、該微粒子調製物を再度
０．１％トライトンＸ−１００にて全希釈１：１，００
０，０００となるように洗浄することによって除去し
た。微粒子を、５００ｎｍにおけるラテックス濃度標準
曲線との比較によって、固体２％となるように調整し
た。
【００４５】先に調製したＢＳＡ接合体を、以下のよう
にして微粒子の感作に使用した。接合体（１５．６ｍ
ｇ）を、５０ｍＭの重炭酸ナトリウムｐＨ８．５を用い
て５ｍｇ接合体ＢＳＡ／ｍｌに希釈した。ウシ血清アル
ブミンフラクションＶ、試薬級（１０９．４ｍｇ）を２
１．８８ｍｌの重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．５に溶解し
た（５ｍｇＢＳＡ／ｍｌ）。次いで、ＢＳＡ（２１．８
８ｍｌ）およびＢＳＡ接合体（３．１２ｍｌ）溶液を合
わせて全体積２５ｍｌの５ｍｌＢＳＡ／ｍｌとした。該
蛋白質溶液を激しく撹拌しつつ、活性化微粒子（２５ｍ
ｌ）を急速に添加した。該反応物を一夜混合した。次い
で非結合ＢＳＡ接合体を、充分な洗浄により除去した。
最終ラテックス懸濁物を、１０ｍＭＫＰｉ、０．１％ト
ライトンＸ−１００、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ
７．５により、および１０ｍＭＫＰｉ、０．１％アジ化
ナトリウム、ｐＨ７．５により、最終微粒子試薬が、１
０ｍＭＫＰｉ、０．１％トライトンＸ−１００、０．１
％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．５中、０．７％の固体と
なるように希釈した。微粒子の固体の百分率は、５００
ｎｍにおける微粒子濃度の標準曲線との比較によって決
定した。
にして微粒子の感作に使用した。接合体（１５．６ｍ
ｇ）を、５０ｍＭの重炭酸ナトリウムｐＨ８．５を用い
て５ｍｇ接合体ＢＳＡ／ｍｌに希釈した。ウシ血清アル
ブミンフラクションＶ、試薬級（１０９．４ｍｇ）を２
１．８８ｍｌの重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．５に溶解し
た（５ｍｇＢＳＡ／ｍｌ）。次いで、ＢＳＡ（２１．８
８ｍｌ）およびＢＳＡ接合体（３．１２ｍｌ）溶液を合
わせて全体積２５ｍｌの５ｍｌＢＳＡ／ｍｌとした。該
蛋白質溶液を激しく撹拌しつつ、活性化微粒子（２５ｍ
ｌ）を急速に添加した。該反応物を一夜混合した。次い
で非結合ＢＳＡ接合体を、充分な洗浄により除去した。
最終ラテックス懸濁物を、１０ｍＭＫＰｉ、０．１％ト
ライトンＸ−１００、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ
７．５により、および１０ｍＭＫＰｉ、０．１％アジ化
ナトリウム、ｐＨ７．５により、最終微粒子試薬が、１
０ｍＭＫＰｉ、０．１％トライトンＸ−１００、０．１
％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．５中、０．７％の固体と
なるように希釈した。微粒子の固体の百分率は、５００
ｎｍにおける微粒子濃度の標準曲線との比較によって決
定した。
【００４６】例２ アンフェタミン／メトアンフェタミンアッセイ 試験用抗血清試薬の調製： アンフェタミンおよびメトア
ンフェタミンに対して選択的なマウスモノクローナル抗
体を、米国特許第４，３２９，２８１号の例６、１３お
よび１４の方法に従って、ウシチログロブリンを担体蛋
白質として使用して調製された免疫原から生成させた。
次いで、モノクローナル抗体を、ｐＨ７．５の水溶液中
に適切に希釈した： １． ０．０５Ｍリン酸カリウム ２． ０．０１％ウシ血清アルブミン ３． ０．５％塩化ナトリウム ４． ０．１％アジ化ナトリウム
ンフェタミンに対して選択的なマウスモノクローナル抗
体を、米国特許第４，３２９，２８１号の例６、１３お
よび１４の方法に従って、ウシチログロブリンを担体蛋
白質として使用して調製された免疫原から生成させた。
次いで、モノクローナル抗体を、ｐＨ７．５の水溶液中
に適切に希釈した： １． ０．０５Ｍリン酸カリウム ２． ０．０１％ウシ血清アルブミン ３． ０．５％塩化ナトリウム ４． ０．１％アジ化ナトリウム
【００４７】アンフェタミンおよびメトアンフェタミン
抗体の比率および濃度は、０〜１０００ｎｇ／ｍｌのｄ
−アンフェタミンで約２００ミリ吸光度単位（ｍＡ）の
スパンが達成され、１０００〜２０００ｎｇ／ｍｌで約
４５ｍＡのスパンが達成されるように調整される。加え
て、５００ｎｇ／ｍｌのｄ−メトアンフェタミンを伴う
２００ｎｇ／ｍｌのｄ−アンフェタミンは、１０００ｎ
ｇ／ｍｌのｄ−アンフェタミン標準と同様な読み取り値
を与える。
抗体の比率および濃度は、０〜１０００ｎｇ／ｍｌのｄ
−アンフェタミンで約２００ミリ吸光度単位（ｍＡ）の
スパンが達成され、１０００〜２０００ｎｇ／ｍｌで約
４５ｍＡのスパンが達成されるように調整される。加え
て、５００ｎｇ／ｍｌのｄ−メトアンフェタミンを伴う
２００ｎｇ／ｍｌのｄ−アンフェタミンは、１０００ｎ
ｇ／ｍｌのｄ−アンフェタミン標準と同様な読み取り値
を与える。
【００４８】次いで一連の検定を、以下のグリッドに従
って、アンフェタミンおよびメトアンフェタミン抗体の
希釈に対して行う。
って、アンフェタミンおよびメトアンフェタミン抗体の
希釈に対して行う。
【００４９】
【表２】
【００５０】こうして決定された濃度は、所望の切り捨
て感度を達成するために、特定の点の周辺において濃度
のわずかな変化を試験することによって微調整される
（図１参照）。
て感度を達成するために、特定の点の周辺において濃度
のわずかな変化を試験することによって微調整される
（図１参照）。
【００５１】試験用試料希釈剤の調整：反応用緩衝溶液
は、ｐＨ７．０の水溶液である。 １． ０．０５Ｍ ＰＩＰＥＳ［１，４−ピペラジンビ
ス（エタンスルホン酸）および二ナトリウム塩］ ２． ２．５％ＰＶＰ［ポリビニルピロリドン］３６０ ３． ２．０％塩化ナトリウム ４． ０．１％アジ化ナトリウム ５． ０．０２５％フォーマスタ、ＦＬＤ
は、ｐＨ７．０の水溶液である。 １． ０．０５Ｍ ＰＩＰＥＳ［１，４−ピペラジンビ
ス（エタンスルホン酸）および二ナトリウム塩］ ２． ２．５％ＰＶＰ［ポリビニルピロリドン］３６０ ３． ２．０％塩化ナトリウム ４． ０．１％アジ化ナトリウム ５． ０．０２５％フォーマスタ、ＦＬＤ
【００５２】アンフェタミン乱用のアッセイ 診断的スクリーニングアッセイを，ＲＯＣＨＥ ＣＯＢ
ＡＳ ＭＩＲＡにて実施した。標準を、０．１％アジ化
ナトリウムを含む薬剤非含有の健常人の尿にｄ−アンフ
ェタミンを添加することによって調製した。この臨床分
析装置は、登載される試薬および試料を１個のキュベッ
ト中にピペット分取し、ここで競合的凝集反応が起こ
り、濁度の測定が行われる。試薬の移送は、２段階で行
われる。段階１：２０マイクロリットルの尿試料が７５
μｌの試料希釈剤と共にキュベット中にピペット分取さ
れ、続いて直ちに１００μｌの抗体試薬が混合される。
最初の分光学的測定が行われる。２５秒後、段階２：３
０μｌの微粒子試薬が、６５μｌの水と共にキュベット
中に移送され、反応物に混合される。段階２の約１５０
秒後に、濁度の最終測定が行われる。反応における濁度
の全体の変化が、検量線と比較され、結果がｎｇ／ｍｌ
にて報告される。
ＡＳ ＭＩＲＡにて実施した。標準を、０．１％アジ化
ナトリウムを含む薬剤非含有の健常人の尿にｄ−アンフ
ェタミンを添加することによって調製した。この臨床分
析装置は、登載される試薬および試料を１個のキュベッ
ト中にピペット分取し、ここで競合的凝集反応が起こ
り、濁度の測定が行われる。試薬の移送は、２段階で行
われる。段階１：２０マイクロリットルの尿試料が７５
μｌの試料希釈剤と共にキュベット中にピペット分取さ
れ、続いて直ちに１００μｌの抗体試薬が混合される。
最初の分光学的測定が行われる。２５秒後、段階２：３
０μｌの微粒子試薬が、６５μｌの水と共にキュベット
中に移送され、反応物に混合される。段階２の約１５０
秒後に、濁度の最終測定が行われる。反応における濁度
の全体の変化が、検量線と比較され、結果がｎｇ／ｍｌ
にて報告される。
【００５３】これらのアッセイ成分と抗体力価は、１０
００ｎｇ／ｍｌのｄ−アンフェタミンおよび５００ｎｇ
／ｍｌのｄ−メトアンフェタミンを伴った２００ｎｇ／
ｍｌのｄ−アンフェタミンのＮＩＤＡ切捨値近傍で所望
の性能の特性を持った標準曲線を与える（図１）。更
に、表２はアンフェタミン関連薬剤の数種についてのこ
のアッセイが有する交差反応性を示す。以下の構造的に
関連する化合物が、交差反応性について試験された。化
合物は、貯留人尿中に調製された。結果は、１０００ｎ
ｇ／ｍｌのｄ−アンフェタミンと同等な応答を生じる薬
剤濃度で表してある。
００ｎｇ／ｍｌのｄ−アンフェタミンおよび５００ｎｇ
／ｍｌのｄ−メトアンフェタミンを伴った２００ｎｇ／
ｍｌのｄ−アンフェタミンのＮＩＤＡ切捨値近傍で所望
の性能の特性を持った標準曲線を与える（図１）。更
に、表２はアンフェタミン関連薬剤の数種についてのこ
のアッセイが有する交差反応性を示す。以下の構造的に
関連する化合物が、交差反応性について試験された。化
合物は、貯留人尿中に調製された。結果は、１０００ｎ
ｇ／ｍｌのｄ−アンフェタミンと同等な応答を生じる薬
剤濃度で表してある。
【００５４】
【表３】
【図１】図は、例２において得られた本発明にかかるア
ッセイの特性を示す検量線図の一例である。
ッセイの特性を示す検量線図の一例である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−503215（ＪＰ，Ａ) 米国特許4329281（ＵＳ，Ａ)
Claims (7)
- 【請求項１】 アンフェタミンに対して選択性を有す
る１種類の抗体およびメトアンフェタミンに対して選択
性を有する１種類の抗体を使用するアンフェタミン検出
またはアンフェタミン存在下におけるメトアンフェタミ
ン検出用２元分析対象免疫アッセイであって、該２種類
の分析対象物の一方の標識誘導体のみを使用することを
含んでなり、該標識誘導体が、両方の抗体に対して異な
るアフィニティをもって結合可能であることを特徴とす
る免疫アッセイ方法。 - 【請求項２】 該抗体が、モノクローナル抗体である請
求項１に記載の免疫アッセイ方法。 - 【請求項３】 該分析対象物が、微粒子標識され、かつ
アッセイ様式が凝集測定である請求項１に記載の免疫ア
ッセイ方法。 - 【請求項４】 アンフェタミンに対して選択性を有する
モノクローナル抗体が式： 【化１】 の免疫原から創製され、メトアンフェタミンに対して選
択性を有するモノクローナル抗体が式： 【化２】 の免疫原から創製され、かつアンフェタミン誘導体の標
識誘導体が、式： 【化３】 式中、Ｌは検出可能な標識部分であり、Ａは、Ｌに物理
的または化学的に結合可能な連結基であり、Ｘは、
Ｈ２、Ｏ、Ｓ、Ｎであり、Ｐは反応 性アミノ基を有する
ポリ（アミノ酸）であり、ｎ＝１−６、ｍ＝１−６、な
らびにｑはｎおよびｍに等しいかまたはそれらの±１で
ある、を有する請求項１に記載の免疫アッセイ方法。 - 【請求項５】 Ｌはラテックス微粒子であり、かつＡが
基 【化４】 であり、ここでＰは反応性アミノ基を有するポリ（アミ
ノ酸）、Ｚは前記アミノ基と共にアミド結合を形成すべ
く反応可能な連結部分である請求項４に記載の免疫アッ
セイ方法。 - 【請求項６】 Ａが、基 【化５】 であり、かつＸが、Ｃ１−１０アルキルまたはフェニル
低級（Ｃ１−４）アルキルである請求項４または５に記
載の免疫アッセイ方法。 - 【請求項７】 アンフェタミン免疫原、メトアンフェタ
ミン免疫原および標識誘導体が、それぞれ式１、２およ
び３： 【化６】 【化７】 【化８】 である請求項６に記載の免疫アッセイ方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US899196 | 1978-04-24 | ||
| US89919692A | 1992-06-16 | 1992-06-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0694711A JPH0694711A (ja) | 1994-04-08 |
| JP2726793B2 true JP2726793B2 (ja) | 1998-03-11 |
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ID=25410609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5143841A Expired - Lifetime JP2726793B2 (ja) | 1992-06-16 | 1993-06-15 | 免疫アッセイ |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5501987A (ja) |
| EP (1) | EP0574782B1 (ja) |
| JP (1) | JP2726793B2 (ja) |
| CA (1) | CA2096495C (ja) |
| DE (1) | DE69321655T2 (ja) |
| DK (1) | DK0574782T3 (ja) |
| ES (1) | ES2123589T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US6716452B1 (en) | 2000-08-22 | 2004-04-06 | New River Pharmaceuticals Inc. | Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents |
| GB2361473C (en) | 2000-03-08 | 2005-06-28 | Microgenics Corp | Ecstasy-class analogs and use of same in detection of ecstasy-class compounds |
| US7632929B2 (en) | 2000-04-20 | 2009-12-15 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Methamphetamine-like hapten compounds, linkers, carriers and compositions and uses thereof |
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| US7202348B2 (en) * | 2000-04-20 | 2007-04-10 | The University Of Arkansas For Medical Sciences | Monoclonal antibody antagonists for treating medical problems associated with d-amphetamine-like drugs |
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| US8394813B2 (en) * | 2000-11-14 | 2013-03-12 | Shire Llc | Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents |
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| MXPA03011385A (es) * | 2001-06-08 | 2005-03-07 | Vector Tobacco Ltd | Modeificacion de los niveles de nicotina y nitrosamina en el tabaco. |
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| JP4878732B2 (ja) * | 2002-02-22 | 2012-02-15 | シャイア エルエルシー | 規制物質の濫用を防ぐための新規な持続放出製薬化合物 |
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