JPH06509580A

JPH06509580A - 体液中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンの定量用の試薬及び方法

Info

Publication number: JPH06509580A
Application number: JP5503712A
Authority: JP
Inventors: アダムツイツク，マシージ; ジヨンソン，ドナルド; ハーター，ダリル・イー; フイツシユポウ，ジエフリー・アール
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-07-29
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2017-02-18
Also published as: ATE196363T1; US5614419A; WO1993003370A1; CA2110917A1; EP0599935A1; AU2408692A; ES2152229T3; JP3257793B2; EP0599935B1; CA2110917C; DE69231443D1; US5407835A; EP0599935A4; DE69231443T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、試験サンプル中のアミトリブチリン（ａｏ＋１ｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ）または試験サンプル中のノルトリブチリン（ｎｏｒｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ）のイムノアッセイ定量に関する。特に、本発明は、アミドリブリチン代謝物の存在下に於けるアミトリブチリンの特異的定量用並びにノルトリブチリン代謝物及びアミトリブチリンの存在下に於けるノルトリブチリンの特異的定量用、好ましくは、蛍光偏光イムノアッセイ（ｆｌｕｏｒｅｓｅ口ｃｅ　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）用の免疫原、そのような免疫原から製造した抗体及び標識試薬に関する。

発明の背景アミドリブ、チリン及びノルトリブチリンは、慢性欝病を治療するために処方される三環式抗領薬であり、各々、式により表される。

アミトリブチリンがこのような治療の主剤であるとき、アミトリブチリンの第３級窒素の脱メチル化によりできる天然代謝物として、ノルトリブチリンが通常存在する。従ってノルトリブチリンは、それ自体が慢性欝病の治療の主剤として処方される時に存在するだけでなく、アミトリブチリンをこのような治療の主剤として使用する際にも存在する。体液（例えば、血清、血漿、全血液、尿など）に存在するアミトリブチリン及びノルトリブチリンの治療的薬しベルをモニターすると、患者を取り扱う一助となる情報を医者に提供するのに非常に有用である。

このような薬レベルをモニターすると、特にアミトリブチリンを用いる治療（アミトリブチリン及びノルトリブチリンの両方が存在することとなる）に於いて、最適治療効果を達成するために患者の投与量を調整し、薬剤不足または毒性レベルとならないようにできる。この点に関しては、高レベルのアミトリブチリン及びノルトリブチリンは中枢神経系疾患、心臓血管毒性、高血圧症、癲晦発作、昏睡及び死亡を伴い、特に、所与の投与量に関してもヒト血漿中の量には通常患者によって様々な違いがあるので、患者の血液中のアミトリブチリン及びノルトリブチリン濃度を治療範囲内に保持しなければならない、。

従って、アミトリブチリンまたはノルトリブチリンを用いる治療に対して個人の反応が様々であるので、例えば、患者の血清若しくは血漿中の、アミトリブチリンが治療の主剤である場合にはアミトリブチリン及びノルトリブチリンの両／ｊのレベルを、またはノルトリブチリンが治療の主剤である場合にはノルトリブチリンレヘルをそれぞれ測定することにより治療をモニターする必要がある。所望の治療範囲以下の濃度では曽病の治療に対して薬剤不足となり、その範囲より高いレベルでは抗僻病効能を全く増大せずに、望ましくない作用（心臓血管合併症、抗コリン作用及び沈静を含む）を併発し得る。。

例えば、高圧液体クロマトグラフィー［Ｄｏｒｅｙら、　Ｃｌ１ｎ。

（：ｈｃｍ、、　３４．２３４８２３５１（１９８８）］　、カスクａマドクラ７　イー２５、５９９−６０３（１９７３）１などのクロマトグラフィー法によるアミトリブチリン々びノルトリブチリンの測定については雑文がある３、しかしながら、これらの方法は、かなり困難な仕事であり、時間の浪費で且つ冗長な種々の厄介な段階を実施するために高度な熟練者が必要である。

２５７−２６７（１９８６）コ、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）法［米国特許第４．４２０．５６８号及び欧州特許出願第２２６．７３０号］及び酵素イムノアッセイ（ＥＩ＾）法［米国特許第４．３０７．２４５号、同第４、２２３．０１３号及びＰａｎｋｅｙら、　Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、、３２．７６８−７７２（１９８６）］などによる三三環式−薬のレベルのイムノアッセイ測定については報告がある。しかしながら、これらの方法は、特異性（即ち、ノルトリブチリン及びアミトリブチリン代謝物の存在下でのアミトリブチリンの測定並びにアミトリブチリン及びノルトリブチリン代謝物の存在下でのノルトリブチリンの測定）に欠けるか、または被分析物質の存在下での抗体特異性の欠失を克服するために厄介なカラム精製が必要である。特に上記の４種類の主要な三環式抗−薬の総量を測定するための非特異的蛍光偏光イムノアッセイ（１・”ＰＩ＾）は市販されており、欧州特許出願公開第２２６．７３０号及び米国特許第４．４２０．５６８号に記載されているが、このアッセイにより測定された濃度は、血漿または血清中の三環式抗憫薬の総量の推測にしかすぎない。従って、このようなアッセイは、例えば、アミトリブチリンで治療した患者中の特異的な個々の三環式抗僻薬を正確に定量するためには使用できず、患者の血漿または血清中のアミトリブチリン及びノルトリブチリンの総量が解るだけである。

発明の概要本発明は、試験サンプル中のアミトリブチリンまたはノルトリブチリンの定量用の特徴的な抗体試薬及び標識試薬を提供する。本発明は、このような抗体試薬の産生法及びこのような標識試薬の製造に使用する免疫原を製造するための合成法も提供する。本発明の標識試薬及び抗体は、試験サンプル中のアミトリブチリンまたはノルトリブチリンの定量用のイムノアッセイで使用する際に従来法よりも優れている。本発明の好ましい態様により、標識試薬及び抗体試薬は、試験サンプル中のアミトリブチリンまたはノルトリブチリンの詳細且つ信頼性のある定量を実施するための、イムノアッセイの特異性とスピード及び均質法の簡便性を併せ持つ蛍光偏光イムノアッセイで標識試薬及び抗体試薬を使用することを開示する。

図面の簡単な説明図１は、本発明の方法によりウシ血清アルブミンにアミトリブチリンを結合させるための合成経路を例示する。

図２は、本発明の方法によりウシ血清アルブミンにアミトリブチリンを結合させるための合成経路を例示する。

図３は、本発明の方法によりウシ血清アルブミンにノルトリブチリンを結合させるための合成経路を例示する。

図４は、本発明の方法によりウシ血清アルブミンにノルトリブチリンを結合させるための合成経路を例示する。

図５は、本発明の方法によりアミトリブチリンアッセイ用の蛍光トレーサーを製造するための合成経路を例示する。

図６は、本発明の方法によりノルトリブチリンアッセイ用の蛍光トレーサーを製造するための合成経路を例示する。

図７は、本発明の方法によるアミトリブチリン蛍光トレーサー及びノルトリブチリン蛍光トレーサーの別の合成経路を例示する。

図８は、Ａｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ（登録商標）アナライザーに於けるアミトリブチリン検量曲線を示すグラフである。

図９は、Ａｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ（登録商標）アナライザーに於けるノルトリブチリン検量曲線を示すグラフである。

図１０は、特異的アミトリブチリンアッセイに於ける蛍光トレーサーの構造変形の効果を示すグラフである。

図１１は、特異的アミトリブチリンアッセイの交差反応性に於ける蛍光トレーサーの構造変更の効果を示す表である。

図１２は、特異的ノルトリブチリンアッセイに於ける蛍光トレーサーの構造変形の効果を示すグラフである。

図１３は、特異的ノルトリブチリンアッセイの交差反応性に於ける蛍光トレーサーの構造変更の効果を示す表である。

図１４は、高性能液体クロマトグラフィーと比較した、本発明のアミトリブチリンの特異的定量用の蛍光偏光イムノアッセイの方法の精度を示すグラフである。

図１５は、高性能液体クロマトグラフィーと比較した、本発明のノルトリブチリンの特異的定量用の蛍光偏光イムノアフセイの方法の精度を示すグラフである。

発明の詳細な説明本発明により、アミトリブチリンまたはノルトリブチリンの特異的定量は、最初に標識試薬またはトレーサー及び抗体試薬と試験サンプルとを同時または任意の順に接触させ、次いで試験サンプル中のアミトリブチリンまたはノルトリブチリンの量の関数として抗体試薬との結合反応に関与したか、または関与しなかった標識試薬の量を測定することにより実施し得る。特に、本発明は、アミトリブチリンの特異的定量及びノルトリブチリンの特異的定量用の蛍光偏光イムノアッセイで使用するための、免疫原、そのような免疫原から製造した抗体及び標識試薬に関する。本発明によるアミトリブチリンまたはノルトリブチリンの特異的定量は、アミトリブチリンイムノアッセイに関しては、アミトリブチリンの特異的定量をノルトリブチリン及びアミトリブチリン代謝物の存在下で実施し、ノルトリブチリンイムノアッセイに関しては、ノルトリブチリンの特異的定量をアミド、リプチリン及びノルトリブチリン代謝物の存在下で実施するものと理解されたい。

［式中、Ｐは、免疫原性キャリヤ物質であり、配置はＥ若しくはＺまたはＥ及びＺの組み合わせであり、アミトリブチリンの定量に関しては、ＲはＣＨ３であり、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のへテロ原子であり、及びＹは炭素原子０〜６個を含む結合基であり、ノルトリブチリンの定量に関しては、ＲはＨであり、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のへテロ原子であり、及びＹは炭素原子０〜６個を含む結合基である］の誘導体で製造した免疫原で産生ずる。

アミトリブチリン用の本発明の標識試薬は、式■：［式中、Ｑは、検出可能な成分、好ましくは蛍光成分であり、アミトリブチリンの定量に関しては、Ｗｌは２若しくは３位の芳香環に結合したヘテロ原子であり、Ｚ、は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であるコの誘導体で製造する。

ノルトリブチリン用の本発明の標識試薬は、式Ｖ：［式中、Ｑは検出可能な成分、好ましくは蛍光成分であり、配置はＥ若しくはＺまたはＥ及びＺの組み合わせであり、ノルトリブチリンの定量に関しては、Ｗ２は相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のへテロ原子であり、Ｚ２は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基、である］の誘導体で製造する。

上記の免疫原は、以下の記載の如く製造するが、これを図１及び２（アミトリブチリン免疫原）並びに図３及び４（ノルトリブチリン免疫原）に示す。アミトリブチリンに関しては、Ｅ及びＺの混合物の、２−置換または３−置換アミトリブチリンスルホン酸は、アミトリブチリンの遊離塩基とクロロスルホン酸の処理から得られた。得られた混合物を次いで塩化スルホニルに転換させ、これをウシ血清アルブミンと反応させて、所望のアミトリブチリン免疫原を得る（図１）、、さらに、スルホン酸の混合物をＨＰｌ、Ｃで分けると、純粋な２Ｅ−アミトリブチリンスルホン酸並びに２２及び３Ｅ異性体が得られる。これらの異性体を各々、上記のアミトリブチリンスルホン酸の混合物に関して用いた方法によってアミトリブチリン免疫原に転換する（図２）。ノルトリブチリン免疫原の製造に関しては、合成ンークエンスをアミトリブチリンスルホニルクロリドの混合物で開始し、これをグリノンメチルエステルと反応させると、メチルエステルスルホンアミドが得られる。スルホンアミドの混合物をＮ゛−脱メチル化、加水分解工程続いてＮ’−ＢＯＣ保護を介してＮ−ＢＯＣ保護カルボン酸に転換させる。この酸の混合物をヒドロキシスクシンイミド活性エステルを介してウシ血清アルブミンに結合させ、得られた中間体をトリフルオロ酢酸で処理すると、所望のノルトリブチリン免疫原が得られる（図３）。さらに、アミトリブチリンスルホン酸の混合物をＨＰＬＣで分けると、純粋な２Ｅ−アミトリブチリンスルホン酸並びに２２及び３Ｅ異性体が得られる。これらを各々塩化スルホニルに転換すると、最終的に図４に示される所望のノルトリブチリン免疫原が得られる。

アミトリブチリン用の特異的蛍光偏光イムノアッセイで使用するための上記の好ましい蛍光標識試薬は、２−アミノイミプラミンと６−カルボキシフルオレセンヒドロキシスクシンイミド活性エステルを縮合して合成すると、図５に示すようなアミトリブチリントレーサーが得られた。ノルトリブチリン用の特異的蛍光偏光イムノアッセイで使用するための上記の好ましい蛍光ノルトリブチリン標識試薬は、２Ｅ−クロロスルホ、−ルアミトリプチリンをグリシンメチルエステルで処理することにより合成してスルポンアミドを得、これを脱メチル化、加水分解し、次いでＮ’−ＢＯＣ誘導体として保護した。Ｎ−ＢＯＣ保護−２Ｅ−スルホンアミド酸をアミノメチルフルオレセンと縮合すると、Ｎ’−ＢＯＣ保護トレーサーが得られた。トリフルオロ酢酸との処理後、図６に示される所望のノルトリブチリントレーサーが得られた。

本発明の試薬を用いる蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩ＾）手順により、試験サンプル中のアミトリブチリンまたはノルトリブチリンの濃度またはレベルを正確に定量し得る。アミトリブチリンまたはノルトリブチリンの特異的定量用のＦＰＩ＾を実施するために、検量曲線をアミトリブチリン（図８）及びノルトリブチリン（図９）の治療範囲をモニターするために作成した。

本発明により、アミトリブチリンまたはノルトリブチリンの定量用の優れた蛍光偏光イムノアッセイのアッセイ結果は、意外且つ驚くべきことに、（ｆ）式■（式中、Ｐは上記の免疫原キャリヤである）のアミトリブチリンまたはノルトリブチリン免疫原から産生じた抗体を含む抗体試薬、及び（Ｕ）式■（アミトリブチリン）または式Ｖ（ノルトリブチリン）（式中、Ｑは上記の蛍光成分である）の蛍光標識試薬を使用すると得られることが分かった。

アミトリブチリンの定量に関しては、抗体試薬は、アミトリブチリンと結合またはこれを識別し得る抗体を含み、抗体は、式■［式中、Ｐはウソ血清アルブミンであり、Ｘは一３Ｏ，−ＮＨ−であり、ＲはＣ１１３であり、及びＹは炭素原子０個である］のアミトリブチリン誘導体から製造した免疫原で産生ずるのが好ましく、及び標識試薬は、式■［式中、Ｑは蛍光成分であり、Ｗｌは−ＮＨ−であり、及びＺ、は−ＣＯ−である］の誘導体から製造するのが好ましい。同様に、ノルトリブチリンの定量に関しては、抗体試薬は、ノルトリブチリンと結合またはこれを識別し得る抗体を含み、抗体は、式■［式中、Ｐはウシ血清アルブミンであり、Ｘは一３Ｏ，−ＮＨ−であり、ＲはＨであり、及びＹは−ＣＨ２−Ｃ０ −である］のノルトリブチリン誘導体から製造した免疫原で産生ずるのが好ましく、及び標識試薬は、式Ｖ［式中、Ｑは蛍光成分であり、Ｗ２は−ＮＨ−３Ｏ□ −であり、及びＺ２は−ＣＨ２−Ｃ０−である］のノルトリブチリン誘導体から製造するのが好ましい。

特に、意外且つ驚くべきことに、アミトリブチリンを特異的に定量するために、式■［式中、ＲはＣＨ３であり、芳香環に結合したスルホンアミド基：　Ｘ　＝　（−３ｏ２−ＮＨ−）を含む］の新規免疫原と式■［式中、アミド基は芳香環に結合する、　Ｗ　、　Ｚ　、　＝　（−ＮＨ−Ｃｏ−）コの新規蛍光トレーサーの組み合わせが、本発明の意図するアミトリブチリンの特異的な定量に重要であることが知見された。この特徴的な試薬の有効な組み合わせにより、アミトリブチリンの特異的な定量が改良された。ノルトリブチリンの特異的定量に関しては、式■［式中、Ｒは［Ｉであり、芳香環に結合したスルホンアミド基を含む；　Ｘ　＝　（−３Ｏ２−ＮＨ−）］の新規免疫原を含む試薬と式■［式中、スルホンアミド基は芳香環に結合している：Ｗ２＝−８Ｏ□−ＮＨ−及びＺ　２＝　（−ＣＨ２−ＣＯ−）］の新規蛍光トレーサーの特徴的な組み合わせがノルトリブチリンの特異的な定量に重要であった。特徴的な試薬を都合よ（組み合わせることにより、本発明の意図するノルトリブチリンの特異的な定量が改良された。

上記の組み合わせの性能は、図１０及び１１（アミトリブチリン）及び図１２及び１３（ノルトリブチリン）に示されており、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）との相関関係が図１４（アミトリブチリン）及び図１５（ノルトリブチリン）に示されている。

上記の如く、アミトリブチリンまたはノルトリブチリンの特異的定量用に蛍光偏光イムノアッセイを実施する場合、トレーサーの検出可能な成分は、蛍光成分（例えば、フルオレセン、アミノフルオレセン、カルボキシフルオレセンなど）、好ましくはアミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、６−カルボキノフルオレセン、５−カルボキシフルオレセン、チオウレア−アミノフルオレセン及びメトキシトリアジツリルーアミノフルオレセンなどの蛍光誘導体である。抗体に結合したトレーサー量は、試験サンプル中に存在するアミトリブチリンまたはノルトリブチリンの量とは逆に変動する。

従って、アミトリブチリンまたはノルトリブチリン及びトレーサーの抗体結合部位に対する相対的でそれ故に特徴的な結合親和性は、アッセイ系の重要なパラメーターである。

通常、蛍光偏光法は、特徴的な波長の平面偏光により励起されたとき、蛍光トレーサーが所与の媒体中のトレーサーの回転比と逆に関連する入射刺激光に対して偏光度を保ちつつ別の特徴的な波長で光（即ち、蛍光）を放出する原理に基づいている。この特性の結果として、例えば、粘性溶液相中などで無理に回転させられたり、または比較的回転比が低い別の溶液成分と結合した場合、トレーサー物質は自由溶液中であっても比較的大きい偏光度の放出光を保持する。従って、配位子及びトレーサーが抗体に結合するのに競合する時間枠内では、トレーサー及び配位子結合速度は、重要な性能パラメーター（例えば、選択性、感受性及び精度）を保持した遊離及び結合トレーサーの好適な割合をもたらすようにする。

本発明のアミトリブチリンの特異的定量用またはノルトリブチリンの特異的定量用の蛍光偏光イムノアッセイを実施する際には、アミトリブチリンまたはノルトリブチリンを含むと考えられる試験サンプルを、本発明の免疫原で製造した抗− 血清の存在に対して検出可能な蛍光偏光応答を産生し得る好適に選択されたそのフルオレセン誘導体の存在下で本発明の免疫原で製造した抗血清と接触させる。

次いで、平面偏光を溶液内を通過させて蛍光偏光応答を得、応答を試験サンプル中に存在するアミトリブチリンまたはノルトリブチリンの量の尺度として検出する。

本発明のアミトリブチリンまたはノルトリブチリン誘導体は、慣用のキャリヤ物質に結合させることにより免疫原を製造し、次いで抗体を得るために使用する。

アミトリブチリン及びノルトリブチリン誘導体も、試験サンプル中のアミトリブチリンまたはノルトリブチリンを定量するためのイムノアッセイ中の検出試薬として作用する標識試薬を製造するのに使用する。

本発明のアミトリブチリン及びノルトリブチリン誘導体は、式ｍ中、Ｐが免疫原性キャリヤである当業界で公知の種々の慣用法により免疫原性キャリヤ物質に結合させ得る。

当業者には理解されるように、免疫原性キャリヤ物質は、これらの任意の慣用の公知方法により選択され得、殆どの場合タンパク質またはポリペプチドであるが、十分な大きさ且つ免疫原性を有する他の物質［例えば、炭水化物、多糖類、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸、核酸など］も使用し得る。免疫原性キャリヤ物質は、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、サイログロブリンなど）であるのが好ましい。本発明の免疫原を使用して、本発明のイムノアッセイで使用するための公知方法により抗体くポリクローナル及びモノクローナル）を製造する。通常、宿主（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、テンジクネズミまたはウマ）に、通常アジュバントとの混合物中の免疫原を種々の部位の一カ所以上に注射する。さらに、最適度に到達したと判断されるまで、抗体量を評価するために採血しながら、一定または不定間隔で同一または別の部位に注射する。抗体は、抗血清を得るために宿主動物を採血するか、またはモノクローナル抗体を得るために公知の体細胞ハイブリダイゼーション法または当業界で公知の他の方法により得、次いで例えば−２０℃で貯蔵し得る。

蛍光偏光イムノアッセイ以外に、本発明のアミトリブチリンまたはノルトリブチリンを定量するために種々の他のイムノアッセイ手順を実施し得る。このようなイムノアッセイ系手順としては、競合的、サンドイッチ及びイムノメトリック（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）法が挙げられるが、これらに限定されない。通常、このようなイムノアッセイ系は、標識または検出可能な成分に結合した本発明の抗体またはそのフラグメントを含む標識試薬を使用して結合量を測定する試験サンプル由来の特異的な被分析物質に結合するための免疫グロブリン（即ち、全抗体またはそのフラグメント）の性能に依存する。このような検出可能な標識としては、酵素、放射性標識、ビオチン、毒素、薬剤、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リポソーム、発色団、化学発光分子、着色粒子及び着色微粒子、蛍光化合物（例えば、アミノメチルフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、アミノフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアシノリルアミノフルオレセンなどの蛍光誘導体）が挙げられるが、これらに限定されない。既に記載の如（、試験サンプルは天然物、人工的に形成した液体、またはその抽出物であってもよく、生物学的試験サンプル（例えば、全血液、血清、血漿、尿、排泄物、唾液、脳を髄液、脳組織など）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、試験サンプルは、試験サンプルの抽出液またはその任意の誘導体であってもよい。

典型的には、このようなイムノアッセイ系手順中の結合量は、検出且つ測定した検出可能な成分量が試験サンプル中の被分析物質量に対応し得る、被分析物質との結合反応に関与したか、または関与しなかった標識試薬中に存在する検出可能な成分量によって決定する。例えば、競合的イムノアッセイ系では、（配位子と参照されることもある）測定される物質は、このような抗体を産生ずるために使用された免疫原と配分した構造的に類似した配位子及びトレーサーの（単数または複数の）部分に特異的な抗体上の結合部位の有限数に関して、（トレーサーと参照されることもある）検出可能な成分に結合した構造的に類似した物質と競合する。治療薬がアミトリブチリンである場合、ノルトリブチリンはアミトリブチリンの代謝物として試験サンプル中に存在するので、アミトリブチリン及びノルトリブチリン量は、本発明のアミトリブチリン及びノルトリブチリン誘導体を個々に使用する別個のイムノアッセイ系で検出するものと理解されたい。

本発明の試験キットは、既に記載の如（、試験サンプル中のアミトリブチリンの定量に関してまたは試験サンプル中のノルトリブチリンの定量に関しては、本発明の所望の特異的蛍光偏光イムノアッセイを実施するのに必要な本質的な試薬をすべて含む。試験キットは、試薬が混和性である場合には組成物または混合物として、必須試薬を保持する１個以上の容器の組み合わせとして市販の包装形に配合されている。特に、アミトリブチリンまたはノルトリブチリンのいずれかの個々の定量に関して上記された免疫原で製造した抗体及び蛍光トレーサー化合物を含む、試験サンプル中のアミトリブチリンの蛍光偏光イムノアッセイ定量または試験サンプル中のノルトリブチリンの蛍光偏光イムノアッセイ定量用の試験キットが好ましい。熱論、試験キットは、従来公知で且つ一般のユーザーの観点からも望ましい他の試薬（例えば、緩衝液、希釈液、標準液など）も含み得るものと理解されたい。

本発明は、本発明を限定しない以下の実施例によりさらに説明されよう。括弧内に含まれた数字は、図面内に使用されている構造式と対応する。

実施例１アミトリブチリン塩酸塩（４）の合成溶液の略号　ＣＨＣｌ３−クロロホルム、Ｍ　ｅ　ＯＩｆ−メタノール、ＤＭＦ −ジメチルホルムアミド、ＣＨ２Ｃｌ２＝塩化メチレン、Ｅｔ２０＝ジエチルエーテル、ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル、１ｌｅｘ＝ヘキサン、Ｔｌ’ｌＦ＝テトラヒドロフラン、ＨＯ＾Ｃ＝酢酸。

アミトリブチリン塩酸塩（１，）（１，００ｇ、　３．１９＋ｓｍｏｌ）をＨｚＯ（２０ｍＬ）に溶解し、６Ｍ　ＮａＯＨでｐＨを１２に調節してＣＨＣｌ３（３Ｘ　２０ｍＬ）で抽出した。ＣＩＣｌ３抽出液を混和し、ブライン（２０１１Ｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、真空下で溶媒除去すると、無色オイル状の遊離塩基（８１５ｏ＋ｇ、　９２％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ。

ＣＤＣ１ｇ）δ７．３−７．　Ｏｆ、　８Ｈ）、　５．８（ｔ、　ＬＨ）、　３．５−２．６（ｍ、　４Ｈ）、　２．３−２、２（ｍ、　４Ｈ）、　２．２（ｓ、　６Ｈ）　；質量分析（ＤＣｌ、　ＮＨｓ）（Ｍ＋Ｈ）’２７８゜クロロスルホン酸（０，３９ｍＬ、　５．９＋ｎａ＋ｏｌ）をＣＨＣｌ５（６，６ｍＬ）に溶解し、次いでＣＨＣｌ５（３，３ｍＬ）中のアミトリブチリン遊離塩基（８１５ｍｇ、　２．９４ｍｍｏｌ）の撹拌した一１５℃の溶液に滴下添加した。

得られた黄色溶液を５０℃に温め、この温度で３時間撹拌し、続いて氷水（５０ｍＬ）に注ぎ、５Ｍ　ＮａＯＨでｐＨを１０に調節し、そしてＣＩ（Ｃ１ｓ　（１５１１＋Ｌ）で洗浄した。水性部分を単離し、真空下でＨ２Ｏを除去（トルエン／ＭｅＯ）１と共沸）し、得られた白色固体をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）ですり砕き、真空濾過し、濾液を真空下で除去すると、白色固体状の所望のスルホン酸のナトリウム塩（２）（８８７ｍｇ、　７９％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤ３０Ｄ）δ７、６−７、０（ｍ、　７Ｈ）、　５．８（ｔ、　ＩＨ）、　３．６−３．２（ｍ、　４Ｈ）、　３．１−２．７（＋、　４１１）。

２、５（ｓ、　６Ｈ）　；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）’３５８ナトリウム塩（２）　（８３４ｍｇ、　２．２０＋ｕ＋ｏｌ）を五塩化リン（９１６ｍｇ。

４、４０ｍｍｏｌ）と混合し、９０℃に加熱し、その温度で２５分撹拌した。冷却後、反応混合物をＣＩＣｌ３抽出液（６で希釈し、氷水（４０ｍＬ）中に注ぎ、６Ｍ　Ｎａ０Ｉｌ（１，２ｍＬ）で処理し、ＣＨＣｌ　３（３Ｘ４０ｍＬ）で抽出した。ＣＨＣｌ３抽出液を混和し、ブライン（飽和ＮａＣ１水溶液）（４０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、真空下で溶媒を除去すると、所望のアリールスルホニルクロリド（３）（６６７１！１ｇ、　８１％）が得られた。’ ＨＮＭＲ（２００）ｌＨｚ、ＣＤＣｌ５）δ　８．０−７．０（ｍ。

７）１）、　５．９（ｔ、　ＩＨ）、　３．５−３．２（ｍ、　２１１）、　３．２−２．９（ｍ、　２Ｈ）、　２．８−２．６（ｍ。

６Ｈ）。

アリールスルホニルクロリド（３）（１７７＋ｎｇ、　０．４７０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１，１ｍＬ）に溶解し、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝　７．８）（６，８ｍＬ）に溶解したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、　４００ｍｇ、　０．００５８３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に滴下添加した。３．５時間撹拌後、反応混合物を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝　７．８）　（２Ｌ）で１６時間透析し、次いでＨ２Ｏ（８Ｘ２Ｌ）で透析した。凍結乾燥後、所望の免疫原（４）　（３８９ｍｇ）が得られた。

実施例２アミトリブチリン免疫原（１１）、（１２）及び（１３）の合成アミトリブチリン塩酸塩（１）（１２，７ｇ、　４０．６ｍｍｏｌ）を１１□０（２５ＯｍＬ）に溶解し、６Ｍ　ＮａＯＨでｐ）１を１２に調節し、ＣＨＣｌ５（３Ｘ２５０＋ｏＬ）で抽出した。ＣＨＣｌ３抽出液を混和し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空下で除去した。得られたアミトリブチリン遊離塩基（オイル）をＣＨＣｌ　３（１６ｍＬ）に溶解し、−１５℃に冷却した。ＣＨＣｌ３　（１６ｍＬ）中のクロロスルホン酸（４，８＋Ｌ、　７２ｍａ＋ｏｌ）を滴下添加し、次いで反応混合物を５０℃で３時間撹拌し、室温に冷却し、氷水（３８０ｍＬ）に注ぎ、６Ｍ　ＮａＯＨでｐｌ＋を９−ＩＯに調節し、ＣＨＣＩｓ（１３０ｍＬ）で洗浄し、真空下でＨ２Ｏを除去（トルエン／ＭｅＯＨと共沸）した。得られた白色固体をＭｅＯＨ（２００ＩｇＬ）ですり砕き、真空濾過し、真空下で溶媒を除去すると、アミトリブチリンの少なくとも４種類のスルホン酸異性体を含む白色固体が得られた。Ｅ−２、Ｅ−３、Ｚ−３異性体を分取逆相Ｃ，８ＨＰＬＣでＨ２０／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ（５０１５０１０，４）で溶離して単離すると、白色固体のＥ−２−アミトリブチリンスルホン酸（５）（１，５９ｇ、　１１％）’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ　７．４１−７．１０（＋、　７１１）、　５．７８（ｔ、　ＩＨ）。

３、４５−３．１３（ｍ、　４Ｈ）、　２．９５−２．６２（ｍ、　８Ｈ）、　２．５５−２．２５（ｍ、　２Ｈ）　；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）”３５８　；白色固体のＥ−３−アミトリブチリンスルホン酸（６）（２，３５ｇ、　１６％）’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ　７．４１−７．１０（ｍ、　７■）、　５．７８（ｔ、　ＩＨ）、　３．４５−３．１３（ｍ、　４ｔｌ）、　２．９５−２．６２（ｍ、　８Ｈ）、　２．５５−２．２５（ｍ、　２Ｂ）　；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）”３５８　；及び白色固体のＺ−２−アミトリブチリンスルホン酸（７）（１，８８ｇ、　１３％）’ＦＩ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）６７．４１−７．１０（ｍ、　７Ｈ）、　５．７８（ｔ、　ＩＨ）。

３、４５−３．１３（ｍ、　４１１）、　２．９５−２．６２（ｍ、　８１）、　２．５５−２．２５（ｍ、　２Ｈ）　；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）”３５８がそれぞれ得られた。

酸（５）（４８ｍｇ、０．１３４ｍａ＋ｏｌ）及び塩化チオニル（０，８ａＬ、　１１ｍｍ。

ｌ）を混合すると不均質な混合物となり、これを７０℃に１時間加熱すると均質な溶液が得られ、これを真空下で溶媒を除去すると、固体の塩化スルホニル（８）が得られた。

塩化スルホニル（８）をＤＭＦ（１，５ａＬ）に溶解させて、ウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）（１５０ｍｇ、　０．００２２１ｍｍｏｌ）／リン酸塩緩衝液（７ａＬ）／ＤＭＦ（１，５ａＬ）の溶液に添加し、２．５日間撹拌した。反応混合物を０．１Ｍリン酸ナトリウム（＋）Ｈ＝　７．８）（２Ｌ）で１６時間、次いでＮ２０［２Ｌずつ（１４時間、５時間、５時間、１４時間及び６時間）］で透析した。凍結乾燥後、所望の免疫原（１１）（１４０ｍｇ）が得られた。

アミトリブチリン免疫原（１２）及び（１３）を、各々酸（６）及び（７）から同様の方法で製造した。

実施例３ノルトリブチリン免疫原（１８）の合成アリールスルホニルクロリド（３）（５，１６ｇ、　１３．７ｍｍｏｌ）をＣｌ１Ｃ１３（２０１Ｌ）に溶解させ、グリシンメチルエステル塩酸塩（３，４５ｇ、　２７．５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ、　６．７ａＬ、　４８ｍｍｏｌ）及びＣ肛１ｓ（２０ａＬ）の撹拌混合物に滴下添加した。反応混合物をＮｚ下でさらに３０分撹拌し、次いで真空濾過し、濾液の溶媒を真空下で除去した。粗な生成物をカラムクロマトグラフィーでＣＨｚＣ１ｚ／１ｌｅＯＨ（９０／１０）で溶離精製すると、所望の生成物（１４）（１，５３ｇ、　２６％）が得られた。’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣ１，）δ　７．０９−７．８８（＋ａ、　７８）、　５．９０−６．００（ｍ、　１■）、　３．７１−３．８０（ｍ、　２Ｈ）。

３、５９（ｓ、　３Ｈ）、　２．６５−３．４８（ｍ、　４Ｂ）、　２．３４− ２．６３（Ｉｌｌ、　４Ｈ）、　２．２４（ｄ、　６１１）；質量分析（ＤＣＩ、　ＮＨｓ）（Ｍ＋Ｈ）”４２９゜エステル（１４）（１，４２ｇ、　３．３１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１゜８５＋ａＬ、　１３．３ｍｍｏｌ）をＣＨＣＩｓ（１０ａＬ）中で混和し、次いでＮ２下で反応混合物を撹拌しながら２．２．２−トリクロロエチルクロロフォーメート（１，８２ｍ１．１３．３ｍｍｏｌ）を滴下添加した。Ｎ、下でさらに３時間撹拌後、反応混合物をＥｔ２０（６０１Ｌ）で希釈し、０．５Ｍ　ＨＣＩ（２Ｘ６０ｍＬ）、１ｈＯ（６ｈＬ）及びブライン（６０ａＬ）の順で洗浄し、続いてＭｇＳＯ４で脱水して真空下で溶媒を除去した。

得られたオイルをカラムクロマトグラフィーでＥｔＯ＾ｃ／Ｈｅｘ（３０／７０）で溶離精製すると、白色固体の所望の化合物（１５ａ）（１，ｌ１ｇ、　４４％）が得られた。’　ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、　ＣＤＣｌ５）６８．０３−７、７７（ｍ、　２Ｈ）、　７．４５−７．０３（ｍ、　５Ｈ）、　６．０３−５．８８（ｍ、　ＩＨ）、　４．８５−４．５１（ｍ、　６Ｈ）、　３．７８（ｓ、　３旧、　３．６２−３．２４（＋ｏ、　４Ｂ）、　３．１４−２．７３（ａ＋、　５Ｈ）。

２、６０−２．３４（ｍ、　２Ｈ）　：質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ−Ｈ）”７６４゜エステル（１５ａ）（１，０９ｇ、　１．４２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（９ａＬ）に溶解し、亜鉛粉末（２，１８ｇ）を添加し、１Ｍリン酸ナトリウム（ｐｌ［＝　５．５）（１，８ａＬ）を添加し、反応混合物を２０時間撹拌した。次いで反応混合物を真空濾過し、濾液の溶媒を真空下で除去し、トルエン／ＭｅＯＨ（５０１５０）と共沸した。得られた残渣をＣＨＣｌ５／ＭｅＯｔｌ（８０／２０）　（２５ａＬ）ですり砕き、濾過し、濾液の溶媒ヲ真空下で除去すると、所望のノルトリブチリン誘導体（１５ｂ）（８２３ｍｇ）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣ１３−ＣＤ３０Ｄ）δ８．１−７、０（ｍ、　７８）、　６．２−５．８（ｍ、　ｌｌ’ｌ）、　３．８−３．７（ｍ、　２Ｈ）、　３．６（ｓ、　３Ｂ）、　３．５−３、２（ｍ、　４Ｈ）、　３．１−２．９（ｍ、　２Ｈ）、　２．９−２．５（＋＋＋、　５Ｈ）　：質量分析（ＤＣＩ。

Ｎｌ（３）（Ｍ＋Ｈ）’４１５遊離アミン（１５ｂ）（４００ｍｇ、０．９６５ｍｍｏｌ）をＣＨＣＬ３（３ａＬ）に部分溶解させ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（０，５４ａＬ、　３．９１１１ｍｏｌ）を添加し、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（ＢＯＣ−０−ＢＯＣ）　（８５０ｍｇ、　３．９■ｏｌ）を添加し、反応混合物をＮ２下で１７時間撹拌した。反応溶媒を真空下で除去し、得られた粗なオイルをカラムクロマトグラフィーでＥｔＯ＾ｃ／Ｈｅｘ（３０／７０）で溶離精製した。この生成物をシリカゲル（２＋ｍ）の分取ＴＬＣプレートでＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ（５０１５０）で２回目の溶離精製をすると、所望のＮ−ＢＯＣ保護化合物（１５ｃ）（９７ｍｇ、　２０％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＩＩｚ、ＣＤＣｌ５）６７、８ −７．０（ｍ、　７Ｈ）、　５．８（ｔ、　ＩＦＩ）、　３．８−３．７（Ｌ　２Ｈ）、　３．６（Ｓ、　３Ｈ）。

３、５−３．２（ｍ、　４１１）、　２．９−２．６（ｍ、　５Ｈ）、　２．５ −２．３（ｍ、　２１１）、　１．６−１．２（ｍ。

９Ｈ）；質量分析（ＤＣＩ、　ＮＨ３）（Ｍ＋Ｈ＋ＮＨ３）”５３２゜化合物１５ｃ（８５ｍｇ、　０．１７ｍｍｏｌ）を１ｌｅＯＨ（１，３ａＬ）に溶解し、１０％Ｎａ０Ｈ（０，６０ａＬ）を添加し、次いで反応混合物を３０分撹拌した。次いで反応混合物をＬＯ（１０ａＬ）で希釈し、ＩＭ　ＨＣＩでｐＨを４に調節し、ＣＨＣＩｇ（３Ｘ１０ｎ＋Ｌ）で抽出した。ＣｌｌＣｌ、抽出液を混和し、ブライン（１０ａＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空下で除去すると、所望の遊離酸（１６）（８３ｍｇ、　１００％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣ１５）δ７．８−７．０（ｍ、　７８）、　６．０− ５、８（ｍ、　ＬＨ）、　３．８−３．７（ｍ、　２■）、　３．５−３．２（ｍ、　４Ｈ）、　３．２−２．７（ｍ、　５Ｈ）。

２、５−２．３（ｍ、２Ｈ）、　１．４（ｓ、　９Ｈ）　；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）”５０１゜遊離酸（１６）（５９ｍｇ、　０．１２＋＋ｍｏｌ）をＤＭＦ（０，５５ａＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）（１６ｍｇ、　０．１４ａ＋ｍｏｌ）を添加し、１．３−シンクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　（２ｈｇ、　０．１４ｍｍｏｌ）を添加し、■−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）水和物を触媒量添加し、次いで反応混合物をＮ２下で６．５時間撹拌した。次いで反応混合物を濾過し、濾液をＯ，１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝　７．８）（３，４ｍＬ）及びＤＭＦ（０，９０ａ＋Ｌ）中に溶解したウシ血清アルブミン（２００■ｇ、　０．００２９ｍｍｏｌ）に添加した。

この反応混合物を１６時間撹拌し、次いで０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．釦（２Ｌ）で２時間、次いで）＋２０（８Ｘ２Ｌ）で透析した。凍結乾燥後、所望のＮ−ＢＯＣ免疫原（１７）（２１８＋ｎｇ）が得られた。

Ｎ−ＢＯＣ免疫原（１７）（２００ｍｇ）にＣＨ２Ｃｈ（１０ｉＬ）、続いてトリフルオロ酢酸（ＴＦ＾）（１０ｉＬ）を添加した。５分間撹拌後、溶媒を真空下で除去し、残渣、ｄｏ、ｎｉミリンナトリウム（ｐＨ＝７、８）（５０ｉＬ）に再溶解させ、得られた濁った溶液を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝　７．８）（２＋、）で１６時間、続いテＨｚＯ（７Ｘ２Ｌ）で透析した。凍結乾燥後、所望のノルトリブチリン免疫原（１８）（１３１ｍｇ）が得られた。

害施例↓ ノルトリブチリン免疫原（２２）、（２３）及び（２４）の合成塩化スルホニル（８）をＣＨＣｌ　ｓ　（３０ｉＬ）に溶解し、ＣｌｌＣｌ　３（３０ｉＬ、）中のグリシンメチルエステル塩酸塩（３，７７ｇ、　３０．０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（６，３ｍＬ、　４５ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に添加した。

トリエチルアミン（２，１ｍ１７．１５ｍｍｏｌ）をさらに添加し、反応混合物をＮ２下で３日間撹拌した。次いで反応混合物をＣＨＣｌ。

（３００ｍＬ）ｉ：注ぎ、０．５１　Ｋ２ＣＯ２（２ｘ１００１１Ｌ）及びブライン（１００ｍＬ）で順に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ２で脱水し、溶媒を真空下で除去した。

得られた粗な残渣をカラムクロマトグラフィーでＣ■、Ｃ１２／ＭｅＯＨ（８５／１５）で溶離精製すると、所望のエステル（１９）（４，０８ｇ。

７３％）が得られた。’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）δ　７．５９（ｄ、　１Ｂ）。

７、５３（ｓ、　ＩＨ）、　７．４１（ｄ、　ＬＨ）、　７．２７−７、１０（ａ＋、　４８）、　５．９３（ｔ、　１Ｂ）、　３．７２（ｓ、　２Ｈ）、　３．５８（ｓ、　３Ｈ）、　３．４８−２．７０（ａ＋、　４Ｈ）、　２．４８− ２．２５Ｃ＋＋＋、　４Ｈ）、　２K １９（ｓ、　６Ｈ）　；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）”４２９゜ＣＨＣＩｓ（９ｍＬ）中の２．２．２−　トリクロロエチルクロロフォーメート（５，２ｍＬ、　３８ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下でＣＨＣＩｇ（３０ｉＬ）中のメチルエステル（１９）（４，０３ｇ、　９．４０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５，２ｍＬ。

３８ｍｍｏｌ）の撹拌した０℃溶液に滴下添加した。反応混合物を室温で４．５時間撹拌し、次いでＥｔｚｏ（１８０ｍＬ）で希釈し、０．５Ｍ　ＨＣＩ（２Ｘ１８０ｎＬ）、ＨｚＯ（１８０ｍＬ）及びブライン（１８０ｍＬ）の順で洗浄し、Ｍｇ５Ｏ，で脱水し、溶媒を真空下で除去した。得られた残渣をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーでＥｔＯ八ｃへＨｅｘ（３０／７０）で溶離精製すると、所望の保護アミン（２０ａ）（３，２１ｇ、　４５％）が得られた。’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）δ　７．９０−７、７５（ｍ、　２Ｈ）、　７．４１（ｄ、　ＬＨ）、　７．３０−７．１４（ｍ、　３１１）、　７．１４ −７．０５（０１，ＩＩＩ）、　５．９７−５．８５（ｍ、　ＩＨ）、　４．８０−４．５０（ｍ、　６Ｈ）、　３．７７（ｓ、　３旧、　３．６５−３．２０（＋ａ、　４Ｈ）、　３．１０−２．７０（ｍ、　５Ｈ）、　２．６０−２．３０（ｍ、　２Ｂ）　；質量分析（ＦＡＢ）（殖＋）ｌ）’７６５゜ニスデル（２０ａ）（３，１７Ｌ４．１４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２７ｉＬ）に溶解させ、亜鉛粉末（６，３４ｇ）を添加し、ＩＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ＝　５．５）（５，４ｗ＋Ｌ）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。次いで反応混合物を濾過し、濾液の溶媒を真空下で除去（トルエン／Ｍｅ（ＩＨと共沸）シた。粗な残渣をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで２種類の主な不純物が除去されるまでＴ　ＨＦ　、／ＭｅＯＨ′ＮＨ４０Ｈ（８５／１５　’０．４）で溶離精製し、次いでＴ）ＩＦ／ＭｅＯＨ／′ＮＨ４０８（７５，２５□０４）で溶離すると、所望の第２級アミン（２０ｂ）（１，４０ｇ、　８１％）が得られた。’ＩＮ捕Ｒ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣ１３−ＣＤ、０Ｄ）６７、７−７、４（ −、３Ｈ）、　７．３−７．１（ＩＩ、　４Ｈ１５，９（ｔ、　１Ｂ）、　３．７（ｓ、　２Ｈ）、　３．６（ｓ、　３）１）、　３．５−３．３（ｍ、　２Ｈ）、　３．２−２．８（ａ、４Ｈ）、２．７−２．４（＋ｏ、５Ｈ）：質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋１“４１５゜アミン（２０ｂ）（１，３７３ｇ、３．３１ｍｍｏｌ’）をＤＭＦ（１１＋＊Ｌ）に溶解させ、ジーｔ−プチルシカーホネート（７９５■ｇ、　３．６４ｓｉ＋ｏｌ）を添加し、トリエチルアミン（０，５５ｉＬ、３．９ｍｍ＋（−１１）を添加し、次いでＮ２下で１６時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をシリカゲル（１’）カラムクａ　マドグラ７．４−でＥｔＯＡｃ、　１ｌｅｘ（５０１５０）で溶離精製すると、所望のＢＯＣ−保護アミン（２０ｃ）（１，Ｏｌｇ、　５９％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）δ７．７− ７、４（ｍ、　３Ｈ）、　７．３−７、１（ｍ、　４Ｈ）、　５．９（ｔ、　ＩＨ）、　３．７（ｄ、　２Ｈ）、　３．６（ｓ、　３Ｈ）、　３．５−３．２（ａ＋、４Ｈ）、　３．１−２．８（ｍ、　２０）、　２．７（ｓ、　３Ｈ）、　２．４−２．３（ａ、　２Ｈ）、　１．５−１．２（ｍ、　９Ｈ）、質量分析（ＤＣｌ、　ＮＨａ）（Ｍ＋ＮＨ４）”５３２゜保護アミン（２０ｃ）（９８３ｍｇ、　１．９１ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１８，３ｍＬ）に溶解し、１０％ＮａＯＨ水溶液（６，１＋Ｌ、　１５ｓｉ＋ｏｌ）を添加し、反応混合物を２０分撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ（７５ａＬ）で希釈し、ＩＭ■ＣｔでｐＨを３−４に調節し、ＣＨＣｈ（３Ｘ７５ｍＬ）で抽出した。ＣＨＣｌ５抽出物を混和し、ブライン（７５ｉＬ）で洗浄し、Ｎａ、ＳＯ，で脱水し、真空下で溶媒を除去すると、所望の酸（２１）（９５５１ｇ＋　１００％）が得られた。’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣ１５）δ　７．７−７、４（！ｌ、　３Ｈ）。

７、３−７．０（ｍ、　４Ｈ）、　５．９（ｔ、　ＩＨ）、　３．７（ｄ、　２Ｈ）、　３．５−３．２（ｍ、　４Ｈ）、　３．２−２、８（ｍ、　Ｈ）、　２．７（ｓ、　３Ｂ）、　２．５−２．３（ｍ、　２Ｈ）、　１．５−１．２（ｍ、　９Ｂ）　；質量分析（ＦＡＢ）　（Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ）　”５２３゜酸（２１）（５２ｍｇ、　０．１０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０，５０１１ＩＬ）に溶解させ、Ｎ−ヒドロキシス多シンイミド（ＨＯ３ｕ）（１４ｍｇ、　０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、１．３−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２５ｍｇ、　０．１２ｍｍｕｌ）を添加し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）水和物の触媒量を添加し、反応混合物をＮ２下で５時間撹拌した。

次いで反応混合物を濾過し、濾液を０．１Ｍリン酸ナトリウムｃｐｎ＝７釦（３，５ｍＬ）及びＤＭＦ（０，９＋＋Ｌ）に溶解したウシ血清アルブミン（１７１ｍｇ、　０．００２６ａ＋ｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。この反応混合物を１６時間撹拌し、Ｏ，１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７、８）（２Ｌ）で２時間、次いでＨ，０［２Ｌずつ（１４時間、４時間、４時間、１４時間、６時間）］で透析した。凍結乾燥後、所望のＮ−ＢＯＣ免疫原（１９５ｍｇ）が得られた。

中間体Ｎ−ＢＯＣ免疫原（１８６ｍｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ＩｌｌＬ）中、次いでトリフルオロ酢酸（ＴＦ＾）（１０ｓＬ）中においた。５分間撹拌後、溶媒を真空下で除去し、残渣を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７、８）（５０ｓＬ）に再溶解し、得られた濁った溶液を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．８）（２Ｌ）で１６時間、続いて１１２０［２Ｌずつ（１４時間、４時間、５時間、１４時間、６時間）］で透析した。凍結乾燥後、所望のノルトリブチリン免疫原（２２）　（１１８ｍｇ）が得られた。

ノルトリブチリン免疫原（２３）及び（２４）を各塩化スルホニル（９）及び（１０）から同様の方法で製造した。

実施例５アミトリブチリントレーサー（２７）の合成イミブラミン塩酸塩（２５）（２，２１ｇ、　６．９７ｍｍｏ１）をＩ１２０（３５ｓＬ）に溶解させ、６Ｍ　ＮａＯＨテ塩基性ニジ、ＣＨＣＩａ（３Ｘ３５ｍＬ）”Ｃ’油抽出た。ＣＨＣｈ抽出液を混和し、ブライン（３５ｓＬ）で洗浄し、Ｎａ、、ＳＯ４で乾燥し、溶媒を真空下で除去すると、所望のイミプラミン遊離塩基（１，９５ｇ）が得られた。

’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ、）６７．２−７．１（ｍ、６Ｂ）、７．０−６．８（ｓ＋、２Ｈ）、３．８（ｔ、２０）、３．２（ｓ、４Ｈ）、　２．３（ｔ、　２０）、　２．１（ｓ、　６Ｂ）、　１．７（ｐ、　２Ｈ）。

イミプラミン（２６ａ、　１．９２５ｇ、　６．８７ｍｍｏｌ）を酢酸（３２ｓＬ）に溶解させ、１８℃に冷却した。反応混合物を１７−１８℃に保持し、撹拌しながら酢酸（１，Ｉｗ＋Ｌ）中の濃硝酸（０，７９＋Ｌ、　１３ｓ＋ｓ＋ｏｌ）を滴下添加し、次いで反応混合物をその温度でさらに２０分間撹拌した。次いで反応混合物を０．１５Ｍ　ＢＣＩ０３０ｍＬ）に注ぎ、Ｅｔ２０（２×８５１１Ｌ）で洗浄し、続いて濃ＮａＯＨでｐｏを１３に調節し、ＣＨＣｌｚ（４ＸｌＯｈＬ）で抽出した。ＣＨＣｌ３抽出液を混和し、ブライン（８５■Ｌ）で洗浄し、Ｎａ　２ＳＯ、で脱水し、真空下で溶媒を除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーでＴＨＦ／Ｈｅｘ／ＮＨ４０Ｈ（７０，’３０１０．４）で溶離精製すると、赤いオイル状の所望の２−二トロイミプラミン（２６ｂ）（１，１４５ｇ、　５１％）が得られた。’ＨＮＩｉＲ（２００ｋｌＨｚ、　ＣＤＣｌ　：ｌ　）６８．０−４．９（ｍ、　２８）、　７．３−７．０（ｍ、　５Ｈ）、　３．９（ｔ。

２Ｈ）、　３．２（ｓ、　４１（）、　２．３（ｔ、２Ｈ）、　２．１（ｓ、　６Ｈ）、　１．７（ｐ、　２Ｈ）　：質量分析（Ｆ、へＢ）（ｋｌ＋Ｈ）”３２６゜２−ニトロイミブラミン（２６ｂ、　５５２ｍｇ、　１．７０ｍｍｏｌ）を無水ＥｔＯＨ（２０ｓＬ）に溶解し、炭素」二の１０％パラジウム（５５ｍｇ）を添加し、反応混合物を１（２（ボンベ圧力）下で３．５時間撹拌した。次いで反応混合物をセライトを通して濾過し、濾液の溶媒を真空下で除去すると、薄黄色オイル状の所望の２−アミノイミプラミン（２６ｃ）　（４９９ｍｇ、　９９％）が得られた。ＩＩ　ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣ１３）６７．２−７．０（ｍ、　３１１）、　６．９−６．８（ｍ、　２Ｈ）、　６．５−６．４（ｍ、　２Ｈ）、　３．７（ｔ、　２Ｈ）、　３．２−３．０（ｍ、　４Ｈ）、　２．３（ｔ、　２１り、　２．１（ｓ、　６Ｈ）、　１．７（ｐ、　２８）　；質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）’２９６゜６−カルボキンフルオレセン（１，００ｇ、　２．６６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯ３ｕ）（３０６ｍｇ、　２．６６ａｍｏｌ）を添加し、１．３−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　（５４９ｍｇ、　２．６６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を暗所でＮ２下１７時間撹拌した。続いて反応混合物を真空濾過し、濾液を２−アミノイミプラミン（２６ｃ）（７８４ｍｇ、　２．６５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０，５６ｓＬ、　４．０ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（４，０ｍＬ）と混合し、暗所でＮ２下で４時間撹拌した。反応溶媒を真空下で除去し、残渣を逆相Ｃ１８分取（１ｍｍ）ＴＬＣプレート上でＨ，０／ＴＨＦ／ＨＯＡｃ（４０／６０１０４）、続いてｆａｔｅｒｓ　ｍｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１ｇカラム（１９ｍ＋ｏｘ１５０ｍｍ）で１１２０／月ＩＦ／）１０＾ｃ（３５／６５１０．４）で流速７．０ｍＬ／分で溶離精製すると、橙色の粉末状の所望のトレーサー（２７）　（４１０ｏ＋ｇ、　２４％）が得られた。質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋ｌＩ）’６５４゜実施例６ノルトリブチリントレーサー（３０）の合成酸（２１）（４６６ｍｇ、　０．９３１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３°−スルホネート（ｆｏｏｄｗａｒｄ’ｓ試薬Ｋ）　（２５９ｍｇ、　１．０２ｍｍ＋ｏｌ）を添加し、トリエチルアミン（０，１９５ｓＬ、　１．４０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をＮｚ下で４０分撹拌した。続いて、アミノメチルフルオレセン塩酸塩（３７０ｍｇ、　０．９３１ｍｍｏｌ）、続いてトリエチルアミン（０，６５０ｓＬ。

４．７ｍｍｏ］、）を添加し、反応混合物を暗所でＮ２下で１７時間撹拌した。

次いで、溶媒を真空下で除去し、残渣をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーでＣＨｚＣ１ｚ／ＭｅＯＨ（９５１５）で主な最初に溶離する不純物を除去するまで溶離精製し、続いてＣＨｚＣ１２／ＭｅＯＨ（８０／２０）で溶離すると、橙色の固体状の所望のＮ−ＢＯＣ保護ノルトリブチリントレーサー（２８）（３７９ｍｇ、　４８％）カ得られた。質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）　”８４４゜Ｎ−ＢＯＣノルトリブチリントレーサー（２８）（３６２ｍｇ、　０．４２９ｍｍ。

１）をＣＨ２Ｃｌ２（４，３ｍＬ）中で撹拌し、トリフルオロ酢酸（４，３ｍＬ）を添加し、反応混合物を５分間撹拌し、溶媒を真空下で除去した。残渣をＣ■ ｚｃ１２／ＭｅＯＨ（５０１５０）（１０ｍＬ）ｌ：再溶解シ、トリエチルアミンでｐＨを７に調整し、溶媒を真空下で除去した。得られた粗な生成物を逆相Ｃ＋Ｓ分取（１ｍａ＋）ＴＬＣプレート上で、Ｈ２０／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ（１５／８５１０．４）で溶離精製すると、橙色の固体の所望のノルトリブチリントレーサー（２９）　（３８８ｍｇ）が得られた。質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）’ ７４４゜実施例７アミトリブチリントレーサー（３０）の合成塩化スルホニル（３）（８４ｍｇ、　０．２３ｍ＋＋＋ｏｌ）をＤＭＦ（０，５ｍＬ）／　トリエチルアミン（１８６ｍＬ、　１．３６ｍｍｏｌ）に溶解させ、アミノメチルフルオレセン（３０ｍｇ、　ｏ、　０７５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を窒素下で３．５時間撹拌した。溶媒を真空下で除去すると、粗な橙色の固体（１４８ｍｇ）が得られ、これをＣ１８分取ｔｉｃプレート−にで精製すると、所望のトレーサー（３０）（１４，１ｍｇ）が得られた。質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）’７０１゜実施例８ノルトリブチリントレーサー（３１）の合成ｌ・リエチルアミン（０，２１ｍ１．、１．５２ｍｍｏｌ）をＮ−ＢＯＣ保護カルボン酸（２１）（２５ｍｇ、　０．０５０ｍｍｏｌ）／Ｗｏｏｄｖａｒｄ’　ｓ　Ｋ（１４ｍｇ、　０．０５５ｍｍｏ１．）／ＤＭＦ（０，５ｍＬ）の溶液に添加し、３５分撹拌し、アミノメチルフルオレセン（２０ｍｇ、　０．０５０ｍ１ｏｌ）をトリエチルアミン（０，２１ｍＬ、　１．５２ｍｍｏｌ）と−緒に添加した。反応混合物を窒素下で暗所で１８時間撹拌し、溶媒を真空下で除去すると、橙色の固体が得られ、これを分取ｔ１ｃプレート上で精製すると、所望のＮ’−ＢＯＣ保護中間体（２１ｍｇ）が得られた。質量分析（ＦＡＢ）（Ｍ）’８４４゜Ｎ’−ＢＯＣ保護中間体（２０ｍｇ、　０．０２４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０，５０ｍＬ）中に溶解させ、トリフルオロ酢酸（０，５０ｏ＋Ｌ）を添加し、反応混合物を５分間撹拌し、得られた溶液を蒸発転層させた。固体をＣＨ２Ｃｌ　２　（０，５ｍＬ）及びトリエチルアミン（０，５＋ｎＬ）に溶解させ、溶媒を真空下で除去すると、橙色の固体が得られ、これをＣｔｓ分取ｔｉｅプレート上で精製すると、所望のトレーサー（３１）（９，０ｍｇ）が得られた。質量分析（ＦＡＢ）　（Ｍ＋Ｈ）“７４４゜実施例９抗血清の産生ウサギを最初に免疫原（ｌａ＋ｇ）で免疫感作し、続いて応答が成熟（〜１２− １５週）するまで免疫原（０，５ｍｇ）で追加免疫し、その後、動物を４週間毎に免疫原（０，２１１＋ｇ）で追加免疫した。

動物を２週間口で出血させ、ブリードを力価滴定して適当な希釈で好適な置換及び結合を示す抗血清集団を選択する。

アミトリブチリンに関しては、典型的なプールを１対４５に希釈したものは、２１０ミリ偏光単位（ｗ＋Ｐ）の結合及びｌ＋ｏＬ当たり１１００ｎのアミトリブチリンを含むアミトリブチリン溶液にｉｔ　Ｌ約９５ｍＰの置換を有し、ノルトリブチリンに関しては、典型的なプールを１対２５０に希釈したものは、約２１０ミリ偏）１位の結合及び１ｍＬ当たり１１００ｎのノルトリブチリンを含むノルトリブチリン溶液に対し約１２０ＩＰの置換を有アミトリブチリンに関する蛍光偏光イムノアッセイ実施例１に記載の如くアミトリブチリン免疫原（４）で免疫感作した６匹のウサギからの血清を混合することにより抗血清を製造した９、個々の動物中の力価変動は３０％以下で、全ての動物は成熟免疫応答（＋ａｔｕｒｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｎｎｓｅ）（１種類の免疫原で６力月以上）を示した。使用した免疫原は′ｐな（とも２種類の８１１個の合成製剤から得たもので、力価、水続性（ａｂｉｄｉｔｙ）（曲線特性）及びノルトリブチリンに対する交差反応（５０％偏向に於いて＜１０％）によって判定される限り同等の応答を与えた。生抗血清を混合し、７０ｏ６リン酸でｐＨを４．５に調節した０、　１００Ｍクリシルグリシンからなる緩衝液中に希釈した。アッセイ進行中、抗血清をＴＤｘ系試薬緩衝液でＴＤｘ系に希釈し、終濃度を１　：４．　ｏｏｏとした。

実施例５に記載されている蛍光トレーサー（２７）を、十分量の塩化ナトリウム及びチオ硫酸ナトリウムを各々１．０％及び０．１％濃度に溶解した、２５％ジメチルホルムアミド、２５％グリセロール及び５０％蒸留水からなる溶液中に乾燥試薬を希釈して製造した。このトレーサー試薬ストック溶液をアッセイで使用するための同一希釈マトリックス中に濃度〜８２ｎ旧こ希釈した。アッセイ進行中、この希釈トレーサー製剤をさらにＴＤｘ系試薬緩衝液で希釈して終濃度を〜１．　ＯｎＭとした。

各試験の分析用サンプルをオフライン多段階二相抽出方法により製造した。１．２５ｍＬポリプロピレン試験管にサンプル（０，２００ｍＬ）を添加した。この試験サンプルを、０．２５Ｎ水酸化ナトリウム（０，１００ｍＬ）及びイソアミルアルコール（０，０２０ｍＬ）を添加して塩基性にした。この溶液を混合して、室温に５分間放置した。５分後、ｎ−デカン（０，５０ｈＬ）をサンプルに添加して、１．０分渦動させて混合した。渦動後、サンプルを〜８．０００Ｘｇで５．０分間、遠心分離した。５．０分の遠心分離後、上清（上部相）　（０，２００ｍＬ）を取って０．１００Ｍグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ３）／アセトニトリル溶液（９：　ｌ）　（０，２００ｍＬ）を含む１．２５ｍＬの第２のポリプロピレン試験管にいれた。係属中の米国特許出願第６２７．２８２号（１９９０年１２月１４日出願）に記載の如く、この時点で予備処理した溶液（Ｚ試薬＝水性クロラミン−Ｔの１０μｇ／ｍＬ溶液）（０，０４０ａ＋Ｌ）を加え、溶液を１．０分渦動させて混合し、第２の試験管からの下部相（５０〜０、１００ｗＬ）をＡｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ（登録商標）アナ−７／ｌ’ザーノサンプルウエルに移した。

試験容量（０，０２０１ｎＬ）を希釈抗血清（０，０２５ｍＬ）及び希釈蛍光トレーサー（０，０２５ｍＬ）と混合したサンプルをＴＤｘアナライザーの標準プロトコルに従って実施した。アッセイ実施終了時の結果をミリ偏光単位（ｍＰ）で表す。ミリ偏光単位は自動的に保存標準曲線（ｓｔｏｒｅｄ　５ｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ）（表８）から内挿され、濃度（ｎｇ／ｍＬ）として表される。

アッセイ用のサンプル製造方法ではサンプルを３倍に希釈しているので、（保存曲線は加重平均した４つのパラメーター曲線の接合により構成されている）較正試料の重量濃度は、表示公称濃度の１／３である。較正試料は、Ｏ，１００Ｍグリシルグリシン（ｐＨ３）を含む緩衝液中の重量希釈により製造した。これらをオフラインサンプル処理（二相抽出）を実施せずにＴＤｘアナライザーに直接導入する。

実施例１１ノルトリブチリンに関する蛍光偏光イムノアッセイ実施例３に記載の如く、ノルトリブチリン免疫原（１８）で免疫感作した６匹のウサギからの血清を混合することにより抗血清を製造した。個々の動物中の力価変動は３０％以下で、全ての動物は成熟免疫応答（１種類の免疫原で６力月以上）を示した。使用した免疫原は少な（とも２種類の別個の合成製剤から得たもので、力価、永続性（曲線特性）及びノルトリブチリンに対する交差反応（５０％偏向に於いてく１０％）によって判定される限り同等の応答を与えた。生抗血清を混合し、ｐＨを７．０に調節した０、　１００Ｍリン酸塩で緩衝させた食塩水からなる緩衝液中に希釈した。アッセイ進行中、抗血清をＴＤＸ系試薬緩衝液でＴＤｘ系に希釈し、終濃度を１：１６゜０００とした。

実施例６に記載されているノルトリブチリン蛍光トレーサー（２９）を、十分量の塩化ナトリウム及びチオ硫酸ナトリウムを各々１．０％及び０．１％濃度に溶解した、２５％ジメチルホルムアミド、２５％グリセロール及び５０％蒸留水からなる溶液中に乾燥試薬を希釈して製造した。このトレーサー試薬ストック溶液をアッセイで使用するための同一希釈マトリックス中に濃度〜８２ｎＭに希釈した。アッセイ進行中、この希釈トレーサー製剤をさらにＴＤｘ系試薬緩衝液で希釈して終濃度を〜ｌ、　ＯｎＭとした。

品試験の分析用サンプルをオフライン多段階二相抽出方法により製造した。１．２５ｍＬポリプロピレン試験管にサンプル（０，２００ｍＬ）を添加した。この試験サンプルを、０．２５Ｎ水酸化ナトリウム（０，１００ｍＬ）及びイソアミルアルコール（０，０２０１、）を添加して塩基性にした。この溶液を混合して、室温に５分間放置した。５分後、ローデカン（０，５００ｍＬ）をサンプルに添加して、１．０分渦動させて混合した。渦動後、サンプルを〜８．０００Ｘｇで５．０分間、遠心分離した。５．０分の遠心分離後、上清（上部相）　（０，２００ｍＬ）を取って０．１００Ｍグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ３）／アセトニトリル溶液（９：１）（０，２００ｍＬ）を含む１．２５ｍＬの第２のポリプロピレン試験管にいれた。係属中の米国特許出願第６２７．２８２号（１９９０年１２月１４日出願）に記載の如く、この時点で予備処理した溶液（Ｚ試薬＝水性クロラミン−Ｔのｌｏμｇ／ｍＬ溶液）（０，０４０ｍＬ）を加え、溶液を１．０分渦動させて混合し、第２の試験管からの下部相（５０〜０、１００ｍＬ）をＡｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ（登録商標）アナライザーのサンプルウェルに移した。

試験容量（０，０１５ｍＬ）を希釈抗血清（０，０２５ａ＋Ｌ）及び希釈蛍光トレーサー（０，０２５ｍＬ）と混合したサンプルをＴＤｘアナライザーの標準プロトコルに従って実施した。アッセイ実施終了時の結果をミリ偏光単位（ａＰ）で表す。ミリ偏光単位は自動的に保存標準曲線（表９）から内挿され、濃度（ｎｇ／ｍＬ）として表される。アッセイ用のサンプル製造方法ではサンプルを３倍に希釈しているので、（保存曲線は加重平均した４つのパラメーター曲線の接合により構成されている）較正試料の重量濃度は、表示公称濃度の１７３である。

較正試料は、Ｏ，１００Ｍグリシルグリシン（ｐＨ３）を含む緩衝液中の重量希釈により製造した。これらをオフラインサンプル処理（二相抽出）を実施せずにＴＤｘアナライザーに直接導入する。

実施例１２アミトリブチリンアッセイに於けるトレーサーの構造変更の効果図７に示されているアミトリブチリンスルホンアミドから図５に示されているアミドに蛍光トレーサー構造を変更すると、アッセイ特性に於いて非常に有効である。２種類の蛍光トレーサー（２７）及び（３０）を用いて６種類の既知濃度で検量曲線を引いた。アミトリブチリン誘導トレーサー（３０）の場合、アミトリブチリン代謝物に対する交差反応性は、所望のアッセイ性能を超えていた（図１１参照）。トレーサー（２７）を使用すると、抗体−トレーサー複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）由来のアミトリブチリンによってトレーサーが多（置換し、並びに交差反応性が大きく低下する（図１０及び１１参照）。これらの知見は、特異的アミトリブチリンアッセイに関して本発明の好ましい態様を示している。

実施例１３ノルトリブチリンアッセイに於けるトレーサーの構造変更の効果図７に示されているノルトリブチリンスルホンアミドから図６に示されている異性体的に純粋なスルホンアミドに蛍光トレーサー構造を変更すると、アッセイ特性に於いて非常に有効である。２種類の蛍光トレーサー（２９）及び（３１）を用いて６種類の既知濃度で検量曲線を引いた。アミドリプリチン誘導トレーサー（３１）の場合、アミドリブリチン代謝物に対する交差反応性は、所望のアッセイ性能を超えていた（図１３参照）。トレーサー（２９）を使用すると、抗体− トレーサー複合体由来のノルトリブチリンによってトレーサーが多く置換し、並びに交差反応性が大きく低下する（図１２及び１３参照）。これらの知見は、特異的ノルトリブチリンアッセイに関して本発明の好ましい態様を示している。

大連−ｆＪ１４アミトリブチリンＴＤｘアッセイ対ＨＰＬＣの対比解析アミトリブチリンＴＤｘアッセイの相対精度を、患者サンプル抽出物を使用して肝ＬＣとの対比により決定した。ＨＰＬＣ分析用の抽出物は以下に記載の如く製造し、三環式抗僻薬トリミプラミン及び２−デスメチルトキセビンを内部標準としてアセトニトリル中、各々濃度４７１ｇ／ｍＬで使用した。。

１、患者標準（１，０ｍＬ）をテフロンねじ栓のついた１６Ｘ１２５シリル化チユーブにピペットでいれた。冷凍庫から好適な標準検量曲線の冷凍アリコートを取り出して、溶かした。内部標準を含むアセトニトリル（０，７５＋Ｌ）を各チューブに入れた。

２、０．２５Ｎ　Ｎａ０Ｈ（１，０ｍＬ）、続いてイソアミル７　ルコ−／Ｌ。

（０，２００ｍＬ）を添加し、激しく渦動させ、チューブを５．０分放置した。

３　各チューブにローへブタン（１０，ｈＬ）をピペットで加え、各チューブの栓をしっかり閉めた。ヘプタン／血漿二相混合物を１．０時間激しく振盪した。

４、振盪機からチューブを取り出し、遠心分離機に移した。

ヘプタン血漿混合物を少なくとも２０００Ｘｇで３０分遠心分離し、層を透明にした。

５、遠心分離機からチューブを取り出し、ヘプタン上部層を０．１ＭｐＨ３のクリシルグリシン緩衝液（１，０ｍＬ）を含む、同一仕様の別のシリル化チューブに移した。これらのチューブを閉め、１．０時間激しく振盪した。

６、振盪機からチューブを取り出し、遠心分離機に移した。

二相グリシルクリジン、ヘプタン混合物を少な（とも２０００Ｘｇで３０分間遠心分離した。

７、遠心分離機からチューブを取り出し、栓を開けて、ヘプタン上部層を吸引するかピペットで取り出して、廃棄した。。

８、０．２５Ｎ　Ｎａ０Ｈ（２，０ｉ＋Ｌ）を各々残っているグリシルグリシン下部層に添加した。ローへブタン（５，ｈＬ）を各水性抽出液に添加し、チューブに栓をして１．０時間振盪した。

９、振盪機からチューブを取り出し、遠心分離機に移した。

ペンタン・水性混合物を２００Ｘｇで３０分間遠心分離した。

１０、遠心分離機からチューブを取り出し、ペンタン上部層を１６Ｘ１００シリル化円錐ねじ山付き試験管に移した。試験管の栓をしっかり閉めて、１７′４回転緩めた。温かい砂浴にチューブをおき、チューブの入った砂浴を真空デシケータ−キャビネットに移して、真空にした。ペンタン蒸発には約２５−３０分間を要した。

１１、砂浴中のチューブをデシケータ−から取り出し、各チューブにペンタン（１，０ｍＬ）をピペットで計り入れ、再び栓をし、各チューブを暫く渦動した。

栓を１／４回転分開けて、チューブをデシケータ−に戻し、ペンタンが蒸発するまで１０−１５分再び真空にした。

１２、乾燥したチューブをデシケータ−がら取り出し、肝ＬＣ移動相（０，０７０１Ｌ）をピペットで計りいれた。各チューブを約３０秒間、チューブの側面が濡れるように注意しながら渦動した。

１３、チューブを遠心分離機に移して、２００Ｘｇで２−３分遠心分離した。

ＩＣチューブを遠心分離機から取り出し、内容物を全てＷＩＳＰオートカル−セル（ａｕｔｏｃａｒｏｕｓｅｌ）サンプルキュベツトに移した。注射量を８０オングストローム孔径の３ミクロンシリカを詰めた１０ｃｍ　ｘ　Ｏ，６ｃｍカラム上ニ０．０５ｈＬ／注射１回に設定する。クロマトグラフィーの移動相は、濃リン酸でｐＨ３に調節した０、　０２５Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム８０部／アセトニトリル２０部１０．０２１Ｍ　ｎ−ノニルアミン（ｐＨ範囲＝　７．４− ７．８）の混合物からなっていた。分析カラムには、４０ミクロンの薄膜シリカを含む乾燥充填保護カラムをつける。溶媒の流速は、１．６■Ｌ／分であった。

直線回帰分析では、アミトリブチリンＴＤｘアッセイとＨＰＬＣアッセイの間には良好な相関関係があった（Ｎ　＝　１０３．　Ｒ＝０、９８７９．　Ｓ　＝　１．００１２）。結果を図１４に示す。

及亀鯉１】ノルトリブチリンＴＤｘアッセイ対ＨＰＬＣの対比解析ノルトリブチリンＴＤｘアッセイの相対精度を、患者サンプル抽出物を使用してＨＰＬＣとの対比により決定した。上記と同様にＨＰＬＣ分析用の抽出物を製造し、クロマトグラフィー条件を用いた。直線回帰分析では、ノルトリブチリンＴＤＸアッセイとＨＰＬＣアッセイの間には良好な相関関係があった（Ｎ＝１０８．Ｒ＝０．９３８１．３＝０．９４４８）。結果を図１５に示す。

Ｆｉｇｕｒｅ　１Ｆｉｇｕｒｅ　２６−カルボキシフルオレセン活性エステル　ＦｎＪ−フルオレセニルＣアミトリブチリンアッセイ用トレーサーアミノメチルフルオレセンＩＩｃＩ塩　＝　ＡＭＦ＝ノルトリブチリンアッセイ用トレーサーＦｉｇｕｒｅ　６Ｆｉｇｕｒｅ　７濃度　（ｎｇ／ｍＬ）濃度　（ｎｇ／ｍＬ）濃度　（ｎｇ／ｍＬ）Ｆｉｇｕｒｅ　１０（Ｚ）−１０−ＯＨ７ミ）！Ｊブチ’Ｊン　５０　１２（Ｅ）−１０−ＯＨアミトリブチリン　５３　１３（Ｚ）−１０−０）１　）ルトリフｆ’Ｊン７　’（Ｅ）−１０−ＯＨ）Ｊｖト’）”ｊチ’）＞　１１　１（Ｚ）−１０−ＯＨアミトリブチリン　（Ｅ）−１０−ＯＨアミトリブチリン（Ｚ）−１０−ＯＨノル）ＩＪブチ’）／　（Ｅ）−１０−ＯＨ／ルｔ−’ＪフチｌＪ：ｚＦｉｇｕｒｅ　１１（Ｅ）−１０−ＯＨアミトリブチリン　２３（Ｅ）−１０−ＯＨノルトリブチリン　２１　７（Ｚ）−１０−ＯＨ７ミトリブチリン　（Ｅ）−１０−ｏＨアミトリブチリンＦｉｇｕｒｅ　１４Ｆｉｇｕｒｅ　１５フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３３　８３１０−２Ｊ（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ、　ＫＲＩ（７２）発明者　バーター、ダリル・イーアメリカ合衆国、イリノイ・６００６０、マンプレイン、サウスポート・ロード・２２５（７２）発明者　フィッシュボウ、ジエフリー・アールアメリカ合衆国、イリノイ・６０６４０、シカゴ、レランド・アベニュー・１７３２

Claims

【特許請求の範囲】

１．試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンを定量するためのイムノアッセイ法であって、（ａ）（ｉ）抗体を式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子０〜６個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］のアミトリプチリンまたはノルトリプチリン誘導体から製造した免疫原で製造し、（ｉｉ）アミトリプチリンの特異的定量用の標識試薬を式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ１は２若しくは３位で芳香環に結合したヘテロ原子であり、Ｚ１は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱは検出可能な成分である］の誘導体から製造するか、またはノルトリプチリンの特異的定量用の標識試薬を式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ２は相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｚ２は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱは検出可能な成分である］の誘導体から製造し、かかるアミトリプチリンまたはノルトリプチリンと結合し得る抗体を含む抗体試薬及び標識試薬を試験サンプルと接触させて反応溶液を形成し、次いで（ｂ）前記試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンの量の関数として前記抗体と結合反応に関与したか、または関与しなかった前記反応溶液中の前記標識試薬量を測定する段階を含む該方法。
２．前記免疫原のＲがＣＨ３であるアミトリプチリンを検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
３．前記免疫原のＲがＨであるノルトリプチリンを検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
４．前記免疫原性キャリヤ物質が、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
５．前記検出可能な成分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学発光分子、燐光分子及び発光分子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
６．前記イムノアッセイ法が、前記標識試薬の検出可能な成分が体液中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンの定量用の抗体の存在に対して検出可能な蛍光偏光応答を産生し得る蛍光分子である蛍光偏光イムノアッセイであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
７．前記標識試薬の量を、（ａ）蛍光偏光応答を得るために前記反応溶液中に平面偏光を通過させ、次いで（ｂ）前記試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンの関数として前記反応溶液に対する蛍光偏光応答を検出することにより測定することを特徴とする請求項６に記載の方法。
８．前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
９．試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンを定量するための蛍光偏光イムノアッセイ法であって、（ａ）（ｉ）抗体を式： ▲数式、化学式、表等があります▼［式中、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子０〜６個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］の誘導体から製造した免疫原で製造し、（ｉｉ）アミトリプチリンの特異的定量用の標識試薬を式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ１は２若しくは３位で芳香環に結合したヘテロ原子であり、Ｚ１は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱは蛍光成分である］の誘導体から製造するか、またはノルトリプチリンの特異的定量用の標識試薬を式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ２は相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｚ２は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱは蛍光成分である］の誘導体から製造し、かかるアミトリプチリンまたはノルトリプチリンと結合し得る抗体を含む抗体試薬及び標識試薬を試験サンプルと接触させて反応溶液を形成し、次いで（ｂ）前記試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンの量の関数として前記抗体と結合反応に関与したか、または関与しなかった前記反応溶液中の前記標識試薬量を測定する段階を含む該方法。
１０．前記免疫原のＲがＣＨ３であるアミトリプチリンを検出することを特徴とする請求項９に記載の方法。
１１．前記ＣＨ３のＲがＨであるノルトリプチリンを検出することを特徴とする請求項９に記載の方法。
１２．前記免疫原性キャリヤ物質がウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
１３．前記標識試薬の量を、（ａ）平面偏光を前記反応溶液中を通過させて、蛍光偏光応答を得、次いで（ｂ）前記試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンの関数として前記反応溶液に対する前記蛍光偏光応答を検出することにより測定することを特徴とする請求項９に記載の方法。
１４．前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメチルトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
１５．試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンに結合し得る抗体を含む抗体試薬であって、前記抗体を、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子０〜６個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］のアミトリプチリンまたはノルトリプチリン誘導体から製造した免疫原で製造することを特徴とする該抗体試薬。
１６．前記免疫原のＲがＣＨ３であるアミトリプチリンを定量することを特徴とする請求項１５に記載の抗体試薬。
１７．前記免疫原のＲがＨであるノルトリプチリンを定量することを特徴とする請求項１５に記載の抗体試薬。
１８．前記免疫原性キャリヤ物質が、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の抗体試薬。
１９．試験サンプル中のアミトリプチリンと結合し得る抗体により識別し得る標識試薬であって、前記標識試薬を式▲数式、化学式、表等があります▼［式中、Ｗ１は２若しくは３位で芳香環に結合したヘテロ原子であり、Ｚ１は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱは検出可能な成分である］の誘導体から製造することを特徴とする該標識試薬。
２０．前記検出可能な成分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学発光分子、燐光分子及び発光分子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の標識試薬。
２１．前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の標識試薬。
２２．試験サンプル中のノルトリプチリンと結合し得る抗体により識別し得る標識試薬であって、前記標識試薬が式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ２は相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｚ２は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱは検出可能な成分である］のノルトリプチリン誘導体から製造することを特徴とする該標識試薬。
２３．前記検出可能な成分が、酵素、発色団、蛍光分子、化学発光分子、燐光分子及び発光分子からなる群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載の標識試薬。
２４．前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載の標識試薬。
２５．試験サンプル中のアミトリプチリンと結合し得る抗体により識別可能な標識試薬であって、前記標識試薬を式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ１は２若しくは３位で芳香環に結合したヘテロ原子であり、Ｚ１は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱは蛍光成分である］の誘導体から製造することを特徴とする核標識試薬。
２６．前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の標識試薬。
２７．試験サンプル中のノルトリプチリンと結合し得る抗体により識別される標識試薬であって、前記標識試薬を式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ２は相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｚ２は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱは検出可能な成分である］のノルトリプチリン誘導体から製造することを特徴とする該標識試薬。
２８．前記蛍光分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の標識試薬。
２９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子０〜６個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］の免疫原。
３０．ＲがＣＨ３であることを特徴とする請求項２９に記載の免疫原。
３１．ＲがＨであることを特徴とする請求項２９に記載の免疫原。
３２．前記免疫原性キャリヤ物質が、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の免疫原。
３３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＲはＣＨ３であり、配置はＥ若しくはＺまたはＥ及びＺの組み合わせであり、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子０〜６個を含む結合基であり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］の化合物。
３４．前記免疫原性キャリヤ物質が、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載の化合物。
３５．Ｘが−ＳＯ２−ＮＨ−であり、硫黄が２位で芳香環に結合しており、Ｙが炭素原子０個であり、Ｐはウシ血清アルブミンであり、及び二重結合に関する配置がＥであることを特徴とする請求項３３に記載の化合物。
３６．Ｘが−ＳＯ２−ＮＨ−であり、硫黄が３位で芳香環に結合しており、Ｙが炭素原子０個であり、Ｐはウシ血清アルブミンであり、及び二重結合に関する配置がＥであることを特徴とする請求項３３に記載の化合物。
３７．Ｘが−ＳＯ２−ＮＨ−であり、硫黄が３位で芳香環に結合しており、Ｙが炭素原子０個であり、Ｐはウシ血清アルブミンであり、及び二重結合に関する配置がＺであることを特徴とする請求項３３に記載の化合物。
３８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＲはＨであり、配置はＥ若しくはＺまたはＥ及びＺの組み合わせであり、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子０〜６個を含む結合基であり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］の化合物。
３９．前記免疫原性キャリヤ物質がウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３８に記載の化合物。
４０．Ｘが−ＳＯ２−ＮＨ−であり、硫黄が２位で芳香環に結合しており、Ｙが炭素原子０個であり、Ｐはウシ血清アルブミンであり、及び二重結合に関する配置がＥであることを特徴とする請求項３８に記載の化合物。
４１．Ｘが−ＳＯ２−ＮＨ−であり、硫黄が３位で芳香環に結合しており、Ｙが炭素原子０個であり、Ｐはウシ血清アルブミンであり、及び二重結合に関する配置がＥであることを特徴とする請求項３８に記載の化合物。
４２．Ｘが−ＳＯ２−ＮＨ−であり、硫黄が３位で芳香環に結合しており、Ｙが炭素原子０個であり、Ｐはウシ血清アルブミンであり、及び二重結合に関する配置がＺであることを特徴とする請求項３８に記載の化合物。
４３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ１は２若しくは３位で芳香環に結合したヘテロ原子であり、Ｚ１は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個であり、及びＱはフルオレセンまたはフルオレセン誘導体である］の化合物。
４４．前記フルオレセンまたはフルオレセン誘導体が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン、メトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の化合物。
４５．Ｗ１が２位に結合した−ＮＨ−であり、Ｚ１は−ＣＯ−であり、及びＱが５−フルオレセニルであることを特徴とする請求項４３に記載の化合物。
４６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ２は相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合している２個のヘテロ原子であり、配置はＥ若しくはＺまたはＥ及びＺの組み合わせであり、Ｚ２は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子１〜２個であり、Ｑはフルオレセンまたはフルオレセン誘導体である］の化合物。
４７．前記フルオレセンまたはフルオレセン誘導体が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン、メトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４６に記載の化合物。
４８．Ｗ２が−ＳＯ２−ＮＨ−であり、硫黄が２位で芳香環に結合しており、Ｚ２が−ＣＨ２−ＣＯ−であり、二重結合に関する配置がＥであり、及びＱが５− フルオレセニルであることを特徴とする請求項４６に記載の化合物。
４９．Ｗ２が−ＳＯ２−ＮＨ−であり、硫黄が３位で芳香環に結合しており、Ｚ２が−ＣＨ２−ＣＯ−であり、二重結合に関する配置がＥであり、及びＱが５− フルオレセニルであることを特徴とする請求項４６に記載の化合物。
５０．Ｗ２が−ＳＯ２−ＮＨ−であり、硫黄が３位で芳香環に結合しており、Ｚ２が−ＣＨ２−ＣＯ−であり、二重結合に関する配置がＺであり、及びＱが５− フルオレセニルであることを特徴とする請求項４６に記載の化合物。
５１．試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンを定量するための試験キットであって、前記試験キットが、（ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｙは炭素原子０〜６個を含む結合基であり、ＲはＣＨ３またはＨであり、及びＰは免疫原性キャリヤ物質である］のアミトリプチリンまたはノルトリプチリン誘導体から製造した免疫原で製造した、試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンと結合し得る抗体を含む抗体試薬；及び（ｂ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ１は２若しくは３位で芳香環に結合したヘテロ原子であり、Ｚ１は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱは検出可能な成分である］の誘導体から製造するか、またはノルトリプチリンの特異的定量用の標識試薬を式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｗ２は相互に結合し且つ２若しくは３位で芳香環に結合した２個のヘテロ原子であり、Ｚ２は炭素原子１〜４個及びヘテロ原子０〜２個を含む結合基であり、及びＱは検出可能な成分である］の誘導体から製造し、かかる試験サンプル中のアミトリプチリンまたはノルトリプチリンと結合し得る抗体を含む標識試薬を含むことを特徴とする該試験キット。
５２．前記免疫原のＲがＣＨ３であるアミトリプチリンを定量することを特徴とする請求項５１に記載の試験キット。
５３．前記免疫原のＲがＨであるノルトリプチリンを定量することを特徴とする請求項５１に記載の試験キット。
５４．前記免疫原性キャリヤ物質が、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン及びサイログロブリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項５１に記載の試験キット。
５５．前記蛍光成分が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセン及びメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンからなる群から選択されることを特徴とする請求項５１に記載の試験キット。