JPH082910B2 - ハプテン−ビオチン複合体及び免疫検定法 - Google Patents
ハプテン−ビオチン複合体及び免疫検定法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ハプテン−ビオチン複
合体及び免疫検定法に関する。
合体及び免疫検定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】体液及び組織中には、特異的な結合パー
トナーと結合できるが、それ自体では免疫学的反応を惹
起することができず、従ってヒトの身体の特定の疾病又
は健康状態のパラメータとして役立つハプテンと称され
る多数の物質が存在する。就中、ホルモン、腫瘍指標及
びウイルスタンパク質を挙げることができる。さらに、
ハプテンには、薬剤的治療を監視するためにしばしば測
定を必要とする大部分の薬剤も加えなければならない。
これらすべてのハプテンは極めて少量でしか存在しない
ので、それを検出するために免疫検定の原理による方法
を使用する。これには多数の変法がある。種々の免疫学
的測定方法は均質法と不均質法とに区分される。不均質
方法の場合には、標識成分の結合部分を未結合部分から
分離するための固相反応が関与している。この種の方法
の場合には、標識は良好に測定することができるけれど
も、不均質反応が長く続くのが欠点である。
トナーと結合できるが、それ自体では免疫学的反応を惹
起することができず、従ってヒトの身体の特定の疾病又
は健康状態のパラメータとして役立つハプテンと称され
る多数の物質が存在する。就中、ホルモン、腫瘍指標及
びウイルスタンパク質を挙げることができる。さらに、
ハプテンには、薬剤的治療を監視するためにしばしば測
定を必要とする大部分の薬剤も加えなければならない。
これらすべてのハプテンは極めて少量でしか存在しない
ので、それを検出するために免疫検定の原理による方法
を使用する。これには多数の変法がある。種々の免疫学
的測定方法は均質法と不均質法とに区分される。不均質
方法の場合には、標識成分の結合部分を未結合部分から
分離するための固相反応が関与している。この種の方法
の場合には、標識は良好に測定することができるけれど
も、不均質反応が長く続くのが欠点である。
【０００３】均質法の場合には、結合標識と未結合標識
との分離は行われないので、結合標識と未結合標識との
区別を他の方法によって行われなければならない。この
ためには種々の手段がある。すなわち例えば標識として
複合酵素を使用することができるが、同酵素は測定すべ
きハプテン又は抗原に結合されるか又は測定すべき物質
によって活性化される場合のみ、その酵素活性を得る。
他の手段は、標識として螢光物質を使用するものであ
り、同物質を測定すべき物質に結合することによってそ
の螢光が他の光波範囲に変移されるか又はその偏向が変
化される。
との分離は行われないので、結合標識と未結合標識との
区別を他の方法によって行われなければならない。この
ためには種々の手段がある。すなわち例えば標識として
複合酵素を使用することができるが、同酵素は測定すべ
きハプテン又は抗原に結合されるか又は測定すべき物質
によって活性化される場合のみ、その酵素活性を得る。
他の手段は、標識として螢光物質を使用するものであ
り、同物質を測定すべき物質に結合することによってそ
の螢光が他の光波範囲に変移されるか又はその偏向が変
化される。
【０００４】これらの公知方法の欠点は、特に、試料が
テストを妨害する成分を含有することが多く、そのため
にこれらの成分物質を除去するための試料の前処理を必
要とすることである。またそれぞれのパラメーターに対
する高価な最適化も必要である、例えば酵素はパラメー
ターに応じて変性しなければならない。これらのすべて
のテストの場合には、最適区分及び最適感度の要件は相
互に対立している、それというのも一方では、試料との
競合反応が有意に可能であるために、粒子状試薬の濃度
は限定されていなければならず、他方では単位時間当り
の十分シグナル変化を得るために、粒子状試薬は高濃度
でありかつ強い標識を有しなければならないからであ
る。このような要件を適合させると限定された感度と障
害の発生し易さがもたらされ、これらは特異的な試料の
前処理によらなければ除去され得ないことが多い。
テストを妨害する成分を含有することが多く、そのため
にこれらの成分物質を除去するための試料の前処理を必
要とすることである。またそれぞれのパラメーターに対
する高価な最適化も必要である、例えば酵素はパラメー
ターに応じて変性しなければならない。これらのすべて
のテストの場合には、最適区分及び最適感度の要件は相
互に対立している、それというのも一方では、試料との
競合反応が有意に可能であるために、粒子状試薬の濃度
は限定されていなければならず、他方では単位時間当り
の十分シグナル変化を得るために、粒子状試薬は高濃度
でありかつ強い標識を有しなければならないからであ
る。このような要件を適合させると限定された感度と障
害の発生し易さがもたらされ、これらは特異的な試料の
前処理によらなければ除去され得ないことが多い。
【０００５】前記難点を解決するために、ＤＥ−Ａ３８
２２７５０では、試料溶液を３種のレセプターＲ1、Ｒ2
及びＲ3と一緒にインキュベートすることからなる均質
測定法が提案された。ここでＲ1及びＲ2は相互に結合可
能であり、Ｒ3は被測定物質と特異的に結合可能であ
り、この際レセプターＲ1は特異的結合対Ｐの一方のパ
ートナーと、被測定物質に相当するか又はその誘導体で
あるか又は被測定物質の少なくとも１個のエピトープを
有する物質とから成る複合体であり、Ｒ2は特異的結合
対の少なくとも２個の結合部位を有するレセプターであ
り、Ｒ3は、少なくとも２個の結合部位を有し、そのう
ちの少なくとも１個が被測定物質又はＳのエピトープと
特異的に結合しているレセプターである。試料溶液をこ
れら３種のレセプターと一緒にインキュベートすると、
被検出物質がレセプターＲ3への結合をめぐってレセプ
ターＲ1と競合しかつレセプターＲ2がレセプターＲ1と
結合する。レセプターＲ1、Ｒ2及びＲ3が結合する場合
のみ、測光的に追跡されうる凝集が起こる。被検出物質
がレセプターＲ3に結合すると、この凝集は阻害される
ので、凝集は被検出物質の関接的尺度である。この方法
は、免疫学的活性物質、例えば抗原、抗体及びハプテン
の検出用に適している。ハプテンの検出の場合には、レ
セプターＲ1として特異的結合対のパトナーとハプテン
とから成る複合体を使用する。極めて有利な実施態様の
場合には、レセプターＲ1としてはビオチンと物質Ｓと
の複合体を、レセプターＲ2としてはストレプトアビジ
ンで被覆したラテックスを、レセプターＲ3としては被
検出物質と結合可能の抗体を使用する。ストレプトアビ
ジンで被覆したラテックスには、ビオチン−ハプテン複
合体がビオチン部分を介して結合する。抗体はハプテン
部分を介してハプテン−ビオチン複合体に結合する。抗
体に、ストレプトアビジンで被覆してラテックスとビオ
チン−ハプテン複合体とから成る、２つの結合体が結合
すると、混濁が生じるので、これを評価することができ
る。この際混濁は、分析量が大きくなればなる程、また
複合体の溶媒和が小さくなればなる程、それだけ緩慢に
起こる。
２２７５０では、試料溶液を３種のレセプターＲ1、Ｒ2
及びＲ3と一緒にインキュベートすることからなる均質
測定法が提案された。ここでＲ1及びＲ2は相互に結合可
能であり、Ｒ3は被測定物質と特異的に結合可能であ
り、この際レセプターＲ1は特異的結合対Ｐの一方のパ
ートナーと、被測定物質に相当するか又はその誘導体で
あるか又は被測定物質の少なくとも１個のエピトープを
有する物質とから成る複合体であり、Ｒ2は特異的結合
対の少なくとも２個の結合部位を有するレセプターであ
り、Ｒ3は、少なくとも２個の結合部位を有し、そのう
ちの少なくとも１個が被測定物質又はＳのエピトープと
特異的に結合しているレセプターである。試料溶液をこ
れら３種のレセプターと一緒にインキュベートすると、
被検出物質がレセプターＲ3への結合をめぐってレセプ
ターＲ1と競合しかつレセプターＲ2がレセプターＲ1と
結合する。レセプターＲ1、Ｒ2及びＲ3が結合する場合
のみ、測光的に追跡されうる凝集が起こる。被検出物質
がレセプターＲ3に結合すると、この凝集は阻害される
ので、凝集は被検出物質の関接的尺度である。この方法
は、免疫学的活性物質、例えば抗原、抗体及びハプテン
の検出用に適している。ハプテンの検出の場合には、レ
セプターＲ1として特異的結合対のパトナーとハプテン
とから成る複合体を使用する。極めて有利な実施態様の
場合には、レセプターＲ1としてはビオチンと物質Ｓと
の複合体を、レセプターＲ2としてはストレプトアビジ
ンで被覆したラテックスを、レセプターＲ3としては被
検出物質と結合可能の抗体を使用する。ストレプトアビ
ジンで被覆したラテックスには、ビオチン−ハプテン複
合体がビオチン部分を介して結合する。抗体はハプテン
部分を介してハプテン−ビオチン複合体に結合する。抗
体に、ストレプトアビジンで被覆してラテックスとビオ
チン−ハプテン複合体とから成る、２つの結合体が結合
すると、混濁が生じるので、これを評価することができ
る。この際混濁は、分析量が大きくなればなる程、また
複合体の溶媒和が小さくなればなる程、それだけ緩慢に
起こる。
【０００６】従って、前記種類の方法でハプテンを検出
するためには、ハプテンとビオチンとから成る複合体を
利用しなければならない。ハプテン−ビオチン複合体は
従来公知である。すなわち例えばＥＰ−Ａ−３１５３１
７（欧州特許出願公開第３１５３１７号明細書）には、
所謂二歯状複合体（ｚｗｅｉｚａｅｈｉｇｅｓ Ｋｏｎ
ｊｕｇａｔ＝Ｂｉｄｅｎｔａｔｅ）が記載されている
が、このものは免疫学的活性分子と特異的結合パートナ
ーとから成り、両者はスペーサーにより結合されてい
る。さて、スペーサーの長さが複合体の特性にどの程度
影響を及ぼすか、種々の試験が行われた。しかも前記刊
行物においては、スペーサーの長さが２２．２Åよりも
長い（これは大体１８個の原子の鎖長に相当する）場合
には、複合体は最適活性を有するが、２０個の原子数よ
りも多い鎖長は再び複合体の感度を低下させることが確
認された。さらに５個よりも多いヘテロ原子の存在は不
利であることも記載されている。しかしこれらの複合体
を用いても、やはり最終的に満足すべき効果は得られな
かった。
するためには、ハプテンとビオチンとから成る複合体を
利用しなければならない。ハプテン−ビオチン複合体は
従来公知である。すなわち例えばＥＰ−Ａ−３１５３１
７（欧州特許出願公開第３１５３１７号明細書）には、
所謂二歯状複合体（ｚｗｅｉｚａｅｈｉｇｅｓ Ｋｏｎ
ｊｕｇａｔ＝Ｂｉｄｅｎｔａｔｅ）が記載されている
が、このものは免疫学的活性分子と特異的結合パートナ
ーとから成り、両者はスペーサーにより結合されてい
る。さて、スペーサーの長さが複合体の特性にどの程度
影響を及ぼすか、種々の試験が行われた。しかも前記刊
行物においては、スペーサーの長さが２２．２Åよりも
長い（これは大体１８個の原子の鎖長に相当する）場合
には、複合体は最適活性を有するが、２０個の原子数よ
りも多い鎖長は再び複合体の感度を低下させることが確
認された。さらに５個よりも多いヘテロ原子の存在は不
利であることも記載されている。しかしこれらの複合体
を用いても、やはり最終的に満足すべき効果は得られな
かった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、均質
免疫検定法にとって適当であり、改善された感度を有し
かつ増大された反応速度を有するハプテン−ビオチン複
合体を提案することであった。
免疫検定法にとって適当であり、改善された感度を有し
かつ増大された反応速度を有するハプテン−ビオチン複
合体を提案することであった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記課題は、ハプテン
が、鎖中に２６〜４０個の原子を有しかつ同鎖の成分と
して少なくとも５個のヘテロ原子を含む線状スペーサー
を介してビオチンに結合されていることを特徴とする、
ハプテン−ビオチン複合体によって解決される。
が、鎖中に２６〜４０個の原子を有しかつ同鎖の成分と
して少なくとも５個のヘテロ原子を含む線状スペーサー
を介してビオチンに結合されていることを特徴とする、
ハプテン−ビオチン複合体によって解決される。
【０００９】意外にも、本発明により定義されたハプテ
ン−ビオチン複合体を使用することによって、公知の複
合体と比べて明らかにシグナルを改善することができ、
スペーサの溶媒和を改善することによって非特異的結合
の発生を減少させることができ、反応速度を増大させ、
テスト性能を改善することができることが確認された。
ン−ビオチン複合体を使用することによって、公知の複
合体と比べて明らかにシグナルを改善することができ、
スペーサの溶媒和を改善することによって非特異的結合
の発生を減少させることができ、反応速度を増大させ、
テスト性能を改善することができることが確認された。
【００１０】本発明によれば、ハプテンとビオチン分子
が、２６〜４０個の原子の鎖長を有しかつこの鎖の成分
として少なくとも５個のヘテロ原子を含むスペーサーを
介して結合されている形のハプテン−ビオチン複合体が
提供される。
が、２６〜４０個の原子の鎖長を有しかつこの鎖の成分
として少なくとも５個のヘテロ原子を含むスペーサーを
介して結合されている形のハプテン−ビオチン複合体が
提供される。
【００１１】スペーサーのヘテロ原子は、有機分子中に
存在するヘテロ原子、すなわち窒素、酸素、硫黄、燐等
であってよい。好ましくはスペーサーはヘテロ原子とし
て窒素原子及び酸素原子を有する。ヘテロ原子の数は少
なくとも５個でなければならない。ヘテロ原子の割合の
大きい方が有利であり、この場合ヘテロ原子の割合はス
ペーサー中の３番目の原子がすべてヘテロ原子であるよ
うな大きさであってもよい。従って例えばスペーサーと
して前記の鎖長のポリエチレンオキシドを使用すること
ができる。
存在するヘテロ原子、すなわち窒素、酸素、硫黄、燐等
であってよい。好ましくはスペーサーはヘテロ原子とし
て窒素原子及び酸素原子を有する。ヘテロ原子の数は少
なくとも５個でなければならない。ヘテロ原子の割合の
大きい方が有利であり、この場合ヘテロ原子の割合はス
ペーサー中の３番目の原子がすべてヘテロ原子であるよ
うな大きさであってもよい。従って例えばスペーサーと
して前記の鎖長のポリエチレンオキシドを使用すること
ができる。
【００１２】スペーサーの長さは２６〜４０個の原子の
範囲にあり、この際鎖中に存在する原子だけを数える。
特に有利な効果は、３０個を越える原子を有するスペー
サーで得られる。
範囲にあり、この際鎖中に存在する原子だけを数える。
特に有利な効果は、３０個を越える原子を有するスペー
サーで得られる。
【００１３】本発明による複合体の製造は、ハプテンと
ビオチンを二官能性スペーサー分子と反応させることに
よって行うことができ、この際ハプテン及びビオチン分
子に存在する官能性基がスペーサー分子の官能性基と反
応する。他の製造は、ハプテン及び／又はビオチン分子
を誘導し、次に得られた誘導体を場合によりさらにスペ
ーサー分子と反応させることによって行うことができ
る。この際誘導体とスペーサー分子は、所望の長さ及び
所望のヘテロ原子数を有するスペーサーが生じるよう
に、再び設計される。
ビオチンを二官能性スペーサー分子と反応させることに
よって行うことができ、この際ハプテン及びビオチン分
子に存在する官能性基がスペーサー分子の官能性基と反
応する。他の製造は、ハプテン及び／又はビオチン分子
を誘導し、次に得られた誘導体を場合によりさらにスペ
ーサー分子と反応させることによって行うことができ
る。この際誘導体とスペーサー分子は、所望の長さ及び
所望のヘテロ原子数を有するスペーサーが生じるよう
に、再び設計される。
【００１４】ハプテン及びビオチンの誘導は公知のよう
に行う。スペーサーとしてはホモ−又はヘテロ−二官能
性リンカー、すなわちジカルボン酸、ジアミン、アミノ
酸、メルカプトカルボン酸及びハロゲンカルボン酸が適
当である。好ましくは、スクシネート、グルタレート、
スベレート、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、
１，８−ジアミン−３，６−ジオキサオクタン、１，１
２−ジアミノ−４，９−ジオキサドデカン、アミノ酪
酸、アミノカプロン酸、チオグリコール酸、チオプロピ
オン酸、ブロム酢酸及び／又はヨード酢酸から構成され
ているスペーサーを使用する。これらの合成要素は、所
望のヘテロ原子数を有する所望の長さのスペーサーが生
じるように構成されなければならない。
に行う。スペーサーとしてはホモ−又はヘテロ−二官能
性リンカー、すなわちジカルボン酸、ジアミン、アミノ
酸、メルカプトカルボン酸及びハロゲンカルボン酸が適
当である。好ましくは、スクシネート、グルタレート、
スベレート、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、
１，８−ジアミン−３，６−ジオキサオクタン、１，１
２−ジアミノ−４，９−ジオキサドデカン、アミノ酪
酸、アミノカプロン酸、チオグリコール酸、チオプロピ
オン酸、ブロム酢酸及び／又はヨード酢酸から構成され
ているスペーサーを使用する。これらの合成要素は、所
望のヘテロ原子数を有する所望の長さのスペーサーが生
じるように構成されなければならない。
【００１５】本発明によるハプテン−ビオチン複合体を
用いると、反応時間の短縮及びひいては能力の増大をも
たらす溶媒和の改善が達成される。
用いると、反応時間の短縮及びひいては能力の増大をも
たらす溶媒和の改善が達成される。
【００１６】本発明の他の対象は、本発明によるハプテ
ン−ビオチン複合体を使用して、反応の際に生じる凝集
を比濁法測定（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｓｃｈｅ ｏ
ｄｅｒ ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｓｈｅ Ｍｅｓｓｕ
ｎｇｅｎ）によって評価する、競合均質免疫検定法であ
る。
ン−ビオチン複合体を使用して、反応の際に生じる凝集
を比濁法測定（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｓｃｈｅ ｏ
ｄｅｒ ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｓｈｅ Ｍｅｓｓｕ
ｎｇｅｎ）によって評価する、競合均質免疫検定法であ
る。
【００１７】次に本発明を、実施例によって詳述する。
ＤＣ板上での物質の検出は２５４ｎｍでの螢光消光によ
って行い（珪酸ゲル６０Ｆ254、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ５
７４８及び珪酸ゲルＲＰ−１８、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ１
５６８５）又はビオチン含有化合物の場合にはＨ2ＳＯ4
／４−ジメチルアミノ−桂皮アルデヒドを噴霧すること
によって行う（この場合には次に１００℃で１０分乾燥
した）。混合物Ａ／Ｂ1/1（ｖ／ｖ）： Ａ） エタノール中の２％Ｈ2ＳＯ4 Ｂ） エタノール中の０．２％４−ジメチルアミノ−桂
皮アルデヒド。
ＤＣ板上での物質の検出は２５４ｎｍでの螢光消光によ
って行い（珪酸ゲル６０Ｆ254、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ５
７４８及び珪酸ゲルＲＰ−１８、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ１
５６８５）又はビオチン含有化合物の場合にはＨ2ＳＯ4
／４−ジメチルアミノ−桂皮アルデヒドを噴霧すること
によって行う（この場合には次に１００℃で１０分乾燥
した）。混合物Ａ／Ｂ1/1（ｖ／ｖ）： Ａ） エタノール中の２％Ｈ2ＳＯ4 Ｂ） エタノール中の０．２％４−ジメチルアミノ−桂
皮アルデヒド。
【００１８】例１５−（１−メチルキサンチ ン−３−イル）ペンタン酸 −
Ｎ−ヒドロキシイクシン イミドエステル の製造規定 （テオフイリン）−３−ｃｂ−ＮＨＳ） １．ａ） １−メチル−７−（ピバロイルオキシメチ
ル）キサンチン１−メチルキサンチン（０．５ｍｏｌ、
Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｎｏ．２８，０９８−４）８３ｇ
を、無水ＤＭＦ３．５ ｌ中に溶かし、無水炭酸ナトリ
ウム５５ｇを加える。次に無水ＤＭＦ３００ｍｌ中のピ
バリン酸クロルメチルエステル（Ａｌｄｅｉｃｈ社、Ｎ
ｏ．１４，１１８−６）８０ｍｌを２０℃で撹拌下に３
０分以内に滴加する。４８時間の反応後に濾過漏斗によ
り吸引濾過し、濾液を高真空で蒸発させる。油状残留物
を、生成物が固化するまでジイソプロピルエーテル５０
０ｍｌと共に熟成させ、次に吸引濾取する。固形物をク
ロロホルム５００ｍｌ中に取り、不溶成分を濾取し、溶
液を蒸発させる。残留物を石油エーテル約２５０ｍｌと
共に熟成し、固体生成物を吸引濾取し、乾燥器で乾燥さ
せる。
Ｎ−ヒドロキシイクシン イミドエステル の製造規定 （テオフイリン）−３−ｃｂ−ＮＨＳ） １．ａ） １−メチル−７−（ピバロイルオキシメチ
ル）キサンチン１−メチルキサンチン（０．５ｍｏｌ、
Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｎｏ．２８，０９８−４）８３ｇ
を、無水ＤＭＦ３．５ ｌ中に溶かし、無水炭酸ナトリ
ウム５５ｇを加える。次に無水ＤＭＦ３００ｍｌ中のピ
バリン酸クロルメチルエステル（Ａｌｄｅｉｃｈ社、Ｎ
ｏ．１４，１１８−６）８０ｍｌを２０℃で撹拌下に３
０分以内に滴加する。４８時間の反応後に濾過漏斗によ
り吸引濾過し、濾液を高真空で蒸発させる。油状残留物
を、生成物が固化するまでジイソプロピルエーテル５０
０ｍｌと共に熟成させ、次に吸引濾取する。固形物をク
ロロホルム５００ｍｌ中に取り、不溶成分を濾取し、溶
液を蒸発させる。残留物を石油エーテル約２５０ｍｌと
共に熟成し、固体生成物を吸引濾取し、乾燥器で乾燥さ
せる。
【００１９】収量：２４．８ｇ（理論値の１８％） ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル；Ｒf＝０．５８ １．ｂ） ３−エチルオキシカルボニルブチル−１−メ
チル−７−（ピバロイルオキシメチル）−キサンチン１
ａ）で得られた化合物２２．４ｇ（８０ｍ ｍｏｌ）を
無水ＤＭＦ３００ｍｌ中に溶かし、無水炭酸ナトリウム
１７ｇ（１６０ｍ ｍｏｌ）及び５−ブロムペンタン酸
エチルエステル３３．６ｇ（＝２８ｍｌ）、１６０ｍ
ｍｏｌ）を加える。２０℃で３日間撹拌し、次に酢酸エ
ステル３ ｌで希釈し、溶液を濾過し、各1 lの水で３回
洗浄する。無水硫酸ナトリウム１００ｇで溶液を脱水
し、回転蒸発器により溶剤を除去する。残留する油状生
成物はこの形で次の段階で使用することができる。
チル−７−（ピバロイルオキシメチル）−キサンチン１
ａ）で得られた化合物２２．４ｇ（８０ｍ ｍｏｌ）を
無水ＤＭＦ３００ｍｌ中に溶かし、無水炭酸ナトリウム
１７ｇ（１６０ｍ ｍｏｌ）及び５−ブロムペンタン酸
エチルエステル３３．６ｇ（＝２８ｍｌ）、１６０ｍ
ｍｏｌ）を加える。２０℃で３日間撹拌し、次に酢酸エ
ステル３ ｌで希釈し、溶液を濾過し、各1 lの水で３回
洗浄する。無水硫酸ナトリウム１００ｇで溶液を脱水
し、回転蒸発器により溶剤を除去する。残留する油状生
成物はこの形で次の段階で使用することができる。
【００２０】収量：粘性油状物４４ｇ（比較的多量の溶
剤を含有する）。
剤を含有する）。
【００２１】ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル；Ｒf＝
０．７５ １．ｃ） ３−カルボキシブチル−１−メチルキサンチ
ン（テオフイリン−３−ｃｂ） １ｂ）で得られた油状生成物４４ｇ全部を、２Ｎ Ｎａ
ＯＨ２．８ ｌ中で環流下に２時間撹拌する。次に冷却
し、溶液のｐＨ値を濃ＨＣｌで５に調節する。この際沈
殿する生成物を吸引濾取し、水で洗浄し、乾燥器で塩化
カルシウムにより乾燥する。
０．７５ １．ｃ） ３−カルボキシブチル−１−メチルキサンチ
ン（テオフイリン−３−ｃｂ） １ｂ）で得られた油状生成物４４ｇ全部を、２Ｎ Ｎａ
ＯＨ２．８ ｌ中で環流下に２時間撹拌する。次に冷却
し、溶液のｐＨ値を濃ＨＣｌで５に調節する。この際沈
殿する生成物を吸引濾取し、水で洗浄し、乾燥器で塩化
カルシウムにより乾燥する。
【００２２】収量：１０．６ｇ（理論値の５０％） ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル／メタノール９／１ （ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．３７ １．ｄ） ５−（１−メチルキサンチン−３−イル）ペ
ンタン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル （テオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ） １ｃ）で得られたテオフイリン−カルボン酸５．３ｇ
(２０ｍ ｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ１５０ｍｌ中に溶か
し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．７６ｇ（２４ｍ
ｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボンジイミド４．
９５ｇ（２４ｍ ｍｏｌ）を加える。２０℃で２４時間
撹拌し、沈殿したジシクロヘキシル尿素を吸引濾取し、
濾液を真空で蒸発させ、再びＤＭＦ１００ｍｌ中に溶か
す。溶液を濾過後に再び蒸発させ、残留物をイソプロパ
ノール１００ｍｌと共に熟成させる。固体生成物を吸引
濾取し、乾燥器で乾燥させる。
ンタン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル （テオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ） １ｃ）で得られたテオフイリン−カルボン酸５．３ｇ
(２０ｍ ｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ１５０ｍｌ中に溶か
し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．７６ｇ（２４ｍ
ｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボンジイミド４．
９５ｇ（２４ｍ ｍｏｌ）を加える。２０℃で２４時間
撹拌し、沈殿したジシクロヘキシル尿素を吸引濾取し、
濾液を真空で蒸発させ、再びＤＭＦ１００ｍｌ中に溶か
す。溶液を濾過後に再び蒸発させ、残留物をイソプロパ
ノール１００ｍｌと共に熟成させる。固体生成物を吸引
濾取し、乾燥器で乾燥させる。
【００２３】収量：無色微結晶粉末６．０ｇ（理論値の
８３％） ＤＣ：珪酸ゲル ＲＰ−１８、ニトロメタン／エタノー
ル9/1（ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．８２ 例２テオフイリン−３−ｃｂ− ＮＨ−ＮＨ−ビオチンの製 造 例１からのテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ７２．７ｍ
ｇ（０．２ｍ ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ２０ｍｌ中に溶か
し、ビオチン−ヒドラジド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ
社、Ｎｏ．Ｂ７６３９）７７．５ｍｇ（０．３ｍ ｍｏ
ｌ）及び４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（Ｍ
ｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８２０４９９）１００μｇを加え
る。２０℃で４時間撹拌し、次に溶剤を高真空で除去
し、半固体の残留物をメタノール約５ｍｌと共に熟成さ
れる。固体生成物を吸引濾取し、高真空ポンプにより乾
燥する。
８３％） ＤＣ：珪酸ゲル ＲＰ−１８、ニトロメタン／エタノー
ル9/1（ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．８２ 例２テオフイリン−３−ｃｂ− ＮＨ−ＮＨ−ビオチンの製 造 例１からのテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ７２．７ｍ
ｇ（０．２ｍ ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ２０ｍｌ中に溶か
し、ビオチン−ヒドラジド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ
社、Ｎｏ．Ｂ７６３９）７７．５ｍｇ（０．３ｍ ｍｏ
ｌ）及び４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（Ｍ
ｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８２０４９９）１００μｇを加え
る。２０℃で４時間撹拌し、次に溶剤を高真空で除去
し、半固体の残留物をメタノール約５ｍｌと共に熟成さ
れる。固体生成物を吸引濾取し、高真空ポンプにより乾
燥する。
【００２４】収量：無水粉末６６ｍｇ（理論値の６５
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）：Ｒf＝０．４ 例３テオフイリン−３−ｃｂ− １，８−ジアミノ−３，６ −
ジオキサオクタン−ビオ チンの製造 例１からのテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ １８２ｍ
ｇ（０．５ｍ ｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ１５ｍｌ中に溶
かし、ビオチン−１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサ
オクタン（ビオチン−ＤＡＤＯＯ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｎｏ．１１１２０７４）２
０６ｍｇ（０．５５ｍ ｍｏｌ）を２０℃で１６時間撹
拌する。次に溶剤を高真空で除去し、残留物を少量のメ
タノール／クロロホルム1/1（ｖ／ｖ）から再結晶させ
る。この生成物を高真空ポンプにより乾燥する。
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）：Ｒf＝０．４ 例３テオフイリン−３−ｃｂ− １，８−ジアミノ−３，６ −
ジオキサオクタン−ビオ チンの製造 例１からのテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ １８２ｍ
ｇ（０．５ｍ ｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ１５ｍｌ中に溶
かし、ビオチン−１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサ
オクタン（ビオチン−ＤＡＤＯＯ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｎｏ．１１１２０７４）２
０６ｍｇ（０．５５ｍ ｍｏｌ）を２０℃で１６時間撹
拌する。次に溶剤を高真空で除去し、残留物を少量のメ
タノール／クロロホルム1/1（ｖ／ｖ）から再結晶させ
る。この生成物を高真空ポンプにより乾燥する。
【００２５】収量：無色微結晶粉末１２８ｍｇ（理論値
の４１％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．５７ 例４テオフイリン−３−ｃｂ− ＤＡＤＯＯ−Ｘ−ビオチン ４．ａ） ビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯ １，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（ＤＡＤ
ＯＯ、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８１８１１６）７．３３ｍ
ｌ（５０ｍ ｍｏｌ）を、ジオキサン／０．１Ｍ燐酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ８．５）2/1（ｖ／ｖ）４５ｍｌ中
に溶かす。同じ溶剤混合物中に溶かしたビオチン−ｅ−
アミノカボン酸−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエス
テル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｎ
ｏ．１００３９３３）１．１４ｇ（２．５ｍ ｍｏｌ）
の溶液、２０℃で撹拌しながら３０分間滴加する。引続
き５時間撹拌し、溶液を蒸発させ、油状残留物を少量の
メタノール中に溶かす。激しく撹拌しながら酢酸エステ
ル２００ｍｌ中に注入すると、白色がかった黄色沈殿物
が生じる。吸引濾取し、沈殿物をできるだけ少量のメタ
ノール／アンモニア9/1（ｖ／ｖ）中に溶かし、珪酸ゲ
ルカラム（５×３０ｃｍ）、溶離液メタノール／アンモ
ニア9/1（ｖ／ｖ）により精製する。相応の画分を集
め、蒸発させ、固体生成物を高真空ポンプにより乾燥さ
せる。
の４１％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．５７ 例４テオフイリン−３−ｃｂ− ＤＡＤＯＯ−Ｘ−ビオチン ４．ａ） ビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯ １，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（ＤＡＤ
ＯＯ、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８１８１１６）７．３３ｍ
ｌ（５０ｍ ｍｏｌ）を、ジオキサン／０．１Ｍ燐酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ８．５）2/1（ｖ／ｖ）４５ｍｌ中
に溶かす。同じ溶剤混合物中に溶かしたビオチン−ｅ−
アミノカボン酸−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエス
テル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｎ
ｏ．１００３９３３）１．１４ｇ（２．５ｍ ｍｏｌ）
の溶液、２０℃で撹拌しながら３０分間滴加する。引続
き５時間撹拌し、溶液を蒸発させ、油状残留物を少量の
メタノール中に溶かす。激しく撹拌しながら酢酸エステ
ル２００ｍｌ中に注入すると、白色がかった黄色沈殿物
が生じる。吸引濾取し、沈殿物をできるだけ少量のメタ
ノール／アンモニア9/1（ｖ／ｖ）中に溶かし、珪酸ゲ
ルカラム（５×３０ｃｍ）、溶離液メタノール／アンモ
ニア9/1（ｖ／ｖ）により精製する。相応の画分を集
め、蒸発させ、固体生成物を高真空ポンプにより乾燥さ
せる。
【００２６】収量：無色粉末７３０ｍｇ（理論値の６０
％） ＤＣ：珪酸ゲル、メタノール／アンモニア9/1（ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．４６ ４．ｂ） テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＯ−Ｘ−
ビオチン例１からのテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ１
８２ｍｇ（０．５ｍｏｌ）を無水ＤＮＦ２０ｍｌ中に溶
かし、ビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯ２４５ｍｇ（０．５ｍ
ｍｏｌ）及びトリエチルアミン６９μｌ（０．５ｍ ｍ
ｏｌ）を加える。２０℃で１６時間撹拌し、次に溶剤を
真空で蒸発させ、生成物を珪酸ゲルカラム（２．８×３
３ｃｍ）によるクロマトグラフイーによって精製する。
溶離液：クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）。相
応の画分を集め、溶剤を真空で除去し、残留物をジイソ
プロピルエーテル２０ｍｌと共に熟成する。固体生成物
を、乾燥器でＣａＣｌ2により乾燥する。
％） ＤＣ：珪酸ゲル、メタノール／アンモニア9/1（ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．４６ ４．ｂ） テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＯ−Ｘ−
ビオチン例１からのテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ１
８２ｍｇ（０．５ｍｏｌ）を無水ＤＮＦ２０ｍｌ中に溶
かし、ビオチン−Ｘ−ＤＡＤＯＯ２４５ｍｇ（０．５ｍ
ｍｏｌ）及びトリエチルアミン６９μｌ（０．５ｍ ｍ
ｏｌ）を加える。２０℃で１６時間撹拌し、次に溶剤を
真空で蒸発させ、生成物を珪酸ゲルカラム（２．８×３
３ｃｍ）によるクロマトグラフイーによって精製する。
溶離液：クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）。相
応の画分を集め、溶剤を真空で除去し、残留物をジイソ
プロピルエーテル２０ｍｌと共に熟成する。固体生成物
を、乾燥器でＣａＣｌ2により乾燥する。
【００２７】収量：無色粉末２１５ｍｇ（理論値の５８
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．６０ 例５ テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＤＯＤ−Ｘ−ビオチン ５．ａ） テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ １，１２−ジアミノ−４，９−ジオキサドデカン（ＤＡ
ＤＯＤ、Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｎｏ．２２，７４４−７）
４．２４ｍｌ（２０ｍ ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ１０ｍｌ
中に溶かし、無水ＤＭＦ２０ｍｌ中に溶かした例１から
のテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ３６３ｍｇ（１ｍ
ｍｏｌ）の溶液を３０分間で滴加する。数分後に綿状沈
殿物が形成される。引続き２０℃で３時間撹拌し、次に
濾過し、濾液を真空で蒸発させる。酢酸エステル５０ｍ
ｌと共に熟成し、溶剤をデカンテーシヨンし、残留物を
少量のＤＭＦ中に溶かす。この溶液を激しく撹拌しなが
ら酢酸エステル５０ｍｌ中に注入する。この際沈殿する
粗生成物を吸引濾取し、珪酸ゲルカラム（５×３５ｃ
ｍ）、溶離液：クロロホルム／メタノール／アンモニア
6/3/1（ｖ／ｖ／ｖ）によるクロマトグラフイーによっ
て精製する。相応の画分を集め、溶剤を真空で除去し、
残存する生成物を水から凍結乾燥する。乾燥器でＣａＣ
ｌ2により乾燥する。
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．６０ 例５ テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＤＯＤ−Ｘ−ビオチン ５．ａ） テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ １，１２−ジアミノ−４，９−ジオキサドデカン（ＤＡ
ＤＯＤ、Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｎｏ．２２，７４４−７）
４．２４ｍｌ（２０ｍ ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ１０ｍｌ
中に溶かし、無水ＤＭＦ２０ｍｌ中に溶かした例１から
のテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ３６３ｍｇ（１ｍ
ｍｏｌ）の溶液を３０分間で滴加する。数分後に綿状沈
殿物が形成される。引続き２０℃で３時間撹拌し、次に
濾過し、濾液を真空で蒸発させる。酢酸エステル５０ｍ
ｌと共に熟成し、溶剤をデカンテーシヨンし、残留物を
少量のＤＭＦ中に溶かす。この溶液を激しく撹拌しなが
ら酢酸エステル５０ｍｌ中に注入する。この際沈殿する
粗生成物を吸引濾取し、珪酸ゲルカラム（５×３５ｃ
ｍ）、溶離液：クロロホルム／メタノール／アンモニア
6/3/1（ｖ／ｖ／ｖ）によるクロマトグラフイーによっ
て精製する。相応の画分を集め、溶剤を真空で除去し、
残存する生成物を水から凍結乾燥する。乾燥器でＣａＣ
ｌ2により乾燥する。
【００２８】収量：無色粉末２４０ｍｇ（理論値の５３
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール／アンモニ
ア6/3/1(ｖ／ｖ／ｖ)；Ｒf＝０．４２ ５．ｂ） テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ−Ｘ−
ビオチンテオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ２２５ｍ
ｇ（０．５ｍ ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ４０ｍｌ中に溶か
し、ビオチン−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル２２７ｍｇ（０．５ｍｏｌ）を
加える。トリエチルアミン６９μｌ（０．５ｍ ｍｏ
ｌ）を加えた後、２０℃で６時間撹拌する。溶剤を高真
空で除去し、残留物をできるだけ少量のクロロホルム／
メタノール1/1（ｖ／ｖ）中に溶かし、珪酸ゲルカラム
（５×３５ｃｍ）上に施す。クロロホルム／メタノール
2/1（ｖ／ｖ）で溶離する。相応の画分を集め、溶剤を
真空で除去し、テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ−
Ｘ−ビオチンを水から凍結乾燥する。
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール／アンモニ
ア6/3/1(ｖ／ｖ／ｖ)；Ｒf＝０．４２ ５．ｂ） テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ−Ｘ−
ビオチンテオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ２２５ｍ
ｇ（０．５ｍ ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ４０ｍｌ中に溶か
し、ビオチン−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル２２７ｍｇ（０．５ｍｏｌ）を
加える。トリエチルアミン６９μｌ（０．５ｍ ｍｏ
ｌ）を加えた後、２０℃で６時間撹拌する。溶剤を高真
空で除去し、残留物をできるだけ少量のクロロホルム／
メタノール1/1（ｖ／ｖ）中に溶かし、珪酸ゲルカラム
（５×３５ｃｍ）上に施す。クロロホルム／メタノール
2/1（ｖ／ｖ）で溶離する。相応の画分を集め、溶剤を
真空で除去し、テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＤ−
Ｘ−ビオチンを水から凍結乾燥する。
【００２９】収量：無色粉末３１０ｍｇ（理論値の７８
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ／）；Ｒf＝０．５４ 例６ テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−ＤＡ
ＤＯＯ−ビオチン ６．ａ） ビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃビオチン−
ＤＡＤＯＯ１．５ｇ（４ｍ ｍｏｌ）を、ピリジン３０
ｍｌ中に溶かし、コハク酸無水物８００ｍｇ（８ｍ ｍ
ｏｌ）を加える。４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ピ
リジン０．１ｍｇを加えた後、２０℃で１時間撹拌す
る。次に溶剤を高真空で除去する。残留物を酢酸エステ
ル２０ｍｌと共に熟成し、吸引濾取する。酢酸エステル
約２０ｍｌで洗浄し、生成物を乾燥器でＣａＣｌ2によ
り乾燥する。
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ／）；Ｒf＝０．５４ 例６ テオフイリン−３−ｃｂ−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−ＤＡ
ＤＯＯ−ビオチン ６．ａ） ビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃビオチン−
ＤＡＤＯＯ１．５ｇ（４ｍ ｍｏｌ）を、ピリジン３０
ｍｌ中に溶かし、コハク酸無水物８００ｍｇ（８ｍ ｍ
ｏｌ）を加える。４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ピ
リジン０．１ｍｇを加えた後、２０℃で１時間撹拌す
る。次に溶剤を高真空で除去する。残留物を酢酸エステ
ル２０ｍｌと共に熟成し、吸引濾取する。酢酸エステル
約２０ｍｌで洗浄し、生成物を乾燥器でＣａＣｌ2によ
り乾燥する。
【００３０】収量：無色微結晶粉末１．４ｇ（理論値の
７４％） ＤＣ：珪酸ゲルＲＰ−１８、イソプロパノール／水／氷
酢酸85/14/1（ｖ／ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．７４ ６．ｂ） ビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−ＤＡＤＯ
Ｏビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ ２３８ｍｇ（０．
５ｍ ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ２５ｍｌ中に溶かし、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド５７ｍｇ（０．５ｍ ｍｏ
ｌ）及び２−（４−モルホリニル）−エチルイソシアニ
ド（Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８１８６４９）６９μｌ
（０．５ｍ ｍｏｌ）を加える。２０℃で３０分撹拌
し、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（Ｄ
ＡＤＯＯ、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８１８１１６）１．５
ｍｌ（１０ｍ ｍｏｌ）を加え、さらにＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド５７ｍｇ及び２−（４−モルホリニル）
エチルイソシアニド６９μｌを加える。引続きこの溶液
を１６時間撹拌し、次に溶剤を高真空で除去し、生成物
を珪酸ゲルカラム（５×６０ｃｍ）、溶離液：クロロホ
ルム／メタノール／アンモニア6/3/1（ｖ／ｖ／ｖ）に
よるクロマトグラフイーによって精製する。相応の画分
を集め、溶剤を除去し、残留物を酢酸エステル１０ｍｌ
と共に熟成する。固体生成物を吸引濾取し、高真空ポン
プにより乾燥する。
７４％） ＤＣ：珪酸ゲルＲＰ−１８、イソプロパノール／水／氷
酢酸85/14/1（ｖ／ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．７４ ６．ｂ） ビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−ＤＡＤＯ
Ｏビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ ２３８ｍｇ（０．
５ｍ ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ２５ｍｌ中に溶かし、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド５７ｍｇ（０．５ｍ ｍｏ
ｌ）及び２−（４−モルホリニル）−エチルイソシアニ
ド（Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８１８６４９）６９μｌ
（０．５ｍ ｍｏｌ）を加える。２０℃で３０分撹拌
し、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（Ｄ
ＡＤＯＯ、Ｍｅｒｃｋ社、Ｎｏ．８１８１１６）１．５
ｍｌ（１０ｍ ｍｏｌ）を加え、さらにＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド５７ｍｇ及び２−（４−モルホリニル）
エチルイソシアニド６９μｌを加える。引続きこの溶液
を１６時間撹拌し、次に溶剤を高真空で除去し、生成物
を珪酸ゲルカラム（５×６０ｃｍ）、溶離液：クロロホ
ルム／メタノール／アンモニア6/3/1（ｖ／ｖ／ｖ）に
よるクロマトグラフイーによって精製する。相応の画分
を集め、溶剤を除去し、残留物を酢酸エステル１０ｍｌ
と共に熟成する。固体生成物を吸引濾取し、高真空ポン
プにより乾燥する。
【００３１】収量：無色粉末１９５ｍｇ（論理値の６５
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール／アンモニ
ア 6/3/1（ｖ／ｖ／ｖ）； Ｒf＝０．５４ ６．ｃ） テオフイリン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−ＤＡ
ＤＯＯ−ビオチンビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−Ｄ
ＡＤＯＯ１５１ｍｇ（０.２５ｍ ｍｏｌ）を、例１から
のテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ９１ｍｇ（０．２５
ｍ ｍｏｌ）と一緒に無水ＤＭＦ１０ｍｌ中溶かし、ト
リエチルアミン３５μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）加える。
２０℃で４時間撹拌し、次に溶剤を高真空で除去し、生
成物を珪酸ゲルカラム（３．５×４０ｃｍ）、溶離液：
クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）によりクロマ
トグラフイーによって分離する。相応の画分を集め、溶
剤を真空で除去し、生成物を高真空ポンプにより少なく
とも６時間乾燥する。
％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール／アンモニ
ア 6/3/1（ｖ／ｖ／ｖ）； Ｒf＝０．５４ ６．ｃ） テオフイリン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−ＤＡ
ＤＯＯ−ビオチンビオチン−ＤＡＤＯＯ−ｓｕｃｃ−Ｄ
ＡＤＯＯ１５１ｍｇ（０.２５ｍ ｍｏｌ）を、例１から
のテオフイリン−３−ｃｂ−ＮＨＳ９１ｍｇ（０．２５
ｍ ｍｏｌ）と一緒に無水ＤＭＦ１０ｍｌ中溶かし、ト
リエチルアミン３５μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）加える。
２０℃で４時間撹拌し、次に溶剤を高真空で除去し、生
成物を珪酸ゲルカラム（３．５×４０ｃｍ）、溶離液：
クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）によりクロマ
トグラフイーによって分離する。相応の画分を集め、溶
剤を真空で除去し、生成物を高真空ポンプにより少なく
とも６時間乾燥する。
【００３２】収量：無色粘性油状物１０５ｍｇ（理論値
の４９％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．３６ 例７ テオフイリンの測定 試薬： 試薬１：ストレプトアビジン−ラテックス（ＥＰ−Ａ０
３４９９８８により製造） ０．１重量％から成る。
の４９％） ＤＣ：珪酸ゲル、クロロホルム／メタノール2/1（ｖ／ｖ）；Ｒf＝０．３６ 例７ テオフイリンの測定 試薬： 試薬１：ストレプトアビジン−ラテックス（ＥＰ−Ａ０
３４９９８８により製造） ０．１重量％から成る。
【００３３】試料２：テオフイリンに対するモノクロナ
ール抗体１．５×１０-6ｍｏｌ／ｌと、 テオフイリン
及びビオチンの複合体（例６により製造）４．５×１０
-7ｍｏｌ ／ｌから成る。
ール抗体１．５×１０-6ｍｏｌ／ｌと、 テオフイリン
及びビオチンの複合体（例６により製造）４．５×１０
-7ｍｏｌ ／ｌから成る。
【００３４】試料３μｌを３７℃で試薬２３０ｍｌと一
緒に装置に入れ、５分間インキュベートとする。次に試
薬１５００μｌを加え、吸光度の変化を４．２分以内で
で測定する。表１は、試料としてテオフイリン水溶液を
使用する場合に得られる測定値を示す。
緒に装置に入れ、５分間インキュベートとする。次に試
薬１５００μｌを加え、吸光度の変化を４．２分以内で
で測定する。表１は、試料としてテオフイリン水溶液を
使用する場合に得られる測定値を示す。
【００３５】例８ Ｔ４の測定 試薬： 試薬１：バルビツール酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）１００
ｍｍｏｌ／ｌ、デキストラン硫酸２重量％、ストレプト
アビジン−ラテックス（ＥＰ−Ａ０３４９９８８により
製造）０．０２重量％、ポリクロナール抗体（Ｔ４に対
するＩｇＧ）４×１０−８ｍｏｌ／ｌから成る。
ｍｍｏｌ／ｌ、デキストラン硫酸２重量％、ストレプト
アビジン−ラテックス（ＥＰ−Ａ０３４９９８８により
製造）０．０２重量％、ポリクロナール抗体（Ｔ４に対
するＩｇＧ）４×１０−８ｍｏｌ／ｌから成る。
【００３６】試薬２：Ｔ４及びビオチンの複合体（例６
により製造）４×１０−８ｍｏｌ／ｌから成る。この場
合には、テオフイリン−３ｃｂ−ＮＨＳの代りにＴ４−
（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−ＮＨＳ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ）Ｔ４を使用す
る。
により製造）４×１０−８ｍｏｌ／ｌから成る。この場
合には、テオフイリン−３ｃｂ−ＮＨＳの代りにＴ４−
（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−ＮＨＳ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ）Ｔ４を使用す
る。
【００３７】試料５μｌ及び試薬１ ２３５μｌを３７
℃で一緒に装置に入れ、５分間インキュベーストとす
る。次に試薬２ ２０μｌを加え、吸光度の変化を４０
５ｎｍで２分以内に測定する。血清標準を用いると、表
２の測定値が得られる。
℃で一緒に装置に入れ、５分間インキュベーストとす
る。次に試薬２ ２０μｌを加え、吸光度の変化を４０
５ｎｍで２分以内に測定する。血清標準を用いると、表
２の測定値が得られる。
【００３８】 表 １ テオフイリン［ｍｏｌ／ｌ］ ΔｍＥ／４．２ ｍｉｎ １．０・１０-5 ４６１ ２．６・１０-5 ２８２ ５．０・１０-5 １４５ １０-4 ４０ ２．０・１０-4 ４ 表 ２ Ｔ4［μｇ／ｄｌ］ ΔｍＥ／２ ｍｉｎ ０．６ ３３５．１２ ４．３ ２０１．８９ ８．５ １２６．２３ １４．６ ６４．７４ ２６．１ ２３．８５
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 473:00） (72)発明者 ディートマル ツドゥネク ドイツ連邦共和国 ミュンヘン 40 ブリ ューテンシュトラーセ 21 (72)発明者 クリスチアン クライン ドイツ連邦共和国 ヴァイルハイム ブリ ューテンシュトラーセ 16 (72)発明者 ローラント シェンク ドイツ連邦共和国 ヴァイルハイム ベレ ンミュールヴェーク 64 (56)参考文献 欧州特許出願公開310361（ＥＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ハプテンが、鎖中に２６〜４０個の原子
を有しかつ同鎖の成分として少なくとも５個のヘテロ原
子を含む線状スペーサーを介してビオチンに結合されて
いることを特徴とするハプテン−ビオチン複合体。 - 【請求項２】 請求項１記載のハプテン−ビオチン複合
体を使用して、反応の際生じる凝集を比濁法測定によっ
て評価する競合均質免疫検定法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| DE4011601.8 | 1990-04-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04224583A JPH04224583A (ja) | 1992-08-13 |
| JPH082910B2 true JPH082910B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=6404148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| AT (1) | ATE126595T1 (ja) |
| DE (2) | DE4011601A1 (ja) |
| DK (1) | DK0451810T3 (ja) |
| ES (1) | ES2077101T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5534620A (en) * | 1987-09-30 | 1996-07-09 | Beckman Instruments, Inc. | Method of heterogenous purification using a bidentate conjugate |
| DE4239429A1 (de) * | 1992-11-24 | 1994-05-26 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Immunkonjugaten |
| CA2130170A1 (en) * | 1993-01-06 | 1994-07-21 | Josephine M. Michael | Method for making a preconjugate |
| US5536820A (en) * | 1993-02-26 | 1996-07-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Avidin-binding azo reagents |
| US5728589A (en) * | 1993-08-24 | 1998-03-17 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Immunoassay method |
| US5527711A (en) * | 1993-12-13 | 1996-06-18 | Hewlett Packard Company | Method and reagents for binding chemical analytes to a substrate surface, and related analytical devices and diagnostic techniques |
| US5747352A (en) * | 1994-05-23 | 1998-05-05 | Beckman Instruments, Inc. | Reagents and methods for the rapid and quantitative assay of pharmacological agents |
| US5716594A (en) * | 1994-06-06 | 1998-02-10 | The Jmde Trust | Biotin compounds for targetting tumors and sites of infection |
| JP4013996B2 (ja) * | 1994-06-06 | 2007-11-28 | テムド トラスト | 腫瘍および感染部位に指向させるためのビオチン化合物 |
| JP3260379B2 (ja) † | 1995-12-29 | 2002-02-25 | ビオテッツ ベルリン―ブッフ ゲーエムベーハー | 西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて生体分子を標識する方法 |
| DE19748489A1 (de) | 1997-11-03 | 1999-05-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Polyethylenglykol-derivatisierte Biomoleküle und deren Verwendung in heterogenen Nachweisverfahren |
| US6326479B1 (en) | 1998-01-27 | 2001-12-04 | Boston Probes, Inc. | Synthetic polymers and methods, kits or compositions for modulating the solubility of same |
| US6153442A (en) * | 1998-05-20 | 2000-11-28 | Dade Behring Inc. | Reagents and methods for specific binding assays |
| US20030003602A1 (en) * | 2001-03-07 | 2003-01-02 | Bernd Vogt | Homogeneous immunoassay method |
| US7145019B2 (en) * | 2003-10-16 | 2006-12-05 | Ambergen, Inc. | Photocleavable isotope-coded affinity tags |
| US20090136522A1 (en) * | 2006-03-24 | 2009-05-28 | Haynes Barton F | Multivalent Immunogen |
| JP2010053118A (ja) * | 2008-07-28 | 2010-03-11 | Fujifilm Corp | ビオチン化チロキシン |
| CN113721012B (zh) * | 2021-08-27 | 2022-08-09 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种组合物及其试剂盒在检测甘胆酸中的用途 |
| WO2023083723A1 (en) | 2021-11-11 | 2023-05-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel monoclonal antibodies directed against l-thyroxine and diagnostic uses thereof |
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| US4617261A (en) * | 1984-03-21 | 1986-10-14 | Cetus Corporation | Process for labeling nucleic acids and hybridization probes |
| NZ211453A (en) * | 1984-03-22 | 1989-01-06 | Biotechnology Research Enterpr | Aryl azides, their preparation and use in the detection, localisation and isolation of polynucleotides |
| US4760142A (en) * | 1984-11-27 | 1988-07-26 | Hoechst Celanese Corporation | Divalent hapten derivatives |
| DE3586314D1 (de) * | 1984-11-27 | 1992-08-13 | Behringwerke Ag | Bifunktionelle haptene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung. |
| EP0315317B2 (en) * | 1987-09-30 | 2000-05-10 | Beckman Instruments, Inc. | Bidentate conjugate and method of use thereof |
| EP0310361A3 (en) * | 1987-09-30 | 1989-05-24 | Beckman Instruments, Inc. | Tridentate conjugate and method of use thereof |
| DE3822750A1 (de) * | 1988-07-05 | 1990-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
-
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- 1990-04-10 DE DE4011601A patent/DE4011601A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-04-04 KR KR1019910005425A patent/KR910018419A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-04-05 JP JP3072756A patent/JPH082910B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-10 EP EP91105678A patent/EP0451810B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-10 DK DK91105678.6T patent/DK0451810T3/da active
- 1991-04-10 US US07/683,284 patent/US5219764A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-10 DE DE59106246T patent/DE59106246D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-10 ES ES91105678T patent/ES2077101T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-10 AT AT91105678T patent/ATE126595T1/de not_active IP Right Cessation
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|---|---|
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| US5219764A (en) | 1993-06-15 |
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