JPH04224583A - ハプテン−ビオチン複合体及び免疫検定法 - Google Patents

ハプテン−ビオチン複合体及び免疫検定法

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JPH04224583A
JPH04224583A JP3072756A JP7275691A JPH04224583A JP H04224583 A JPH04224583 A JP H04224583A JP 3072756 A JP3072756 A JP 3072756A JP 7275691 A JP7275691 A JP 7275691A JP H04224583 A JPH04224583 A JP H04224583A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ハプテン−ビオチン複
合体及び免疫検定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】体液及び組織中には、特異的な結合パー
トナーと結合できるが、それ自体では免疫学的反応を惹
起することができず、従ってヒトの身体の特定の疾病又
は健康状態のパラメータとして役立つハプテンと称され
る多数の物質が存在する。就中、ホルモン、腫瘍指標及
びウイルスタンパク質を挙げることができる。さらに、
ハプテンには、薬剤的治療を監視するためにしばしば測
定を必要とする大部分の薬剤も加えなければならない。 これらすべてのハプテンは極めて少量でしか存在しない
ので、それを検出するために免疫検定の原理による方法
を使用する。これには多数の変法がある。種々の免疫学
的測定方法は均質法と不均質法とに区分される。不均質
方法の場合には、標識成分の結合部分を未結合部分から
分離するための固相反応が関与している。この種の方法
の場合には、標識は良好に測定することができるけれど
も、不均質反応が長く続くのが欠点である。
【０００３】均質法の場合には、結合標識と未結合標識
との分離は行われないので、結合標識と未結合標識との
区別を他の方法によって行われなければならない。この
ためには種々の手段がある。すなわち例えば標識として
複合酵素を使用することができるが、同酵素は測定すべ
きハプテン又は抗原に結合されるか又は測定すべき物質
によって活性化される場合のみ、その酵素活性を得る。 他の手段は、標識として螢光物質を使用するものであり
、同物質を測定すべき物質に結合することによってその
螢光が他の光波範囲に変移されるか又はその偏向が変化
される。
【０００４】これらの公知方法の欠点は、特に、試料が
テストを妨害する成分を含有することが多く、そのため
にこれらの成分物質を除去するための試料の前処理を必
要とすることである。またそれぞれのパラメーターに対
する高価な最適化も必要である、例えば酵素はパラメー
ターに応じて変性しなければならない。これらのすべて
のテストの場合には、最適区分及び最適感度の要件は相
互に対立している、それというのも一方では、試料との
競合反応が有意に可能であるために、粒子状試薬の濃度
は限定されていなければならず、他方では単位時間当り
の十分シグナル変化を得るために、粒子状試薬は高濃度
でありかつ強い標識を有しなければならないからである
。このような要件を適合させると限定された感度と障害
の発生し易さがもたらされ、これらは特異的な試料の前
処理によらなければ除去され得ないことが多い。
【０００５】前記難点を解決するために、ＤＥ−Ａ３８
２２７５０では、試料溶液を３種のレセプターＲ１、Ｒ
２及びＲ３と一緒にインキュベートすることからなる均
質測定法が提案された。ここでＲ１及びＲ２は相互に結
合可能であり、Ｒ３は被測定物質と特異的に結合可能で
あり、この際レセプターＲ１は特異的結合対Ｐの一方の
パートナーと、被測定物質に相当するか又はその誘導体
であるか又は被測定物質の少なくとも１個のエピトープ
を有する物質とから成る複合体であり、Ｒ２は特異的結
合対の少なくとも２個の結合部位を有するレセプターで
あり、Ｒ３は、少なくとも２個の結合部位を有し、その
うちの少なくとも１個が被測定物質又はＳのエピトープ
と特異的に結合しているレセプターである。試料溶液を
これら３種のレセプターと一緒にインキュベートすると
、被検出物質がレセプターＲ３への結合をめぐってレセ
プターＲ１と競合しかつレセプターＲ２がレセプターＲ
１と結合する。レセプターＲ１、Ｒ２及びＲ３が結合す
る場合のみ、測光的に追跡されうる凝集が起こる。被検
出物質がレセプターＲ３に結合すると、この凝集は阻害
されるので、凝集は被検出物質の関接的尺度である。こ
の方法は、免疫学的活性物質、例えば抗原、抗体及びハ
プテンの検出用に適している。ハプテンの検出の場合に
は、レセプターＲ１として特異的結合対のパトナーとハ
プテンとから成る複合体を使用する。極めて有利な実施
態様の場合には、レセプターＲ１としてはビオチンと物
質Ｓとの複合体を、レセプターＲ２としてはストレプト
アビジンで被覆したラテックスを、レセプターＲ３とし
ては被検出物質と結合可能の抗体を使用する。ストレプ
トアビジンで被覆したラテックスには、ビオチン−ハプ
テン複合体がビオチン部分を介して結合する。抗体はハ
プテン部分を介してハプテン−ビオチン複合体に結合す
る。抗体に、ストレプトアビジンで被覆してラテックス
とビオチン−ハプテン複合体とから成る、２つの結合体
が結合すると、混濁が生じるので、これを評価すること
ができる。この際混濁は、分析量が大きくなればなる程
、また複合体の溶媒和が小さくなればなる程、それだけ
緩慢に起こる。
【０００６】従って、前記種類の方法でハプテンを検出
するためには、ハプテンとビオチンとから成る複合体を
利用しなければならない。ハプテン−ビオチン複合体は
従来公知である。すなわち例えばＥＰ−Ａ−３１５３１
７には、所謂二歯複合体（ｚｗｅｉｚａｅｈｉｇｅｓ　
Ｋｏｎｊｕｇａｔ）が記載されているが、このものは免
疫学的活性分子と特異的結合パートナーとから成り、両
者はスペーサにより結合されている。さて、スペーサの
長さが複合体の特性にどの程度影響を及ぼすか、種々の
試験が行われた。しかも前記刊行物においては、スペ−
サの長さが２２．２Åよりも長い（これは大体１８個の
原子の鎖長に相当する）場合には、複合体は最適活性を
有するが、２０個の原子数よりも多い鎖長は再び複合体
の感度を低下させることが確認された。さらに５個より
も多いヘテロ原子の存在は不利であることも記載されて
いる。しかしこれらの複合体を用いても、やはり最終的
に満足すべき効果は得られなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、均質
免疫検定法にとって適当であり、改善された感度を有し
かつ増大された反応速度を有するハプテン−ビオチン複
合体を提案することであった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記課題は、ハプテンが
、鎖中に２６〜４０個の原子を有しかつ少なくとも５個
のヘテロ原子を含むスペーサーを介してビオチンに結合
されていることを特徴とする、ハプテン−ビオチン複合
体によって解決される。
【０００９】意外にも、本発明により定義されたハプテ
ン−ビオチン複合体を使用することによって、公知の複
合体と比べて明らかにシグナルを改善することができ、
スペーサの溶媒和を改善することによって非特異的結合
の発生を減少させることができ、反応速度を増大させ、
テスト性能を改善することができることが確認された。
【００１０】本発明によれば、ハプテンとビオチン分子
が、２６〜４０個の原子ｋ鎖長を有しかつ少なくとも５
個のヘテロ原子を有するスペーサを介して結合されてい
る形のハプテン−ビオチン複合体が提供される。
【００１１】スペーサーのヘテロ原子は、有機分子中に
存在するヘテロ原子、すなわち窒素、酸素、硫黄、燐等
であってよい。好ましくはスペーサーはヘテロ原子とし
て窒素原子及び酸素原子を有する。ヘテロ原子の数は少
なくとも５個でなければならない。ヘテロ原子の割合の
大きい方が有利であり、この場合ヘテロ原子の割合はス
ペーサー中の３番目の原子がすべてヘテロ原子であるよ
うな大きさであってもよい。従って例えばスペーサーと
して前記の鎖長のポリエチレンオキシドを使用すること
ができる。
【００１２】スペーサーの長さは２６〜４０個の原子の
範囲にあり、この際鎖中に存在する原子だけを数える。 特に有利な効果は、３０個を越える原子を有するスペー
サーで得られる。
【００１３】本発明による複合体の製造は、ハプテンと
ビオチンを二官能性スペーサー分子と反応させることに
よって行うことができ、この際ハプテン及びビオチン分
子に存在する官能性基がスペーサー分子の官能性基と反
応する。他の製造は、ハプテン及び／又はビオチン分子
を誘導し、次に得られた誘導体を場合によりさらにスペ
ーサー分子と反応させることによって行うことができる
。この際誘導体とスペーサー分子は、所望の長さ及び所
望のヘテロ原子数を有するスペーサーが生じるように、
再び設計される。
【００１４】ハプテン及びビオチンの誘導は公知のよう
に行う。スペーサーとしてはホモ−又はヘテロ−二官能
性リンカー、すなわちジカルボン酸、ジアミン、アミノ
酸、メルカプトカルボン酸及びハロゲンカルボン酸が適
当である。好ましくは、スクシネート、グルタレート、
スベレート、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、
１，８−ジアミン−３，６−ジオキサオクタン、１，１
２−ジアミノ−４，９−ジオキサドデカン、アミノ酪酸
、アミノカプロン酸、チオグリコール酸、チオプロピオ
ン酸、ブロム酢酸及び／又はヨード酢酸から構成されて
いるスペーサーを使用する。これらの合成要素は、所望
のヘテロ原子数を有する所望の長さのスペーサーが生じ
るように構成されなければならない。
【００１５】本発明によるハプテン−ビオチン複合体を
用いると、反応時間の短縮及びひいては能力の増大をも
たらす溶媒和の改善が達成される。
【００１６】本発明の他の対象は、本発明によるハプテ
ン−ビオチン複合体を使用して、反応の際に生じる凝集
を比濁法測定（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｓｃｈｅ　　
ｏｄｅｒ　　ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｓｈｅ　　Ｍｅ
ｓｓｕｎｇｅｎ）によって評価する、競合均質免疫検定
法である。
【００１７】次に本発明を、実施例によって詳述する。 ＤＣ板上での物質の検出は２５４ｎｍでの螢光消光によ
って行い（珪酸ゲル６０Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ
５７４８及び珪酸ゲルＲＰ−１８、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ
１５６８５）又はビオチン含有化合物の場合にはＨ２Ｓ
Ｏ４／４−ジメチルアミノ−桂皮アルデヒドを噴霧する
ことによって行う（この場合には次に１００℃で１０分
乾燥した）。混合物Ａ／Ｂ１／１（ｖ／ｖ）：Ａ）　　
エタノール中の２％Ｈ２ＳＯ４Ｂ）　　エタノール中の
０．２％４−ジメチルアミノ−桂皮アルデヒド。
【００１８】例１ ５−（１−メチルキサンチン−３−イル）ペンタン酸−
Ｎ−ヒドロキシイクシンイミドエステルの製造規定（テ
オフイリン）−３−ｃｂ−ＮＨＳ）１．ａ）　　１−メ
チル−７−（ピバロイルオキシメチル）キサンチン１−
メチルキサンチン（０．５ｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ社、
Ｎｏ．２８，０９８−４）８３ｇを、無水ＤＭＦ３．５
　ｌ中に溶かし、無水炭酸ナトリウム５５ｇを加える。 次に無水ＤＭＦ３００ｍｌ中のピバリン酸クロルメチル
エステル（Ａｌｄｅｉｃｈ社、Ｎｏ．１４，１１８−６
）８０ｍｌを２０℃で撹拌下に３０分以内に滴加する。 ４８時間の反応後に濾過漏斗により吸引濾過し、濾液を
高真空で蒸発させる。油状残留物を、生成物が固化する
までジイソプロピルエーテル５００ｍｌと共に熟成させ
、次に吸引濾取する。固形物をクロロホルム５００ｍｌ
中に取り、不溶成分を濾取し、溶液を蒸発させる。残留
物を石油エーテル約２５０ｍｌと共に熟成し、固体生成
物を吸引濾取し、乾燥器で乾燥させる。
【００１９】収量：２４．８ｇ（理論値の１８％）ＤＣ
：珪酸ゲル、酢酸エステル；Ｒｆ＝０．５８１．ｂ）　
　３−エチルオキシカルボニルブチル−１−メチル−７
−（ピバロイルオキシメチル）−キサンチン１ａ）で得
られた化合物２２．４ｇ（８０ｍ　ｍｏｌ）を無水ＤＭ
Ｆ３００ｍｌ中に溶かし、無水炭酸ナトリウム１７ｇ（
１６０ｍ　ｍｏｌ）及び５−ブロムペンタン酸エチルエ
ステル３３．６ｇ（＝２８ｍｌ）、１６０ｍ　ｍｏｌ）
を加える。２０℃で３日間撹拌し、次に酢酸エステル３
　ｌで希釈し、溶液を濾過し、各１　ｌの水で３回洗浄
する。無水硫酸ナトリウム１００ｇで溶液を脱水し、回
転蒸発器により溶剤を除去する。残留する油状生成物は
この形で次の段階で使用することができる。
【００２０】収量：粘性油状物４４ｇ（比較的多量の溶
剤を含有する）。
【００２１】ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル；Ｒｆ＝０
．７５ １．ｃ）　　３−カルボキシブチル−１−メチルキサン
チン（テオフイリン−３−ｃｂ） １ｂ）で得られた油状生成物４４ｇ全部を、２Ｎ　Ｎａ
ＯＨ２．８　ｌ中で環流下に２時間撹拌する。次に冷却
し、溶液のｐＨ値を濃ＨＣｌで５に調節する。この際沈
殿する生成物を吸引濾取し、水で洗浄し、乾燥器で塩化
カルシウムにより乾燥する。
【００２２】収量：１０．６ｇ（理論値の５０％）ＤＣ
：珪酸ゲル、酢酸エステル／メタノール９／１（ｖ／ｖ
）；Ｒｆ＝０．３７ １．ｄ）　　５−（１−メチルキサンチン−３−イル）
ペンタン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（
テオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ） １ｃ）で得られたテオフイリン−カルボン酸５．３ｇ（
２０ｍ　ｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ１５０ｍｌ中に溶かし
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．７６ｇ（２４ｍ　
ｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボンジイミド４．９
５ｇ（２４ｍ　ｍｏｌ）を加える。２０℃で２４時間撹
拌し、沈殿したジシクロヘキシル尿素を吸引濾取し、濾
液を真空で蒸発させ、再びＤＭＦ１００ｍｌ中に溶かす
。溶液を濾過後に再び蒸発させ、残留物をイソプロパノ
ール１００ｍｌと共に熟成させる。固体生成物を吸引濾
取し、乾燥器で乾燥させる。
【００２３】収量：無色微結晶粉末６．０ｇ（理論値の
８３％） ＤＣ：珪酸ゲル　ＲＰ−１８、ニトロメタン／エタノー
ル９／１（ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝０．８２ 例２ テオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨ−ＮＨ−ビオチンの製造
例１からのテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ７２．７ｍ
ｇ（０．２ｍ　ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ２０ｍｌ中に溶か
し、ビオチン−ヒドラジド（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉ
ｅ社、Ｎｏ．Ｂ７６３９）７７．５ｍｇ（０．３ｍ　ｍ
ｏｌ）及び４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（
Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８２０４９９）１００μｇを加え
る。２０℃で４時間撹拌し、次に溶剤を高真空で除去し
、半固体の残留物をメタノール約５ｍｌと共に熟成され
る。固体生成物を吸引濾取し、高真空ポンプにより乾燥
する。
【００２４】収量：無水粉末６６ｍｇ（理論値の６５％
） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール２／１（ｖ
／ｖ）：Ｒｆ＝０．４例３ テオフイリン−３−ｃｂ−１，８−ジアミノ−３，６−
ジオキサオクタン−ビオチンの製造 例１からのテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ　１８２ｍ
ｇ（０．５ｍ　ｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ１５ｍｌ中に溶
かし、ビオチン−１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサ
オクタン（ビオチン−ＤＡＤＯＯ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｎｏ．１１１２０７４）
２０６ｍｇ（０．５５ｍ　ｍｏｌ）を２０℃で１６時間
撹拌する。次に溶剤を高真空で除去し、残留物を少量の
メタノール／クロロホルム１／１（ｖ／ｖ）から再結晶
させる。この生成物を高真空ポンプにより乾燥する。
【００２５】収量：無色微結晶粉末１２８ｍｇ（理論値
の４１％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール２／１（ｖ
／ｖ）；Ｒｆ＝０．５７例４ テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＯ−Ｘ−ビオチン４
．ａ）　　ビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯ１，８−ジアミノ
−３，６−ジオキサオクタン（ＤＡＤＯＯ、Ｍｅｒｃｋ
社、Ｎｏ．８１８１１６）７．３３ｍｌ（５０ｍ　ｍｏ
ｌ）を、ジオキサン／０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）２／１（ｖ／ｖ）４５ｍｌ中に溶かす。同じ
溶剤混合物中に溶かしたビオチン−ｅ−アミノカボン酸
−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｎｏ．１００３
９３３）１．１４ｇ（２．５ｍ　ｍｏｌ）の溶液、２０
℃で撹拌しながら３０分間滴加する。引続き５時間撹拌
し、溶液を蒸発させ、油状残留物を少量のメタノール中
に溶かす。激しく撹拌しながら酢酸エステル２００ｍｌ
中に注入すると、白色がかった黄色沈殿物が生じる。吸
引濾取し、沈殿物をできるだけ少量のメタノール／アン
モニア９／１（ｖ／ｖ）中に溶かし、珪酸ゲルカラム（
５×３０ｃｍ）、溶離液メタノール／アンモニア９／１
（ｖ／ｖ）により精製する。相応の画分を集め、蒸発さ
せ、固体生成物を高真空ポンプにより乾燥させる。
【００２６】収量：無色粉末７３０ｍｇ（理論値の６０
％） ＤＣ：珪酸ゲル、メタノール／アンモニア９／１（ｖ／
ｖ）；Ｒｆ＝０．４６ ４．ｂ）　　テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＯ−Ｘ
−ビオチン例１からのテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ
１８２ｍｇ（０．５ｍｏｌ）を無水ＤＮＦ２０ｍｌ中に
溶かし、ビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯ２４５ｍｇ（０．５
ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン６９μｌ（０．５ｍ　
ｍｏｌ）を加える。２０℃で１６時間撹拌し、次に溶剤
を真空で蒸発させ、生成物を珪酸ゲルカラム（２．８×
３３ｃｍ）によるクロマトグラフイーによって精製する
。 溶離液：クロロホルム／メタノール２／１（ｖ／ｖ）。 相応の画分を集め、溶剤を真空で除去し、残留物をジイ
ソプロピルエーテル２０ｍｌと共に熟成する。固体生成
物を、乾燥器でＣａＣｌ２により乾燥する。
【００２７】収量：無色粉末２１５ｍｇ（理論値の５８
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール２／１（ｖ
／ｖ）；Ｒｆ＝０．６０例５ テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＤＯＤ−Ｘ−ビオチン
５．ａ）　　テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ１，
１２−ジアミノ−４，９−ジオキサドデカン（ＤＡＤＯ
Ｄ、Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｎｏ．２２，７４４−７）４．
２４ｍｌ（２０ｍ　ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ１０ｍｌ中に
溶かし、無水ＤＭＦ２０ｍｌ中に溶かした例１からのテ
オフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ３６３ｍｇ（１ｍ　ｍｏ
ｌ）の溶液を３０分間で滴加する。数分後に綿状沈殿物
が形成される。引続き２０℃で３時間撹拌し、次に濾過
し、濾液を真空で蒸発させる。酢酸エステル５０ｍｌと
共に熟成し、溶剤をデカンテーシヨンし、残留物を少量
のＤＭＦ中に溶かす。この溶液を激しく撹拌しながら酢
酸エステル５０ｍｌ中に注入する。この際沈殿する粗生
成物を吸引濾取し、珪酸ゲルカラム（５×３５ｃｍ）、
溶離液：クロロホルム／メタノール／アンモニア６／３
／１（ｖ／ｖ／ｖ）によるクロマトグラフイーによって
精製する。相応の画分を集め、溶剤を真空で除去し、残
存する生成物を水から凍結乾燥する。乾燥器でＣａＣｌ
２により乾燥する。
【００２８】収量：無色粉末２４０ｍｇ（理論値の５３
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール／アンモニ
ア６／３／１（ｖ／ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝０．４２５．ｂ）
　　テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ−Ｘ−ビオチ
ンテオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ２２５ｍｇ（０
．５ｍ　ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ４０ｍｌ中に溶かし、ビ
オチン−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル２２７ｍｇ（０．５ｍｏｌ）を加える
。トリエチルアミン６９μｌ（０．５ｍ　ｍｏｌ）を加
えた後、２０℃で６時間撹拌する。溶剤を高真空で除去
し、残留物をできるだけ少量のクロロホルム／メタノー
ル１／１（ｖ／ｖ）中に溶かし、珪酸ゲルカラム（５×
３５ｃｍ）上に施す。クロロホルム／メタノール２／１
（ｖ／ｖ）で溶離する。相応の画分を集め、溶剤を真空
で除去し、テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ−Ｘ−
ビオチンを水から凍結乾燥する。
【００２９】収量：無色粉末３１０ｍｇ（理論値の７８
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール２／１（ｖ
／ｖ／）；Ｒｆ＝０．５４例６ テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−ＤＡ
ＤＯＯ−ビオチン ６．ａ）　　ビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃビオチン
−ＤＡＤＯＯ１．５ｇ（４ｍ　ｍｏｌ）を、ピリジン３
０ｍｌ中に溶かし、コハク酸無水物８００ｍｇ（８ｍ　
ｍｏｌ）を加える。４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−
ピリジン０．１ｍｇを加えた後、２０℃で１時間撹拌す
る。次に溶剤を高真空で除去する。残留物を酢酸エステ
ル２０ｍｌと共に熟成し、吸引濾取する。酢酸エステル
約２０ｍｌで洗浄し、生成物を乾燥器でＣａＣｌ２によ
り乾燥する。
【００３０】収量：無色微結晶粉末１．４ｇ（理論値の
７４％） ＤＣ：珪酸ゲルＲＰ−１８、イソプロパノール／水／氷
酢酸８５／１４／１（ｖ／ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝０．７４６
．ｂ）　　ビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−ＤＡＤＯ
Ｏビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ　２３８ｍｇ（０．
５ｍ　ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ２５ｍｌ中に溶かし、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド５７ｍｇ（０．５ｍ　ｍｏｌ
）及び２−（４−モルホリニル）−エチルイソシアニド
（Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８１８６４９）６９μｌ（０．
５ｍ　ｍｏｌ）を加える。２０℃で３０分撹拌し、１，
８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（ＤＡＤＯＯ
、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８１８１１６）１．５ｍｌ（１
０ｍ　ｍｏｌ）を加え、さらにＮ−ヒドロキシスクシン
イミド５７ｍｇ及び２−（４−モルホリニル）エチルイ
ソシアニド６９μｌを加える。引続きこの溶液を１６時
間撹拌し、次に溶剤を高真空で除去し、生成物を珪酸ゲ
ルカラム（５×６０ｃｍ）、溶離液：クロロホルム／メ
タノール／アンモニア６／３／１（ｖ／ｖ／ｖ）による
クロマトグラフイーによって精製する。相応の画分を集
め、溶剤を除去し、残留物を酢酸エステル１０ｍｌと共
に熟成する。固体生成物を吸引濾取し、高真空ポンプに
より乾燥する。
【００３１】収量：無色粉末１９５ｍｇ（論理値の６５
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール／アンモニ
ア　６／３／１（ｖ／ｖ／ｖ）；　　Ｒｆ＝０．５４６
．ｃ）　　テオフイリン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−ＤＡ
ＤＯＯ−ビオチンビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−Ｄ
ＡＤＯＯ１５１ｍｇ（０．２５ｍ　ｍｏｌ）を、例１か
らのテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ９１ｍｇ（０．２
５ｍ　ｍｏｌ）と一緒に無水ＤＭＦ１０ｍｌ中溶かし、
トリエチルアミン３５μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）加える
。 ２０℃で４時間撹拌し、次に溶剤を高真空で除去し、生
成物を珪酸ゲルカラム（３．５×４０ｃｍ）、溶離液：
クロロホルム／メタノール２／１（ｖ／ｖ）によりクロ
マトグラフイーによって分離する。相応の画分を集め、
溶剤を真空で除去し、生成物を高真空ポンプにより少な
くとも６時間乾燥する。
【００３２】収量：無色粘性油状物１０５ｍｇ（理論値
の４９％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール２／１（ｖ
／ｖ）；Ｒｆ＝０．３６例７ テオフイリンの測定 試薬： 試薬１：ストレプトアビジン−ラテックス（ＥＰ−Ａ０
３４９９８８により製造）　　０．１重量％から成る。
【００３３】試料２：テオフイリンに対するモノクロナ
ール抗体１．５×１０−６ｍｏｌ／ｌと、　　テオフイ
リン及びビオチンの複合体（例６により製造）４．５×
１０−７ｍｏｌ　　／ｌから成る。
【００３４】試料３μｌを３７℃で試薬２３０ｍｌと一
緒に装置に入れ、５分間インキュベートとする。次に試
薬１５００μｌを加え、吸光度の変化を４．２分以内で
で測定する。表１は、試料としてテオフイリン水溶液を
使用する場合に得られる測定値を示す。
【００３５】例８ Ｔ４の測定 試薬： 試薬１：バルビツール酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）１００
ｍ　ｍｏｌ／ｌ、デキストラン硫酸２重量％、ストレプ
トアビジン−ラテックス（ＥＰ−Ａ０３４９９８８によ
り製造）０．０２重量％、ポリクロナール抗体（Ｔ４に
示すＩｇＧ）４×１０−８ｍｏｌ／ｌから成る。
【００３６】試薬２：Ｔ４及びビオチンの複合体（例３
により製造）４×１０−８ｍｏｌ／ｌから成る。この場
合には、テオフイリン−３ｃｂ−ＮＨＳの代りにＴ４−
（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−ＮＨＳ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　　ＧｍｂＨ）Ｔ４を
使用する。
【００３７】試料５μｌ及び試薬１　２３５μｌを３７
℃で一緒に装置に入れ、５分間インキュベーストとする
。次に試薬２　２０μｌを加え、吸光度の変化を４０５
ｎｍで２分以内に測定する。血清標準を用いると、表２
の測定値が得られる。
【００３８】

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　ハプテンが、鎖中に２６〜４０個の原
    子を有しかつ少なくとも５個のヘテロ原子を含むスペー
    サを介してビオチンに結合されていることを特徴とする
    ハプテン−ビオチン複合体。
  2. 【請求項２】　　請求項１記載のハプテン−ビオチン複
    合体を使用して、反応の際生じる凝集を比濁法測定によ
    って評価する競合均質免疫検定法。
JP3072756A 1990-04-10 1991-04-05 ハプテン−ビオチン複合体及び免疫検定法 Expired - Lifetime JPH082910B2 (ja)

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