JP3257793B2 - 体液中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンの定量用の試薬及び方法 - Google Patents

体液中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンの定量用の試薬及び方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、試験サンプル中のアミトリプチリン（amit
riptyline）または試験サンプル中のノルトリプチリン
（nortriptyline）のイムノアッセイ定量に関する。特
に、本発明は、アミトリプチリン代謝物の存在下に於け
るアミトリプチリンの特異的定量用並びにノルトリプチ
リン代謝物及びアミトリプチリンの存在下に於けるノル
トリプチリンの特異的定量用、好ましくは、蛍光偏光イ
ムノアッセイ（fluoresence polarization immunoassa
y）用の免疫原、そのような免疫原から製造した抗体及
び標識試薬に関する。
発明の背景 アミトリプチリン及びノルトリプチリンは、慢性鬱病
を治療するために処方される三環式抗鬱薬であり、各
々、式Ｉ及び式II: により表される。
アミトリプチリンがこのような治療の主剤であると
き、アミトリプチリンの第３級窒素の脱メチル化により
できる天然代謝物として、ノルトリプチリンが通常存在
する。従ってノルトリプチリンは、それ自体が慢性鬱病
の治療の主剤として処方される時に存在するだけでな
く、アミトリプチリンをこのような治療の主剤として使
用する際にも存在する。体液（例えば、血清、血漿、全
血液、尿など）に存在するアミトリプチリン及びノルト
リプチリンの治療的薬レベルをモニターすると、患者を
取り扱う一助となる情報を医者に提供するのに非常に有
用である。このような薬レベルをモニターすると、特に
アミトリプチリンを用いる治療（アミトリプチリン及び
ノルトリプチリンの両方が存在することとなる）に於い
て、最適治療効果を達成するために患者の投与量を調整
し、薬剤不足または毒性レベルとならないようにでき
る。この点に関しては、高レベルのアミトリプチリン及
びノルトリプチリンは中枢神経系疾患、心臓血管毒性、
高血圧症、癲癇発作、昏睡及び死亡を伴い、特に、所与
の投与量に関してもヒト血漿中の量には通常患者によっ
て様々な違いがあるので、患者の血液中のアミトリプチ
リン及びノルトリプチリン濃度を治療範囲内に保持しな
ければならない。
従って、アミトリプチリンまたはノルトリプチリンを
用いる治療に対して個人の反応が様々であるので、例え
ば、患者の血清若しくは血漿中の、アミトリプチリンが
治療の主剤である場合にはアミトリプチリン及びノルト
リプチリンの両方のレベルを、またはノルトリプチリン
が治療の主剤である場合にはノルトリプチリンレベルを
それぞれ測定することにより治療をモニターする必要が
ある。所望の治療範囲以下の濃度では鬱病の治療に対し
て薬剤不足となり、その範囲より高いレベルでは抗鬱病
効能を全く増大せずに、望ましくない作用（心臓血管合
併症、抗コリン作用及び沈静を含む）を併発し得る。
例えば、高圧液体クロマトグラフィー［Doreyら,Cli
n.Chem.,34,2348−2351（1988）］、ガスクロマトグラ
フィー［Garlandら,Clin.Pharmacol.Ther.,25,844−856
（1979）］、薄層クロマトグラフィー［Nagyら,J.Phar
m.Pharmacol.,25,599−603（1973）］などのクロマトグ
ラフィー法によるアミトリプチリン及びノルトリプチリ
ンの測定については報文がある。しかしながら、これら
の方法は、かなり困難な仕事であり、時間の浪費で且つ
冗長な種々の厄介な段階を実施するために高度な熟練者
が必要である。
例えば、ラジオイムノアッセイ（RIA）法［Sayegh,Ne
urochem.Res.,11,193−206（1986）;Virtanen,Scand.J.
Clin.Lab.Invest.,40,191−197（1980）］、酵素結合免
疫吸着アッセイ（ELISA）法［Denisら,Clin.Chem.Acta,
159,257−267（1986）］、蛍光偏光イムノアッセイ（FP
IA）法［米国特許第4,420,568号及び欧州特許出願第22
6,730号］及び酵素イムノアッセイ（EIA）法［米国特許
第4,307,245号、同第4,223,013号及びPankeyら,Clin.Ch
em.,32,768−772（1986）］などによる三環式抗鬱薬の
レベルのイムノアッセイ測定については報告がある。し
かしながら、これらの方法は、特異性（即ち、ノルトリ
プチリン及びアミトリプチリン代謝物の存在下でのアミ
トリプチリンの測定並びにアミトリプチリン及びノルト
リプチリン代謝物の存在下でのノルトリプチリンの測
定）に欠けるか、または被分析物質の存在下での抗体特
異性の欠失を克服するために厄介なカラム精製が必要で
ある。特に上記の４種類の主要な三環式抗鬱薬の総量を
測定するための非特異的蛍光偏光イムノアッセイ（FPI
A）は市販されており、欧州特許出願公開第226,730号及
び米国特許第4,420,568号に記載されているが、このア
ッセイにより測定された濃度は、血漿または血清中の三
環式抗鬱薬の総量の推測にしかすぎない。従って、この
ようなアッセイは、例えば、アミトリプチリンで治療し
た患者中の特異的な個々の三環式抗鬱薬を正確に定量す
るためには使用できず、患者の血漿または血清中のアミ
トリプチリン及びノルトリプチリンの総量が解るだけで
ある。
発明の概要 本発明は、試験サンプル中のアミトリプチリンまたは
ノルトリプチリンの定量用の特徴的な抗体試薬及び標識
試薬（ラベル化された試薬ともいう）を提供する。本発
明は、このような抗体試薬の産生法及びこのような標識
試薬の製造に使用する免疫原を製造するための合成法も
提供する。本発明の標識試薬及び抗体は、試験サンプル
中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンの定量用
のイムノアッセイで使用する際に従来法よりも優れてい
る。本発明の好ましい態様により、標識試薬及び抗体試
薬は、試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルト
リプチリンの詳細且つ信頼性のある定量を実施するため
の、イムノアッセイの特異性とスピード及び均質法の簡
便性を併せ持つ蛍光偏光イムノアッセイで標識試薬及び
抗体試薬を使用することを開示する。
図面の簡単な説明 図１は、本発明の方法によりウシ血清アルブミンにア
ミトリプチリンを結合させるための合成経路を例示す
る。
図２は、本発明の方法によりウシ血清アルブミンにア
ミトリプチリンを結合させるための合成経路を例示す
る。
図３は、本発明の方法によりウシ血清アルブミンにノ
ルトリプチリンを結合させるための合成経路を例示す
る。
図４は、本発明の方法によりウシ血清アルブミンにノ
ルトリプチリンを結合させるための合成経路を例示す
る。
図５は、本発明の方法によりアミトリプチリンアッセ
イ用の蛍光トレーサーを製造するための合成経路を例示
する。
図６は、本発明の方法によりノルトリプチリンアッセ
イ用の蛍光トレーサーを製造するための合成経路を例示
する。
図７は、本発明の方法によるアミトリプチリン蛍光ト
レーサー及びノルトリプチリン蛍光トレーサーの別の合
成経路を例示する。
図８は、Abbott TDx（登録商標）アナライザーに於け
るアミトリプチリン検量曲線を示すグラフである。
図９は、Abbott TDx（登録商標）アナライザーに於け
るノルトリプチリン検量曲線を示すグラフである。
図10は、特異的アミトリプチリンアッセイに於ける蛍
光トレーサーの構造変形の効果を示すグラフである。
図11は、特異的アミトリプチリンアッセイの交差反応
性に於ける蛍光トレーサーの構造変更の効果を示す表で
ある。
図12は、特異的ノルトリプチリンアッセイに於ける蛍
光トレーサーの構造変形の効果を示すグラフである。
図13は、特異的ノルトリプチリンアッセイの交差反応
性に於ける蛍光トレーサーの構造変更の効果を示す表で
ある。
図14は、高性能液体クロマトグラフィーと比較した、
本発明のアミトリプチリンの特異的定量用の蛍光偏光イ
ムノアッセイの方法の精度を示すグラフである。
図15は、高性能液体クロマトグラフィーと比較した、
本発明のノルトリプチリンの特異的定量用の蛍光偏光イ
ムノアッセイの方法の精度を示すグラフである。
発明の詳細な説明 本発明により、アミトリプチリンまたはノルトリプチ
リンの特異的定量は、最初に標識試薬またはトレーサー
及び抗体試薬と試験サンプルとを同時または任意の順に
接触させ、次いで試験サンプル中のアミトリプチリンま
たはノルトリプチリンの量の関数として抗体試薬との結
合反応に関与したか、または関与しなかった標識試薬の
量を測定することにより実施し得る。特に、本発明は、
アミトリプチリンの特異的定量及びノルトリプチリンの
特異的定量用の蛍光偏光イムノアッセイで使用するため
の、免疫原、そのような免疫原から製造した抗体及び標
識試薬に関する。本発明によるアミトリプチリンまたは
ノルトリプチリンの特異的定量は、アミトリプチリンイ
ムノアッセイに関しては、アミトリプチリンの特異的定
量をノルトリプチリン及びアミトリプチリン代謝物の存
在下で実施し、ノルトリプチリンイムノアッセイに関し
ては、ノルトリプチリンの特異的定量をアミトリプチリ
ン及びノルトリプチリン代謝物の存在下で実施するもの
と理解されたい。
本発明の抗体は、式III: ［式中、Ｐは、免疫原性キャリヤ物質であり、配置はＥ
若しくはＺまたはＥ及びＺの組み合わせであり、 アミトリプチリンの定量に関しては、ＲはCH3であり、
Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合し
た２個のヘテロ原子であり、及びＹは炭素原子０〜６個
を含む結合基であり、 ノルトリプチリンの定量に関しては、ＲはＨであり、Ｘ
は相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した
２個のヘテロ原子であり、及びＹは炭素原子０〜６個を
含む結合基である］の誘導体で製造した免疫原で産生す
る。
アミトリプチリン用の本発明の標識試薬は、式IV: ［式中、Ｑは、検出可能な成分、好ましくは蛍光成分で
あり、 アミトリプチリンの定量に関しては、W1は２若しくは３
位の芳香環に結合したヘテロ原子であり、Z1は炭素原子
１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基である］
の誘導体で製造する。
ノルトリプチリン用の本発明の標識試薬は、式V: ［式中、Ｑは検出可能な成分、好ましくは蛍光成分であ
り、配置はＥ若しくはＺまたはＥ及びＺの組み合わせで
あり、 ノルトリプチリンの定量に関しては、W2は相互に結合し
且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原
子であり、Z2は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２
個を含む結合基である］の誘導体で製造する。
上記の免疫原は、以下の記載の如く製造するが、これ
を図１及び２（アミトリプチリン免疫原）並びに図３及
び４（ノルトリプチリン免疫原）に示す。アミトリプチ
リンに関しては、Ｅ及びＺの混合物の、２−置換または
３−置換アミトリプチリンスルホン酸は、アミトリプチ
リンの遊離塩基とクロロスルホン酸の処理から得られ
た。得られた混合物を次いで塩化スルホニルに転換さ
せ、これをウシ血清アルブミンと反応させて、所望のア
ミトリプチリン免疫原を得る（図１）。さらに、スルホ
ン酸の混合物をHPLCで分けると、純粋な2E−アミトリプ
チリンスルホン酸並びに2Z及び3E異性体が得られる。こ
れらの異性体を各々、上記のアミトリプチリンスルホン
酸の混合物に関して用いた方法によってアミトリプチリ
ン免疫原に転換する（図２）。ノルトリプチリン免疫原
の製造に関しては、合成シークエンスをアミトリプチリ
ンスルホニルクロリドの混合物で開始し、これをグリシ
ンメチルエステルと反応させると、メチルエステルスル
ホンアミドが得られる。スルホンアミドの混合物をN'−
脱メチル化、加水分解工程続いてN'−BOC保護を介して
N'−BOC保護カルボン酸に転換させる。この酸の混合物
をヒドロキシスクシンイミド活性エステルを介してウシ
血清アルブミンに結合させ、得られた中間体をトリフル
オロ酢酸で処理すると、所望のノルトリプチリン免疫原
が得られる（図３）。さらに、アミトリプチリンスルホ
ン酸の混合物をHPLCで分けると、純粋な2E−アミトリプ
チリンスルホン酸並びに2Z及び3E異性体が得られる。こ
れらを各々塩化スルホニルに転換すると、最終的に図４
に示される所望のノルトリプチリン免疫原が得られる。
アミトリプチリン用の特異的蛍光偏光イムノアッセイ
で使用するための上記の好ましい蛍光標識試薬は、２−
アミノイミプラミンと６−カルボキシフルオレセンヒド
ロキシスクシンイミド活性エステルを縮合して合成する
と、図５に示すようなアミトリプチリントレーサーが得
られた。ノルトリプチリン用の特異的蛍光偏光イムノア
ッセイで使用するための上記の好ましい蛍光ノルトリプ
チリン標識試薬は、2E−クロロスルホニルアミトリプチ
リンをグリシンメチルエステルで処理することにより合
成してスルホンアミドを得、これを脱メチル化、加水分
解し、次いでN'−BOC誘導体として保護した。N'−BOC保
護−2E−スルホンアミド酸をアミノメチルフルオレセン
と縮合すると、N'−BOC保護トレーサーが得られた。ト
リフルオロ酢酸との処理後、図６に示される所望のノル
トリプチリントレーサーが得られた。
本発明の試薬を用いる蛍光偏光イムノアッセイ（FPI
A）手順により、試験サンプル中のアミトリプチリンま
たはノルトリプチリンの濃度またはレベルを正確に定量
し得る。アミトリプチリンまたはノルトリプチリンの特
異的定量用のFPIAを実施するために、検量曲線をアミト
リプチリン（図８）及びノルトリプチリン（図９）の治
療範囲をモニターするために作成した。
本発明により、アミトリプチリンまたはノルトリプチ
リンの定量用の優れた蛍光偏光イムノアッセイのアッセ
イ結果は、意外且つ驚くべきことに、 （ｉ）式III（式中、Ｐは上記の免疫原キャリヤであ
る）のアミトリプチリンまたはノルトリプチリン免疫原
から産生した抗体を含む抗体試薬、及び （ii）式IV（アミトリプチリン）または式Ｖ（ノルトリ
プチリン）（式中、Ｑは上記の蛍光成分である）の蛍光
標識試薬 を使用すると得られることが分かった。アミトリプチリ
ンの定量に関しては、抗体試薬は、アミトリプチリンと
結合またはこれを識別し得る抗体を含み、抗体は、式II
I［式中、Ｐはウシ血清アルブミンであり、Ｘは−SO2−
NH−であり、ＲはCH3であり、及びＹは炭素原子０個で
ある］のアミトリプチリン誘導体から製造した免疫原で
産生するのが好ましく、及び標識試薬は、式IV［式中、
Ｑは蛍光成分であり、W1は−NH−であり、及びZ1は−CO
−である］の誘導体から製造するのが好ましい。同様
に、ノルトリプチリンの定量に関しては、抗体試薬は、
ノルトリプチリンと結合またはこれを識別し得る抗体を
含み、抗体は、式III［式中、Ｐはウシ血清アルブミン
であり、Ｘは−SO2−NH−であり、ＲはＨであり、及び
Ｙは−CH2−CO−である］のノルトリプチリン誘導体か
ら製造した免疫原で産生するのが好ましく、及び標識試
薬は、式Ｖ［式中、Ｑは蛍光成分であり、W2は−NH−SO
2−であり、及びZ2は−CH2−CO−である］のノルトリプ
チリン誘導体から製造するのが好ましい。
特に、意外且つ驚くべきことに、アミトリプチリンを
特異的に定量するために、式III［式中、ＲはCH3であ
り、芳香環に結合したスルホンアミド基:X＝（−SO2−N
H−）を含む］の新規免疫原と式IV［式中、アミド基は
芳香環に結合する;W1Z1＝（−NH−CO−）］の新規蛍光
トレーサーの組み合わせが、本発明の意図するアミトリ
プチリンの特異的な定量に重要であることが知見され
た。この特徴的な試薬の有効な組み合わせにより、アミ
トリプチリンの特異的な定量が改良された。ノルトリプ
チリンの特異的定量に関しては、式III［式中、ＲはＨ
であり、芳香環に結合したスルホンアミド基を含む;X＝
（−SO2−NH−）］の新規免疫原を含む試薬と式Ｖ［式
中、スルホンアミド基は芳香環に結合している;W2＝−S
O2−NH−及びZ2＝（−CH2−CO−）］の新規蛍光トレー
サーの特徴的な組み合わせがノルトリプチリンの特異的
な定量に重要であった。特徴的な試薬を都合よく組み合
わせることにより、本発明の意図するノルトリプチリン
の特異的な定量が改良された。上記の組み合わせの性能
は、図10及び11（アミトリプチリン）及び図12及び13
（ノルトリプチリン）に示されており、高性能液体クロ
マトグラフィー（HPLC）との相関関係が図14（アミトリ
プチリン）及び図15（ノルトリプチリン）に示されてい
る。
上記の如く、アミトリプチリンまたはノルトリプチリ
ンの特異的定量用に蛍光偏光イムノアッセイを実施する
場合、トレーサーの検出可能な成分は、蛍光成分（例え
ば、フルオレセン、アミノフルオレセン、カルボキシフ
ルオレセンなど）、好ましくはアミノメチルフルオレセ
ン、アミノフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フ
ルオレセニル、６−カルボキシフルオレセン、５−カル
ボキシフルオレセン、チオウレア−アミノフルオレセン
及びメトキシトリアジノリル−アミノフルオレセンなど
の蛍光誘導体である。抗体に結合したトレーサー量は、
試験サンプル中に存在するアミトリプチリンまたはノル
トリプチリンの量とは逆に変動する。従って、アミトリ
プチリンまたはノルトリプチリン及びトレーサーの抗体
結合部位に対する相対的でそれ故に特徴的な結合親和性
は、アッセイ系の重要なパラメーターである。通常、蛍
光偏光法は、特徴的な波長の平面偏光により励起された
とき、蛍光トレーサーが所与の媒体中のトレーサーの回
転比と逆に関連する入射刺激光に対して偏光度を保ちつ
つ別の特徴的な波長で光（即ち、蛍光）を放出する原理
に基づいている。この特性の結果として、例えば、粘性
溶液相中などで無理に回転させられたり、または比較的
回転比が低い別の溶液成分と結合した場合、トレーサー
物質は自由溶液中であっても比較的大きい偏光度の放出
光を保持する。従って、配位子及びトレーサーが抗体に
結合するのに競合する時間枠内では、トレーサー及び配
位子結合速度は、重要な性能パラメーター（例えば、選
択性、感受性及び精度）を保持した遊離及び結合トレー
サーの好適な割合をもたらすようにする。
本発明のアミトリプチリンの特異的定量用またはノル
トリプチリンの特異的定量用の蛍光偏光イムノアッセイ
を実施する際には、アミトリプチリンまたはノルトリプ
チリンを含むと考えられる試験サンプルを、本発明の免
疫原で製造した抗−血清の存在に対して検出可能な蛍光
偏光応答を産生し得る好適に選択されたそのフルオレセ
ン誘導体の存在下で本発明の免疫原で製造した抗血清と
接触させる。次いで、平面偏光を溶液内を通過させて蛍
光偏光応答を得、応答を試験サンプル中に存在するアミ
トリプチリンまたはノルトリプチリンの量の尺度として
検出する。
本発明のアミトリプチリンまたはノルトリプチリン誘
導体は、慣用のキャリヤ物質に結合させることにより免
疫原を製造し、次いで抗体を得るために使用する。アミ
トリプチリン及びノルトリプチリン誘導体も、試験サン
プル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンを定
量するためのイムノアッセイ中の検出試薬として作用す
る標識試薬を製造するのに使用する。
本発明のアミトリプチリン及びノルトリプチリン誘導
体は、式III中、Ｐが免疫原性キャリヤである当業界で
公知の種々の慣用法により免疫原性キャリヤ物質に結合
させ得る。当業者には理解されるように、免疫原性キャ
リヤ物質は、これらの任意の慣用の公知方法により選択
され得、殆どの場合タンパク質またはポリペプチドであ
るが、十分な大きさ且つ免疫原性を有する他の物質［例
えば、炭水化物、多糖類、リポ多糖、ポリ（アミノ）
酸、核酸など］も使用し得る。免疫原性キャリヤ物質
は、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、アオガ
イヘモシアニン（キーホールリンペットヘモシアニンと
もいう）、サイログロブリンなど）であるのが好まし
い。本発明の免疫原を使用して、本発明のイムノアッセ
イで使用するための公知方法により抗体（ポリクローナ
ル及びモノクローナル）を製造する。通常、宿主（例え
ば、ウサギ、ヤギ、マウス、テンジクネズミまたはウ
マ）に、通常アジュバントとの混合物中の免疫原を種々
の部位の一カ所以上に注射する。さらに、最適度に到達
したと判断されるまで、抗体量を評価するために採血し
ながら、一定または不定間隔で同一または別の部位に注
射する。抗体は、抗血清を得るために宿主動物を採血す
るか、またはモノクローナル抗体を得るために公知の体
細胞ハイブリダイゼーション法または当業界で公知の他
の方法により得、次いで例えば−20℃で貯蔵し得る。
蛍光偏光イムノアッセイ以外に、本発明のアミトリプ
チリンまたはノルトリプチリンを定量するために種々の
他のイムノアッセイ手順を実施し得る。このようなイム
ノアッセイ系手順としては、競合的、サンドイッチ及び
イムノメトリック（immunometric）法が挙げられるが、
これらに限定されない。通常、このようなイムノアッセ
イ系は、標識または検出可能な成分に結合した本発明の
抗体またはそのフラグメントを含む標識試薬を使用して
結合量を測定する試験サンプル由来の特異的な被分析物
質に結合するための免疫グロブリン（即ち、全抗体また
はそのフラグメント）の性能に依存する。このような検
出可能な標識としては、酵素、放射性標識、ビオチン、
毒素、薬剤、ハプテン、DNA、RNA、リポソーム、発色
団、化学発光分子、着色粒子及び着色微粒子、蛍光化合
物（例えば、アミノメチルフルオレセン、５−フルオレ
セニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレ
セン、６−カルボキシフルオレセン、アミノフルオレセ
ン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリ
ルアミノフルオレセンなどの蛍光誘導体）が挙げられる
が、これらに限定されない。既に記載の如く、試験サン
プルは天然物、人工的に形成した液体、またはその抽出
物であってもよく、生物学的試験サンプル（例えば、全
血液、血清、血漿、尿、排泄物、唾液、脳脊髄液、脳組
織など）が挙げられるが、これらに限定されない。さら
に、試験サンプルは、試験サンプルの抽出液またはその
任意の誘導体であってもよい。
典型的には、このようなイムノアッセイ系手順中の結
合量は、検出且つ測定した検出可能な成分量が試験サン
プル中の被分析物質量に対応し得る、被分析物質との結
合反応に関与したか、または関与しなかった標識試薬中
に存在する検出可能な成分量によって決定する。例え
ば、競合的イムノアッセイ系では、（配位子と参照され
ることもある）測定される物質は、このような抗体を産
生するために使用された免疫原と配分した構造的に類似
した配位子及びトレーサーの（単数または複数の）部分
に特異的な抗体上の結合部位の有限数に関して、（トレ
ーサーと参照されることもある）検出可能な成分に結合
した構造的に類似した物質と競合する。治療薬がアミト
リプチリンである場合、ノルトリプチリンはアミトリプ
チリンの代謝物として試験サンプル中に存在するので、
アミトリプチリン及びノルトリプチリン量は、本発明の
アミトリプチリン及びノルトリプチリン誘導体を個々に
使用する別個のイムノアッセイ系で検出するものと理解
されたい。
本発明の試験キットは、既に記載の如く、試験サンプ
ル中のアミトリプチリンの定量に関してまたは試験サン
プル中のノルトリプチリンの定量に関しては、本発明の
所望の特異的蛍光偏光イムノアッセイを実施するのに必
要な本質的な試薬をすべて含む。試験キットは、試薬が
混和性である場合には組成物または混合物として、必須
試薬を保持する１個以上の容器の組み合わせとして市販
の包装形に配合されている。特に、アミトリプチリンま
たはノルトリプチリンのいずれかの個々の定量に関して
上記された免疫原で製造した抗体及び蛍光トレーサー化
合物を含む、試験サンプル中のアミトリプチリンの蛍光
偏光イムノアッセイ定量または試験サンプル中のノルト
リプチリンの蛍光偏光イムノアッセイ定量用の試験キッ
トが好ましい。無論、試験キットは、従来公知で且つ一
般のユーザーの観点からも望ましい他の試薬（例えば、
緩衝液、希釈液、標準液など）も含み得るものと理解さ
れたい。
本発明は、本発明を限定しない以下の実施例によりさ
らに説明されよう。括弧内に含まれた数字は、図面内に
使用されている構造式と対応する。
実施例１ アミトリプチリン免疫原（４）の合成 溶液の略号:CHCl3＝クロロホルム、MeOH＝メタノール、
DMF＝ジメチルホルムアミド、CH2Cl2＝塩化メチレン、E
t2O＝ジエチルエーテル、EtOAc＝酢酸エチル、Hex＝ヘ
キサン、THF＝テトラヒドロフラン、HOAc＝酢酸。
アミトリプチリン塩酸塩（１）（1.00g,3.19mmol）を
H2O（20mL）に溶解し、6M NaOHでpHを12に調節してCHCl
3（３×20mL）で抽出した。CHCl3抽出液を混和し、ブラ
イン（20mL）で洗浄し、Na2SO4で脱水し、真空下で溶媒
除去すると、無色オイル状の遊離塩基（815mg,92％）が
得られた。1N NMR（200MHz,CDCl3）δ7.3−7.0（m,8
H）,5.8（t,1H）,3.5−2.6（m,4H）,2.3−2.2（m,4H）,
2.2（s,6H）；質量分析（DCI,NH3）（Ｍ＋Ｈ）+278. クロロスルホン酸（0.39mL,5.9mmol）をCHCl3（6.6m
L）に溶解し、次いでCHCl3（3.3mL）中のアミトリプチ
リン遊離塩基（815mg,2.94mmol）の撹拌した−15℃の溶
液に滴下添加した。得られた黄色溶液を50℃に温め、こ
の温度で３時間撹拌し、続いて氷水（50mL）に注ぎ、6M
NaOHでpHを10に調節し、そしてCHCl3（15mL）で洗浄し
た。水性部分を単離し、真空下でH2Oを除去（トルエン/
MeOHと共沸）し、得られた白色固体をMeOH（20mL）です
り砕き、真空濾過し、濾液を真空下で除去すると、白色
固体状の所望のスルホン酸のナトリウム塩（２）（887m
g,79％）が得られた。1H NMR（200MHz,CD3OD）δ7.6−
7.0（m,7H）,5.8（t,1H）,3.6−3.2（m,4H）,3.1−2.7
（m,4H）,2.5（s,6H）；質量分析（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+35
8. ナトリウム塩（２）（834mg,2.20mmol）を五塩化リン
（916mg,4.40mmol）と混合し、90℃に加熱し、その温度
で25分撹拌した。冷却後、反応混合物をCHCl3（6mL）で
希釈し、氷水（40mL）中に注ぎ、6M NaOH（1.2mL）で処
理し、CHCl3（３×40mL）で抽出した。CHCl3抽出液を混
和し、ブライン（飽和NaCl水溶液）（40mL）で洗浄し、
Na2SO4で脱水し、真空下で溶媒を除去すると、所望のア
リールスルホニルクロリド（３）（667mg,81％）が得ら
れた。1H NMR（200MHz,CDCl3）δ8.0−7.0（m,7H）,5.9
（t,1H）,3.5−3.2（m,2H）,3.2−2.9（m,2H）,2.8−2.
6（m,6H）． アリールスルホニルクロリド（３）（177mg,0.470mmo
l）をDMF（1.1mL）に溶解し、0.1Mリン酸ナトリウム（p
H＝7.8）（6.8mL）に溶解したウシ血清アルブミン（BS
A,400mg,0.00588mmol）の撹拌溶液に滴下添加した。3.5
時間撹拌後、反応混合物を0.1Mリン酸ナトリウム（pH＝
7.8）（2L）で16時間透析し、次いでH2O（８×2L）で透
析した。凍結乾燥後、所望の免疫原（４）（389mg）が
得られた。
実施例２ アミトリプチリン免疫原（11）、（12）及び（13）の合
成 アミトリプチリン塩酸塩（１）（12.7g,40.6mmol）を
H2O（250mL）に溶解し、6M NaOHでpHを12に調節し、CHC
l3（３×250mL）で抽出した。CHCl3抽出液を混和し、Na
2SO4で脱水し、溶媒を真空下で除去した。得られたアミ
トリプチリン遊離塩基（オイル）をCHCl3（16mL）に溶
解し、−15℃に冷却した。CHCl3（16mL）中のクロロス
ルホン酸（4.8mL,72mmol）を滴下添加し、次いで反応混
合物を50℃で３時間撹拌し、室温に冷却し、氷水（380m
L）に注ぎ、6M NaOHでpHを９−10に調節し、CHCl3（130
mL）で洗浄し、真空下でH2Oを除去（トルエン/MeOHと共
沸）した。得られた白色固体をMeOH（200mL）ですり砕
き、真空濾過し、真空下で溶媒を除去すると、アミトリ
プチリンの少なくとも４種類のスルホン酸異性体を含む
白色固体が得られた。Ｅ−２、Ｅ−３、Ｚ−３異性体を
分取逆相C18HPLCでH2O/MeOH/HOAc（50/50/0.4）で溶離
して単離すると、白色固体のＥ−２−アミトリプチリン
スルホン酸（５）（1.59g,11％）1H NMR（300MHz,DMSO
−d6）δ7.41−7.10（m,7H）,5.78（t,1H）,3.45−3.13
（m,4H）,2.95−2.62（m,8H）,2.55−2.25（m,2H）；質
量分析（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+358;白色固体のＥ−３−アミ
トリプチリンスルホン酸（６）（2.35g,16％）1H NMR
（300MHz,DMSO−d6）δ7.41−7.10（m,7H）,5.78（t,1
H）,3.45−3.13（m,4H）,2.95−2.62（m,8H）,2.55−2.
25（m,2H）；質量分析（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+358;及び白色
固体のＺ−２−アミトリプチリンスルホン酸（７）（1.
88g,13％）1H NMR（300MHz,DMSO−d6）δ7.41−7.10
（m,7H）,5.78（t,1H）,3.45−3.13（m,4H）,2.95−2.6
2（m,8H）,2.55−2.25（m,2H）；質量分析（FAB）（Ｍ
＋Ｈ）+358がそれぞれ得られた。
酸（５）（48mg,0.134mmol）及び塩化チオニル（0.8m
L,11mmol）を混合すると不均質な混合物となり、これを
70℃に１時間加熱すると均質な溶液が得られ、これを真
空下で溶媒を除去すると、固体の塩化スルホニル（８）
が得られた。
塩化スルホニル（８）をDMF（1.5mL）に溶解させて、
ウシ血清アルブミン（BSA）（150mg,0.00221mmol）／リ
ン酸塩緩衝液（7mL）/DMF（1.5mL）の溶液に添加し、2.
5日間撹拌した。反応混合物を0.1Mリン酸ナトリウム（p
H＝7.8）（2L）で16時間、次いでH2O［2Lずつ（14時間,
5時間,5時間,14時間及び６時間）］で透析した。凍結乾
燥後、所望の免疫原（11）（140mg）が得られた。
アミトリプチリン免疫原（12）及び（13）を、各々酸
（６）及び（７）から同様の方法で製造した。
実施例３ ノルトリプチリン免疫原（18）の合成 アリールスルホニルクロリド（３）（5.16g,13.7mmo
l）をCHCl3（20mL）に溶解させ、グリシンメチルエステ
ル塩酸塩（3.45g,27.5mmol）、トリエチルアミン（TEA,
6.7mL,48mmol）及びCHCl3（20mL）の撹拌混合物に滴下
添加した。反応混合物をN2下でさらに30分撹拌し、次い
で真空濾過し、濾液の溶媒を真空下で除去した。粗な生
成物をカラムクロマトグラフィーでCH2Cl2/MeOH（90/1
0）で溶離精製すると、所望の生成物（14）（1.53g,26
％）が得られた。1H NMR（300MHz,CDCl3）δ7.09−7.88
（m,7H）,5.90−6.00（m,1H）,3.71−3.80（m,2H）,3.5
9（s,3H）,2.65−3.48（m,4H）,2.34−2.63（m,4H）,2.
24（d,6H）；質量分析（DCI,NH3）（Ｍ＋Ｈ）+429. エステル（14）（1.42g,3.31mmol）及びトリエチルア
ミン（1.85mL,13.3mmol）をCHCl3（10mL）中で混和し、
次いでN2下で反応混合物を撹拌しながら2,2,2−トリク
ロロエチルクロロフォーメート（1.82ml,13.3mmol）を
滴下添加した。N2下でさらに３時間撹拌後、反応混合物
をEt2O（60mL）で希釈し、0.5M HCl（２×60mL）、H2O
（60mL）及びブライン（60mL）の順で洗浄し、続いてMg
SO4で脱水して真空下で溶媒を除去した。得られたオイ
ルをカラムクロマトグラフィーでEtOAc/Hex（30/70）で
溶離精製すると、白色固体の所望の化合物（15a）（1.1
1g,44％）が得られた。1H NMR（300MHz,CDCl3）δ8.03
−7.77（m,2H）,7.45−7.03（m,5H）,6.03−5.88（m,1
H）,4.85−4.51（m,6H）,2.78（s,3H）,3.62−3.24（m,
4H）,3.14−2.73（m,5H）,2.60−2.34（m,2H）；質量分
析（FAB）（Ｍ−Ｈ）+764. エステル（15a）（1.09g,1.42mmol）をTHF（9mL）に
溶解し、亜鉛粉末（2.18g）を添加し、1Mリン酸ナトリ
ウム（pH＝5.5）（1.8mL）を添加し、反応混合物を20時
間撹拌した。次いで反応混合物を真空濾過し、濾液の溶
媒を真空下で除去し、トルエン/MeOH（50/50）と共沸し
た。得られた残渣をCHCl3/MeOH（80/20）（25mL）です
り砕き、濾過し、濾液の溶媒を真空下で除去すると、所
望のノルトリプチリン誘導体（15b）（823mg）が得られ
た。1H NMR（200MHz,CDCl3−CD3OD）δ8.1−7.0（m,7
H）,6.2−5.8（m,1H）,3.8−3.7（m,2H）,3.6（s,3H）,
3.5−3.2（m,4H）,3.1−2.9（m,2H）,2.9−2.5（m,5
H）；質量分析（DCI,NH3）（Ｍ＋Ｈ）+415. 遊離アミン（15b）（400mg,0.965mmol）をCHCl3（3m
L）に部分溶解させ、トリエチルアミン（TEA）（0.54m
L,3.9mmol）を添加し、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート
（BOC−Ｏ−BOC）（850mg,3.9mmol）を添加し、反応混
合物をN2下で17時間撹拌した。反応溶媒を真空下で除去
し、得られた粗なオイルをカラムクロマトグラフィーで
EtOAc/Hex（30/70）で溶離精製した。この生成物をシリ
カゲル（2mm）の分取TLCプレートでEtOAc/Hex（50/50）
で２回目の溶離精製をすると、所望のＮ−BOC保護化合
物（15c）（97mg,20％）が得られた。1H NMR（200MHz,C
DCl3）δ7.8−7.0（m,7H）,5.8（t,1H）,3.8−3.7（m,2
H）,3.6（s,3H）,3.5−3.2（m,4H）,2.9−2.6（m,5H）,
2.5−2.3（m,2H）,1.6−1.2（m,9H）；質量分析（DCI,N
H3）（Ｍ＋Ｈ＋NH3）+532. 化合物15c（85mg,0.17mmol）をMeOH（1.3mL）に溶解
し、10％NaOH（0.60mL）を添加し、次いで反応混合物を
30分撹拌した。次いで反応混合物をH2O（10mL）で希釈
し、1M HClでpHを４に調節し、CHCl3（３×10mL）で抽
出した。CHCl3抽出液を混和し、ブライン（10mL）で洗
浄し、Na2SO4で脱水し、溶媒を真空下で除去すると、所
望の遊離酸（16）（83mg,100％）が得られた。1H NMR
（200MHz,CDCl3）δ7.8−7.0（m,7H）,6.0−5.8（m,1
H）,3.8−3.7（m,2H）,3.5−3.2（m,4H）,3.2−2.7（m,
5H）,2.5−2.3（m,2H）,1.4（s,9H）；質量分析（FAB）
（Ｍ＋Ｈ）+501. 遊離酸（16）（59mg,0.12mmol）をDMF（0.55mL）に溶
解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）（16mg,
0.14mmol）を添加し、1,3−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（DCC）（29mg,0.14mmol）を添加し、１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（HOBT）水和物を触媒量添加
し、次いで反応混合物をN2下で6.5時間撹拌した。次い
で反応混合物を濾過し、濾液を0.1Mリン酸ナトリウム
（pH＝7.8）（3.4mL）及びDMF（0.90mL）中に溶解した
ウシ血清アルブミン（200mg,0.0029mmol）に添加した。
この反応混合物を16時間撹拌し、次いで0.1Mリン酸ナト
リウム（pH＝7.8）（2L）で２時間、次いでH2O（８×2
L）で透析した。凍結乾燥後、所望のＮ−BOC免疫原（1
7）（218mg）が得られた。
Ｎ−BOC免疫原（17）（200mg）にCH2Cl2（10mL）、続
いてトリフルオロ酢酸（TFA）（10mL）を添加した。５
分間撹拌後、溶媒を真空下で除去し、残渣を0.1Mリン酸
ナトリウム（pH＝7.8）（50mL）に再溶解させ、得られ
た濁った溶液を0.1Mリン酸ナトリウム（pH＝7.8）（2
L）で16時間、続いてH2O（７×2L）で透析した。凍結乾
燥後、所望のノルトリプチリン免疫原（18）（131mg）
が得られた。
実施例４ ノルトリプチリン免疫原（22）、（23）及び（24）の合
成 塩化スルホニル（８）をCHCl3（30mL）に溶解し、CHC
l3（30mL）中のグリシンメチルエステル塩酸塩（3.77g,
30.0mmol）とトリエチルアミン（6.3mL,45mmol）の撹拌
混合物に添加した。トリエチルアミン（2.1mL,15mmol）
をさらに添加し、反応混合物をN2下で３日間撹拌した。
次いで反応混合物をCHCl3（300mL）に注ぎ、0.5M K2CO3
（２×100mL）及びブライン（100mL）で順に洗浄し、Na
2SO4で脱水し、溶媒を真空下で除去した。得られた粗な
残渣をカラムクロマトグラフィーでCH2Cl2/MeOH（85/1
5）で溶離精製すると、所望のエステル（19）（4.08g,7
3％）が得られた。1H NMR（300MHz,CDCl3）δ7.59（d,1
H）,7.53（s,1H）,7.41（d,1H）,7.27−7.10（m,4H）,
5.93（t,1H）,3.72（s,2H）,3.58（s,3H）,3.48−2.70
（m,4H）,2.48−2.25（m,4H）,2.19（s,6H）；質量分析
（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+429. CHCl3（9mL）中の2,2,2−トリクロロエチルクロロフ
ォーメート（5.2mL,38mmol）を、N2下でCHCl3（30mL）
中のメチルエステル（19）（4.03g,9.40mmol）及びトリ
エチルアミン（5.2mL,38mmol）の撹拌した０℃溶液に滴
下添加した。反応混合物を室温で4.5時間撹拌し、次い
でEt2O（180mL）で希釈し、0.5M HCl（２×180mL）、H2
O（180mL）及びブライン（180mL）の順で洗浄し、MgSO4
で脱水し、溶媒を真空下で除去した。得られた残渣をシ
リカゲルのカラムクロマトグラフィーでEtOAc/Hex（30/
70）で溶離精製すると、所望の保護アミン（20a）（3.2
1g,45％）が得られた。1H NMR（300MHz,CDCl3）δ7.90
−7.75（m,2H）,7.41（d,1H）,7.30−7.14（m,3H）,7.1
4−7.05（m,1H）,5.97−5.85（m,1H）,4.80−4.50（m,6
H）,3.77（s,3H）,3.65−3.20（m,4H）,3.10−2.70（m,
5H）,2.60−2.30（m,2H）；質量分析（FAB）（Ｍ＋Ｈ）
+765. エステル（20a）（3.17g,4.14mmol）をTHF（27mL）に
溶解させ、亜鉛粉末（6.34g）を添加し、1Mリン酸ナト
リウム（pH＝5.5）（5.4mL）を添加し、反応混合物を一
晩撹拌した。次いで反応混合物を濾過し、濾液の溶媒を
真空下で除去（トルエン/MeOHと共沸）した。粗な残渣
をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで２種類の主
な不純物が除去されるまでTHF/MeOH/NH4OH（85/15/0.
4）で溶離精製し、次いでTHF/MeOH/NH4OH（75/25/0.4）
で溶離すると、所望の第２級アミン（20b）（1.40g,81
％）が得られた。1H NMR（200MHz,CDCl3−CD3OD）δ7.7
−7.4（m,3H）,7.3−7.1（m,4H）,5.9（t,1H）,3.7（s,
2H）,3.6（s,3H）,3.5−3.2（m,2H）,3.2−2.8（m,4
H）,2.7−2.4（m,5H）；質量分析（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+41
5. アミン（20b）（1.373g,3.31mmol）をDMF（11mL）に
溶解させ、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（795mg,3.64
mmol）を添加し、トリエチルアミン（0.55mL,3.9mmol）
を添加し、次いでN2下で16時間撹拌した。溶媒を真空下
で除去し、残渣をシリカゲルのカラムクロマトグラフィ
ーでEtOAc/Hex（50/50）で溶離精製すると、所望のBOC
−保護アミン（20c）（1.01g,59％）が得られた。1H NM
R（200MHz,CDCl3）δ7.7−7.4（m,3H）,7.3−7.1（m,4
H）,5.9（t,1H）,3.7（d,2H）,3.6（s,3H）,3.5−3.3
（m,4H）,3.1−2.8（m,2H）,2.7（s,3H）,2.4−2.3（m,
2H）,1.5−1.2（m,9H）；質量分析（DCI,NH3）（Ｍ＋NH
4）+532. 保護アミン（20c）（983mg,1.91mmol）をMeOH（18.3m
L）に溶解し、10％NaOH水溶液（6.1mL,15mmol）を添加
し、反応混合物を20分撹拌した。反応混合物をH2O（75m
L）で希釈し、1M HClでpHを３−４に調節し、CHCl3（３
×75mL）で抽出した。CHCl3抽出物を混和し、ブライン
（75mL）で洗浄し、Na2SO4で脱水し、真空下で溶媒を除
去すると、所望の酸（21）（955mg,100％）が得られ
た。1H NMR（200MHz,CDCl3）δ7.7−7.4（m,3H）,7.3−
7.0（m,4H）,5.9（t,1H）,3.7（d,2H）,3.5−3.2（m,4
H）,3.2−2.8（m,H）,2.7（s,3H）,2.5−2.3（m,2H）,
1.5−1.2（m,9H）；質量分析（FAB）（Ｍ＋Ｈ＋Na）+52
3. 酸（21）（52mg,0.10mmol）をDMF（0.50mL）に溶解さ
せ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）（14mg,0.1
2mmol）を添加し、1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（DCC）（25mg,0.12mmol）を添加し、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（HOBT）水和物の触媒量を添加し、
反応混合物をN2下で５時間撹拌した。次いで反応混合物
を濾過し、濾液を0.1Mリン酸ナトリウム（pH＝7.8）
（3.5mL）及びDMF（0.9mL）に溶解したウシ血清アルブ
ミン（171mg,0.0026mmol）の撹拌溶液に添加した。この
反応混合物を16時間撹拌し、0.1Mリン酸ナトリウム（pH
＝7.8）（2L）で２時間、次いでH2O［2Lずつ（14時間、
４時間、４時間、14時間、６時間）］で透析した。凍結
乾燥後、所望のＮ−BOC免疫原（195mg）が得られた。
中間体Ｎ−BOC免疫原（186mg）をCH2Cl2（10mL）中、
次いでトリフルオロ酢酸（TFA）（10mL）中においた。
５分間撹拌後、溶媒を真空下で除去し、残渣を0.1Mリン
酸ナトリウム（pH＝7.8）（50mL）に再溶解し、得られ
た濁った溶液を0.1Mリン酸ナトリウム（pH＝7.8）（2
L）で16時間、続いてH2O［2Lずつ（14時間、４時間、５
時間、14時間、６時間）］で透析した。凍結乾燥後、所
望のノルトリプチリン免疫原（22）（118mg）が得られ
た。
ノルトリプチリン免疫原（23）及び（24）を各塩化ス
ルホニル（９）及び（10）から同様の方法で製造した。
実施例５ アミトリプチリントレーサー（27）の合成 イミプラミン塩酸塩（25）（2.21g,6.97mmol）をH2O
（35mL）に溶解させ、6M NaOHで塩基性にし、CHCl3（３
×35mL）で抽出した。CHCl3抽出液を混和し、ブライン
（35mL）で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、溶媒を真空下で除
去すると、所望のイミプラミン遊離塩基（1.95g）が得
られた。1H NMR（200MHz,CDCl3）δ7.2−7.1（m,6H）,
7.0−6.8（m,2H）,3.8（t,2H）,3.2（s,4H）,2.3（t,2
H）,2.1（s,6H）,1.7（p,2H）． イミプラミン（26a,1.925g,6.87mmol）を酢酸（32m
L）に溶解させ、18℃に冷却した。反応混合物を17−18
℃に保持し、撹拌しながら酢酸（1.1mL）中の濃硝酸
（0.79mL,13mmol）を滴下添加し、次いで反応混合物を
その温度でさらに20分間撹拌した。次いで反応混合物を
0.15M HCl（130mL）に注ぎ、Et2O（２×85mL）で洗浄
し、続いて濃NaOHでpHを13に調節し、CHCl3（４×100m
L）で抽出した。CHCl3抽出液を混和し、ブライン（85m
L）で洗浄し、Na2SO4で脱水し、真空下で溶媒を除去し
た。残渣をカラムクロマトグラフィーでTHF/Hex/NH4OH
（70/30/0.4）で溶離精製すると、赤いオイル状の所望
の２−ニトロイミプラミン（26b）（1.145g,51％）が得
られた。1H NMR（200MHz,CDCl3）δ8.0−7.9（m,2H）,
7.3−7.0（m,5H）,3.9（t,2H）,3.2（s,4H）,2.3（t,2
H）,2.1（s,6H）,1.7（p,2H）；質量分析（FAB）（Ｍ＋
Ｈ）+326. ２−ニトロイミプラミン（26b,552mg,1.70mmol）を無
水EtOH（20mL）に溶解し、炭素上の10％パラジウム（55
mg）を添加し、反応混合物をH2（ボンベ圧力）下で3.5
時間撹拌した。次いで反応混合物をセライトを通して濾
過し、濾液の溶媒を真空下で除去すると、薄黄色オイル
状の所望の２−アミノイミプラミン（26c）（499mg,99
％）が得られた。1H NMR（200MHz,CDCl3）δ7.2−7.0
（m,3H）,6.9−6.8（m,2H）,6.5−6.4（m,2H）,3.7（t,
2H）,3.2−3.0（m,4H）,2.3（t,2H）,2.1（s,6H）,1.7
（p,2H）；質量分析（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+296. ６−カルボキシフルオレセン（1.00g,2.66mmol）をDM
F（8mL）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（HO
Su）（306mg,2.6mmol）を添加し、1,3−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（DCC）（549mg,2.66mmol）を添加
し、反応混合物を暗所でN2下17時間撹拌した。続いて反
応混合物を真空濾過し、濾液を２−アミノイミプラミン
（26c）（784mg,2.65mmol）、トリエチルアミン（0.56m
L,4.0mmol）及びDMF（4.0mL）と混合し、暗所でN2下で
４時間撹拌した。反応溶媒を真空下で除去し、残渣を逆
相C18分取（1mm）TLCプレート上でH2O/THF/HOAc（40/60
/0.4）、続いてWaters mbondapak C18カラム（19mm×15
0mm）でH2O/THF/HOAc（35/65/0.4）で流速7.0mL/分で溶
離精製すると、橙色の粉末状の所望のトレーサー（27）
（410mg,24％）が得られた。質量分析（FAB）（Ｍ＋
Ｈ）+654. 実施例６ ノルトリプチリントレーサー（30）の合成 酸（21）（466mg,0.931mmol）をDMF（5mL）中に溶解
し、２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−3'−
スルホネート（Woodward's試薬Ｋ）（259mg,1.02mmol）
を添加し、トリエチルアミン（0.195mL,1.40mmol）を添
加し、反応混合物をN2下で40分撹拌した。続いて、アミ
ノメチルフルオレセン塩酸塩（370mg,0.931mmol）、続
いてトリエチルアミン（0.650mL,4.7mmol）を添加し、
反応混合物を暗所でN2下で17時間撹拌した。次いで、溶
媒を真空下で除去し、残渣をシリカゲルのカラムクロマ
トグラフィーでCH2Cl2/MeOH（95/5）で主な最初に溶離
する不純物を除去するまで溶離精製し、続いてCH2Cl2/M
eOH（80/20）で溶離すると、橙色の固体状の所望のＮ−
BOC保護ノルトリプチリントレーサー（28）（379mg,48
％）が得られた。質量分析（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+844. Ｎ−BOCノルトリプチリントレーサー（28）（362mg,
0.429mmol）をCH2Cl2（4.3mL）中で撹拌し、トリフルオ
ロ酢酸（4.3mL）を添加し、反応混合物を５分間撹拌
し、溶媒を真空下で除去した。残渣をCH2Cl2/MeOH（50/
50）（10mL）に再溶解し、トリエチルアミンでpHを７に
調整し、溶媒を真空下で除去した。得られた粗な生成物
を逆相C18分取（1mm）TLCプレート上で、H2O/MeOH/HOAc
（15/85/0.4）で溶離精製すると、橙色の固体の所望の
ノルトリプチリントレーサー（29）（388mg）が得られ
た。質量分析（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+744. 実施例７ アミトリプチリントレーサー（30）の合成 塩化スルホニル（３）（84mg,0.23mmol）をDMF（0.5m
L）／トリエチルアミン（186mL,1.36mmol）に溶解さ
せ、アミノメチルフルオレセン（30mg,0.075mmol）を添
加し、反応混合物を窒素下で3.5時間撹拌した。溶媒を
真空下で除去すると、粗な橙色の固体（148mg）が得ら
れ、これをC18分取tlcプレート上で精製すると、所望の
トレーサー（30）（14.1mg）が得られた。質量分析（FA
B）（Ｍ＋Ｈ）+701. 実施例８ ノルトリプチリントレーサー（31）の合成 トリエチルアミン（0.21mL,1.52mmol）をN'−BOC保護
カルボン酸（21）（25mg,0.050mmol）/Woodward's K（1
4mg,0.055mmol）/DMF（0.5mL）の溶液に添加し、35分撹
拌し、アミノメチルフルオレセン（20mg,0.050mmol）を
トリエチルアミン（0.21mL,1.52mmol）と一緒に添加し
た。反応混合物を窒素下で暗所で18時間撹拌し、溶媒を
真空下で除去すると、橙色の固体が得られ、これを分取
tlcプレート上で精製すると、所望のN'−BOC保護中間体
（21mg）が得られた。質量分析（FAB）（Ｍ）+844. N'−BOC保護中間体（20mg,0.024mmol）をCH2Cl2（0.5
0mL）中に溶解させ、トリフルオロ酢酸（0.50mL）を添
加し、反応混合物を５分間撹拌し、得られた溶液を蒸発
乾凅させた。固体をCH2Cl2（0.5mL）及びトリエチルア
ミン（0.5mL）に溶解させ、溶媒を真空下で除去する
と、橙色の固体が得られ、これをC18分取tlcプレート上
で精製すると、所望のトレーサー（31）（9.0mg）が得
られた。質量分析（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+744. 実施例９ 抗血清の産生 ウサギを最初に免疫原（1mg）で免疫感作し、続いて
応答が成熟（〜12−15週）するまで免疫原（0.5mg）で
追加免疫し、その後、動物を４週間毎に免疫原（0.2m
g）で追加免疫した。動物を２週間目で出血させ、ブリ
ードを力価滴定して適当な希釈で好適な置換及び結合を
示す抗血清集団を選択する。アミトリプチリンに関して
は、典型的なプールを１対45に希釈したものは、210ミ
リ偏光単位（mP）の結合及び1mL当たり100ngのアミトリ
プチリンを含むアミトリプチリン溶液に対し約95mPの置
換を有し；ノルトリプチリンに関しては、典型的なプー
ルを１対250に希釈したものは、約210ミリ偏光単位の結
合及び1mL当たり100ngのノルトリプチリンを含むノルト
リプチリン溶液に対し約120mPの置換を有する。
実施例10 アミトリプチリンに関する蛍光偏光イムノアッセイ 実施例１に記載の如くアミトリプチリン免疫原（４）
で免疫感作した６匹のウサギからの血清を混合すること
により抗血清を製造した。個々の動物中の力価変動は30
％以下で、全ての動物は成熟免疫応答（mature immune
response）（１種類の免疫原で６カ月以上）を示した。
使用した免疫原は少なくとも２種類の別個の合成製剤か
ら得たもので、力価、永続性（abidity）（曲線特性）
及びノルトリプチリンに対する交差反応（50％偏向に於
いて＜10％）によって判定される限り同等の応答を与え
た。生抗血清を混合し、70％リン酸でpHを4.5に調節し
た0.100Mグリシルグリシンからなる緩衝液中に希釈し
た。アッセイ進行中、抗血清をTDx系試薬緩衝液でTDx系
に希釈し、終濃度を1:4,000とした。
実施例５に記載されている蛍光トレーサー（27）を、
十分量の塩化ナトリウム及びチオ硫酸ナトリウムを各々
1.0％及び0.1％濃度に溶解した、25％ジメチルホルムア
ミド、25％グリセロール及び50％蒸留水からなる溶液中
に乾燥試薬を希釈して製造した。このトレーサー試薬ス
トック溶液をアッセイで使用するための同一希釈マトリ
ックス中に濃度〜82nMに希釈した。アッセイ進行中、こ
の希釈トレーサー製剤をさらにTDx系試薬緩衝液で希釈
して終濃度を〜1.0nMとした。
各試験の分析用サンプルをオフライン多段階二相抽出
方法により製造した。1.25mLポリプロピレン試験管にサ
ンプル（0.200mL）を添加した。この試験サンプルを、
0.25N水酸化ナトリウム（0.100mL）及びイソアミルアル
コール（0.020mL）を添加して塩基性にした。この溶液
を混合して、室温に５分間放置した。５分後、ｎ−デカ
ン（0.500mL）をサンプルに添加して、1.0分渦動させて
混合した。渦動後、サンプルを〜8,000×ｇで5.0分間、
遠心分離した。5.0分の遠心分離後、上清（上部相）
（0.200mL）を取って0.100Mグリシルグリシン緩衝液（p
H3）／アセトニトリル溶液（9:1）（0.200mL）を含む1.
25mLの第２のポリプロピレン試験管にいれた。係属中の
米国特許出願第627,282号（1990年12月14日出願）に記
載の如く、この時点で予備処理した溶液（Ｚ試薬＝水性
クロラミン−Ｔの10μg/mL溶液）（0.040mL）を加え、
溶液を1.0分渦動させて混合し、第２の試験管からの下
部相（50〜0.100mL）をAbbott TDx（登録商標）アナラ
イザーのサンプルウエルに移した。
試験容量（0.020mL）を希釈抗血清（0.025mL）及び希
釈蛍光トレーサー（0.025mL）と混合したサンプルをTDx
アナライザーの標準プロトコルに従って実施した。アッ
セイ実施終了時の結果をミリ偏光単位（mP）で表す。ミ
リ偏光単位は自動的に保存標準曲線（stored standard
curve）（表８）から内挿され、濃度（ng/mL）として表
される。アッセイ用のサンプル製造方法ではサンプルを
３倍に希釈しているので、（保存曲線は加重平均した４
つのパラメーター曲線の接合により構成されている）較
正試料の重量濃度は、表示公称濃度の1/3である。較正
試料は、0.100Mグリシルグリシン（pH3）を含む緩衝液
中の重量希釈により製造した。これらをオフラインサン
プル処理（二相抽出）を実施せずにTDxアナライザーに
直接導入する。
実施例11 ノルトリプチリンに関する蛍光偏光イムノアッセイ 実施例３に記載の如く、ノルトリプチリン免疫原（1
8）で免疫感作した６匹のウサギからの血清を混合する
ことにより抗血清を製造した。個々の動物中の力価変動
は30％以下で、全ての動物は成熟免疫応答（１種類の免
疫原で６カ月以上）を示した。使用した免疫原は少なく
とも２種類の別個の合成製剤から得たもので、力価、永
続性（曲線特性）及びノルトリプチリンに対する交差反
応（50％偏向に於いて＜10％）によって判定される限り
同等の応答を与えた。生抗血清を混合し、pHを7.0に調
節した0.100Mリン酸塩で緩衝させた食塩水からなる緩衝
液中に希釈した。アッセイ進行中、抗血清をTDx系試薬
緩衝液でTDx系に希釈し、終濃度を1:16,000とした。
実施例６に記載されているノルトリプチリン蛍光トレ
ーサー（29）を、十分量の塩化ナトリウム及びチオ硫酸
ナトリウムを各々1.0％及び0.1％濃度に溶解した、25％
ジメチルホルムアミド、25％グリセロール及び50％蒸留
水からなる溶液中に乾燥試薬を希釈して製造した。この
トレーサー試薬ストック溶液をアッセイで使用するため
の同一希釈マトリックス中に濃度〜82nMに希釈した。ア
ッセイ進行中、この希釈トレーサー製剤をさらにTDx系
試薬緩衝液で希釈して終濃度を〜1.0nMとした。
各試験の分析用サンプルをオフライン多段階二相抽出
方法により製造した。1.25mLポリプロピレン試験管にサ
ンプル（0.200mL）を添加した。この試験サンプルを、
0.25N水酸化ナトリウム（0.100mL）及びイソアミルアル
コール（0.020mL）を添加して塩基性にした。この溶液
を混合して、室温に５分間放置した。５分後、ｎ−デカ
ン（0.500mL）をサンプルに添加して、1.0分渦動させて
混合した。渦動後、サンプルを〜8,000×ｇで5.0分間、
遠心分離した。5.0分の遠心分離後、上清（上部相）
（0.200mL）を取って0.100Mグリシルグリシン緩衝液（p
H3）／アセトニトリル溶液（9:1）（0.200mL）を含む1.
25mLの第２のポリプロピレン試験管にいれた。係属中の
米国特許出願第627,282号（1990年12月14日出願）に記
載の如く、この時点で予備処理した溶液（Ｚ試薬＝水性
クロラミン−Ｔの10μg/mL溶液）（0.040mL）を加え、
溶液を1.0分渦動させて混合し、第２の試験管からの下
部相（50〜0.100mL）をAbbott TDx（登録商標）アナラ
イザーのサンプルウエルに移した。
試験容量（0.015mL）を希釈抗血清（0.025mL）及び希
釈蛍光トレーサー（0.025mL）と混合したサンプルをTDx
アナライザーの標準プロトコルに従って実施した。アッ
セイ実施終了時の結果をミリ偏光単位（mP）で表す。ミ
リ偏光単位は自動的に保存標準曲線（表９）から内挿さ
れ、濃度（ng/mL）として表される。アッセイ用のサン
プル製造方法ではサンプルを３倍に希釈しているので、
（保存曲線は加重平均した４つのパラメーター曲線の接
合により構成されている）較正試料の重量濃度は、表示
公称濃度の1/3である。較正試料は、0.100Mグリシルグ
リシン（pH3）を含む緩衝液中の重量希釈により製造し
た。これらをオフラインサンプル処理（二相抽出）を実
施せずにTDxアナライザーに直接導入する。
実施例12 アミトリプチリンアッセイに於けるトレーサーの構造変
更の効果 図７に示されているアミトリプチリンスルホンアミド
から図５に示されているアミドに蛍光トレーサー構造を
変更すると、アッセイ特性に於いて非常に有効である。
２種類の蛍光トレーサー（27）及び（30）を用いて６種
類の既知濃度で検量曲線を引いた。アミトリプチリン誘
導トレーサー（30）の場合、アミトリプチリン代謝物に
対する交差反応性は、所望のアッセイ性能を超えていた
（図11参照）。トレーサー（27）を使用すると、抗体−
トレーサー複合体（complex）由来のアミトリプチリン
によってトレーサーが多く置換し、並びに交差反応性が
大きく低下する（図10及び11参照）。これらの知見は、
特異的アミトリプチリンアッセイに関して本発明の好ま
しい態様を示している。
実施例13 ノルトリプチリンアッセイに於けるトレーサーの構造変
更の効果 図７に示されているノルトリプチリンスルホンアミド
から図６に示されている異性体的に純粋なスルホンアミ
ドに蛍光トレーサー構造を変更すると、アッセイ特性に
於いて非常に有効である。２種類の蛍光トレーサー（2
9）及び（31）を用いて６種類の既知濃度で検量曲線を
引いた。アミトリプチリン誘導トレーサー（31）の場
合、アミトリプチリン代謝物に対する交差反応性は、所
望のアッセイ性能を超えていた（図13参照）。トレーサ
ー（29）を使用すると、抗体−トレーサー複合体由来の
ノルトリプチリンによってトレーサーが多く置換し、並
びに交差反応性が大きく低下する（図12及び13参照）。
これらの知見は、特異的ノルトリプチリンアッセイに関
して本発明の好ましい態様を示している。
実施例14 アミトリプチリンTDxアッセイ対HPLCの対比解析 アミトリプチリンTDxアッセイの相対精度を、患者サ
ンプル抽出物を使用してHPLCとの対比により決定した。
HPLC分析用の抽出物は以下に記載の如く製造し、三環式
抗鬱薬トリミプラミン及びＺ−デスメチルドキセピンを
内部標準としてアセトニトリル中、各々濃度４μg/mLで
使用した。
1. 患者標準（1.0mL）をテフロンねじ栓のついた16×1
25シリル化チューブにピペットでいれた。冷凍庫から好
適な標準検量曲線の冷凍アリコートを取り出して、溶か
した。内部標準を含むアセトニトリル（0.75mL）を各チ
ューブに入れた。
2. 0.25N NaOH（1.0mL）、続いてイソアミルアルコー
ル（0.200mL）を添加し、激しく渦動させ、チューブを
5.0分放置した。
3. 各チューブにｎ−ヘプタン（10.0mL）をピペットで
加え、各チューブの栓をしっかり閉めた。ヘプタン／血
漿二相混合物を1.0時間激しく振盪した。
4. 振盪機からチューブを取り出し、遠心分離機に移し
た。ヘプタン／血漿混合物を少なくとも200×ｇで30分
遠心分離し、層を透明にした。
5. 遠心分離機からチューブを取り出し、ヘプタン上部
層を0.1M pH3のグリシルグリシン緩衝液（1.0mL）を含
む同一仕様の別のシリル化チューブに移した。これらの
チューブを閉め、1.0時間激しく振盪した。
6. 振盪機からチューブを取り出し、遠心分離機に移し
た。二相グリシルグリシン／ヘプタン混合物を少なくと
も2000×ｇで30分間遠心分離した。
7. 遠心分離機からチューブを取り出し、栓を開けて、
ヘプタン上部層を吸引するかピペットで取り出して、廃
棄した。
8. 0.25N NaOH（2.0mL）を各々残っているグリシルグ
リシン下部層に添加した。ｎ−ヘプタン（5.0mL）を各
水性抽出液に添加し、チューブに栓をして1.0時間振盪
した。
9. 振盪機からチューブを取り出し、遠心分離機に移し
た。ペンタン／水性混合物を200×ｇで30分間遠心分離
した。
10. 遠心分離機からチューブを取り出し、ペンタン上
部層を16×100シリル化円錐ねじ山付き試験管に移し
た。試験管の栓をしっかり閉めて、1/4回転緩めた。温
かい砂浴にチューブをおき、チューブの入った砂浴を真
空デシケーターキャビネットに移して、真空にした。ペ
ンタン蒸発には約25−30分間を要した。
11. 砂浴中のチューブをデシケーターから取り出し、
各チューブにペンタン（1.0mL）をピペットで計り入
れ、再び栓をし、各チューブを暫く渦動した。栓を1/4
回転分開けて、チューブをデシケーターに戻し、ペンタ
ンが蒸発するまで10−15分再び真空にした。
12. 乾燥したチューブをデシケーターから取り出し、H
PLC移動相（0.070mL）をピペットで計りいれた。各チュ
ーブを約30秒間、チューブの側面が濡れるように注意し
ながら渦動した。
13. チューブを遠心分離機に移して、200×ｇで２−３
分遠心分離した。
14. チューブを遠心分離機から取り出し、内容物を全
てWISPオートカルーセル（autocarousel）サンプルキュ
ベットに移した。注射量を80オングストローム孔径の３
ミクロンシリカを詰めた10cm×0.6cmカラム上に0.050mL
/注射１回に設定する。クロマトグラフィーの移動相
は、濃リン酸でpH3に調節した0.025M二塩基性リン酸ナ
トリウム80部／アセトニトリル20部/0.021M n−ノニル
アミン（pH範囲＝7.4−7.8）の混合物からなっていた。
分析カラムには、40ミクロンの薄膜シリカを含む乾燥充
填保護カラムをつける。溶媒の流速は、1.6mL/分であっ
た。
直線回帰分析では、アミトリプチリンTDxアッセイとH
PLCアッセイの間には良好な相関関係があった（Ｎ＝10
3,R＝0.9879,S＝1.0012）。結果を図14に示す。
実施例15 ノルトリプチリンTDxアッセイ対HPLCの対比解析 ノルトリプチリンTDxアッセイの相対精度を、患者サ
ンプル抽出物を使用してHPLCとの対比により決定した。
上記と同様にHPLC分析用の抽出物を製造し、クロマトグ
ラフィー条件を用いた。直線回帰分析では、ノルトリプ
チリンTDxアッセイとHPLCアッセイの間には良好な相関
関係があった（Ｎ＝108,R＝0.9381,S＝0.9448）。結果
を図15に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨンソン，ドナルド アメリカ合衆国、イリノイ・60046、リ ンデンハースト、サンセツト・レーン・ 2309 (72)発明者 ハーター，ダリル・イー アメリカ合衆国、イリノイ・60060、マ ンデレイン、サウスポート・ロード・ 225 (72)発明者 フイツシユポウ，ジエフリー・アール アメリカ合衆国、イリノイ・60640、シ カゴ、レランド・アベニユー・1732 (56)参考文献 特開 昭61−41（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−132362（ＪＰ，Ａ) 米国特許4307245（ＵＳ，Ａ) 米国特許4223013（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 C07D 493/10 C07K 16/44 G01N 33/533 C07C 311/37

Claims (25)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試験サンプル中のアミトリプチリンを定量
    するためのイムノアッセイ法であり、 （ａ）試験サンプルをラベル化された試薬および抗体試
    薬と接触させて反応溶液を形成する工程であり、該抗体
    試薬がアミトリプチリンに結合し得る抗体を含み、 （ｉ）該抗体が、式： ［式中、Ｘは相互に結合し、２若しくは３位で芳香環と
    結合する２個のヘテロ原子であり、Ｙは０〜６個の炭素
    原子を含む結合基であり、Ｐは免疫原性キャリアー物質
    である］のアミトリプチリン誘導体から調製された免疫
    原により産生され、 （ii）アミトリプチリンの特異的定量に用いる前記ラベ
    ル化された試薬が式： ［式中W1は２若しくは３位で芳香環と結合するヘテロ原
    子であり、Z1は１〜４個の炭素原子および０〜２個のヘ
    テロ原子を含む結合基であり、Ｑは検出可能な成分であ
    る］の化合物を含むこと、 を特徴とする工程、および （ｂ）前記試験サンプル中のアミトリプチリンの量の関
    数として、抗体との結合反応に関係した、あるいはしな
    かった反応溶液中のラベル化された試薬の量を測定する
    工程、 を含むことを特徴とする前記イムノアッセイ法。
  2. 【請求項２】試験サンプル中のノルトリプチリンを定量
    するためのイムノアッセイ法であり、 （ａ）試験サンプルをラベル化された試薬および抗体試
    薬と接触させて反応溶液を形成する工程であり、該抗体
    試薬がノルトリプチリンに結合し得る抗体を含み、 （ｉ）該抗体が、式： ［式中、Ｘは相互に結合し、２若しくは３位で芳香環と
    結合する２個のヘテロ原子であり、Ｙは０〜６個の炭素
    原子を含む結合基であり、Ｐは免疫原性キャリアー物質
    である］のアミトリプチリン誘導体から調製された免疫
    原により産生され、 （ii）アミトリプチリンの特異的定量に用いる前記ラベ
    ル化された試薬が式： ［式中、W2は相互に結合し、２若しくは３位で芳香環と
    結合する２個のヘテロ原子であり、Z2は１〜４個の炭素
    原子および０〜２個のヘテロ原子を含む結合基であり、
    およびＱは検出可能な成分である］の化合物を含むこ
    と、 を特徴とする工程、および （ｂ）前記試験サンプル中のノルトリプチリンの量の関
    数として、抗体との結合反応に関係した、あるいはしな
    かった反応溶液中のラベル化された試薬の量を測定する
    工程、 を含むことを特徴とするイムノアッセイ法。
  3. 【請求項３】前記免疫原性キャリアー物質がウシ血清ア
    ルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、および
    サイログロブリンから成る群から選択される、請求項１
    あるいは２に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記検出可能な成分が、酵素、発色団、蛍
    光分子、化学発光分子、燐光分子及び発光分子からなる
    群から選択されることを特徴とする請求項１あるいは２
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記イムノアッセイ法が、前記ラベル化さ
    れた試薬の検出可能な成分が、体液中のアミトリプチリ
    ンの定量用の抗体の存在に対して検出可能な蛍光偏光応
    答を産生し得る蛍光分子である蛍光偏光イムノアッセイ
    であることを特徴とする、請求項１あるいは２に記載の
    方法。
  6. 【請求項６】（ａ）蛍光偏光応答を得るために、前記反
    応溶液中に平面偏光を通過させ、（ｂ）試験サンプル中
    のアミトリプチリンの関数として、反応溶液に対する該
    蛍光偏光応答を検出することにより、前記ラベル化され
    た試薬の量を測定する請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセ
    イン、アミノフルオレセイン、５−フルオレセイニル、
    ６−フルオレセイニル、５−カルボキシフルオレセイ
    ン、６−カルボキシフルオレセイン、チオウレアフルオ
    レセイン、およびメトキシトリアジノリルアミノフルオ
    レセインから成る群から選択されることを特徴とする請
    求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】（ｉ）前記抗体が 式： のアミトリプチリン誘導体から調製される免疫原によっ
    て産生されること、および （ii）アミトリプチリンの特異的定量のための前記ラベ
    ル化された試薬が 式： ［式中、Ｑは６−カルボキシフルオレセインである］ を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
  9. 【請求項９】（ｉ）前記抗体が 式： のノルトリプチリン誘導体から調製される免疫原によっ
    て産生されること、および （ii）ノルトリプチリンの特異的定量のための前記ラベ
    ル化された試薬が 式： ［式中、Ｑはアミノメチルフルオレセインである］ を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
  10. 【請求項１０】試験サンプル中のアミトリプチリンある
    いはノルトリプチリンに結合し得る抗体を含む抗体試薬
    であって、該抗体が式： ［式中、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環
    に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子０〜
    ６個を含む結合基であり、ＲはCH3あるいはＨであり、
    Ｐは免疫原性キャリアー物質である］のアミトリプチリ
    ンあるいはノルトリプチリン誘導体から調製された抗原
    により産生されることを特徴とする前記抗体試薬。
  11. 【請求項１１】前記免疫原性キャリアー物質が、ウシ血
    清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンおよ
    びサイログロブリンからなる群から選択されることを特
    徴とする請求項10に記載の抗体試薬。
  12. 【請求項１２】試験サンプル中のアミトリプチリンに結
    合し得る抗体により認識し得るラベル化された試薬であ
    って、該ラベル化された試薬を式： ［式中、W1は２若しくは３位で芳香環に結合したヘテロ
    原子であり、Z1は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜
    ２個を含む結合基であり、Ｑは検出可能な成分である］
    の誘導体から調製することを特徴とする前記ラベル化さ
    れた試薬。
  13. 【請求項１３】試験サンプル中のノルトリプチリンに結
    合し得る抗体により認識し得るラベル化された試薬であ
    って、該ラベル化された試薬を式： ［式中、W2は相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環
    に結合した２個のヘテロ原子であり、Z2は炭素原子１〜
    ４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、Ｑは
    検出可能な成分である］のノルトリプチリン誘導体から
    調製することを特徴とするラベル化された試薬。
  14. 【請求項１４】前記検出可能な成分が、酵素、発色団、
    蛍光分子、化学発光分子、燐光分子及び発光分子からな
    る群から選択されることを特徴とする請求項12又は13に
    記載のラベル化された試薬。
  15. 【請求項１５】前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレ
    セイン、アミノフルオレセイン、５−フルオレセイニ
    ル、６−フルオレセイニル、５−カルボキシフルオレセ
    イン、６−カルボキシフルオレセイン、チオウレアフル
    オレセイン、およびメトキシトリアジノリルアミノフル
    オレセインから成る群から選択されることを特徴とする
    請求項14に記載のラベル化された試薬。
  16. 【請求項１６】W1が２位に結合する−NH−であり、Z1が
    −CO−であり、Ｑが５−フルオレセイニルである請求項
    15に記載の化合物。
  17. 【請求項１７】W2が−SO2−NH−であり、硫黄が芳香環
    の３位に結合し、Z1が−CH2−CO−であり、二重結合に
    関する配置がＺであり、Ｑが５−フルオレセイニルであ
    る請求項15に記載の化合物。
  18. 【請求項１８】試験サンプル中のアミトリプチリンを定
    量するための試験キットであり、 （ａ） 試験サンプル中のアミトリプチリンに結合し得る抗体を
    含む抗体試薬であって、該抗体が式： ［式中、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環
    に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは、炭素原子０
    〜６個を含む結合基であり、Ｐは免疫原性キャリアー物
    質である］のアミトリプチリン誘導体から調製される免
    疫原を用いて産生されることを特徴とする前記抗体試
    薬、および （ｂ）試験サンプル中のアミトリプチリンと結合し得る
    抗体によって認識し得るラベル化された試薬であって、
    該ラベル化された試薬が式： ［式中、W1は２若しくは３位で芳香環と結合するヘテロ
    原子であり、Z1は１〜４個の炭素原子および０〜２個の
    ヘテロ原子を含む結合基であり、Ｑは蛍光成分である］
    を含むことを特徴とする前記ラベル化された試薬、 を含むことを特徴とする前記試験キット。
  19. 【請求項１９】試験サンプル中のノルトリプチリンを定
    量するための試験キットであり、 （ａ） 試験サンプル中のノルトリプチリンに結合し得る抗体を
    含む抗体試薬であって、該抗体が式： ［式中、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環
    に結合した２項のヘテロ原子であり、Ｙは、炭素原子０
    〜６個を含む結合基であり、Ｐは免疫原性キャリアー物
    質である］のノルトリプリチン誘導体から調製される免
    疫原を用いて産生されることを特徴とする前記抗体試
    薬、および （ｂ）試験サンプル中のノルトリプチリンと結合し得る
    抗体によって認識し得るラベル化された試薬であって、
    該ラベル化された試薬が式： ［式中、W2は相互に結合し、２若しくは３位で芳香環と
    結合する２個のヘテロ原子であり、Z2は１〜４個の炭素
    原子および０〜２個のヘテロ原子を含む結合基であり、
    Ｑは蛍光成分である］を含むことを特徴とする前記ラベ
    ル化された試薬、 を含むことを特徴とする前記試験キット。
  20. 【請求項２０】前記免疫原性キャリアー物質が、ウシ血
    清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンおよ
    びサイログロブリンからなる群から選択されることを特
    徴とする請求項18あるいは19に記載の試験キット。
  21. 【請求項２１】前記蛍光成分が、アミノメチルフルオレ
    セイン、アミノフルオレセイン、５−フルオレセイニ
    ル、６−フルオレセイニル、５−カルボキシフルオレセ
    イン、６−カルボキシフルオレセイン、チオウレアフル
    オレセイン、およびメトキシトリアジノリルアミノフル
    オレセインから成る群から選択されることを特徴とする
    請求項18あるいは19に記載の試験キット。
  22. 【請求項２２】前記抗体試薬が式： のアミトリプチリン誘導体から調製される免疫原によっ
    て産生され、前記ラベル化された試薬が式： ［式中、Ｑは６−カルボキシフルオレセイン］であるこ
    とを特徴とする、請求項21に記載の試験キット。
  23. 【請求項２３】前記抗体試薬が式： のノルトリプチリン誘導体から調製される免疫原によっ
    て産生され、前記ラベル化された試薬が式： ［式中、Ｑはアミノメチルフルオレセイン］であること
    を特徴とする、請求項21に記載の方法。
  24. 【請求項２４】式： ［式中、ＲはCH3であり、配置はＥ若しくはＺまたはＥ
    及びＺの組み合わせであり、Ｘは相互に結合し且つ２若
    しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であ
    り、Ｙは炭素原子０〜６個を含む結合基であり、及びＰ
    は免疫原性キャリヤ物質である］の化合物。
  25. 【請求項２５】式： ［式中、ＲはＨであり、配置はＥ若しくはＺまたはＥ及
    びＺの組み合わせであり、Ｘは相互に結合し且つ２若し
    くは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、
    Ｙは炭素原子０〜６個を含む結合基であり、及びＰは免
    疫原性キャリヤ物質である］の化合物。
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