JPH0651670B2 - 二官能性ハプテンおよび免疫化学的ハプテン測定法 - Google Patents

二官能性ハプテンおよび免疫化学的ハプテン測定法

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JPH0651670B2
JPH0651670B2 JP60110612A JP11061285A JPH0651670B2 JP H0651670 B2 JPH0651670 B2 JP H0651670B2 JP 60110612 A JP60110612 A JP 60110612A JP 11061285 A JP11061285 A JP 11061285A JP H0651670 B2 JPH0651670 B2 JP H0651670B2
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ベーリングウエルケ・アクチエンゲゼルシャフト
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は２個のハプテン成分が二官能性架橋構成部分を
介して結合している式A-X-A（式中Ａはハプテン成分で
ありそしてＸは二官能性架橋構成部分を意味する）を有
する二官能性ハプテン誘導体、およびそれらを用いる免
疫化学的ハプテン測定法に関する。
ハプテンは動物において何ら抗体生成を惹起しない限定
された分子量（通常1000以下）を有する化学的化合物と
して定義されうる。しかしながら高分子状抗原キヤリア
ーに共有結合した場合生成したハプテン／キヤリアー接
合体は宿主動物において抗体の生成をひき起し得、この
ことによりハプテンが識別される。この方法で抗体が産
生されるところの医薬、アミノ酸および代謝産物、小さ
なペプチド、ステロイドおよび芳香族残基例えばジニト
ロフエニル基のような物質種類を含む多数のハプテン例
が存在する。代表的なキヤリアーは宿主動物にとつて異
種である蛋白質のような大きな多官能性分子である。ハ
プテン／キヤリアー接合体の調製法は現在技術上よく知
られておりそしてビー・エフ・エルランガー（B.F.Erla
nger）氏により「メソツズ・イン・エンザイモロジー
（Methods in Enzymology）」第70巻第84頁（1980年）
にまとめられている。
二官能性ハプテンはハプテン／キヤリアー接合体の小部
分と見なされうる。キヤリアーは二個の官能基を介して
ハプテンに共有結合する。二個の官能基は異なりうる
が、しかしながら一般に同一である。キヤリアー分子は
任意の分子量および任意の分子形状を有しうる。
ここに記載されるキヤリアーは主に２個のハプテン成分
を１個の化学的架橋構成部分により分離するという目的
を有する。それらの二価特性ゆえにこれらはハプテンに
対応する隣接抗体分子上の抗原結合部位を架橋すること
ができ、従ってこれらは遊離のハプテンと区別される。
隣接する抗体分子を架橋するための二価ハプテンの構想
は一連の2,4−ジニトロフエニル化されたポリメチレン
ジアミンについて研究された（「ジエー・モレキユラー
・ビオル(J.Molecular Biol.)」第27巻第615頁（1967
年）参照）。最小８個の炭素原紙を有する長さの架橋構
成部分により抗体の架橋が可能であることが見出され
た。しかしながら、前記架橋構成部分の水溶性が非常に
悪いことが示された。水により良好に溶解する二価ハプ
テン系が必要でありそして所望されている。
本発明は二官能性ハプテン誘導体に関する。
特に本発明は式Ｉ A-X-A Ｉ 〔式中Ａはハプテン成分でありそしてＸは式II (B)m-Y-(CH2)n-Z-(CH2)n-Y-(B)m I
I （式中指数ｍは相互に独立して０または１であり、Ｂは
(CH2)n′（ここでｎ′は１〜４の整数である）またはCO
(CH2)n″（ここでｎ″は２〜４の整数である）であり、
基Ｙは−CONH−であり、ｎは１〜10の整数でありそして
Ｚは−Ｏ−(CH2)4−Ｏ−、ピペラジン−1,4−ジイルま
たは−NH(CH2)4−NH−である）ものとする〕に相当する
二官能性架橋構成部分を介して結合した２個のハプテン
成分からなる誘導体に関する。
Ｘはなかんずく合成された化学的化合物である。
ＺはＡに対する抗体を用いるＡの免疫学的検出を不可能
としない有機基である。
ここに記載された化合物はキヤリアー（ここでは簡単に
二官能性架橋構成部分として示される）が、１個または
それ以上の炭素原子がヘテロ原子により置換されたホモ
二官能性の、主に線状の、有機分子である新規な種類の
二価ハプテンである。好ましいヘテロ原子の例は酸素お
よび窒素である。これらヘテロ原子の挿入はこれらが欠
けた類似体と比較して水中における明らかに高められた
溶解度をハプテン接合体に付与する。疎水性ハプテンで
はこの溶性となされた架橋構成部分の性質により抗体の
形成に適する水性緩衝液中における二価ハプテンの調製
が可能である。
ハプテンは二官能性架橋構成部分と種々の共有結合によ
り結合しうるが、しかしながら特に好ましい方法はアミ
ド結合の調製にある。これにはハプテンがカルボキシル
官能基を含有するかまたはそれに容易に変換しうるもの
でなければならない。適当な、カルボキシル官能基を含
有するハプテンの例はＬ−チロキシンである。カルボキ
シル基が導入されうるハプテンには例えばテオフイリ
ン、フエニトイン(Phenytoin)およびフエノバルビター
ルが包含される。
結合すべきハプテンが何らカルボキシル官能基を含有し
ない場合は、これは当業者に知られた種々の方法に従い
導入されうる。例えばアミン、アルコールまたはチオー
ルのような求核性官能基を含有するハプテンをハロゲン
アルキルカルボン酸を用いてアルキル化するかまたはコ
ハク酸無水物と反応させて半スクシネートとなすことが
できる。
例えばアミノ酸の場合にそうであるように、アミン官能
基またはそれ以外の反応性の基がハプテン中に存在する
場合は、これらは二官能性ジアミン架橋構成部分との縮
合に着手する前に保護基で遮蔽されねばならない。保護
基は、後刻接合後のそれらの除去に際して二価ハプテン
を害わない限り現在技術においてよく知られたものが選
択されうる。適当な保護基には第三ブトキシカルボニ
ル、ベンジルオキシカルボニルおよびトリフルオロアセ
チルが包含される。適当な遮蔽法は現在技術においてよ
く知られている。
二官能性の架橋構成部分は、抗体粒子との反応において
立体的な相互作用ができるだけ少なくなるような長さを
有する。かつまた、二官能性架橋構成部分はそれが例え
ば窒素または酸素のような親水性原子の挿入により二価
接合体に水溶性を付与する性質を有するように選択され
る。それゆえ二官能性架橋構成部分の構成分Ｚとして
は、接合体に水溶性を付与するために-O-(CH2)4-O-、ピ
ペラジン−1,4−ジイル（1,4−ジ置換されたピペラジ
ン）または-NH-(CH2)4-NH-のような基が選択される。こ
の指標により前記化合物は現在技術により知られるそれ
にまさる利点を有する〔「ジエー・モル・ビオル（J.Mo
l.Biol）」第27巻第615頁（1967年参照）〕。この二官
能性架橋構成部分が対称であることは本発明にとつて必
要でないが、しかしかかる化合物がより合成容易であ
る。適当な二官能性架橋構成部分は現在技術においてよ
く知られた方法に従い合成できそして大部分は商業上入
手しうる。
ハプテンカルボキシレートと二官能性ジアミン架橋構成
部分との結合はアミド結合の形成に現在技術においてよ
く知られた種々の方法に従いカルボン酸基を予め活性化
することにより遂行される。これにはカルボジイミドま
たはカルボニルジイミダゾールのような縮合剤の使用な
らびにカルボキシ基の無水物、酸クロライドまたは活性
エステルへの変換が包含される。テオフイリンのとりわ
け活性化されたカルボキシル官能基は８−酪酸誘導体の
環状ラクタムである（実施例５参照）。
活性化されたハプテンカルボキシレートの二官能性ジア
ミン架橋構成部分への結合は二官能性架橋構成部分１に
対しハプテンの最小モル比２において、そして好ましく
は完全な反応を得るために程よい過剰のハプテン成分を
用いて遂行される。結合させるには種々の溶媒が用いら
れうる。特に好ましいのはジメチルホルムアミドまたは
ジメチルスルホキシドのような双極性の非プロトン型の
溶媒である。
仕上つた反応混合物は一般に二価のハプテン接合体およ
び活性化された過剰のハプテンカルボキシレートから専
らなる。二価ハプテンの取得は一般に選択的沈殿または
結晶化により遂行される。比較的困難な場合はシリカゲ
ルクロマトグラフイーのようなクロマトグラフイー法を
適用するのが好都合でありうる。
かかる二価ハプテンがポリクローナル抗体混合物のアフ
イニテイ精製に役立てられうることが考えられる。代表
的にはポリクローナル抗体混合物は関連するハプテンと
特異的に結合する小さな分子部分のみを含有する。この
フラクシヨンを単離するためには、固定されたハプテン
を含有するアフイニテイ担体を調製しうる。かかる担体
の調製はしばしば複雑でそしてその成果はハプテン負
荷、および固形マトリツクスを有するハプテンを結合す
る「コード」の長さのような容易に最適とならない変動
の如何による。固相での抗体のアフイニテイ精製におけ
る方法の概要およびその際出現する問題はイー・ルオス
ラーテイ（E.Ruoslahti）編、「イムノアドソーバンツ
・イン・プロテイン・ビユリフイケーシヨン（Immunoad
sorbents in Protein Purification）」、ユニバーシテ
イ・プレス（University Press）出版、ボルチモア、第
１８頁（1976年）と記載されている。それの代りに二価
ハプテンと特異的な抗体との間に小さな溶性の複合物を
形成させることができ、その後に異種抗体の分離が当業
者によく知られたモレキユラーシーブ法により達成され
うる。カラム分離したのち複合物をカオトロープ（chao
trope）塩での処理または酸性化のような現在技術によ
く知られた方法により分離する。次に第二のゲル過に
より精製された遊離の抗体が得られる。
かかる操作法は下記のようにして進行することが示され
うる。
pH7.4の隣酸塩緩衝された食塩溶液（以下PBSと略記す
る）中の知られた力価を有するポリクローナル免疫グロ
ブリンＧ１０mgを濃度１〜１０mg／ｍに調整しそして
少過剰の二価ハプテンで処理する。室温で30〜60分培養
したのちこの混合物をセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−
２００ゲル200ｍを含有するPBSで平衡化されたカラム
に加える。このカラムをPBSで溶離し、１〜５ｍずつ
のフラクシヨンを集める。複合物（分子量300,000また
はそれ以上）がゲルから除去されそしてカラムの「ボイ
ド量（Void Volume）」（Vo）の液体が流下すると共に
出現し、一方非特異的な抗体はピークより遅れて現われ
る。ピークフラクシヨンは280nmでの吸光により位置測
定されそして合一される。複合物は３モルカリウムチオ
シアネートまたは１モルプロピオン酸の同量と５分間処
理することにより分解されそして塩および遊離の二価ハ
プテンを除去するためにゲル過する。
本発明による二価のハプテン誘導体は濁り測定による医
薬含量測定にも使用されうる。すなわち近年臨床的な試
験法または診断法が出現し、その方法においては患者の
病理学的状況または病理学的予後が判定されるかまたは
患者に投与されるべき医薬量が、彼らの体内においてハ
プテンおよび／またはそれらの代謝産物としてまたは患
者に投与された医薬および／またはそれらの代謝産物と
して存在する低分子量の生理学的に活性な物質の尿また
は血液中における含量が計測される方法で測定される。
測定すべきハプテンは例えばT3およびT4のような甲状腺
ホルモンである。測定すべき医薬にはなかんずく下記の
ものがあげられる。すなわち、その薬用量ができるだけ
正確に計算されねばならず、そしてその作用が血液また
は尿中における濃度に関連して示されねばならない医
薬、例えばジギタリス製剤、抗生物質例えばテトラサイ
クリン、向精神剤例えばアンフエタミン、麻酔剤例えば
モルホリン、血液凝固剤ならびに抗凝固剤、しかし特に
テオフイリンおよびフエノバルビタールである。
この関連において概念ではハプテンは人体中に存在する
低分子量の生理学的に活性な物質ならびにそれらの代謝
産物、または人体に投与される医薬またはその代謝産物
であつて、それらは単独では抗体を産生する状態にない
が、しかし蛋白質、多糖類または糖蛋白質のようなそれ
自体抗原であるキヤリアー物質と結合すると抗体を産生
しうる物質であることが理解されるべきである。
ハプテンは通常痕跡量において出現し、その際これは血
液または尿中において複雑な組成を有する複合体結合ま
たは接合した形態で存在する。それゆえその検出および
測定法は費用がかかりそして時間を食うものである。
これらハプテンを測定するには、種々の方法、しかも物
理−化学的または免疫化学的方法または競合蛋白結合法
が用いられうる。
免疫化学的方法は反応の特異性および測定感度に関して
物理−化学的方法にまさつている。目下人体における痕
跡のハプテンの多数の免疫化学的測定法例えば凝集阻止
法、放射線免疫測定法（以下RIAと略記する）ならびに
酵素免疫測定法（以下EIAと略記する）が知られてい
る。知られたEIA法では測定すべきハプテンに対する抗
体を用いて感受性となされた粒子およびハプテンとキヤ
リアー物質との結合生成物が使用される（西ドイツ特許
公開公報第2155658号参照）。
凝集阻止法を実施するに際しては固形粒子例えば血液細
胞またはラテツクス粒子に結合した高い分子量を有する
蛋白質、多糖類または糖蛋白質のようなキヤリアー物質
と測定すべきハプテンからなる結合生成物が抗原成分と
して使用されうる。測定すべきハプテンに対する抗体
は、同様にハプテンとキヤリアー物質からの結合生成物
を用いて免疫された哺乳動物、例えばモルモツト、家兎
または羊から取得される抗血清から得られる。
抗体をハプテンキヤリアー接合体が結合した粒子と混合
するとこの二成分の間で凝集反応が行われる。この凝集
反応はその試料が測定すべきハプテンを含有している場
合は抑制される。これは、その際加水分解またはクロマ
トグラフイーのような複雑な方法措置を必要とすること
なく複合物または接合体の形態で血液中または尿中に存
在するハプテンを測定する簡単な方法である。その感度
は約100mg／ｍでありしかも血液細胞が粒子として使
用される場合にもそうである。しかしながら人体におけ
るそれらの測定が重要である大抵のハプテンは500pg／
ｍ〜５０ng／ｍの量で存在するので、それらは濃縮
されねばならない。
それゆえ本発明のもう一つの課題は知られた方法より高
い測定感度を有する凝集阻止による新規な免疫化学的ハ
プテン測定法を案出することである。
この課題は測定すべきハプテンに対する抗体を用いて感
受性となされた粒子、低分子の、ハプテン基を２個含有
する化合物および測定すべきハプテンを含有する液体を
合し、そしてハプテンにより惹起された濁度減少からハ
プテン量を測定することを特徴とする、凝集阻止を用い
るハプテンの免疫化学的測定法により解決された。
凝集阻止法（西ドイツ特許第2743445号参照）におい
て、測定すべきハプテンに対する抗体を用いて感受性と
なされた粒子がキヤリアーと結合したハプテンと共に用
いられているのは現在の技術である。
本発明による測定法を実施するには通常、測定すべきハ
プテンを含有する定められた量の体液または排泄物を直
接または種々の濃度に希釈して、抗体を用いて感受性と
なされた粒子懸濁液の定められた量との反応に用いる。
次に定められた量の二官能性ハプテン（ジーハプテン）
をこの反応混合物に添加する。ある時間反応させたのち
比濁分析または濁り測定法を行う。評価は参照曲線に基
づき行われる。
ハプテンに対する抗体は知られた方法で次のようにして
得られる。すなわち、ハプテンをキヤリアー物質に結合
させる。キヤリアーと結合したハプテンを抗原として用
いて慣用法により免疫した動物から抗血清を得る。吸収
により他の抗体、すなわちキヤリアーまたはキヤリアー
とハプテンとの結合部位に対する抗体を除去する方法で
ハプテンに対する抗体を取得する。キヤリアー物質とし
ては多くの物質が用いられうる。キヤリアー物質が高い
抗原作用を有する場合、例えばキーホールカサガイ（Ke
yhole limpet）ヘモシアニンである場合に良好な結果が
得られる。
感受性とすべき粒子としては通常免疫化学的凝集反応ま
たは凝集阻止反応を実施する際に使用されるような微細
に分割されたキヤリアー、例えば高分子ラテツクスが使
用される。
ラテツクス粒子の感受性化にはヨーロツパ特許出願第00
80614号（米国特許第4,448,908号および訂正証明書）記
載の方法に従い、前記方法により得られたハプテンに対
する抗体を粒子に共有結合させうる。
ハプテンに対する抗体の産生に使用されるキヤリアーと
結合したハプテンならびにいわゆる「デベロツパー（De
veloper）」として測定法に関連して使用されるジハプ
テンはキヤリアー物質とハプテンとの間の結合部位で相
互に異なりうる。
本発明による方法を用いて測定しうるハプテンは例えば
医薬であるテオフイリン、フエノバルビタール、ジフエ
ニルヒダントイン、ジゴキシン、プリミドン（Primido
n）、バルプロイン酸（Valproinsure）、カルバマゼ
ピン（Carbamazepine）、ゲンタマイシン、トブラマイ
シン（Tobramycin）またはカナマイシンである。
他のかかるハプテンは例えばT3およびT4のような甲状腺
ホルモンである。
慣用の方法と比較して本発明は非常に高い測定感度を有
する。
本発明による方法においてはハプテンに対する抗体およ
びジハプテンの少量しか必要でない。例えばジハプテン
であるジテオフイリンの消費は慣用法で必要である量の
およそ１／１００〜１／1000まで減少されうる。
凝集阻止によるハプテン測定のためのDE2743445C2号に
記載された方法によれば、キヤリアーに結合したハプテ
ンが使用されている。そこに記載されるように、ハプテ
ン−キヤリアー接合体が微細な粒子に結合している場合
は測定感度はさらに高まりうる。
驚くべきことに、二量体ハプテン誘導体がハプテン−キ
ヤリアー−接合体よりも比濁分析的測定により良好に適
することが見出された。
二量体ハプテン誘導体の利点は、測定がより感度よくそ
してより短時間で実施されうるという点にある。もう一
つのより大きな利点は、例えばハプテン−アポフエリン
またはハプテン−アルブミン接合体のようなハプテン−
キヤリアー接合体の費用のかかる合成がいらないことに
ある。当業者に周知のように、前記蛋白質−ハプテン接
合体は副反応ゆえに中程度の収率でしか調製されずそし
て品質が変動する。これら誘導体は分子量（蛋白質−蛋
白質−交叉結合）およびハプテンの負荷量に関して非常
に雑多である。二量体ハプテン誘導体の調製は簡単でか
つ費用の点で好都合である。検査できない副反応が何ら
出現し得ないので、一定の品質が保証されそして分析上
のデータ（質量分光分析、C-H-N分析、赤外線または核
磁気共鳴スペクトル）を用いて確実に検査できる。
下記実施例により本発明を説明するが、本発明はそれら
に限定されるものではない。
実施例１ テオフイリン−８−酪酸 ジアミノジメチルウラシル水化物２５ｇおよびグルタル
酸無水物５０ｇをジメチルアニリン250ｍ中３時間還
流下に加熱する。次に冷却しそしてこの混合物を水1.5
および濃水酸化ナトリウム５０ｍ中に加える。かく
して得られた溶液をジメチルアニリンを除去するために
エーテル300ｍで抽出する。水層を水1.5で希釈しそ
して次にこれを蟻酸型ダウエツクス２−陰イオン交換樹
脂1.5を含有するカラムに通す。このカラムを水６
そして次に水／アセトン（１：１）混合物中の0.2モル
蟻酸４を用いて溶離する。生成物を含有する溶出液を
合しそして減圧下に結晶かゆとなるまで濃縮する。
結晶を集め、冷水で洗いそして熱イソプロパノールから
再結晶するとテオフイリン−８−酪酸２０ｇが得られ
る。
実施例２ ビス−（テオフイリン−８−ブチリル）−1,6−ヘキサ
ンジアミド ジメチルホルムアミド１０ｍ中にテオフイリン−８−
酪酸１ｇを溶解させ、これにトリブチルアミン0.89ｍ
を加えそしてこの溶液を５℃に冷却する。次にクロロ蟻
酸イソブチルエステル0.48mを加え、１０分間攪拌し
そしてジメチルホルムアミド１０ｍ中に溶解されそし
て５℃に冷却されたヘキサンジアミン0.2ｇを加える。
この反応混合物を３０分間０℃〜５℃で攪拌する。その
際重いゼラチン様沈殿が生成し、これを過しそしてジ
メチルホルムアミドで洗う。生成物を真空下に乾燥する
とビス−（テオフイリン−８−ブチリル）−1,6−ヘキ
サンジアミド0.75ｇが得られる。
実施例３ ビス−（テオフイリン−８−ブチリル）−4,9−ジオキ
サ−1,12−ドデカンジアミド 実施例２と同様であるが1,6−ヘキサンジアミンを4,9−
ジオキサ−1,12−ドデカンジアミン0.4ｍに置き換え
て合成を行う。反応混合物である溶液を攪拌下にエチル
エーテル500ｍ中に注入する。一夜冷却（約１６時
間）したのちこの懸濁液を過する。粗製固形物質をメ
タノールから再結晶すると、ビス−（テオフイリン−８
−ブチリル）−4,9−ジオキサ−1,12−ドデカンジアミ
ド0.45ｇが得られる。
実施例４ ビス−（テオフイリン−８−ブチリル）−ジアミドの溶
解度比較 1,6−ヘキサンジアミンまたは4,9−ジオキサ−1,12−ド
デカンジアミンのビス−（テオフイリン−８−ブチリ
ル）−ジアミド（実施例２または３の生成物）をそれぞ
れジメチルスルホキシド中に溶解させる。4,9−ジオキ
サ−1,12−ドデカンジアミドは室温で容易に溶解して１
０mg／0.5ｍの溶液が得られる。この溶液を５０ミリ
モル水性燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）２ｍを用い
て希釈すると透明で安定な溶液が得られる。これに対し
1,6−ヘキサンジアミドはジメチルスルホキシド２ｍ
中の１０mgの溶液を得るためには加熱を必要とし、そし
てこの溶液をpH7.5の燐酸塩緩衝液２倍量で希釈すると
二価ハプテンの広範な沈殿が直ちに観察される。
実施例５ テオフイリン−８−酪酸ラクタム テオフイリン−８−酪酸（実施例１の生成物）２４ｇを
無水酢酸500ｍ中に加熱しながら溶解させる。還流下
に３０分間加熱したのちこの混合物を予め加温したフイ
ルターで過する。この生成物は冷却すると結晶化し、
それを集め、エーテルおよびヘキサンで洗いそして５０
℃で真空下に乾燥するとテオフイリン−８−酪酸ラクタ
ム２０ｇが得られる。
実施例６ ビス−（テオフイリン−８−ブチリル）−N,N−ビス−
３−アミノプロピルピペラジン−ジアミド テオフイリン−８−酪酸ラクタム（実施例５の生成物）
0.5ｇをジメチルホルムアミド５ｍ中に懸濁させる。
これにビス−（３−アミノプロピル）−ピペラジン0.2
ｍおよびトリブチルアミン0.48ｍを攪拌下に加え
る。それにより初め溶液が生じるがしかし１５分後には
重いゼラチン様沈殿が生成する。この反応混合物をジメ
チルホルムアミド５ｍで希釈しそして一夜攪拌する。
沈殿を過し、ジメチルホルムアミドで洗い、そして乾
燥するとビス−（テオフイリン−８−ブチリル）−N,N
−ビス−３−アミノプロピルピペラジン0.6ｇが得られ
る。
実施例７ フエノバルビタール−Ｎ−プロピオン酸 フエノバルビタール９３ｇおよび３−ブロモプロピオン
酸７４ｇを水200ｍ中に加える。次にこれによく混合
しながら水酸化ナトリウム４８ｇを加える。時々揺り動
かしながら蒸気浴上1.5時間加熱する。次にさらに水酸
化ナトリウム１６ｇを加えさらに1.5時間加熱する。こ
の溶液を1.6となるまで水で希釈しそして濃塩酸を用
いてpH6.5に調整する。その際未反応のフエノバルビタ
ールから沈殿が生成する。フエノバルビタールを実質上
除去するためにこの混合物を各400ｍずつの酢酸エス
テルを用いて３回抽出する。残留する水溶液を濃塩酸を
用いてpH4.5に調整すると乳状の懸濁液が生ずる。これ
を各400ｍずつの酢酸エステルを用いて２回抽出す
る。生成物を含有する合一した抽出液を水および飽和塩
化ナトリウム溶液で洗う。この抽出液を硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、過しそして油状物となるまで蒸発させ
る。この油状物はアセトン中に溶解させそして混濁する
までヘキサンを添加することにより結晶化する。生成物
を集めそして乾燥するとフエノバルビタール−Ｎ−プロ
ピオン酸２０ｇが得られる。
実施例８ ビス−（フエノバルビタール−Ｎ−プロピオニル）−4,
9−ジオキサ−1,12−ドデカンジアミド ジメチルホルムアミド５ｍ中にフエノバルビタール−
Ｎ−プロピオン酸1.27ｇを溶解させる。ジメチルホルム
アミド５ｍ中に溶解したカルボニルジイミダゾール0.
61ｇを室温で攪拌下に滴下する。３０分後にジメチルホ
ルムアミド５ｍ中の4,9−ジオキサ−1,12−ドデカン
ジアミン0.40ｍを滴下する。次に室温で２時間攪拌す
る。溶媒を高真空下に蒸発除去しそして残留物をヘキサ
ンとこすると、固形物が生ずる。かくして得られた粗生
成物をクロロホルム／メタノール（９：１）混合物１０
ｍ中に溶解させそしてこれをシリカゲルカラムに加え
る。このカラムをクロロホルムそして次にクロロホルム
／メタノールの９：１〜１：１混合物を用いて溶離す
る。９：１混合物を用いて溶離した生成物は薄層クロマ
トグラフイーによれば単一である。このフラクシヨンを
合しそして油状物が得られるまで蒸発させる。真空下に
乾燥するとビス−（フエノバルビタール−Ｎ−プロピオ
ニル）−4,9−ジオキサ−1,12−ドデカンジアミド0.65
ｇが無定形固形物質として得られる。
実施例９ トリフルオロアセチル−Ｌ−チロキシン Ｌ−チロキシン−ナトリウム塩１０ｇを酢酸エステル15
0ｍおよびトリフルオロ酢酸４０ｍからなる冷却さ
れた混合物中に攪拌下に加える。得られた溶液にトリフ
ルオロ酢酸無水物１０ｍを滴下する。添加終了後０〜
２℃で２時間攪拌し、次に氷冷した塩化ナトリウム溶液
200ｍ中に注入し、この混合物を酢酸エステル100ｍ
で希釈しそして相を分離する。
酢酸エステル相を１モル硫酸水素ナトリウムそして次に
飽和塩化ナトリウム溶液で洗う。次にこの溶液を硫酸マ
グネシウムで乾燥し、過しそして少量となるまで濃縮
する。エーテルそして次に低沸点石油エーテルで希釈す
るとフレーク状沈殿が生じ、これを集めそして乾燥する
と生成物8.2ｇが得られる。薄層クロマトグラフイーに
おいてはチロキシンのごとく小さな第２のスポツトが示
される。クロロホルム／メタノール（９：１）中シリカ
ゲルクロマトグラフイーすることにより精製するとトリ
フルオロアセチル−Ｌ−チロキシン4.3ｇが得られる。
実施例１０ ビス−（トリフルオロアセチル−Ｌ−チロキシル）−4,
9−ジオキサ−1,12−ドデカンジアミド トリフルオロアセチル−Ｌ−チロキシン（実施例９の生
成物）1.23ｇをテトラヒドロフラン８ｍ中に溶解させ
そしてこの溶液を氷／アセトン浴中−２℃まで冷却す
る。これにＮ−メチルモルホリン0.16ｍそして次にク
ロロ蟻酸イソプチルエステル0.18ｍを加える。７分間
攪拌したのちテトラヒドロフラン２ｍ中の4,9−ジオ
キサ−1,12−ドデカンジアミン0.15ｍの溶液を５分間
かかつて滴下する。０℃で３０分間攪拌しそして次に室
温まで加温する。塩を除去するために反応混合物を過
し、そして液を蒸発させて油状物を得る。これを再び
酢酸エステル中に溶解させそしてこの溶液を１モル硫酸
水素ナトリウム水溶液そして次に0.5モル塩化ナトリウ
ム水溶液で洗う。酢酸エステル溶液を硫酸マグネシウム
で乾燥し、しそして濃縮して油状物を得る。この油状
物を酢酸エステル／ヘキサンから結晶化させると、２回
の結晶化でビス−（トリフルオロアセチル−Ｌ−チロキ
シル）−4,9−ジオキサ−1,12−ドデカンジアミド0.6ｇ
が得られる。
実施例１１ ビス−（Ｌ−チロキシル）−4,9−ジオキサ−1,12−ド
デカンジアミドジ塩酸塩 ビス−（トリフルオロアセチル−Ｌ−チロキシル）−4,
9−ジオキサドデカン−1,12−ジアミド（実施例１０の
生成物）0.34ｇをメタノール３ｍ中に溶解させる。攪
拌下に１モルカセイソーダを加えそして室温で４０時間
反応せしめる。次に冷１モル塩酸２０ｍを用いて希釈
すると生成物の微細な懸濁液が得られる。この懸濁液を
遠心分離しそして沈殿をエタノール中に溶解させる。こ
のエタノール溶液を蒸発させて固形粗生成物残留物を得
る。この生成物をメタノール／エーテルから再結晶する
とビス−（Ｌ−チロキシル）−4,9−ジオキサ−1,12−
ドデカンジアミドジ塩酸塩0.18ｇが得られる。
実施例１２ ビス−（Ｎ−スクシニル−Ｌ−チロキシル）−4,9−ジ
オキサ−1,12−ドデカンジアミド ピリジン２０ｍ中のコハク酸無水物２ｇの溶液をピリ
ジン２０ｍ中の4,9−ジオキサ−1,12−ドデカンジア
ミン２ｇの冷却された溶液中に滴下する。この反応混合
物を４℃で１８時間放置しそしてこれを次に蒸発させて
固形残留物を得る。これを水３０ｍ中に溶解させそし
てH+-型のダウエツクス５０陽イオン交換体３０ｍを
含有するカラムに導入する。次にこのカラムを水６０ｍ
で洗う。流出液を約半量となるまで濃縮するとビスス
クシニル−4,9−ジオキサ−1,12−ドデカンジアミドが
無色結晶として得られ、これを集めそして乾燥する。収
量は2.18ｇである。
この中間生成物をＮ−ヒドロキシスクシンイミド1.5ｇ
と一緒にジメチルホルムアミド３０ｍ中に溶解させ
る。この溶液を冷却しそして同時にジメチルホルムアミ
ド１５ｍ中のジシクロヘキシルカルボジイミド2.45ｇ
を加える。４℃で１８時間後反応混合物をしそして
を蒸発させて油状物を得る。これをイソプロパノールお
よびエーテルから結晶化させるとビス−スクシンイミド
−O,N−スクシニル−4,9−ジオキサ−1,12−ドデカンジ
アミン1.3ｇが結晶性生成物として得られる。この活性
エステル0.3ｇをジメチルホルムアミド２ｍ中に溶解
させ、そしてメチルモルホリン0.11ｍを含有するジメ
チルホルムアミド４ｍ中のＬ−チロキシン−ナトリウ
ム塩0.89ｇの懸濁液中に滴下する。この反応混合物を７
２時間攪拌しそして得られる溶液を蒸発させて油状物を
得る。この油状物を酢酸エステルおよび１モル硫酸水素
ナトリウムの混合物を用いて洗浄すると固形物質が生
じ、これをにより集め、水およびメタノールで洗いそ
して乾燥するとビス−（Ｎ−スクシニル−Ｌ−チロキシ
ル）−4,9−ジオキサ−1,12−ドデカンジアミド0.22ｇ
が得られる。
実施例１３ テオフイリンの測定 ジハプテンとしてはN,N′−ビス−（テオフイリン−８
−ブチリルアミノ−３−プロピル）−ピペラジンが用い
られた。
このジハプテンをジメチルホルムアミド中に１mg／ｍ
の濃度に溶解させそして次に４ｇ／100ｍのヒト血清
アルブミンを添加した蒸留水中に１：51200に希釈し
た。この希釈したジハプテンを「デベロツパー」として
試験において使用した。テオフイリンに対する抗血清を
ポリスチレンラテツクスに結合させることによりラテツ
クス試薬を調製した。抗−テオフイリン−ラテツクス−
試薬はEP82110273.8号記載のようにして調製された。
測定するにはキユベツト中でpH8.0の0.1モルグリシン−
NaCl緩衝液中１：100に希釈したテオフイリン含有試料
１０μｌを前記したデベロツパー希釈物１０μｌならび
に4.6ｍ／100ｍのポリエチレングリコール6000を含
有する燐酸塩緩衝された塩化ナトリウム溶液２０μｌお
よび前記抗−テオフイリン−ラテツクス試薬１０μｌと
混合した。この混合物を室温で１２時間培養した。続い
てこれに4.6ｍ／100ｍのポリエチレングリコール60
00を含有する燐酸塩緩衝された塩化ナトリウム溶液200
μｌを加え、混合しそして光散乱を比濁計で測定した。
異なる量の添加テオフイリンを用いて阻害曲線を調製し
た。測定範囲はテオフイリン約１〜４０μｇ／ｍにわ
たる。
比較するために現在技術によるアポフエリチンデベロツ
パーを用いて測定を行つた。アポフエリチン−テオフイ
リン誘導体はカレスタド（Kallestad）社から入手した
（チヤージ番号R1）。これをヒト血清アルブミン水溶液
中に１：1280にて希釈しそしてこの希釈物を試験におい
てデベロツパーとして使用した。測定のための操作はジ
ハプテン−デベロツパーの代りにアポフエリチン−テオ
フイリン誘導体が使用される以外は前記したようにして
実施された。異なる量の添加テオフイリンを用いて得ら
れた阻害曲線では比較的低い感度、すなわち下限の検出
限界が実施例１３におけるより高いところにあることが
示された。
実施例１４ フエノバルビタールの測定 ジハプテンとして1,12−ビス−（フエノバルビタール−
プロピオニルアミノ）−4,9−ジオキサ−ドデカンが用
いられた。
このジハプテンをジメチルスルホキシド中に１mg／ｍ
の濃度で溶解させそして次に４ｇ／100ｍのヒト血清
アルブミン水溶液中１：40000に希釈した。希釈したジ
ハプテンを「デベロツパー」として試験において使用し
た。フエノバルビタールに対する抗血清をポリスチレン
ラテツクスに結合させることによりラテツクス試薬を調
製した。抗−フエノバルビタール−ラテツクス−試薬は
EP82110273.8号記載のようにして調製された。
測定するにはキユベツト中でpH8.0の0.1モルグリシン−
NaCl緩衝液中１：100に希釈したフエノバルビタール含
有試料２０μｌを前記したデベロツパー希釈物２０μｌ
ならびに4.6ｍ／100ｍのポリエチレングリコール60
00を含有する燐酸塩緩衝された塩化ナトリウム溶液４０
μｌおよび前記抗−フエノバルビタール−ラテツクス試
薬２０μｌと混合した。この混合物を室温で２５分間培
養した。続いてこれに4.6ｍ／100ｍのポリエチレン
グリコール6000を含有する燐酸塩緩衝された塩化ナトリ
ウム溶液200μｌをさらに加え、混合しそして光散乱を
比濁計で測定した。異なる量の添加フエノバルビタール
を用いて阻害曲線を調製した。測定範囲はフエノバルビ
タール約2.5〜80μｇ／ｍにわたる。
比較するために現在技術によるアポフエリチンデベロツ
パーを用いて測定を行なつた。アポフエリチン−フエノ
バルビタール誘導体はカレスタド（Kallestad）社から
入手した（チヤージ番号０２６−Ｓ１）。これをヒト血
清アルブミン水溶液中に１：750にて希釈しそしてこの
希釈物を試験においてデベロツパーとして使用した。測
定のための操作は前記のようにして実施された。ジハプ
テン−デベロツパーの代りにアポフエリチン−フエノバ
ルビタール誘導体が用いられた。異なる量の添加フエノ
バルビタールを用いて非常に平坦な阻害曲線が得られ、
それが原因でこれは良好に再現されうる測定には使用で
きない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴオルフガング・カプマイアー ドイツ連邦共和国デー‐3550マルブルク ７．ラインハルツヴアルトシユトラーセ５ (72)発明者 カスリーン・ジエリツク・プライムズ アメリカ合衆国カリフオルニア州（92124) サンデイエゴ．バルデイナウエイ4823 (72)発明者 ジエラルド・フランシス・シグラー アメリカ合衆国カリフオルニア州（92117) サンデイエゴ．セリストリート4126

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式Ｉ Ａ−Ｘ−Ａ Ｉ 〔式中Ａはハプテン成分でありそしてＸは式II (B)m−Ｙ−(CH2)n−Ｚ−(CH2)n−Ｙ−(B)m II （式中指数ｍは相互に独立して０または１であり、Ｂは
    (CH2)n′（ここでｎ′は１〜４の整数である）またはCO
    (CH2)n″（ここでｎ″は２〜４の整数である）であり、
    基Ｙは−CONH−であり、ｎは１〜10の整数であり、そし
    てＺは−Ｏ−(CH2)4−Ｏ−、ピペラジン−１，４−ジイ
    ルまたは−NH−(CH2)4−NH−である）を有する二官能性
    架橋構成部分を表わすものとする〕 を有する化合物に相当する、二官能性架橋構成部分を介
    して結合した２個のハプテン成分からなる化合物。
  2. 【請求項２】ハプテン成分がテオフィリンであることか
    らなる前記特許請求の範囲第１項記載の化合物。
  3. 【請求項３】ハプテン成分がＬ−チロキシンであること
    からなる前記特許請求の範囲第１項記載の化合物。
  4. 【請求項４】ハプテン成分がフェノバルビタールである
    ことからなる前記特許請求の範囲第１項記載の化合物。
  5. 【請求項５】測定すべきハプテンに対する抗体を用いて
    感受性となされた粒子、式Ｉ Ａ−Ｘ−Ａ Ｉ 〔式中Ａはハプテン成分でありそしてＸは式II (B)m−Ｙ−(CH2)n−Ｚ−(CH2)n−Ｙ−(B)m II （式中指数ｍは相互に独立して０または１であり、Ｂは
    (CH2)n′（ここでｎ′は１〜４の整数である）またはCO
    (CH2)n″（ここでｎ″は２〜４の整数である）であり、
    基Ｙは−CONH−であり、ｎは１〜10の整数であり、そし
    てＺは−Ｏ−(CH2)4−Ｏ−、ピペラジン−1,4−ジイル
    または−NH−(CH2)4−NH−である）を有する二官能性架
    橋構成部分を表わすものとする〕 を有する化合物に相当する二官能性架橋構成部分を介し
    て結合した２個のハプテン成分からなる化合物ならびに
    その中でハプテンが測定されるべき液体を合し、ハプテ
    ンにより惹起されそして液体中のハプテンの濃度に依存
    する濁度減少を計測しそしてそこから液体中のハプテン
    濃度を測定することからなる、凝集抑制による免疫化学
    的ハプテン測定法。
  6. 【請求項６】抗体を担持する粒子が高分子ラテックスか
    らなる前記特許請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】抗体がラテックスに共有結合していること
    からなる前記特許請求の範囲第５項記載の方法。
  8. 【請求項８】その抗体がキーホールカサガイ（Keyhole
    Limpet）ヘモシアニンとハプテンとのカップリング生成
    物を用いて動物を免疫することにより得られることから
    なる前記特許請求の範囲第５項記載の方法。
  9. 【請求項９】濁りが測光的に計測されることからなる前
    記特許請求の範囲第５項記載の方法。
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