ES2319257T3 - Derivados triciclicos antidepresivos e inmunoensayo. - Google Patents
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Abstract
Compuesto que tiene la estructura ** ver fórmula** en la que R 1 es una cadena de 0-10 átomos de carbono o heteroátomos, saturada o no saturada, sustituida o no sustituida, recta o ramificada. X es un grupo enlazador que consiste en 0-2 anillos aromáticos sustituidos o no sustituidos e Y es un éster activado o N H- Z, en la que Z es un poli(aminoácido) o polisacárido.
Description
Derivados tricíclicos antidepresivos e
inmunoensayo.
La presente invención se refiere de manera
general al sector de medición de un analito en un medio líquido.
Más específicamente, se refiere a un inmunoensayo y a reactivos
útiles para la determinación de un analito en una muestra biológica
y en particular, para la determinación de fármacos antidepresivos
tricíclicos.
La presente invención se refiere a un nuevo
inmunógeno antidepresivo tricíclico (TCA) utilizado para la
generación de anticuerpos policlonales y monoclonales con respecto
a los TCA. El nuevo inmunógeno se caracteriza por un doble enlace
saturado en la parte de amitriptilina de la molécula (dihidro
amitriptilina). La invención se refiere también a derivados de
hapteno activados por TCA utilizados para preparar trazadores y
conjugados para inmunoensayos TCA utilizando un anticuerpo
producido a partir del inmunógeno de estructura I derivatizado en
la posición C-2 con un conjugado de derivatización
en oposición N-1 de imipramina o un conjugado
derivatizado en la posición C-2 de
dihidro-amitriptilina. Los inmunoensayos de la
presente invención incluyen un ensayo de cribado único, cualitativo
o semicuantitativo, toxicológico, que reconocería de manera amplia
los antidepresivos tricíclicos como clase.
La presente invención comprende las siguientes
realizaciones:
un compuesto que tiene la estructura
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en la que R_{1} es una cadena de
0-10 átomos de carbono o heteroátomos saturada o no,
sustituida o no sustituida, recta o ramificada, X es un grupo
enlazador que consiste en 0-2 anillos aromáticos
sustituidos o no sustituidos e Y es un éster activado o
NH-Z, en la que Z es un
poli(aminoácido);
un inmunógeno que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
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en la que Z es un
poli(aminoácido);
un anticuerpo producido como respuesta a un
inmunógeno de estructura II;
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un hapteno activado que tiene la estructura
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un hapteno activado que tiene la
estructura
\vskip1.000000\baselineskip
un hapteno activado que tiene la
estructura
un hapteno activado que tiene la
estructura
un inmunoensayo para un fármaco
antidepresivo tricíclico utilizando un anticuerpo producido a partir
de un inmunógeno de estructura II y un fármaco conjugado derivado
de una estructura III, VI, V y
VI,
un inmunoensayo para un fármaco antidepresivo
tricíclico utilizando un anticuerpo específico para un antidepresivo
tricíclico y un fármaco conjugado derivado de la estructura III,
VI, V y VI; y
un inmunoensayo para un fármaco antidepresivo
tricíclico utilizando un anticuerpo producido a partir de un
inmunógeno de estructura II y un análogo de fármaco antidepresivo
tricíclico.
Las figuras 1(a), 1(b) y
1(c) son diagramas esquemáticos que muestran la síntesis de
dos conjugados de proteínas de la presente invención, los
compuestos 10 y 11 (estructura II).
La figura 2 es un diagrama esquemático que
muestra la síntesis del compuesto 14 (estructura IV).
La figura 3 es un diagrama esquemático que
muestra la síntesis del compuesto 16 (estructura III).
Las figuras 4(a) y 4(b) son
diagramas esquemáticos que muestran la síntesis del compuesto 22
(estructura V). La figura 4(c) es un diagrama esquemático
que muestra la síntesis del clorhidrato de metil
4-aminometilbenzoato (compuesto 20) utilizado en la
síntesis del compuesto 22.
La figura 5 es un diagrama esquemático que
muestra la síntesis del compuesto 26 (estructura VI).
La figura 6 muestra las estructuras de los
compuestos 27, 28, 29 y 30.
La figura 7 es un gráfico que muestra curvas
estándar (respuesta de dosis) generadas a partir de datos obtenidos
utilizando conjugados y anticuerpos de la presente invención en un
inmunoensayo de encimas basado en una placa de micropocillos.
Las figuras 8 y 9 son gráficos que muestran
curvas estándar (respuesta a la dosis) generadas de datos obtenidos
utilizando conjugados y anticuerpos de la presente invención en un
inmunoensayo de flujo lateral.
Los compuestos antidepresivos tricíclicos que se
pueden detectar en un ensayo de acuerdo con la presente invención
incluyen derivados de dibenzazepin, dibenzocilcoheptadieno y
dibenzoxepina caracterizándose por la fórmula
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en la que V es CH_{2} o CH=, W es
CH_{2}, O ó =CH, X_{1} es N ó C=, Y_{1} es CH_{2} ó =CH- y R
es H ó CH_{3}. Son ejemplos de dichos compuestos antidepresivos
tricíclicos la imipramina, desipramina, amitriptilina,
nortriptilina, protriptilina, trimipramina, clomipramina y
doxepina.
En la comprobación para pequeños analitos tales
como moléculas de fármacos, se han demostrado especialmente
ventajosos los inmunoensayos, particularmente los inmunoensayos de
unión competitiva. En los inmunoensayos de unión competitiva un
analito en una muestra biológica compite con un reactivo marcado o
análogo de analito o trazador, por un número limitado de sitios de
unión receptores en anticuerpos específicos para el analito y
análogo del analito. Se utilizan como trazadores enzimas tales como
\beta-galactosidasa y peroxidasa, moléculas
fluorescentes tales como compuestos de fluoresceína, compuestos
radiactivos tales como ^{125}I, y micropartículas como sustancias
marcadoras comunes. La concentración de analito en la muestra
determina la cantidad de análogo de analito que se unirá al
anticuerpo. La cantidad de análogo de analito que se unirá es
inversamente proporcional a la concentración de analito en la
muestra, porque el analito y el análogo de analito se unen al
anticuerpo en proporción a sus respectivas concentraciones. La
cantidad de análogo de analito libre o unido se puede determinar
por métodos apropiados al marcador específico utilizado.
Se pueden utilizar diferentes tipos de proteínas
tales como material antigénico poli(aminoácido). Estos tipos
comprenden albúminas, proteínas de suero, por ejemplo globulinas,
proteínas del entorno ocular, lipoproteínas y otros. Entre las
proteínas, a título de ejemplo se incluyen suero albúmina bovina,
hemocianina de la lapa "keyhole limpet", ovalbúmina de huevo,
gamma-globulina bovina y otros. De manera
alternativa, se pueden preparar aminopolisacáridos, tales como
aminodextrano o poli(aminoácidos) sintéticos con el
suficiente número de grupos amino disponibles, por ejemplo,
lisinas.
En el método de la invención, una mezcla que se
sospecha que contiene imipramina, desipramina, amitriptilina,
nortriptilina o un fármaco estructuralmente relacionado se combina
con un anticuerpo que tiene especificidad para la imipramina,
desipramina, amitriptilina, nortriptilina y un análogo del halito
marcado que puede interaccionar con la combinación de anticuerpo y
su correspondiente analito a efectos de detectar la presencia de los
analitos en los niveles de corte seleccionados solos o en
combinación. La invención puede ser utilizada con cualquier tipo de
formato de inmunoensayo, por ejemplo ensayo de aglutinación
turbidométrica, radioinmunoensayo, inmunoensayo de enzimas,
inmunoensayo de polarización fluorescente o inmunocromatografía de
flujo lateral. Una utilización potencial de la presente invención
es con formatos aglutinométricos susceptibles a método instrumental
para la medición de los cambios provocados por la reacción de
aglutinación. Se pueden utilizar de manera adecuada para el
análisis aglutinométrico tanto aparatos manuales como automatizados
de prueba. De manera típica, la instrumentación automatizada
funcionará utilizando una serie de contenedores o recipientes de
reactivos de los que se pipeteará la cantidad apropiada de cada
reactivo para adición a la muestra. Para inmunoensayos tales como
el ensayo de aglutinación del sujeto, esto comporta usualmente, como
mínimo, dos de dichos recipientes, de manera típica, uno para un
reactivo anticuerpo y el otro para las micropartículas unidas con el
ligando correspondiente. De manera alternativa, un contenedor puede
comprender un reactivo conjugado del análogo del ligando y el otro
comprende micropartículas unidas con el anticuerpo. Se pueden
encontrar presentes en algunos instrumentos contenedores o
recipientes adicionales conteniendo diluyentes, tampones u otros
aditivos para tratamiento apropiado de la muestra.
El analizador clínico pipetea los reactivos y
muestras que contiene y los pasa a una cubeta en la que tiene lugar
la reacción de aglomeración competitiva y se realiza la medición de
la turbidez. Por ejemplo, utilizando el analizador HITACHI 917
(Roche Diagnostics) y los fármacos del ABUSCREEN® OnLine del equipo
de reactivos (Roche Diagnostics), se pipetea una muestra de orina
con diluyente de muestra en la cubeta, seguido inmediatamente de la
cantidad apropiada de reactivo anticuerpo y efectuando mezcla. Se
toma una lectura inicial de espectrofotómetro. A continuación, se
transfiere la cantidad apropiada de reactivo de micropartículas a la
cubeta y se mezcla la reacción. Después de un breve periodo de
incubación se realiza una medición de turbidez final. El cambio
general de turbidez (absorbancia) en la reacción es comparado con
una cuba de calibrado y se anotan los resultados en ng/ml.
El ensayo ELISA basado en micropocillos (ensayo
inmunoabsorbente relacionado con enzimas) es una tecnología bien
conocida que ha sido ampliamente aplicada para desarrollar
inmunoensayos de enzimas para diferentes analitos y proteínas. El
ensayo ELISA competitivo ha sido aplicado para desarrollar
inmunoensayos de enzimas sensibles para pequeños analitos tales
como moléculas de fármaco. La presente invención puede ser utilizada
en ELISA competitivo para la cuantificación de los TCA en fluidos
biológicos. En el método de la invención, una muestra de la que se
sospecha que contiene, por ejemplo, imipramina o compuestos
estructuralmente relacionados, es diluida y añadida a placas de
micropocillos debidamente recubiertos con cualquiera de los
conjugados de TCA dados a conocer en la presente invención, seguido
de una cantidad predeterminada de anticuerpo
anti-TCA. Después de la incubación, los pocillos
pueden ser sometidos a proceso con el proceso ELISA estándar
(anticuerpo secundario marcado con la enzima apropiada, sustrato,
etapas de lavado intermedias y medición de densidades ópticas). Las
densidades ópticas pueden ser representadas en un gráfico con
respecto a la concentración final de imipramina o compuesto
relacionado estructuralmente con TCA seleccionado como calibrador y
calculado como concentración molecular.
Los procesos de inmunoensayo mediante
polarización de fluorescencia proporcionan un medio cuantitativo
para la medición de la cantidad del conjugado
trazador-anticuerpo producido en un inmunoensayo de
unión competitivo. Estas técnicas de polarización por fluorescencia
están basadas en el principio de que un compuesto marcado
fluorescente, una vez excitado por luz polarizada plana, emitirá
fluorescencia que tiene un grado de polarización inversamente
relacionado con su velocidad de rotación. De acuerdo con ello,
cuando un conjugado trazador-anticuerpo que tiene
un marcador fluorescente es excitado con luz polarizada plana, la
luz emitida permanece altamente polarizada a causa de que el
fluoróforo no puede girar entre el tiempo en que la luz es absorbida
y emitida. Como contraste, cuando un trazador no unido es excitado
mediante luz polarizada plana, su rotación es mucho más rápida que
el correspondiente conjugado trazador-anticuerpo y
las moléculas están más orientadas al azar. Como resultado, la luz
emitida desde las moléculas del trazador no unido es
despolarizada.
Se ha utilizado la inmunocromatografía de flujo
lateral para desarrollar un ensayo rápido de banda ("strip
assay"), no basado en instrumentos, para inmunoensayos
cualitativos. El ensayo inmunocromatográfico de banda está basado
en el principio del inmunoensayo competitivo en el que el fármaco en
la orina compite con un fármaco impregnado en la membrana conjugado
para el anticuerpo específico sobre micropartículas dotadas de color
tales como un sol de oro o látex teñido. El aspecto de una barra
coloreada en la zona de detección (área de impregnación del
fármaco) para el fármaco indica un resultado negativo. No se
observan bandas si el fármaco se encuentra presente en la muestra
de orina en o por encima de la concentración de corte para el
correspondiente ensayo. La presente invención es útil para el
desarrollo de dispositivos de bandas de membrana que sirven como
inmunoensayo de cribado toxicológico para los TCA.
Por antidepresivo tricíclico (TCA) se comprende
cualquier grupo de fármacos habitualmente utilizados para el
tratamiento de la depresión, los cuales tienen una estructura
química similar, un triple anillo con una cadena lateral de
metilaminopropano. Son ejemplos de este grupo imipramina,
desipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina,
trimipramina, clomipramina, doxepina, tal como derivados
biológicamente o terapéuticamente activos y metabolitos de los
mismos.
El término analito se refiere a la sustancia o
grupo de sustancias cuya presencia o cantidad en el medio líquido
se tiene que determinar y significa que incluye cualquier fármaco o
derivado de fármaco, hormona, antígeno de proteína u
oligonucleótido.
Análogo de analito significa cualquier sustancia
o grupo de sustancias que se comporta esencialmente igual que el
analito con respecto a afinidad de unión del anticuerpo para el
analito y significa que incluye cualquier fármaco antidepresivo
tricícilico o derivado así como metabolitos e isómeros de los
mismos.
Anticuerpo o receptor significa un asociado de
unión específico del analito y está destinado a incluir cualquier
sustancia o grupo de sustancias que tiene una afinidad de unión
específica para el analito con respecto a la exclusión de otras
sustancias. El término incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos
monoclonales y fragmentos de anticuerpos.
Los haptenos son antígenos parciales o
incompletos. Son sustancias libres de proteínas, en su mayor parte
sustancias de bajo peso molecular, que no son capaces de estimular
formación de anticuerpos pero que reaccionan con anticuerpos. Éstos
últimos se forman acoplando el hapteno a un portador de alto peso
molecular e inyectando este producto acoplado en humanos o
animales. Se incluyen entre los ejemplos de hapteno los fármacos
terapéuticos tales como digoxina y teofilina, fármacos de abuso,
tales como morfina y LSD, antibióticos tales como gentamicina y
vancomicina, hormonas tales como estrógeno y progesterona, vitaminas
tales como vitamina B12 y ácido fólico, tiroxina, histamina,
serotonina, adrenalina y otros.
Un hapteno activado significa un derivado de
hapteno que ha sido dotado de un lugar disponible para reacción,
por ejemplo, por el acoplamiento de un grupo de enlace para
sintetizar un conjugado derivado.
Un portador, tal como se utiliza este término en
esta descripción, es una sustancia inmunogénica, habitualmente una
proteína, que se puede unir con un hapteno, habilitando así que el
hapteno estimule una respuesta inmune. Entre las sustancias
portadoras se incluyen proteínas, glicoproteínas, polisacáridos
complejos y ácidos nucleicos que son reconocidos como extraños y
por lo tanto elicitan una respuesta inmunológica del hospedante.
Los términos inmunógeno e inmunogénico
utilizados en esta descripción se refieren a sustancias capaces de
producir o generar una respuesta inmune en un organismo.
El término derivado se refiere a un compuesto
químico o molecular preparado a partir de un compuesto tal como
molécula parental mediante una o varias reacciones químicas.
Los grupos de enlace son utilizados para
activar, es decir, proporcionar un sitio disponible en un derivado
de fármaco para sintetizar un hapteno. La utilización de un grupo de
enlace puede ser o no ventajosa o necesaria, dependiendo en el
hapteno específico y pares de portador. El término enlazador se
refiere a una fracción química que conecta un hapteno a un
portador, inmunógeno, marcador, trazador u otro enlazador. Los
enlazadores pueden ser cadenas de carbonos rectas o ramificadas,
saturadas o insaturadas. También pueden incluir uno o varios
heteroátomos en la cadena o en los terminales de las cadenas. Por
heteroátomos se comprenden átomos distintos del carbono que son
escogidos del grupo que comprende oxígeno, nitrógeno y azufre.
Tal como se utiliza en esta descripción, una
molécula detectora, marcador o trazador es una etiqueta
identificadora que cuando es acoplada a una sustancia portadora o
molécula portadora puede ser utilizada para detectar un analito.
Una etiqueta puede ser fijada a su sustancia portadora o anticuerpo
directamente o indirectamente por medio de una fracción de enlace o
de puente. Se incluyen entre los ejemplos de las etiquetas enzimas
tales como \beta-galactosidasa y peroxidada,
compuestos fluorescentes tales como rodamina e isotiocianato de
fluoresceína (FITC), compuestos luminiscentes, tales como
dioxiatanos y luciferina e isótopos radioactivos tales como
^{125}I.
Un péptido es cualquier compuesto formado por el
enlace de dos o más aminoácidos por enlaces amida (péptido),
usualmente un polímero de \alpha-aminoácidos en el
que el grupo \alpha-amino de cada residuo de
aminoácido (excepto el terminal NH_{2)} está enlazado al grupo
\alpha-carboxilo del siguiente residuo en una
cadena lineal. Los términos péptido, polipéptido y
poli(aminoácido) se utilizan como sinónimos en esta
descripción para hacer referencia a esta clase de compuestos sin
restricción en cuanto a dimensiones. Los elementos mayores de esta
clase reciben la designación de proteínas.
Cualquier muestra de la que se sospeche
razonablemente que contiene el analito, es decir, un fármaco
antidepresivo tricíclico, puede ser analizada por el método de la
presente invención. La muestra es típicamente una solución acuosa
tal como un fluido corporal procedente del hospedante, por ejemplo
orina, sangre entera, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputos,
fluido cerebroespinal, lágrimas, mocos o similares, pero
preferentemente se trata de plasma o suero. La muestra puede ser
pretratada en caso deseado y puede ser preparada en cualquier medio
conveniente que no interfiera con el ensayo. Es preferible un medio
acuoso.
El material de calibrado significa cualquier
material estándar o de referencia que contenga una cantidad conocida
del analito a medir. La muestra de la que se sospecha que contiene
el analito y el material de calibrado son ensayados en condiciones
similares. A continuación, se calcula la concentración de analito
comparando los resultados obtenidos para la muestra desconocida con
los resultados obtenidos para la norma. Esto se lleva a cabo
habitualmente por construcción de una curva de calibrado tal como en
las figuras 6 y 7.
Se utilizarán frecuentemente varios materiales
auxiliares en un ensayo de acuerdo con la presente invención. Por
ejemplo, los tampones se encontrarán frecuentemente presentes en el
medio de ensayo y también estabilizantes para el medio de ensayo y
los componentes de ensayo. Frecuentemente, además de estos aditivos,
se pueden incluir proteínas adicionales tales como albúmina o
tensoactivos, particularmente tensoactivos no iónicos o
similares.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a equipos útiles para llevar a cabo de forma cómoda los métodos de
ensayo de la invención para la determinación de un analito. Para
favorecer la versatilidad de la presente invención, los reactivos
utilizables en los métodos de la invención pueden ser facilitados en
una combinación envasada, en los mismos contenedores o contenedores
separados, en forma líquida o liofilizada, de manera que la
proporción de los reactivos facilita la optimización sustancial del
método y del ensayo. Cada uno de los reactivos pueden encontrarse
en contenedores separados o bien varios reactivos pueden ser
combinados en uno o varios contenedores dependiendo de la
reactividad cruzada y estabilidad de los reactivos.
La presente invención comprende también un
equipo de pruebas de reactivos que comprende, en una combinación
envasada, un anticuerpo específico para imipramina, desipramina,
amitriptilina o nortriptilina, un complejo que comprenda un ligando
de un derivado de TCA acoplado a una fracción de marcado y
opcionalmente puede comprender también uno o varios calibradores
que comprenden una cantidad conocida de una sustancia seleccionada
entre el grupo que consiste en imipramina, desipramina,
amitriptilina y nortriptilina. Este equipo de pruebas proporciona
reactivos para un ensayo con sensibilidad clínica mejorada para
imipramina, desipramina, amitriptilina, nortriptilina y compuestos
estructuralmente relacionados.
En los ejemplos siguientes, los numerales en
negrita se refieren a la estructura correspondiente en los
dibujos.
Una mezcla de 15 g (89 mmol) de ácido
m-metoxifenil acético, 13,2 g (89 mmol) de anhídrido
ftálico y 246 mg (2.9 mmol) de acetato sódico se calentaron a 240ºC
durante 6 horas y se retiró agua de forma continua de la reacción.
Se formó un sólido en el recipiente de la reacción al enfriar. Éste
fue recristalizado a partir de etanol absoluto obteniendo 15,6 g
(62 mmol, 69%) de 1 en forma de polvo amarillo.
Una solución de 15,6 g de 1 (62 mmol) en 300 ml
de THF fue añadida a 30 g de Pd-C a 10%, 40 g de
formato amónico y 17,2 ml de trietil amina. La mezcla de la
reacción fue calentada a 70ºC durante 6 horas y se filtró. El
filtrado fue concentrado y redisuelto en 500 ml de acetato etilo y
lavado con 2x150 ml de HCl en solución acuosa al 3% y 2x100 ml de
salmuera. La capa orgánica fue concentrada y triturada con 1:1 de
etil acetato:hexano proporcionando 8 g (31,2 mmol, 51%) de 2.
A 5 g de pentóxido fosforoso se añadieron 50 ml
de ácido metansulfónico. La mezcla fue calentada a 80ºC durante una
hora. La mezcla de reacción fue llevada a 40ºC y se añadieron 3 g
(11,7 mmol) de 2 en forma de sólido. La mezcla fue calentada a 40ºC
durante 1 hora y enfriada a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción fue vertida en 300 ml de hielo/agua y extraída con 200 ml
de acetato de etilo. La capa orgánica fue lavada con 2x150 ml de
agua, 2x150 de NaHCO_{3} saturado y 100 ml de agua. La capa
orgánica resultante fue secada (Na_{2}SO_{4}) y concentrada
proporcionando 2,6 g (11,7 mmol, 94%) de 3 en forma de un polvo
blancuzco.
A 30 g de virutas de magnesio se añadieron 100
ml de THF recién destilado y una cantidad catalítica de yodo. La
mezcla de la reacción fue calentada hasta reflujo durante 10 minutos
y enfriada a temperatura ambiente. A esta mezcla de reacción se
añadieron 3,5 g (29 mmol) de
3-cloro-N,N-dimetilpropano
y la mezcla de reacción fue calentada a reflujo durante 3 horas. La
mezcla de reacción fue enfriada a temperatura ambiente y se añadió
una solución de 2 g de 3 (8,3 mmol) en 20 ml de THF recién
destilado. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente
durante 2 horas y se filtró. Se añadieron al filtrado 10 ml de
solución saturada de cloruro amónico y se concentró para retirar
THF. Éste fue diluido con 100 ml de cloruro amónico saturado y
extraído con acetato de etilo (3x150 ml). La capa orgánica
combinada fue lavado con 2x75 ml de NaHCO_{3} saturado y 2x75 ml
de agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. El producto
crudo fue purificado por cromatografía de columnas de gel de sílice
utilizando metanol en diclorometano al 10% proporcionando 2,6 g (7,9
mmol, 95%) de 4 en forma de un polvo blanco.
A 65 mg (0,19 mmol) de 4 se añadieron 5 ml de
ácido acético glacial. La mezcla fue calentada a 60ºC y se dejó en
agitación hasta que la mezcla fue homogénea. La mezcla de reacción
se enfrió a temperatura ambiente y se añadieron 300 mg de Pd/C al
10% seguido de 1 g de formato amónico. La mezcla fue calentada a
70ºC y se dejaron en agitación a dicha temperatura durante 4 horas.
La mezcla de reacción fue enfriada a temperatura ambiente y
filtrada. El residuo fue lavado con 50 ml de diclorometano. El
filtrado combinado fue concentrado. El residuo fue disuelto en 100
ml de diclorometano y lavado con 2x50 ml de NaHCO_{3} saturado
seguido de 2x50 ml de salmuera. La parte orgánica fue secada
(Na_{2}SO_{4}) y se concentró proporcionando 50 mg (0,16 mmol,
82%) de 5.
A 35 ml de diclorometano recién destilado se
añadieron 1,98 ml de tribromuro de boro. La mezcla de reacción fue
colocada en un baño de agua. A la mezcla de reacción se añadió una
solución de 1,1 g (3,5 mmol) de 5 en 15 ml de diclorometano gota a
gota. La mezcla se dejó en agitación a temperatura ambiente
(23-26ºC) durante 30 minutos y se vertió en 50 g de
hielo/agua. Se añadieron además 50 ml de agua y se extrajo con 3x100
ml de cloroformo. La capa orgánica combinada fue secada
(Na_{2}SO_{4}) y concentrada proporcionando 1,2 g (3,18 mmol,
90%) de 6 en forma de sólido blancuzco.
A 500 mg (1,32 mmol) de 6 se añadieron 10 ml de
acetona recién destilada (destilada sobre K_{2}CO_{3} anhidro)
y 10 ml de DMF anhidro. A esta mezcla de reacción se añadieron 450
mg(3,0 mmol) de yoduro sódico, 2g de 4ºA criba molecular, 2
g (6,13 mmol) de carbonato de cesio y una cantidad catalítica de
18-crown-6. A esta mezcla de
reacción se añadieron 500 \mul (3,38 mmol) de etil
4-bromobutirato y la mezcla de reacción fue
calentada en un baño de aceite precalentado (90ºC) bajo atmósfera
de argón durante 18 horas. La mezcla fue enfriada a temperatura
ambiente y filtrada. El residuo fue lavado con 30 ml de cloroformo.
El filtrado combinado fue concentrado a presión reducida y
redisuelto en 100 ml de diclorometano. Éste fue lavado con 2x100 ml
de NaOH al 5% seguido por 2x100 ml de agua, se secó
(Na_{2}SO_{4}) y se concentró. El residuo fue purificado por
cromatografía de columna de gel de sílice utilizando metanol al 10%
en diclorometano proporcionando 450 mg (1,09 mmol, 83%) de 7 en
forma de un aceite parduzco.
A una solución de 875 mg de 7 (2,1 mmol) en 10
ml de THF recién destilado se añadió una solución de 875 mg de
hidróxido de litio en 10 ml de agua y 5 ml de metanol. La reacción
se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y se
concentró para eliminar THF y metanol. El residuo acuoso fue
ajustado a pH6 con 6N HCl. Éste fue extraído con 3x100 ml de
diclorometano. El pH de la parte acuosa se reajustó a valor 6
nuevamente después de una primera extracción. La parte orgánica
combinada fue secada (Na_{2}SO_{4}) y concentrada
proporcionando 790 mg (2,0 mmol, 97%) de 8 en forma de sólido amorfo
de color blanco.
A una solución de 200 mg (0.52 mmol) de 8 en 40
ml de diclorometano (destilado sobre hidruro cálcico) se añadieron
92 mg (0,8 mmol) de N-hidroxisuccinimida y 152 mg
(0,8 mmol) de clorhidrato (EDC) de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente
durante 48 horas. La mezcla de reacción fue diluida con 50 ml de
diclorometano y lavada con 50 ml de salmuera, 2x50 ml de bicarbonato
sódico saturado seguido de 2x50 ml de salmuera. La solución
resultante fue secada (Na_{2}SO_{4}) y concentrada consiguiendo
245 mg (0,51 mmol, 98%) de 9 en forma de sólido blanco.
738 mg de tiroglobulina bovina en 12 ml de
fosfato potásico 50 mM (pH 7,5), fueron enfriados en una baño de
hielo. A la solución se añadieron 37 ml de dimetilsulfóxido gota a
gota y la temperatura de reacción se mantuvo por debajo de la
temperatura ambiente. A la solución de proteína se añadió una
solución de 111 mg (0,23 mmol) de 9 en 1 ml de DMF gota a gota. La
mezcla se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas.
El conjugado resultante fue colocado en un tubo de diálisis (corte
peso molecular 50.000) y se dializó en 2 L de DMSO al 70% en
fosfato potásico 50 mM (pH 7,5, 3 cambios, como mínimo, de 3 horas
cada uno de ellos), 2 L de DMSO al 50% en fosfato potásico 50 mM
(como mínimo 3 horas), 2 L de DMSO al 30% en fosfato potásico 50 mM
(como mínimo 3 horas), 10% de DMSO en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas) a temperatura ambiente seguido de 6 cambios con
fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) a 4ºC (2 L cada vez durante un
mínimo de 6 horas cada vez). La concentración de proteína fue
determinada en 3,9 mg/ml utilizando el ensayo de proteína de azul
Coomassie Biorad (Bradford,M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976). Se
obtuvo un total de 100 ml del conjugado. La extensión de la
modificación de lisina disponible se determinó que era 70% por el
método TNBS (Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14,
328-34, 1988).
Una solución de 1g de albúmina de suero bovino
(BSA) en 16 ml de fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) fue enfriada en
un baño de hielo. Se añadieron a la solución 19 ml de DMSO gota a
gota y la temperatura de la reacción se mantuvo por debajo de la
temperatura ambiente. Se añadió a la solución de la proteína una
solución de 18,1 mg (0,038 mmol) de derivado éster (9) de TCA NHS
posición C-2 en 1,5 ml de DMF anhidro, gota a gota.
La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente
durante 48 horas. El conjugado resultante fue colocado en un tubo
de diálisis (corte peso molecular 10.000) y se dializó en 2 L de
DMSO a 60% en fosfato potásico 50 mM (3 cambios, como mínimo de 3
horas cada uno), 2 L de DMSO a 50% en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas), 2 L de DMSO al 30% en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas), 2 L de DMSO al 10% en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas) a temperatura ambiente seguido por 6 cambios con
fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) a 4ºC (2 L cada uno durante un
mínimo de 6 horas cada uno de ellos). Se obtuvo un total de 70 ml
de conjugado TCA-BSA. La concentración de proteína
se determinó que era 8,2 mg/ml utilizando azul Coomassie Biorad en
ensayo de proteína. Proporción general fármaco:BSA= 2,5:1.
Una solución de 100 mg (0,34 mmol) de derivado
de hidroxi TCA 6 en 3 ml de DMF bajo atmósfera de argón fue tratada
con 16 mg (0,4 mmol) de NaH (60% dispersión en aceite mineral) y se
agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla fue
tratada a continuación con 85 mg (0,37 mmol) de
metil-4-(bromometil)benzoato y se agitó a
temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción se diluyó con
CH_{2}Cl_{2} y se lavó con 50 mM KPO_{4}, pH7. La parte
acuosa fue extraída una vez con CH_{2}Cl_{2}. Las partes
combinadas de CH_{2}Cl_{2} fueron secadas sobre
Na_{2}SO_{4} y concentradas en vacío en forma de aceite. Éste
fue cromatografiado sobre 20 g de gel de sílice utilizando 3% MeOH
en CH_{2}Cl_{2} como diluyente, consiguiendo 46 mg (31%) de 12
en forma de aceite amarillo pálido.
Una solución de 46 mg (0,104 mmol) de 12 en 4,5
ml de MeOH y 0,5 ml de H_{2}O en atmósfera de argón fue tratada
con 28 mg (0,202 mmol) de K_{2}CO_{3} y se calentó a reflujo
durante 4 horas. La reacción fue concentrada en vacío. El residuo
fue disuelto en H_{2}O y el pH se ajustó a 6,5 con HCl diluido. Se
forma un precipitado. Éste fue extraído con 3x10 ml de
CH_{2}Cl_{2}, secado sobre Na_{2}SO_{4} y concentrado al
vacío proporcionado 35 mg (79%) de 13 en forma de sólido amorfo
blancuzco.
Una solución de 35 mg (0,082 mmol) de ácido 13
en 5 ml de CH_{2}Cl_{2} bajo atmósfera de argón fue tratada con
25 mg (0,217 mmol) de N-hidroxisuccinimida y 40 mg
(0,209 mmol) de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
HCl y se agitó a temperatura ambiente durante toda una noche. La
reacción fue lavada con H_{2}O, NaHCO_{3} saturado y salmuera,
se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en vacío
proporcionando 30 mg (70%) de 14 en forma de sólido amorfo de color
blanco.
Una mezcla de 32 mg (0,212 mmol) de ácido
4-(aminometil)benzoico en 2 ml de H_{2}O y 4 ml de THF fue
tratada aproximadamente con 0,1 ml de 2 N NaOH de manera tal que el
pH de la mezcla fue de aproximadamente 9. Éste fue tratado con una
solución de 100 mg (0,209 mmol) del éster TCA NHS 9 en 4,5 ml de
THF. El pH fue ajustado aproximadamente a 8,5-9,0
con 2N NaOH y la reacción fue agitada a temperatura ambiente durante
15 minutos. La reacción fue neutralizada a pH6 con 2N HCl y luego
extraída dos veces con CH_{2}Cl_{2.} Las partes
CH_{2}Cl_{2} fueron combinadas, secadas sobre Na_{2}SO_{4}
anhidro y concentradas en vacío para proporcionar 87 mg (81%) del
ácido 15 en forma de un aceite amarillo pálido. Éste fue utilizado
en la siguiente etapa sin más purificación.
Se trata una solución de 87 mg (0,169 mmol) del
ácido (15) en 10 ml de CH_{2}Cl_{2} con 40 mg (0,348 mmol) de
N-hidroxisuccinimida y 87 mg (0,454 mmol) de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
HCl y se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La
reacción fue lavada con H_{2}O, NaHCO_{3} saturado y salmuera,
se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en vacío. El residuo
fue cromatografiado sobre gel de sílice utilizando éter al 10% en
CH_{2}Cl_{2} como diluyente proporcionando 34 mg (33%) de 16 en
forma de sólido amorfo de color blanco.
Una solución de 6,02 g (19,8 mmol) de
clorhidrato de desipramina se dejó en agitación a temperatura
ambiente durante 5 minutos. Se extrajo con 6 x 100 ml de
cloroformo. La parte orgánica combinada fue lavada con 100 ml de
agua, se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró
proporcionado 5,25 g de desipramina base libre. Se añadió una
solución de 2,82 g (10,6 mmol) de desipramina base libre en 100 ml
de acetona anhidro. A esta mezcla de reacción se añadieron 2,03 ml
(15,8 mmol) de
etil-3-bromopropionato, 3,65 g (26,4
mmol) de carbonato potásico anhidro, 264 mg (1,76 mmol) de ioduro
sódico, 5 mg de 18-crown-6 y 0,7 ml
de DMF anhidro. La mezcla de reacción se dejó en reflujo en una
atmósfera de argón durante toda una noche. La mezcla fue filtrada y
el residuo fue lavado con 20 ml de acetona. El filtrado combinado
fue concentrado y purificado por cromatografía de columna de gel de
sílice utilizando metanol al 4% en acetato de etilo proporcionando
3,45 g (9,41 mmol, 89%) del etil éster (17) en forma de un aceite
espeso.
A 2,15 g (5,86 mmol) del etil éster (17) se
añadieron 29,6 ml de THF recién destilado, 29,6 ml de metanol y una
solución de 4,7 g de hidróxido de litio en 63 ml de agua. Esta
mezcla se dejo en agitación a temperatura ambiente durante una
noche y se concentró para eliminar el metanol y el THF. El pH de la
solución acuosa se ajustó a 6. Se extrajo con 6x100 ml de
cloroformo. Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con 100 ml
de agua, secadas (Na_{2}SO_{4} anhidro) y concentradas
proporcionando 1,97 g (5,82 mmol, 99%) de 18 en forma de un sólido
amorfo de color blanco.
A una solución de 0,93 g (2,74 mmol) de 18 en
100 ml de diclorometano anhidro se añadieron 446 mg (2,21 mmol) de
clorhidrato de metil aminometil benzoato (20), seguido de 1,05 g
(5,47 mmol)
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida.
La mezcla se dejó en agitación a temperatura ambiente durante toda
una noche. A la mezcla de reacción se añadieron 100 ml de agua y 20
ml de diclorometano. La capa orgánica fue separada y la parte acuosa
fue extraída con 4x75 ml de diclorometano. La capa orgánica
combinada fue lavada con 2x100 ml de agua, secada (Na_{2}SO_{4})
y concentrada. La reacción anterior fue repetida utilizando 1,02 g
de (18). El producto crudo combinado fue purificado por
cromatografía de columna de gel de sílice utilizando 30% de
cloroformo en metanol, proporcionando 1,2 g (2,47 mmol, 43%) del
metil éster (19). También se obtuvieron otros 760 mg del producto
conteniendo una pequeña cantidad de impurezas.
Una suspensión agitada magnéticamente de 6,05 g
(40 mmol) de ácido aminometil benzoico en 480 ml de metanol fue
enfriada a -20ºC. Se añadieron a la mezcla de reacción 12,3 ml de
cloruro tionilo durante un periodo de 10 minutos. La mezcla de
reacción fue calentada hasta 4ºC y se dejó en agitación a la
temperatura indicada durante toda una noche. La solución resultante
fue concentrada proporcionando un sólido. El análisis NMR indicó
que la reacción no era completa. Ésta fue sometida nuevamente a las
condiciones de reacción indicadas proporcionando 7,8 g (38 mmol,
96%) de 20 en forma de un sólido de color blancuzco.
\vskip1.000000\baselineskip
A 1,2 g (2,47 mmol) de 18 se añadieron 16,5 ml
de THF, 16,5 ml de metanol y una solución de 2,63 g de hidróxido de
litio en 38 ml de agua. La mezcla se dejó en agitación a temperatura
ambiente durante toda una noche. Fue concentrada para eliminar el
metanol y el THF. El pH de la solución fue ajustado a 6 utilizando
ácido fosfórico al 85%. La mezcla resultante fue extraída con 5x100
ml de cloroformo. La capa orgánica combinada fue lavada con 100 ml
de agua, secada (Na_{2}SO_{4}) y concentrada. El residuo fue
purificado dos veces mediante cromatografía de columna de gel de
sílice utilizando 7:3 metanol: acetato de etilo proporcionando 550
mg (1,16 mmol, 47%) de 21.
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de 55 mg (1,16 mmol) de 21 en 30 ml
de diclorometano fue dejada en agitación a temperatura ambiente
bajo atmósfera de argón. A la mezcla de reacción se añadieron 575 mg
(2,9 mmol) de
1-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida)
y 264 mg (2,29 mmol) de N-hidroxisuccinimida. La
mezcla se dejó en agitación durante 24 horas y se diluyó con 15 ml
de diclorometano. La capa orgánica fue separada y lavada con 4x50 ml
de agua, 3x50 ml de una solución saturada de NaHCO_{3} y 3x50 ml
de agua. La capa de diclorometano fue secada (Na_{2}SO_{4}) y
concentrada proporcionando 480 mg (0.8 mmol, 72%) de 22 en forma de
un polvo de color blanco.
\vskip1.000000\baselineskip
A 6,02 g de clorhidrato de desipramina se
añadieron 150 ml de 1N NaOH. La mezcla se dejó en agitación durante
10 minutos. La mezcla acuosa fue extraída con 6 x 100 ml de
cloroformo. La capa combinada de cloroformo fue lavada con 200 ml
de agua. La parte orgánica fue secada (Na_{2}SO_{4}) y
concentrada proporcionando 5,25 g de desipramina base libre.
A 3,23 g (12,04 mmol) de desipramina base libre
se añadieron 80 ml de acetona seca, 3,6 g de carbonato potásico
anhidro, 3,0 g (13,45 mmol) de 2-(BOC-amino) bromuro
de etilo, 3 ml de dimetilformamida anhidro, 15 mg de
18-crown-6 y 500 mg de ioduro
sódico. La mezcla se dejó en reflujo 18 horas con atmósfera de
argón. La mezcla de reacción fue enfriada a temperatura ambiente y
filtrada. El residuo fue lavado con 10 ml de acetona. El filtrado
fue concentrado y el residuo fue purificado mediante cromatografía
de columna de gel de sílice utilizando metanol al 4% en acetato de
etilo proporcionando 4,8 g (11,7 mmol, 96%) de 23 en forma de aceite
espeso.
\vskip1.000000\baselineskip
A 1,0 g (2,44 mmol) de 23 se añadieron 10 ml de
CH_{2}Cl_{2} y 10 ml de ácido trifluoroacético. La mezcla de
reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente y se concentró.
El residuo fue disuelto en CH_{2}Cl_{2} y concentrado. El
procedimiento anterior se repitió dos veces y el residuo fue
purificado por cromatografía de columna de gel de sílice utilizando
cloroformo al 60% en metanol proporcionando 1,02 g (2,40 mmol, 99%)
de 24 en forma de aceite espeso.
A 500 mg (1,18 mmol) de TCA amina (24) se
añadieron 316 \mul de trietil amina y 30 ml de DMF. En un
recipiente separado se mezclaron 1,16 g (mmol) de ácido tereftálico
di-N-hidroxisuccinimida éster (25)
con 30 ml de DMF anhidro. La solución de TCA amina preparada con
anterioridad fue añadida a la solución de ácido tereftálico
di-N-hidroxisuccinimida gota a gota.
La mezcla de reacción fue dejada en agitación a temperatura ambiente
durante toda una noche y se concentró. El residuo fue disuelto en
75 ml de diclorometano. La capa orgánica fue lavada con 2x50 ml de
agua, 2x50 ml de solución saturada de NaHCO_{3} y 50 ml de agua,
se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. El residuo fue
purificado por cromatografía de gel de sílice utilizando acetona al
20% en acetato de etilo proporcionando 145 mg (0.26 mmol, 22%) de
26 en forma de polvo blanco.
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de 96 mg de derivado éster de TCA
NHS (18) en 1,5 ml de DMF anhidro fue enfriada a 0ºC. Se añadieron
a la mezcla de reacción 74 mg de diciclohexil urea (DCC) y 48 mg de
N-hidroxisuccinimida. La mezcla fue dejada en
agitación a 4ºC durante 24 horas. El éster
di-N-hidroxisuccinimida preparado
fue utilizado in situ en la conjugación de proteína.
Setecientos mg de tiroglobulina bovina en 12 ml
de fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) fueron enfriados en baño de
hielo. Se añadieron a la solución 37 ml de dimetilsulfóxido (DMSO)
gota a gota y la temperatura de la reacción se mantuvo por debajo
de la temperatura ambiente. A la solución de proteína se añadió gota
a gota la solución de N-hidroxisuccinimida éster
preparada in situ (tal como se ha descrito en lo anterior).
La mezcla se dejó en agitación a temperatura ambiente 18 horas. El
conjugado resultante fue colocado en el tubo de diálisis (corte
peso molecular 50.000) y se dializó en 2L de DMSO al 70% en fosfato
potásico 50 mM (pH 7,5, 3 cambios, como mínimo 3 horas cada uno de
ellos), 2L de DMSO al 50% de fosfato potásico 50 mM (como mínimo 3
horas), 2L de DMSO al 30% de fosfato potásico 50 mM (como mínimo 3
horas), DMSO al 10% en fosfato potásico 50 mM (como mínimo 3 horas)
a temperatura ambiente seguido por 6 cambios con fosfato potásico 50
mM (pH 7,5) a 4ºC (2L cada vez durante un mínimo de 6 horas cada
uno). La concentración de proteína se determinó en 4,5 mg/ml
utilizando el ensayo de proteína de azul Coomassie Biorad
(Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248 (1976). Se obtuvo un total de
90 ml del conjugado (28). La extensión de la modificación de lisina
disponible fue determinada en 70% por un método TNBS, Habeeb AFSA,
Anal.Biochem. 14, 328-34 (1988). Nota: Referencia
para la preparación del conjugado de proteína: Hubbard et
al., J. Pharm. Sc. 67,1571-1578 (1978).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una solución de 550 mg de albúmina de
suero bovino (BSA) en 11 ml de fosfato potásico 50 mM (pH 7,5). Una
solución de 10 ml fue transmitida a un recipiente RB y se enfrió en
un baño de hielo. Se añadieron a la solución 10 ml de DMSO gota a
gota y la temperatura de la reacción se mantuvo por debajo de la
temperatura ambiente. A la solución de proteína se añadió una
solución de 46,2 mg de derivado de éster TCA NHS en posición
C-2 (16) en 0,96 ml de DMSO gota a gota. La mezcla
de la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente 16
horas. El conjugado resultante fue colocado en un tubo de diálisis
(corte peso molecular 10.000) y se dializó contra 500 ml de DMSO al
50% en fosfato potásico 50 mM (como mínimo 3 horas a temperatura
ambiente), 500 ml de DMSO al 30% en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas a temperatura ambiente), 500 ml de DMSO al 10% en
fosfato potásico 50 mM (como mínimo 3 horas a temperatura ambiente)
seguido de 4 cambios con fosfato potásico 50 mM (pH 7.5) a 4ºC (2L
cada uno durante un mínimo de 3 horas cada vez). El conjugado
resultante fue filtrado a través de un filtro de 0,45 \mum. Se
obtuvo un total de 37 ml de conjugado de TCA-BSA. La
concentración de proteína se determinó que era 14,4 mg/ml
utilizando ensayo de proteína de azul Coomassie Biorad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se enfrió en un baño de hielo una solución de 1
g de albúmina de suero bovino (BSA) en 16 ml de fosfato potásico 50
mM (pH 7,5). Se añadieron a la solución 19 ml de DMSO gota a gota y
la temperatura de reacción se mantuvo por debajo de la temperatura
ambiente. A la solución de proteína se añadió la solución de 21 mg
de derivado de éster TCA NHS (22) en 1,5 ml de DMF anhidro, gota a
gota. La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura
ambiente 24 horas. El conjugado resultante fue colocado en un tubo
de diálisis (corte peso molecular 10.000) y se dializó en 2 L de
DMSO al 60% en fosfato potásico 50 mM (3 cambios, como mínimo 3
horas cada uno), 2 L de DMSO al 50% en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas), 2 L de DMSO al 30% en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas), 2 L de DMSO al 10% en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas) a temperatura ambiente seguido de seis cambios con
fosfato potásico 50 mM (pH 7.5) a 4ºC (2 L cada uno, como mínimo, 6
horas en cada caso). Se obtuvo un total de 75 ml de conjugado
TCA-BSA. La concentración de proteína se determinó
en 11,4 mg/ml utilizando ensayo de proteína de azul Coomassie
Biorad.
Una solución de 12,8 mg de derivado de éster TCA
NHS (18) en 1,5 ml de DMF anhidro fue enfriada a 0ºC. A la mezcla
de reacción se añadieron 9,3 mg de diciclohexil urea (DCC) y 5,24 mg
de N-hidroxisuccinimida. La mezcla se dejó en
agitación a 4ºC durante 24 horas. El éster de
N-hidroxisuccinimida preparado fue utilizado in
situ en la conjugación de proteína.
Una solución de 1 g de albúmina de suero bovino
(BSA) en 16 ml de fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) fue enfriada en
un baño de hielo. Se añadieron a la solución 19 ml de DMSO, gota a
gota y la temperatura de reacción se mantuvo por debajo de la
temperatura ambiente. A la solución de proteína se añadió gota a
gota solución de éster N-hidroxisuccinimida
preparado in situ (tal como se ha descrito en lo anterior).
La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente
durante 24 h. El conjugado resultante fue colocado en un tubo de
diálisis (corte peso molecular 10.000) y fue dializado en 2 L de
DMSO al 60% en fosfato potásico 50 mM (3 cambios, como mínimo 3
horas cada uno), 2 L de DMSO al 50% en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas), 2 L de DMSO al 30% en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas), 2 L de DMSO al 10% en fosfato potásico 50 mM (como
mínimo 3 horas) a temperatura ambiente seguido de 6 cambios con
fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) a 4ºC (2 L cada uno durante un
mínimo de 6 horas cada uno). Se obtuvo un total de 100 ml de
conjugado TCA-BSA. La concentración de proteína se
determinó que era de 7,2 mg/ml utilizando ensayo de proteína con
azul Coomassie Biorad.
Se escogieron para este trabajo conejos sanos de
ambos sexos previamente no inmunizados. Los conejos fueron alojados
y tratados con aprobación del comité IUACUC del vendedor.
La inmunización primaria tuvo lugar con
conjugado
2-carboxipropil-dihidroamitriptilina-BTG
emulsionado en coadyuvante de Freund completo con una concentración
de 1 mg/ml. La dosis total administrada a cada uno de los conejos
fue de 0,2 ml o 0,2 mg suministrada por inyección subcutánea en
múltiples lugares de la espalda. Cuatro semanas más tarde se
repitió la inmunización sustituyendo el coadyuvante incompleto de
Freund en lugares distintos en la espalda, nuevamente mediante
inyección subcutánea. SE repitieron las inmunizaciones a intervalos
de cuatro semanas utilizando una dosis total de 0,1 mg administrado
a través de la misma ruta descrita anteriormente hasta la semana
16.
La respuesta anticuerpo fue determinada a través
de ensayo ELISA de muestras tomadas por sangrado de la vena de la
oreja. Se comprobaron diluciones en serie de suero clarificado en
conjugados (BSA) de proteína de prueba en posición
C-2 y en posición N-1. Las
concentraciones de suero expresadas como el 50% de la dilución de
respuesta máxima fueron en general similares con respecto al
conjugado de pruebas utilizado, aproximadamente 5x105. Las
variaciones parecen estar más relacionadas con el animal individual
que con el conjugado utilizado para pruebas por el hecho de que los
respondedores destacados en el conjugado de pruebas de posición
C-2 fueron también más elevados en el conjugado de
posición N-1 y el orden de respuesta entre los
animales, de mayor a menor, fue generalmente la misma que la medida
en cada conjugado de pruebas.
El inmunógeno C-2, compuesto 10,
fue preparado para inmunización primaria de ratones, diluyendo 0,2
mg/ml en solución fisiológica salina y emulsionando con un volumen
igual de coadyuvante completo de Freund (Sigma Chemicals, St
Louis,MO) utilizando dos jeringas y una aguja de tamaño 25 con doble
émbolo. La emulsión fue inyectada en el ratón en las plantas de las
patas traseras y en el área peritoneal. Se inyectó una dosis total
de 0,1 ml por ratón. Se inyectó una inyección secundaria utilizando
la misma formulación con coadyuvante incompleto de Freund por las
mismas rutas cuatro semanas más tarde. La tercera inyección era
igual que la segunda y se administró 6 semanas después de la
segunda inyección.
Se tomaron muestras de sangre por sangrado retro
orbital 14 días después de la segunda inyección. Se separó el suero
mediante centrifugación y se conservó por adición de 1 \mul de
solución de timerosal al 10%. El volumen típico de suero fue de
10-20 \mul.
Para analizar los sueros en cuanto a contenido
de anticuerpo se llevó a cabo un ensayo ELISA utilizando el
antígeno análogo asociado a una proteína diferente
(2-carboxipropil-dihidroamitriptilina-BSA)
(compuesto 11). Este antígeno fue diluido a 5 \mug/ml en
carbonato tampón 0,1 M, pH 9,5. Se trasladó mediante pipeta 100
\mul de esta solución de antígeno en pocillos de una microplaca de
poliestireno de 96 pocillos (Costar, Cambridge, MA). Se incubó en
una bolsa de plástico a 37ºC durante 1 hora. Las soluciones se
retiraron por succión y los pocillos se llenaron con una solución
de bloqueo. Ésta consistió en hidrolizado de gelatina, 1%,
sacarosa, 2%, Tris, 0,15 M, pH 7,4 (todos los reactivos de Sigma
Chemicals). Se dejó que bloqueara las placas durante 1 hora a
temperatura ambiente en bolsas de plástico. A continuación los
pocillos fueron vaciados por succión.
Se prepararon diluciones de los sueros por
transferencia de 1 \mul a un tubo de ensayo de cristal conteniendo
1 ml de solución salina con tampón fosfato con 0,1% Tween 20
(PBS-T). Ciento cincuenta microlitros de esta
dilución de cada suero fueron transferidos a pocillos de la fila A
de una microplaca de cloruro de polivinilo. Todos los demás
pocillos fueron llenados con 100 \mul de PBS-T. Se
prepararon diluciones en serie de tres fases por transferencia de
50 \mul de la fila A a la fila B utilizando un micropipeteador de
canales múltiples. Se consiguió la mezcla por repipeteado 3 veces.
Esta operación se repitió de la fila B a la C y así sucesivamente
para cada columna de pocillos.
Una vez preparadas las diluciones 95 \mul para
cada una de ellas, empezando por la fila H, fueron transferidas a
la misma fila de la placa dotada de recubrimiento. La placa fue
colocada en una bolsa de plástico Ziploc con una pieza húmeda de
toalla de papel y se incubó a 37ºC durante una hora. Después de la
incubación, los pocillos fueron lavados cuatro veces manualmente
con partes alícuotas de 300 \mul de PBS-T. Se
preparó una dilución 1:5.000 de conjugado AM-HRP
IgG de cabra antiratón (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) en
PBS-T. 100 \mul de esta dilución se trasladaron
por pipeteado a cada pocillo y la placa se incubó nuevamente tal
como se ha descrito. La placa fue lavada 6 veces con 300 \mul de
PBS-T manualmente y 100 \mul de sustrato
K-Blue (Neogen, Lexington, KY) fueron añadidos a
cada pocillo. Se dejó revelar en la oscuridad durante 5 minutos y
la reacción fue interrumpida por adición de 100 \mul de una
solución de ácido fosfórico 2 M. Las densidades ópticas de los
pocillos fueron leídas utilizando un lector de placas Molecular
Devices Tmax y un ordenador Macintosh. Los datos sugirieron que
todos los ratones estaban sensibilizados con respecto al inmunógeno,
mostrando algunos de ellos más respuesta que los otros.
Un ratón que mostraba elevada respuesta a
inmunógeno vía ELISA se escogió para su utilización. Este animal
recibió una inmunización de refuerzo de 100 \mug de antígeno en
coadyuvante incompleto de Freund cuatro días antes de llevar a cabo
la fusión. La línea celular de mieloma F0 (ATCC, Manassas, VA) fue
utilizada para la fusión. La fusión fue llevada a cabo por el
método de St Groth y Scheidegger, Journal of Immunol. Meth. 35,
1-21, 1980. Diez días más tarde los cultivos de
células híbridas se encontraban preparados para rastreo. Éste fue
llevado a cabo por un proceso similar al ELISA indicado
anteriormente, con la adición de placas con recubrimiento de un
conjugado desipramina-BSA con enlace N (compuesto
27) y una placa de control dotada de recubrimiento solamente con
BSA. Se escogieron células híbridas que mostraban capacidad de
anticuerpos de unión tanto con el compuesto 11 como con el
compuesto 27, pero no BSA para continuación del trabajo. Éste
consistió en el reclonado inmediato y también la expansión del
cultivo para congelación en nitrógeno líquido. El reclonado fue
llevado a cabo por dilución de las células a 60 células viables por
40 ml del medio de cultivo, distribución de 200 \mul a cada
pocillo en placas de cultivo estériles de 96 pocillos e incubación
en un incubador de CO_{2} humidificado hasta observar
crecimiento.
Los pocillos de las placas de reclonado que
mostraban crecimiento fueron comprobados en cuanto a expresión de
anticuerpos por el ensayo de rastreo descrito con anterioridad. Los
clones que mostraban las reacciones deseadas fueron ampliados y
almacenados en nitrógeno líquido.
Los anticuerpos monoclonales fueron producidos
colocando el hibridoma deseado en cultivo de tejidos para ampliación
del número de células, seguido por transferencia a dispositivos de
cultivo comerciales estándar tales como Miniperm (Hereaus,
Alemania). Se utilizó anticuerpo como sobrenadante de cultivo
conservado para desarrollo del ensayo.
El clon TCA 1.1 de hibridoma fue colocado en un
cultivo de alta densidad y se recogió el sobrenadante. Esta
preparación fue conservada por la adición de timerosal a una
concentración de 0,02%. El contenido de anticuerpo fue evaluado por
un experimento de titulación en el que se colocaron diluciones
variables de sobrenadante en pocillos de una microplaca dotada de
un recubrimiento con una cantidad constante de conjugado antígeno.
Se utilizó la dilución que proporcionaba aproximadamente el 90% de
la señal máxima para trabajo adicional en la demostración de un
inmunoensayo.
Se demostraron inmunoensayos de imipramina
preparando varias diluciones de una solución de 1 mg/ml del fármaco
en PBS-T. Se transfirieron por pipeteado cincuenta
microlitros de estas diluciones a pocillos de una microplaca dotada
de recubrimiento con concentraciones preoptimizadas de conjugados
del compuesto 11 o del compuesto 27, seguido por 50 \mul del
sobrenadante del anticuerpo diluido a la mitad de la dilución
previamente determinada. Esto proporciona una dilución final de
sobrenadante igual a la determinada previamente y una concentración
final de la mitad del nivel del fármaco en las diluciones
anteriores. La incubación durante 1 hora a 37ºC fue seguida por el
mismo procedimiento que para los ensayos de rastreo. Las densidades
ópticas fueron trasladadas a gráficos en comparación con la
concentración final de imipramina calculada como concentración molar
(peso molecular en gramos de fármaco por litro). Las curvas
estándar fueron construidas con los siguientes datos (ver figura
7):
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en estos resultados, la cantidad más
reducida detectable de fármaco libre por el ensayo utilizando el
compuesto 11 se estimó en 1,3 x 10^{-6} M, o aproximadamente 0,36
microgramos por ml. Utilizando el conjugado del compuesto 27 fue
detectable una concentración más baja de 4 x 10^{-7} M, es decir,
de aproximadamente 0,11 microgramos/ml. Los niveles de fondo eran
de forma reproducible muy bajos, sugiriendo que la incorporación de
un tiempo de desarrollo más largo proporcionaría probablemente
concentraciones detectables más bajas.
Además, se observó que los otros fármacos
antidepresivos tricíclicos mostraron también reactividad cruzada
con la unión de TCA 1.1 tanto a los conjugados de compuesto 11 como
de compuesto 27. Estos datos soportan la suposición de que la
inmunización utilizando el conjugado de
2-carboxipropil-dihidroamitriptilina-BTG
(compuesto 10) es útil en el desarrollo de anticuerpos adecuados
para el objetivo de determinadas concentraciones de antidepresivos
tricíclicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Micropartículas azules de polietileno
modificadas por carbóxilo de Seradyn (0,3 micras) fueron lavadas en
primer lugar tres veces a 1% de sólidos por centrifugación en tampón
MES 20 mM, pH 6,1 (ácido
2-[N-morfolino]etanesulfónico). Las
micropartículas lavadas fueron ajustadas a continuación a 5% de
sólidos en MES y el anticuerpo diseñado anti-TCA
fue absorbido sobre las micropartículas de la manera siguiente: A
las soluciones de micropartículas se añade un volumen igual de 3
mg/ml de anticuerpo anti-TCA y se dejó en agitación
durante 16 horas a temperatura ambiente. Las micropartículas fueron
bloqueadas a continuación con solución BCA en MES durante 1 hora a
temperatura ambiente y la mezcla fue lavada tres veces hasta 1% de
sólidos en MES por centrifugación. Después del lavado final, la
solución de micropartículas fue ajustada nuevamente a 10% de
sólidos. Antes de su utilización, se mezclaron volúmenes iguales de
este látex y 35% peso/volumen de sacarosa en MES.
Nitrocelulosa de poros grandes
(5-20 micras) con recubrimiento de Mylar fue cortada
en trozos de 15 cm de longitud y 5 cm de anchura. Se dispensaron
soluciones del conjugado TCA-BSA (aproximadamente 5
mg/ml) y anticuerpo monoclonal anti-TCA
(aproximadamente 2 mg/ml) ambos en fosfato potásico tampón 50 mM pH
7,5, utilizando el sistema IVEK Corp. Digispense 2000^{TM} con
una proporción de 1 \mul/cm sobre la nitrocelulosa a una distancia
respectivamente de 2 cm y 1 cm desde el lado de 15 cm. Los
segmentos de nitrocelulosa se dejaron secar durante unos 20 minutos
a 37ºC y a continuación fueron bloqueados con alcohol polivinílico
(PVA, peso molecular 13.000-23.000) solución en
TRIS 20 mM, pH 8, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los
segmentos fueron lavados finalmente en agua y se secaron.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la misma nitrocelulosa descrita en lo
anterior como membrana separada para micropartículas (membrana
superior). La construcción de la configuración de una banda de dos
membranas fue realizada tal como se describe en detalle en la
patente US No. 5.770.458. De forma simplificada, la membrana
superior fue bloqueada y lavada utilizando el mismo protocolo que
la membrana principal. La membrana superior que contiene una
cantidad apropiada de micropartículas fue aplicada por laminación a
la membrana principal con un adhesivo de mylar de Adhesive Research
Inc. Después de ello, el segmento fue cortado en tiras con una
anchura de 5 mm, un terminal de muestra ("sample pad") y un
terminal de inmersión ("sink pad") fueron colocados
respectivamente en un extremo inicial y final de dichas bandas. Se
utilizó celulosa de BioRad Laboratories (gel blotter) tanto para los
terminales receptores de muestra como para los terminales de
inmersión. Se obtuvo una curva de calibrado aplicando
aproximadamente 100 \mul de soluciones que contenían cantidades
predeterminadas del fármaco (normas TCA) sobre la banda de
membrana. La intensidad de la señal se determinó del modo siguiente:
2,5 a 3,0 = azul oscuro; 1,5 a 2,0 = azul medio, 1,0 = azul claro,
0,5 = color difícilmente perceptible y 0 = incoloro. Cuando la banda
fue leída como incolora, se consiguió una inhibición completa y la
muestra se indicó que contenía 1000 ng/ml de norma TCA (por
ejemplo, imipramina). Los resultados se indican en las tablas
2-5 a continuación y en la figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Compuesto que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{1} es una cadena de
0-10 átomos de carbono o heteroátomos, saturada o no
saturada, sustituida o no sustituida, recta o ramificada. X es un
grupo enlazador que consiste en 0-2 anillos
aromáticos sustituidos o no sustituidos e Y es un éster activado o
N H- Z, en la que Z es un poli(aminoácido) o
polisacárido.
2. Inmunógeno que tiene una estructura
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Z es un
poli(aminoácido).
3. Anticuerpo específico para antidepresivos
tricíclicos que se obtiene por inmunización de un animal con un
inmunógeno de la reivindicación 2.
4. Compuesto que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
5. Compuesto que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
6. Compuesto que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
7. Compuesto que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método de inmunoensayo para determinar un
analito seleccionado entre el grupo que consiste en fármacos
antidepresivos tricíclicos, derivados y metabolitos del mismo que
comprende las siguientes etapas:
(a) combinar una muestra de la que se sospecha
que contiene dicho analito con un anticuerpo específico para dicho
analito y un análogo del analito derivado de un compuesto que tiene
un estructura seleccionada del grupo que consiste en
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
comprendiendo dicho análogo y dicho
anticuerpo un marcador detectable, en condiciones favorables para
que dicho analito y análogo de analito se combinen con dicho
anticuerpo para formar un complejo detectable,
y
(b) determinar la presencia o cantidad de dicho
complejo detectable como medición de dicho analito en dicha
muestra.
9. Método de inmunoensayo para determinar un
analito seleccionado entre el grupo que consiste en fármacos
antidepresivos tricíclicos, derivados y metabolitos del mismo que
comprende las siguientes etapas:
(a) combinar una muestra de la que se sospecha
que contiene dicho analito con un anticuerpo producido a partir del
inmunógeno de la reivindicación 2 y un análogo del analito,
comprendiendo dicho análogo y dicho anticuerpo un marcador
detectable, en condiciones favorables para que dicho analito y
análogo del analito se combinen con dicho anticuerpo para formar un
complejo detectable, y
(b) determinar la presencia o cantidad de dicho
complejo detectable como medida de dicho analito en dicha
muestra.
10. Método de inmunoensayo para determinar un
analito seleccionado entre el grupo que consiste en fármacos
antidepresivos tricíclicos, derivados y metabolitos de los mismos
que comprende las siguientes etapas:
(a) combinar una muestra de la que se sospecha
que contiene dicho analito con un anticuerpo producido a partir del
inmunógeno de la reivindicación 2 y un análogo del analito derivado
de un compuesto que tiene una estructura seleccionada entre el
grupo que comprende
\vskip1.000000\baselineskip
comprendiendo dicho análogo o dicho
anticuerpo un marcador detectable, en condiciones favorables para
que dicho analito y análogo de analito se combinen con dicho
anticuerpo para formar un complejo detectable,
y
(b) determinar la presencia o cantidad de dicho
complejo detectable como medida de dicho analito en dicha
muestra.
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