JP2007056030A - 三環系抗うつ薬誘導体およびイムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
構造I:
構造II:
構造IIの免疫原から産生される抗体、および構造III、IV、VおよびVIから誘導された薬物コンジュゲートを使用する、三環系抗うつ薬のためのイムノアッセイ;
三環系抗うつ薬に特異的な抗体、および構造III、IV、VおよびVIから誘導された薬物コンジュゲートを使用する、三環系抗うつ薬のためのイムノアッセイ;および、
構造IIの免疫原から作製される抗体、および三環系抗うつ薬類似体を使用する、三環系抗うつ薬のためのイムノアッセイ。
(1) 三環系抗うつ薬、その誘導体および代謝物からなる群から選択されるアナライトを測定するためのイムノアッセイ法であって、(a)前記アナライトを含有すると推定される試料を、前記アナライトに特異的な抗体、および構造III、IV、VおよびVIからなる群から選択される構造を有する化合物から誘導されたアナライト類似体(ただし、前記類似体または前記抗体は検出可能な標識を含むものである)と、前記アナライトおよびアナライト類似体が前記抗体と結合して検出可能な複合体を形成するために適した条件の下で混合すること、および(b)前記の検出可能な複合体の存在または量を、前記試料中の前記アナライトの指標として測定すること、からなるステップを含んでなる上記方法;
(2) 三環系抗うつ薬、その誘導体および代謝物からなる群から選択されるアナライトを測定するためのイムノアッセイ法であって、(a) 前記アナライトを含有すると推定される試料を、構造IIを有する化合物である免疫原から作製された抗体、およびアナライト類似体(ただし、前記類似体または前記抗体は検出可能な標識を含むものである)と、前記アナライトおよびアナライト類似体が前記抗体と結合して検出可能な複合体を形成するために適した条件の下で混合すること、および(b) 前記の検出可能な複合体の存在または量を、前記試料中の前記アナライトの指標として測定すること、からなるステップを含んでなる上記方法;
(3) 三環系抗うつ薬、その誘導体および代謝物からなる群から選択されるアナライトを測定するためのイムノアッセイ法であって、(a)前記アナライトを含有すると推定される試料を、構造IIを有する化合物である免疫原から作製された抗体、および構造III、IV、VおよびVIからなる群から選択される構造を有する化合物から誘導されたアナライト類似体(ただし、前記類似体または前記抗体は検出可能な標識を含むものである)と、前記アナライトおよびアナライト類似体が前記抗体と結合して検出可能な複合体を形成するために適した条件の下で混合すること、および(b)前記の検出可能な複合体の存在または量を、前記試料中の前記アナライトの指標として測定すること、からなるステップを含んでなる上記方法。
3-(3-メトキシ−ベンジリデン)-3H-イソベンゾフラン-1-オン(化合物1)の調製
15g(89 mmol)のm−メトキシフェニル酢酸、13.2 g(89 mmol)の無水フタル酸および246 mg(2.9 mmol)の酢酸ナトリウムの混合物を6時間240℃に加熱し、連続的に反応物から水を除去した。冷却後、反応フラスコ内に固形物が生成した。これを無水エタノールで再結晶し、15.6 g(62 mmol、69%)の化合物1を黄色粉末として得た。
実施例2
2-[2-(3-メトキシ-フェニル)-エチル]-安息香酸(化合物2)の調製
15.6 gの化合物1(62 mmol)の300mlのTHF溶液に30 gの10%Pd-C、40 gのギ酸アンモニウムおよび17.2 mlのトリエチルアミンを加えた。この反応混合物を6時間70℃に加熱し、濾過した。濾液を濃縮し、500 mlの酢酸エチルに再溶解し、150 mlの3% HCl水溶液で2回、100 mlの食塩水で2回洗浄した。有機層を濃縮し、1:1酢酸エチル:ヘキサンとともに粉砕し、8 g(31.2 mmol、51%)の化合物2が得られた。
実施例3
2-メトキシ-10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-5-オン(化合物3)の調製
5 gの五酸化リンに50 mlのメタンスルホン酸を添加した。この混合物を1時間80℃に加熱した。反応混合物を40℃に冷まし、3 g(11.7 mmol)の化合物2を固体の状態で添加した。この混合物を1時間40℃に加熱し、室温まで冷却した。反応混合物を300 mlの氷/水に注ぎ入れ、200 mlの酢酸エチルで抽出した。有機層を150 mlの水で2回、150 mlの飽和NaHCO3で2回、さらに100 mlの水で洗浄した。その結果得られた有機層を乾燥し(Na2SO4)、濃縮して、灰白色の粉末として2.6 g(11.7 mmol、94%)の化合物3を得た。
実施例4
5-(3-ジメチルアミノ-プロピル)-2-メトキシ-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-5-オール(化合物4)の調製
30 gの削りくず状のマグネシウムに、直前に蒸留された100 mlのTHFおよび触媒量のヨウ素を添加した。この反応混合物を加熱して10分間還流した後、室温に冷却した。この反応混合物に3.5 g(29 mmol)の3-クロロ-N,N-ジメチルプロパンを加え、反応混合物を加熱して3時間還流した。反応混合物を室温に冷却し、2 gの化合物3(8.3 mmol)を新たに蒸留したTHF 20 mlに溶解した溶液を添加した。室温で2時間撹拌して反応させた後、濾過した。この濾液に10 mlの飽和塩化アンモニウム溶液を添加し、濃縮してTHFを除去した。これを100 mlの飽和塩化アンモニウム溶液で希釈し、酢酸エチルで抽出した(150 mlで3回)。有機層を合わせて、75 mlの飽和NaHCO3で2回、75 mlの水で2回、洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濃縮した。粗生成物を、ジクロロメタン中の10%メタノールを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、2.6 g(7.9 mmol, 95%)の化合物4を白色粉末として得た。
実施例5
10,11-ジヒドロ-2-メトキシ-N,N-ジメチル-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-5-プロピルアミン(化合物5)の調製
65 mg(0.19 mmol)の化合物4に5 mlの氷酢酸を添加した。混合物を60℃に加熱し、混合物が均一になるまで撹拌しておいた。反応混合物を室温に冷却し、300 mgの10% Pd/Cを加え、続いて1 gのギ酸アンモニウムを添加した。この混合物を70℃に加熱し、その温度で4時間撹拌し続けた。反応混合物を室温に冷却し、濾過した。残渣を50 mlのジクロロメタンで洗浄した。濾液を合わせて濃縮した。残渣は100 mlのジクロロメタンに溶解し、50 mlの飽和NaHCO3で2回、つぎに50 mlの食塩水で2回洗浄した。有機部分を乾燥し(Na2SO4)、濃縮して50 mg(0.16 mmol, 82%)の化合物5が得られた。
実施例6
5-(3-ジメチルアミノプロピル)-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-2-オール臭化水素酸塩(化合物6)の調製
新たに蒸留したジクロロメタン35 mlに1.98 ml三臭化ホウ素を加えた。反応混合物を水浴中に配置した。この反応混合物に1.1 g(3.5 mmol)の化合物5の15 mlジクロロメタン溶液を滴下して加えた。混合物を室温(23〜26℃)で30分間撹拌し、50 gの氷/水に注ぎ入れた。50 mlの水を追加して加え、100 mlのクロロホルムで3回抽出した。有機層を合わせて、乾燥し(Na2SO4)、濃縮して1.2 g(3.18 mmol, 90%)の化合物6を、灰白色の固形物として得た。
実施例7
4-[5-(3-ジメチルアミノプロピル)-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-2-イルオキシ]-酪酸エチルエステル(化合物7)の調製
500mg(1.32 mmol)の化合物6に、新たに蒸留したアセトン(無水K2CO3上で蒸留)10 mlおよび無水DMF 10 mlを加えた。この反応混合物に、450 mg(3.0 mmol)のヨウ化ナトリウム、2 g の4Å モレキュラーシーブ、2 g(6.13 mmol)の炭酸セシウム、および触媒量の18−クラウン−6を添加した。この反応混合物に500μl(3.38 mmol)の4−ブロモ酪酸エチルを加え、その反応混合物をアルゴン雰囲気下で18時間、予め熱しておいた(90℃)オイルバスで加熱した。混合物を室温に冷却し、濾過した。残渣を30 mlのクロロホルムで洗浄した。濾液を合わせて減圧下で濃縮し、100 mlのジクロロメタンに再溶解した。これを100 mlの5% NaOHで2回、続いて100 mlの水で2回洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濃縮した。この残渣を、ジクロロメタン中の10%メタノールを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、450 mg(1.09 mmol, 83%)の化合物7を茶色がかった油状物として得た。
実施例8
4-[5-(3-ジメチルアミノ-プロピル)-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-2-イルオキシ]-酪酸(化合物8)の調製
875 mgの化合物7(2.1 mmol)を10 mlの新たに蒸留したTHFに溶解した溶液に、875 mgの水酸化リチウムを10 mlの水に溶解した溶液および5 mlのメタノールを添加した。反応混合物を室温で18時間撹拌し、濃縮してTHFおよびメタノールを除去した。水性残留物を6N HClでpH 6に調整した。これを100 mlのジクロロメタンで3回抽出した。水層のpHを1回目の抽出後にもう一度6に調整した。有機層を合わせて、乾燥(Na2SO4)、濃縮し、790 mg(2.0 mmol, 97%)の化合物8を白色非晶質固形物として得た。
実施例9
4-[5-(3-ジメチルアミノ-プロピル)-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-2-イルオキシ]-酪酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル エステル(化合物9)の調製
200 mg(0.52 mmol)の化合物8を40 mlのジクロロメタン(水素化カルシウム上で蒸留した)に溶解した溶液に、92 mg(0.8 mmol)のN−ヒドロキシスクシンイミドおよび152 mg(0.8 mmol)の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)を添加した。反応混合物を室温で48時間撹拌した。この反応混合物を50 mlのジクロロメタンで希釈し、50 mlの食塩水で洗浄し、50 mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で2回、次に50 mlの食塩水で2回洗浄した。得られた溶液を乾燥し(Na2SO4)、濃縮して245 mg(0.51 mmol、98%)の化合物9が白色固形物として得られた。
実施例10
C-2位TCA免疫原(化合物10)の調製
50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)の12 mlに溶解した738 mgのウシ チログロブリンを氷浴で冷却した。この溶液に37 mlジメチルスルホキシドを滴下して加え、反応温度は室温以下に維持した。このタンパク質溶液に、111 mg(0.23 mmol)の化合物9を溶解した1 mlのDMF溶液を滴下して加えた。混合物を室温で18時間撹拌した。得られたコンジュゲートを透析チューブ(50,000 MWカットオフ)に入れ、室温で、50mMリン酸カリウム中の70% DMSOの2L(pH7.5、少なくとも3時間ごとに3回替える)、50mMリン酸カリウム中の50% DMSOの2L(少なくとも3時間)、50mMリン酸カリウム中の30% DMSOの2L(少なくとも3時間)、50mMリン酸カリウム中の10% DMSOの2L(少なくとも3時間)に対して透析し、次に4℃で50mMリン酸カリウム(pH7.5)を6回替えて透析した(少なくとも6時間ずつ、それぞれ2L)。Biorad クーマシーブルータンパク質アッセイ(Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976)を用いてタンパク質濃度を測定したところ、3.9 mg/mlであった。全体として100mlのコンジュゲートが得られた。利用可能なリシン修飾の程度は、TNBS法(Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14, 328-34, 1988)によって70%であると判定された。
実施例11
C-2位TCA-BSA ELISAスクリーニングコンジュゲート(化合物11)の調製
1gのウシ血清アルブミン(BSA)を16 mlの50mMリン酸カリウム(pH7.5)に溶解した溶液を氷浴によって冷却した。その溶液に19 ml DMSOを滴下して加え、反応温度を室温以下に維持した。このタンパク質溶液に、18.1 mg(0.038 mmol)のC-2位TCA NHSエステル誘導体(化合物9)を1.5 mlの無水DMFに溶解した溶液を、滴下して加えた。反応混合物を室温で48時間撹拌した。得られたコンジュゲートを透析チューブ(10,000 MWカットオフ)に入れ、室温で、50mMリン酸カリウム中の60% DMSOの2L(少なくとも各回3時間、3回替える)、50mMリン酸カリウム中の50% DMSOの2L(少なくとも3時間)、50mMリン酸カリウム中の30% DMSOの2L(少なくとも3時間)、50mMリン酸カリウム中の10% DMSOの2L(少なくとも3時間)に対して透析し、次に4℃で50mMリン酸カリウム(pH7.5)を6回替えて透析した(少なくとも各回6時間、それぞれ2L)。全体として、70 mlのTCA−BSAコンジュゲートが得られた。タンパク質濃度はBioradクーマシーブルータンパク質アッセイを用いて、8.2 mg/mlであると測定された。総薬剤:BSA=2.5:1。
実施例12
4-[5-(3-ジメチルアミノ-プロピル)-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-2-イルオキシメチル]安息香酸メチルエステル(化合物12)の調製
アルゴン雰囲気下、100 mg(0.34 mmol)のヒドロキシTCA誘導体6を3mlのDMFに溶解した溶液を16 mg(0.4 mmol)のNaH(鉱油中60%分散液)で処理し、室温で15分間撹拌した。つぎに、混合物を85 mg(0.37 mmol)の4−(ブロモメチル) 安息香酸メチルで処理して、室温で4時間撹拌した。反応液をCH2Cl2で希釈し、50 mM KPO4、pH 7で洗浄した。水層をCH2Cl2で1回抽出した。CH2Cl2層を合わせ、Na2SO4上で乾燥し、油状物になるまで減圧下で濃縮した。これを、溶離液としてCH2Cl2中の3% メタノールを用いて20 gのシリカゲルクロマトグラフィーで分離し、46 mg(31%)の化合物12を淡黄色の油状物として得た。
実施例13
4-[5-(3-ジメチルアミノプロピル)-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-2-イルオキシメチル]安息香酸(化合物13)の調製
アルゴン雰囲気下、46 mg(0.104 mmol)化合物12を4.5 mlのメタノールおよび0.5 mlの水に溶解した溶液を、28 mg(0.202 mmol)のK2CO3で処理し、加熱して4時間還流した。反応液を減圧下で濃縮した。残渣を水に溶解し、pHを希塩酸で6.5に調整した。沈澱が生成した。これを10 mlのCH2Cl2で3回抽出し、Na2SO4上で乾燥し、減圧下で濃縮して、35 mg(79%)の化合物13を、灰白色の非晶質固形物として得た。
実施例14
4-[5-(3-ジメチルアミノプロピル)-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-2-イルオキシメチル]安息香酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(化合物14)の調製
アルゴン下で、35 mg(0.082 mmol)の酸(化合物13)を5 mlのCH2Cl2に溶解した溶液を、25 mg(0.217 mmol)のN-ヒドロキシスクシンイミドおよび40 mg(0.209 mmol)の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドHClで処理し、室温で一晩撹拌した。反応液を、水、飽和NaHCO3および食塩水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、減圧濃縮して30 mg(70%)の化合物14を白色非晶質固形物として得た。
実施例15
4-({4-[5-(3-ジメチルアミノプロピル)-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-2-イルオキシ]ブチルアミノ}メチル)安息香酸(化合物15)の調製
32 mg(0.212 mmol)の4-(アミノメチル)安息香酸を2 mlのH2Oおよび4 mlのTHFに溶解した混合物を、約0.1 mlの2N NaOHで処理して、混合物のpHを約9とした。次にこれを4.5 mlのTHFに溶解した100 mg(0.209 mmol)のTCA NHSエステルの化合物9で処理した。pHを2N NaOHで約8.5-9.0に調整し、反応液を室温で15分間撹拌した。反応液を2N HClで中和してpH6とし、次にCH2Cl2で2回抽出した。CH2Cl2層を合わせて、無水Na2SO4上で乾燥し、減圧濃縮して87 mg(81%)の酸(化合物15)を淡黄色油状物として得た。これ以上の精製を行なわず、これを次のステップに使用した。
実施例16
4-({4-[5-(3-ジメチルアミノプロピル)-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[a,d]シクロヘプテン-2-イルオキシ]ブチルアミノ}メチル)安息香酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(化合物16)の調製
87 mgの(0.169 mmol)酸(化合物15)を10 mlのCH2Cl2に溶解した溶液を、40 mg(0.348 mmol)N-ヒドロキシスクシンイミドおよび87 mg(0.454 mmol)の1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドHClで処理し、室温で一晩撹拌した。反応液を、水、飽和NaHCO3および食塩水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、減圧濃縮した。残渣を、10%エーテル/CH2Cl2を溶離液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、34 mg(33%)の化合物16を白色非晶質固形物として得た。
実施例17
3-{[3-(10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f]アゼピン-5-イル)-プロピル]-メチル-アミノ}-プロピオン酸エチルエステル(化合物17)の調製
6.02g(19.8 mmol)の塩酸デシプラミンの溶液を室温で5分間撹拌した。これを100 mlのクロロホルムで6回抽出した。有機層を合わせて、100 mlの水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濃縮して、5.25 gのデシプラミン遊離塩基を得た。2.82 g(10.6 mmol)のデシプラミン遊離塩基を100 mlの無水アセトンに溶解した溶液を添加した。この反応混合物に2.03 ml(15.8 mmol)の3-ブロモプロピオン酸エチル、3.65 g(26.4 mmol)の無水炭酸カリウム、264 mg(1.76mmol)のヨウ化ナトリウム、5 mgの18-クラウン-6および0.7 mlの無水DMFを添加した。反応混合物をアルゴン下で一晩還流させた。その混合物を濾過し、残渣を20 mlのアセトンで洗浄した。濾液を合わせて濃縮し、4%メタノール/酢酸エチルを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、3.45 g(9.41 mmol、89%)のエチルエステル(化合物17)を、粘稠な油状物として得た。
実施例18
3-{[3-(10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f]アゼピン-5-イル)-プロピル]-メチル-アミノ}-プロピオン酸(化合物18)の調製
2.15 g(5.86 mmol)のエチルエステル(化合物17)に29.6 mlの新たに蒸留したTHFを加え、29.6 mlのメタノールおよび4.7 gの水酸化リチウムを63 mlの水に溶解した溶液を添加した。この混合物を室温で一晩撹拌し、濃縮してメタノールおよびTHFを除去した。水性溶液のpHを 6に調整した。これを100 mlのクロロホルムで6回抽出した。有機層を合わせて、100 mlの水で洗浄し、乾燥(無水Na2SO4)、濃縮し、1.97 g(5.82 mmol, 99%)の化合物18を白色非晶質固体として得た。
実施例19
4-[(3-{[3-(10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f]アゼピン-5-イル)-プロピル]-メチル-アミノ}-プロピオニルアミノ)-メチル]-安息香酸メチルエステル(化合物19)の調製
0.93 g(2.74 mmol)の化合物18を100 mlの無水ジクロロメタンに溶解した溶液に、446 mg(2.21 mmol)のアミノメチル安息香酸メチル塩酸塩(化合物20)を加え、次に1.05 g(5.47 mmol)の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドを加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物に100 mlの水および20 mlのジクロロメタンを添加した。有機層を分離し、水層を75 mlのジクロロメタンで4回抽出した。有機層を合わせ、100mlの水で2回洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濃縮した。1.02 gの化合物18を用いて上記の反応を繰り返した。粗生成物を合わせて、30%クロロホルム/メタノールを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、1.2g(2.47 mmol、43%)のメチルエステル(化合物19)を得た。また、さらに少量の不純物を含有する760 mgの生成物が得られた。
実施例20
アミノメチル安息香酸メチル塩酸塩(化合物20)の調製
マグネティックスターラーで撹拌された、480 mlのメタノールに懸濁した6.05 g(40 mmol)のアミノメチル安息香酸の懸濁液を-20℃に冷却した。反応混合物に12.3 mlの塩化チオニルを10分間かけて添加した。反応混合物を4℃まで加温し、その温度で一晩撹拌しておいた。得られた溶液を濃縮し、固形物が得られた。NMR分析によって、反応が完了していないことが示された。これを再び上記の反応条件に供し、7.8 g(38 mmol、96%)の化合物20が灰白色固形物として得られた。
実施例21
4-[(3-{[3-(10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f]アゼピン-5-イル)-プロピル]-メチル-アミノ}-プロピオニルアミノ)-メチル]-安息香酸(化合物21)の調製
1.2 g(2.47 mmol)の化合物18に、16.5 mlのTHF、16.5 mlのメタノール、および38mlの水に2.63g水酸化リチウムを溶解した溶液を加えた。混合物を一晩室温で撹拌した。これを濃縮して、メタノールおよびTHFを除去した。溶液のpHを、85%リン酸を用いて6に調整した。得られた混合物を100 mlのクロロホルムで5回抽出した。有機層を合わせて100mlの水で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濃縮した。7:3メタノール:酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、残渣を2回精製し、550 mg(1.16 mmol , 47%)の化合物21が得られた。
実施例22
4-[3-{[3-(10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f]アゼピン-5-イル)-プロピル]-メチル-アミノ}-メチル]-安息香酸2、5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(化合物22)の調製
55 mg(1.16 mmol)の化合物21を30 mlのジクロロメタンに溶解した溶液を、アルゴン雰囲気下で、室温で撹拌しておいた。この反応混合物に575 mg(2.9 mmol)の1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドおよび264 mg(2.29 mmol)のN-ヒドロキシスクシンイミドを添加した。この混合物を24時間撹拌しておき、15 mlのジクロロメタンで希釈した。有機層を分離し、50mlの水で4回、50mlの飽和NaHCO3溶液で3回、および50mlの水で3回洗浄した。ジクロロメタン層を乾燥し(Na2SO4)、濃縮し、480 mg(0.8 mmol、72%)の化合物22を白色粉末として得た。
実施例23
2-[3-(10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f]アゼピン-5-イル)-プロピルアミノ]-エチル]-カルバミン酸t-ブチルエステル(化合物23)の調製
6.02 gの塩酸デシプラミンに、150 mlの1N NaOHを添加した。混合物を10分間撹拌した。この水性混合物を100mlのクロロホルムで6回抽出した。クロロホルム層を合わせて、200mlの水で洗浄した。有機層を乾燥し(Na2SO4)、濃縮して5.25gのデシプラミン遊離塩基が得られた。
実施例24
N-[3-(10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f]アゼピン-5-イル)-N1-メチル-エタン-1,2-ジアミン(化合物24)の調製
1.0 g(2.44 mmol)の化合物23に、10 mlのCH2Cl2および10 mlのトリフルオロ酢酸を添加した。反応混合物を室温で撹拌し、濃縮した。残渣をCH2Cl2に溶解し、濃縮した。上記の手順を2回繰返し、残留物を60%クロロホルム/メタノールを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、1.02 g(2.40 mmol、99%)の化合物24を粘稠な油状物として得た。
実施例25
N-(2-{[3-(10,11-ジヒドロ-ジベンゾ[b,f]アゼピン-5-イル)-プロピル]-メチル-アミノ}-エチル)-テレフタルアミド酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(化合物26)の調製
500 mg(1.18 mmol)のTCAアミン(化合物24)に、316μlのトリエチルアミンおよび30 mlのDMFを添加した。別のフラスコで、1.16 g(mmol)テレフタル酸ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(化合物25)を30 mlの無水DMFと混合した。予め調製されたTCAアミン溶液をテレフタル酸ジ-N-ヒドロキシスクシンイミド溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、濃縮した。残渣を75 mlのジクロロメタンに溶解した。有機層を50 mlの水で2回、50 ml NaHCO3飽和溶液で2回さらに50 mlの水で洗浄し、乾燥して(Na2SO4)、濃縮した。残留物を、20%アセトン/酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色粉末として145 mg(0.026 mmol、22%)の化合物26を得た。
実施例26
N-1位TCA免疫原(化合物28)の調製
96 mgのTCA NHSエステル誘導体(化合物18)を1.5 mlの無水DMFに溶解した溶液を0℃に冷却した。反応混合物に74 mgのジシクロへキシル尿素(DCC)および48 mgのN-ヒドロキシスクシンイミドを添加した。その混合物を4℃で24時間撹拌しておいた。調製されたN-ヒドロキシスクシンイミドエステルがタンパク質のコンジュゲート形成にin situで使用された。
実施例27
C-2位TCA-BSA(芳香族リンカー)コンジュゲート(化合物29)の調製
550 mgのウシ血清アルブミン(BSA)を11 mlの50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)に溶解した溶液を調製した。10 ml溶液をRBフラスコに移し、氷浴中で冷却した。その溶液に、10 mlのDMSOを滴下して加え、反応温度は室温以下に維持した。このタンパク質溶液に、48.2 mgのC-2位TCA NHSエステル誘導体(化合物16)を0.96 ml DMSOに溶解した溶液を、滴下して加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌しておいた。得られたコンジュゲートを透析チューブ(10,000 MWカットオフ)に入れ、500 mlの50% DMSO/50 mMリン酸カリウム(室温で最低3時間)、500 mlの30% DMSO/50 mMリン酸カリウム(室温で最低3時間)、500 mlの10% DMSO/50 mMリン酸カリウム(室温で最低3時間)、に対して透析し、続いて4℃で50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)を4回交換して透析した(各回毎に2Lで最低3時間)。得られたコンジュゲートを0.45μmフィルターを透して濾過した。全体で37 mlのTCA-BSAコンジュゲートが得られた。タンパク質濃度は、Biorad クーマシーブルータンパク質アッセイを用いて、14.4 mg/mlと測定された。
実施例28
N-1位TCA-BSA(芳香族リンカー)コンジュゲート(化合物30)の調製
1 gのウシ血清アルブミン(BSA)を16 mlの50 mMリン酸カリウム(pH7.5)に溶解した溶液を氷浴中で冷却した。その溶液に、19 mlのDMSOを滴下して加え、反応温度は室温以下に維持した。このタンパク質溶液に、21 mgのTCA NHSエステル誘導体(化合物22)を1.5 mlの無水DMFに溶解した溶液を、滴下して加えた。反応混合物を室温で24時間撹拌しておいた。得られたコンジュゲートを透析チューブ(10,000 MWカットオフ)に入れ、室温で、2Lの60% DMSO/50 mMリン酸カリウム(3回交換、各回最低3時間)、2Lの50% DMSO/50 mMリン酸カリウム(最低3時間)、2Lの30% DMSO/50 mMリン酸カリウム(最低3時間)、2Lの10% DMSO/50 mMリン酸カリウム(最低3時間)に対して透析し、続いて4℃で50 mMリン酸カリウム(pH 7.5)を6回交換して透析した(各回毎に2Lで最低6時間)。全体で75 mlのTCA-BSAコンジュゲートが得られた。タンパク質濃度は、Biorad クーマシーブルータンパク質アッセイを用いて、11.4 mg/mlと測定された。
実施例29
N-1位TCA-BSA(短いリンカー)コンジュゲート(化合物27)の調製
12.8 mgのTCA NHSエステル誘導体(化合物18)を1.5 mlの無水DMFに溶解した溶液を0℃に冷却した。この反応混合物に9.3 mgのジシクロヘキシル尿素(DCC)および5.24 mgのN-ヒドロキシスクシンイミドを添加した。混合物を4℃で24時間撹拌した。調製されたN-ヒドロキシスクシンイミドエステルはin situでタンパク質コンジュゲート形成のために使用した。
実施例30
C-2位免疫原に対するポリクローナル抗血清の開発
健康で、以前に免疫感作されていない雌雄のウサギがこの研究のために選択された。仕入先のIUACUC委員会によって承認されるように、ウサギを収容し、取り扱った。
1 mg/mlの濃度で完全フロイントアジュバントに懸濁した2-カルボキシプロピル-ジヒドロアミトリプチリン-BTGコンジュゲートを用いて一次免疫を行なった。各ウサギに投与された総投与量は、0.2 mlすなわち0.2 mgであり、背中全域の多数の部位に皮下注射によって投与された。4週間後、免疫感作を繰り返したが、アジュバントを不完全フロイントアジュバントに代えて、背中全域の異なる部位に、再度皮下注射によって行なった。次に4週間の間隔をおいて免疫感作を反復したが、総投与量0.1 mgを使用して、前記と同様の投与経路で、16週まで投与した。
耳静脈出血によって採取した試料のELISAによって、抗体応答を測定した。清澄化した血清の連続希釈物をC-2位およびN-1位テストタンパク質(BSA)コンジュゲートの両者について検査した。最大応答希釈物の50%として表される血清の抗体価は、使用したテストコンジュゲートについてほぼ類似し、約5 x 105であった。C-2位テストコンジュゲートに関して高い反応性を示す試料は、N-1位コンジュゲートについても、より高いこと、動物間の最高から最低までの反応性の順序はそれぞれのテストコンジュゲートに関して測定されたものについてほぼ同じであったことから、変動は、テストに使用したコンジュゲートとの関連よりも、動物個体との関連性が大きいと思われた。
実施例31
C-2免疫原によるマウスの免疫感作
C-2免疫原(化合物10)を、生理食塩水で0.2 mg/mlに希釈し、同量のフロイント完全アジュバント(Sigma Chemicals, St Louis, MO)に、2本のシリンジとダブルハブ25ゲージ針を用いて乳化して、マウスの一次免疫のために調製した。このエマルションを、それぞれの後ろ足および腹膜領域内でマウスに注射した。マウス当り0.1 mlの総投与量を注射した。フロイント不完全アジュバントを用いた同一処方を使用した2回目の注射を4週間後に同様の投与経路で注射した。3回目の注射は2回目と同様であり、2回目の注射の6週間後に投与された。
実施例32
ELISAアッセイ
血清の抗体含量を分析するために、異なるタンパク質(2-カルボキシプロピル-ジヒドロアミトリプチリン-BSA)に結合した同起源の抗原(化合物11)を用いたELISAアッセイを使用した。この抗原を0.1M炭酸バッファー、pH9.5を用いて、5μg/mlに希釈した。この抗原溶液の一定量、100μlをピペットで取り、ポリスチレン96-穴マイクロプレート(Costar, Cambridge, MA)のウェルに入れた。これをプラスチックバッグに入れて37℃で1時間インキュベートした。次に、溶液を吸引によって取り除き、ウェルをブロッキング溶液で満たした。この溶液の組成は、ゼラチン加水分解物が1%、ショ糖2%、Tris, 0.15M, pH7.4(試薬はすべてSigma Chemicals製)とした。これをプラスチックバッグ内で、室温で1時間放置して、プレートをブロックした。次に吸引してウェルを空にした。
実施例33
マウスハイブリドーマによるモノクローナル抗体の作製
免疫原に対してELISAで高い反応性を示すマウスを、使用のために選定した。融合を行なう4日前に、この動物は不完全フロイントアジュバントに懸濁した100μgの抗原の追加免疫を受けた。骨髄腫細胞系F0(ATCC, Manassas, VA)を融合に使用した。融合は、de St GrothおよびScheidegger, Journal of Immunol. Meth. 35, 1-21, 1980の方法によって行なった。10日後、ハイブリッド細胞培養物はスクリーニングに供された。これは上記のELISAと同様の方法によって、N-結合デシプラミン-BSAコンジュゲート(化合物27)でコーティングされたプレート、およびBSAのみでコーティングされたコントロールプレートを追加して、実施された。化合物11および化合物27の両方に結合するがBSAには結合できない抗体を示すハイブリッド細胞を、以下の操作のために選択した。これは、迅速な再クローニング、ならびに液体窒素による凍結のための、培養の増殖からなる。再クローニングは、細胞を40 mlの培地当り生細胞数60に希釈し、滅菌した96穴培養プレートの各ウェルに200μlずつ分注し、増殖が観察されるまで、加湿したCO2インキュベーター内でインキュベートすることによって、行なわれた。
実施例34
モノクローナル抗体TCA 1.1を用いたイミプラミンのイムノアッセイ
ハイブリドーマクローンTCA 1.1を高密度培養し、上清を集めた。0.02%の濃度になるようにチメロサールを添加して、この標品を保存した。一定量の抗原コンジュゲートでコーティングしたマイクロプレートウェルにさまざまな希釈度の上清希釈物を入れる、力価実験によって、抗体含量を評価した。最大シグナルの約90%を与える希釈物を、イムノアッセイを立証するための以下の操作に使用した。
実施例35
抗体の微粒子への吸収
Seradyn製カルボキシル-修飾ブルーポリスチレン微粒子(0.3 ミクロン)を、最初に、1%固形分として、20 mM, pH6.1 MESバッファー(2-[N-モルフォリノ]エタンスルホン酸)中で遠心分離することにより3回洗浄した。洗浄した微粒子を次にMESにおいて5%固形分に調整し、指定された抗-TCA抗体を下記のように微粒子上に吸収させた。微粒子の溶液に、同量の3 mg/ml抗-TCA抗体を加え、16時間室温で撹拌しておいた。次にその微粒子を、室温で1時間BSAのMES溶液でブロックし、この混合物を、MES中1%固形分として遠心分離により3回洗浄した。最終洗浄後、微粒子溶液を再び10%固形分に調整した。使用前に、同量の上記ラテックスと35% w/vショ糖/MES溶液を混合した。
実施例36
メンブランストリップの調製
マイラー(Mylar)で裏打ちされた大孔径のニトロセルロース(5-20μm)を長さ15 cm、幅5 cmの小片に切り取った。いずれも50 mMリン酸カリウムバッファー、pH7.5に溶解した溶液であるTCA-BSA複合体(約5 mg/ml)および抗-TCAモノクローナル抗体(約2 mg/ml)を、IVEK Corp. Digispense 2000(登録商標)システムを用いて、1μl/cmの速度でニトロセルロース上に、15 cm側からそれぞれ2 cmおよび1 cmの距離をおいて、分配した。ニトロセルロースの切片を37℃で約20分間、放置して乾燥させ、つぎに20 mM TRIS、pH8に溶解したポリビニルアルコール(PVA, MW 13,000-23,000)溶液で、室温で30分間ブロックした。次にこの切片を水ですすぎ、乾燥した。
実施例37
ポリクローナル抗TCA(C-2)抗体を用いたイミプラミンのイムノクロマトグラフィーアッセイ
この実施例においても上記と同じニトロセルロースを微粒子のための分離用メンブランとして使用した(トップメンブラン)。米国特許第5,770,458号に詳細に記載されるように、2-メンブランストリップ構造の構築を行なった。簡単に述べると、トップメンブランをメインメンブランと同じ手順を用いてブロックし、洗浄した。Adhesive Research Inc.製の接着マイラーで、適当な量の微粒子を含有するトップメンブランをメインメンブランに重ねて積層板とした。この後、その切片を5 mm幅のストリップに切断し、サンプルパッドおよびシンクパッドをそれぞれストリップの開始および終末末端に配置した。BioRad Laboratories製セルロース(ゲルブロッター)をサンプル受けパッドおよびシンクパッドのいずれにも使用した。予め決定された量の薬物(TCA標準物質)を含有する約100μl溶液をこのメンブランストリップ上に供することによって、検量線が得られた。シグナル強度はつぎのように判定された:2.5から3.0 = ダークブルー、1.5から2.0 = ミディアムブルー、1.0 = ライトブルー、0.5 = ほとんど感知できない色、および0 = 無色。ストリップが無色であると読みとられた場合、完全な阻害が実現しており、試料は1000 ng/mlのTCA標準物質(たとえばイミプラミン)を含有することが示された。結果を下記の表2-5および図4に示す。
Claims (3)
- 三環系抗うつ薬、その誘導体および代謝物からなる群から選択されるアナライトを測定するためのイムノアッセイ法であって、
(a) 前記アナライトを含有すると推定される試料を、前記アナライトに特異的な抗体、および下記の構造:
(b) 前記の検出可能な複合体の存在または量を、前記試料中の前記アナライトの指標として測定すること、
からなるステップを含んでなる上記方法。 - 三環系抗うつ薬、その誘導体および代謝物からなる群から選択されるアナライトを測定するためのイムノアッセイ法であって、
(a) 前記アナライトを含有すると推定される試料を、下記の構造:
の免疫原から作製された抗体、および下記の構造:
(b) 前記の検出可能な複合体の存在または量を、前記試料中の前記アナライトの指標として測定すること、
からなるステップを含んでなる上記方法。
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