KR100876430B1 - 제초제 메타미포프 잔류물의 효소면역학적 분석에 이용되는합텐-단백질 복합체 및 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제초제 메타미포프의 효소면역학적 분석에 이용되는 합텐-단백질 복합체 및 그로부터 생성된 항체에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 메타미포프의 특정 합텐 화합물과 단백질이 결합된 복합체에 대한 항체를 이용함으로써 제초제 메타미포프를 신속하고 정량적으로 검출할 수 있다.
Description
도 1은 합텐-BSA 단백질 복합체 및 합텐-KLH 단백질 복합체의 형성을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 2는 항체 분리의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 간접경쟁 ELISA 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 제초제 메타미포프 잔류물의 효소면역학적 분석에 이용되는 합텐-단백질 복합체 및 항체에 관한 것이다.
메타미포프는 세계 최초로 국내에서 개발한 제초제로서 우리나라의 정밀화학 기술력과 농약산업의 수준을 국제적으로 입증한 경우이다. 잔류농약의 분석은 주로 감도와 정확도가 높은 기체 크로마토그래피(GC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등에 의해 수행되었으나, 이들 크로마토그래피 방법은 장시간의 전처리 과정과 고가의 기기, 전문적 기술을 가진 인력 등을 필요로 할 뿐만 아니라, GC의 경우 열적으로 불안정한 물질의 분석은 불가능하고, HPLC의 경우는 발색단이 없는 농약은 검출이 어려운 단점을 가지고 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 주로 생체성분의 분석이나 임상진단에 이용되었던 면역분석법(immunoassay)을 잔류농약의 분석에 적용시키려는 시도가 1970년대에 시작되었다. 분석과정에 효소와 항체가 관련되어 효소면역학적 분석 [Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)]이라고 부르며 이 효소면역학적 분석법에 의한 잔류농약의 분석은 감도가 매우 높고, 시료의 전처리 과정이 거의 불필요하며, 다수의 시료를 동시에 신속하게 분석할 수 있고, 비용이 적게 든다는 장점이 있다.
이와 같은 ELISA(효소면역학적 분석법)은 항체와 항원 사이의 특이적이며 친화력이 높은 결합에 근거한 분석법이므로, 면역분석법을 개발하기 위해서는 분석물질에 대한 항체를 생산하여야하며, 따라서 적절한 항원이 준비되어야 한다. 그러나, 농약과 같은 저분자 물질은 그 자체로서 항원으로 작용할 수 없어서 항체의 생산이 불가능하므로, 농약과 구조가 유사하며, 단백질과 공유결합할 수 있는 원자단을 가진 물질, 즉, 합텐(hapten)의 합성이 요구되었다. 또한, 경쟁적 면역분석법에서 사용되는 경쟁자인 코팅항원 및 효소 트레이서(enzyme tracer)의 제조를 위해서도 합텐의 합성이 요구되었다.
농약의 ELISA는 이미 미국의 FDA를 비롯한 전세계 기관에 의해 1970년대 이후 활발한 연구가 진행되고 있고 현재 외국에서 개발된 혹은 개발중인 농약에 대한 ELISA 분석법은 살균제 7종, 살충제 30종, 제초제 28 종, 식물생장조정제 10종 등으로 약 80여종이다.
그러나 국내에서 일부 대학 및 연구 기관에서 연구목적으로 실험이 진행되어 항혈청이 생산된 농약은 7종 정도이고 상품화가 된 것은 없으며 이들 대상농약은 대부분 개발된 지 오래된 일반적인 농약으로서 경쟁력이 크지 않고, 현재 국내에 사용중인 농약 잔류 검출용 ELISA 키트는 전량 수입제품이다. 따라서, 국제적으로 농산물 시장의 개방화와 더불어 국내 농업에서도 영농체제가 기술집약적이고 고품질, 고안전성을 추구하는 경향에 있으므로 유통농산물의 잔류농약에 대한 안전성 검정에 있어서도 그 효율성과 경제성이 높고 또한 특이성과 민감도가 탁월한 항혈청을 이용한 ELISA법이 계속적으로 절실히 요구되고 있다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 제초제 메타미포프에 대한 검출 방법을 연구하던 중, 메타미포프의 특정 합텐 화합물과 단백질이 결합된 복합체에 대한 항체를 이용함으로써 제초제 메타미포프를 신속하게 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 제초제 메타미포프(metamifop)의 합텐 화합물과 단백질이 아미드 결합에 의해 결합된 복합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 특정 구조를 갖는 메타미포프의 합텐 화합물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 복합체에 반응하여 생성되는, 메타미포프에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 복합체로 포유동물을 면역시키는 단계 및 상기 포유동물로부터 메타미포프에 특이적인 항체를 선발하는 단계를 포함하는, 메타미포프에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 항체를 포함하는, 시료 중의 메타미포프를 검출하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
제초제 메타미포프(metamifop)의 합텐 화합물과 단백질이 아미드 결합에 의해 결합된 복합체를 제공한다. 합텐은 항원만으로 원활한 면역작용을 일으킬 수 없을 때, 항원과 결합하여 항원에 대한 면역반응을 유도하는 물질을 말한다. 분자량이 작은 물질도 항체와 결합할 수 있으나, 생체 내에서 면역반응을 유발하지는 않는다. 따라서 이 물질은 분자량이 큰 담체(carrier)에 연결시켜야만 한다. 대부분의 농약은 면역계를 자극할 수 있을 만큼 충분히 크지 않기 때문에 농약에 대한 항체를 얻기 위해서는 단백질과 같이 분자량이 큰 담체(carrier)에 연결시켜 실험동물에 주사하여야 한다. 담체와 결합시키기 좋은 -COOH, -SH, -OH 또는 -NH2 등의 작용기를 가진 농약들도 있으나, 대부분의 농약에는 이러한 작용기가 없기 때문에 작용기를 도입한 농약 유도체를 합성하여 이용하는데, 이렇게 단백질과 결합할 수 있는 물질을 합텐이라고 한다.
합텐이 단백질과 아미드 결합을 형성하기 위해 카르복실기 또는 아미노기를 포함할 수 있다. 합텐의 카르복실기는 단백질의 아미노기와 아미드 결합을 형성할 수 있으며, 합텐의 아미노기는 단백질의 카르복실기와 아미드 결합을 형성할 수 있다. 담체 단백질에 합텐의 결합은 당업자에게 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 상기 방법은 당연히 담체 단백질에 존재하는 작용기에 의존할 것이다. 본 발명에서는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 단백질과 소 혈청 알부민(BSA) 단백질을 이용하여 합텐과 결합시켰다. 단백질과 카르복실기가 있는 합텐과 결합시키는 방법은 하기와 같은 카보디이미드와 N-히드록시숙신이미드를 이용한 활성 에스테르 방법을 이용하였다.
바람직하게는, 상기 메타미포프의 합텐 화합물은 이 하기 화학식 1의 화합물 이다:
<화학식 1>
[식 중,
R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기를 나타내고;
R5 및 R6는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 1 내지 10의 카르복시알킬기, 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기, 또는
상기 R7는 수소, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬기를 나타내고;
R8, R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기를 나타내며;
단, R1 내지 R12 중 하나 이상은 카르복실기 및 아미노기 중 하나 이상을 포함한다].
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 알킬기는 탄소수 1 내지 10의 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 포함하며, 바람직한 알킬 라디칼은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬이다. 이와 같은 라디칼의 예로서는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸, iso-아밀, 헥실 등을 들 수 있다. 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬 라디칼이 더욱 바람직하다.
상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 할로겐 원자는 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드 및 요오디드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
더욱 바람직하게는, 상기 메타미포프의 합텐 화합물은 하기 화학식 2, 3, 4, 5 또는 6의 화합물이다:
<화학식 2>
<화학식 3>
<화학식 4>
<화학식 5>
<화학식 6>
상기 메타미포프의 합텐 화합물은 메타미포프(하기 그림)의 특징적인 구조인 N-메틸-2-플루오로페닐-아미드(하기 그림의 붉은 색) 구조를 인식할 수 있도록 벤족사졸 위치(위치 a)에 스페이서를 부착시킨 합텐, 2-플루오로페닐 고리에 스페이서를 부착시킨 합텐(위치 b, c), N-메틸 부분을 치환시킨 합텐(위치 d)을 제조하기 위해, 가장 많이 도입하는 기능기인 COOH를 도입하여 상기 화학식 2 내지 6의 합텐을 합성하였다. 이렇게 합성된 합텐의 구조는 NMR과 MS를 이용하여 확인하였다.
본 발명의 복합체에서, 상기 단백질은 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 피브리노겐, 오발부민, 티로글로불린(thyroglobulin) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 담체 단백질은 T-세포를 자극할 수 있고, 이어서 B-세포로 하여금 전체 합텐-담체 복합체 분자에 대한 항체를 생산하도록 유도하는 적어도 하나의 T-세포 에피토프를 함유하는 분자를 포함한다. 에피토프의 결정 인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹들로 구성되며, 특정 전하 특성뿐만 아니라 특정한 3차원 구조적 특성을 갖는다. 면역원성을 가지기 위해서는 단백질 또는 폴리펩티드가 T- 세포를 자극할 수 있어야 한다고 여겨진다. 그러나, T-세포 에피토프가 결핍된 담체 단백질도 또한 면역원성을 가질 수 있다.
본 발명의 복합체는 제초제 메타미포프의 효소면역학적 분석에 이용될 수 있다. ELISA 분석을 위해서는 검출하고자 하는 항원에 결합하는 항체를 필요로 하는데, 본 발명의 복합체에 의해 생성된 항체가 메타미포프에 선택적으로 결합하게 된다면, 메타미포프의 효소면역학적 분석에 이용될 수 있는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
하기 화학식 1의 구조를 갖는 메타미포프의 합텐 화합물을 제공한다:
<화학식 1>
[식 중,
R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기를 나타내고;
R5 및 R6는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 1 내지 10의 카르복시알킬기, 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기, 또는
상기 R7는 수소, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬기를 나타내고;
R8, R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기를 나타내며;
단, R1 내지 R12 중 하나 이상은 카르복실기 및 아미노기 중 하나 이상을 포함한다]. 상기 합텐 화합물은 제초제 메타미포프의 효소면역학적 분석에 이용된다. 바람직하게는 상기 메타미포프의 합텐 화합물은 하기 화학식 2, 3, 4, 5 또는 6의 화합물이다:
<화학식 2>
<화학식 3>
<화학식 4>
<화학식 5>
<화학식 6>
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
상기 복합체에 반응하여 생성되는, 메타미포프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 메타미포프의 합텐 화합물과 단백질의 복합체에 의해 생성되는 항체는 합텐에 특이적인 항체, 단백질에 특이적인 항체 및 합텐 및 단백질의 복합체에 특이적인 항체가 생성될 수 있다. 이 중에서, 합텐에 특이적인 항체가 메타미포프에 특이적으로 결합할 수 있으므로 바람직하다. 상기 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체일 수 있다. 단클론성 항체의 제조 기술은 당업계에 공지되어 있다. 단클론성 항체는 니코틴 합텐-담체 복합체를 포함하는 조성물을 쥐에 주사하고, 이어서 혈청 시료를 제거하여 항체 생성을 확인하며, 비장을 제거하여 B-림프구를 얻고, 이 B-림프구와 골수종 세포를 융합하여 하이브리도마를 제조하고, 이 하이브리도마를 클로닝하고, 합텐-담체 복합체에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선발하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하고, 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리함으로써 얻을 수 있다.
단클론성 항체는 잘 확립된 각종 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 분리 기술로는 단백질-A 세파로오스를 이용한 친수성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피를 들 수 있다. 예를 들면, 콜리간(Coligan)의 2.7.1~2.7.12 페이지 및 2.9.1~2.9.3 페이지를 참조한다. 또한, 바인스(Baines) 등의 "Purification of Immunoglobulin G(IgG)"(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, 79~104 페이지, The Humana Press, Inc. 1992)을 참조한다.
다클론성 항체의 제조 기술도 당업계에 공지되어 있다. 다클론성 항체는 공지된 표준 기술에 따라 제조된다. 다클론성 항체를 제조하기 위하여, 면역원성 물질을 동물에 주사하고 주사된 면역원의 수많은 에피토프에 대한 항체 혼합물을 함유하는 혈청을 채취한다. 항체 생산용으로 적합한 숙주 포유동물로는 인간, 쥐, 마우스, 토끼 및 염소를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
상기 복합체로 포유동물을 면역시키는 단계 및 상기 포유동물로부터 메타미포프에 특이적인 항체를 선발하는 단계를 포함하는, 메타미포프에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 단클론성 항체 또는 다클론성 항체를 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
상기 복합체에 대한 항체를 포함하는, 시료 중의 메타미포프를 검출하는 키트를 제공한다. 본 발명의 항체는 또한 시료 중의 메타미포프 수준을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있는 키트를 제조하는데 유용하다. 본 발명에 따른 키트는 적합한 용기 내에 본 발명에 따른 메타미포프-특이적 항체를 포함한다. 방사면역분석법에서는 상기 키트는 표지된 메타미포프를 포함해도 좋다. 시료 중의 메타미포프는 표지된 메타미포프를 항체에 결합시킨 후, 항체로부터의 메타미포프와 검사할 시료를 경쟁시킴으로써 검출한다. ELISA 키트도 또한 본 발명에 따른 항체를 포함하며, 추가로 메타미포프-특이적 항체에 특이적인 효소 표지된 2차 항체, 상기 효소가 분해하여 발색 반응을 야기할 수 있는 기질 용액 등을 포함할 것이다. 상기 효소는 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 우레아제 등을 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 합텐의 합성
1) 합텐 A의 합성
화학연구소로부터 분양받은 K13209 (200mg)을 1,4-디옥산 5ml에 녹인 다음 수산화리튬 일수화물(20mg, 2eq)를 1ml의 물에 녹여 가하고 상온에서 5~6시간 저어주었다. 반응액에 2N HCl로 pH 2로 산성화시킨 다음에 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하여 감압증류 하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 32mg의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:n-헥산=1:3, 0.1% 아세트산)
TLC:Rf=0.21(아세톤:헥산=3:7, 0.1% 아세트산)
LC/MS; 471(M+H), 473
NMR(아세톤 d6); 1.67(3H,d), 5.12(1H, q), 7.1~8.8(11H, m), 9.2(1H,s)
2) 합텐 B의 합성
페녹사프로프-P-에틸 (10.8g)을 1,4-디옥산 50ml에 녹인 다음 수산화리튬 일수화물(1.5g)를 10ml의 물에 녹여 가하고 상온에서 5~6시간 저어주었다. 반응이 완결되면 물과 디클로로메탄을 가하고 10분 정도 저어 준 후, 물 층을 회수하여 2N HCl로 pH 2로 산성화시킨 다음에 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하여 감압증류하였다. 이것을 에틸 에테르:n-헥산=1:1 용액으로 재결정하여 합텐 A 7.1g을 얻었다.
LC/MS: 334(M+H), 335, 375(M+ACN), 376
NMR(CDCl3); 1.67(3H,d), 4.80(1H, q), 6.70~7.47(7H, m)
3) 합텐 C의 합성
① c2의 합성
4-플루오로-3-니트로벤조산 (b1, 4.64g)와 에탄올 10ml를 벤젠 50ml에 녹인 후, 1g의 conc. H2SO4를 가하고 18시간 동안 가열 환류하였다. 물과 소량의 1N NaOH를 가하여 pH 10으로 맞추고 저어준 후 유기층을 취하여 황산마그네슘으로 건조 여과하고 감압농축하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 4.3g의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:n-헥산=1:3)
TLC:Rf=0.57(에틸 아세테이트:헥산=1:3)
NMR(CDCl3); 1.2(3H, t), 4.3(2H, q), 6.8~7.5(3H, m)
② c3의 합성
SnCl2·2H2O (17g, 4eq)를 30ml의 conc. HCl에 녹인 후 0도에서 4-플루오로-3-니트로벤조산 에틸 에스테르(4.0g)를 천천히 적가하고 실온에서 4시간 동안 저어주었다. 2N NaOH를 가하여 pH 7로 맞추고 에틸 아세테이트 100ml로 2회 추출한 후 유기층을 취하여 황산마그네슘으로 건조 여과하고 감압농축하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 2.8g의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:n-헥산=1:3)
TLC:Rf=0.49(에틸 아세테이트:헥산=1:3)
NMR(CDCl3); 1.2(3H, t), 3.5(2H, s), 4.4(2H, q), 6.8~7.5(3H, m)
③ c4의 합성
합텐 B(2.24g)을 클로로포름 20ml에 가한 후 녹을 때까지 테트라히드로푸란을 첨가하였다. 0도로 낮춘 후 디시클로카보디이미드(DCC 1.51g)와 디메틸아미노-피리딘 (DMAP)를 소량 첨가 후 b3(1.12g)를 클로로포름에 녹여 적가하였다. 6시간 동안 저어준 후 여과하여 생성된 우레아를 제거하고 감압농축하였다. 물(100ml)과 에틸 아세테이트 100ml로 2회 추출한 후 유기층을 취하여 황산마그네슘으로 건조 여과하고 감압농축하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 2.3g의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:n-헥산=1:3)
TLC:Rf=0.34(에틸 아세테이트:헥산=1:3)
NMR(CDCl3); 1.2(3H, t), 1.7(3H,d), 4.2(2H, q), 4.8(1H, q), 6.8~8.2(10H, m), 9.2(1H,s)
④ 합텐 C의 합성
b5 (100mg)을 1,4-디옥산 5ml에 녹인 다음 수산화리튬 일수화물(20mg, 2eq)를 1ml의 물에 녹여 가하고 상온에서 5~6시간 저어주었다. 반응액에 2N HCl로 pH 2로 산성화시킨 다음에 디클로로메탄으로 추출하였다 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하여 감압증류 하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 17mg의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:n-헥산=1:3, 0.1% 아세트산)
TLC:Rf=0.21(아세톤:헥산=3:7, 0.1% 아세트산)
LC/MS; 471(M+H), 473
NMR(아세톤 d6); 1.67(3H,d), 5.12(1H, q), 7.1~8.8(11H, m), 9.2(1H, s)
4) 합텐 D의 합성
① d2의 합성
2-플루오로아닐린 (d1, 11.1g)과 에틸 3-브로모프로피오네이트(18.1g), 아세트산나트륨(8.2g)을 에탄올 20ml에 녹인 후 12시간 동안 가열 환류하였다. 물 50ml를 가하고 에틸 아세테이트 100ml로 2회 추출 후 유기층을 취하여 황산마그네슘으로 건조, 여과하여 감압농축하였다.
농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 10.5g의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:헥산=1:10)
TLC:Rf=0.55(에틸 아세테이트:헥산=1:3)
NMR(CDCl3); 1.26(3H, t), 2.62(2H, t), 3.47(2H, t), 4.15(2H, q), 4.24(broad), 6.6~7.1(4H, m)
② d3의 합성
합텐 B (330mg)을 에틸 아세테이트 20ml에 녹인 후, 0도로 냉각하고 옥살릴 클로라이드 (0.2ml) 를 가한 후 DMF(디메틸포름아미드)를 소량 첨가하였다. 3시간 후 용매를 감압농축하고, d2(220mg)와 NaHCO3가 녹아 있는 에틸 아세테이트 용액에 천천히 적가하였다. 2시간 후 물을 가하고 저어준 후 유기층을 취하여 황산마그네슘으로 건조, 여과하여 감압농축하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 350mg의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:헥산=1:8)
TLC:Rf=0.31(에틸 아세테이트:헥산=1:2)
GC/MS: 526(M+), 528, 481, 288, 266, 178, 124
NMR(CDCl3); 1.26(3H, t), 1.82(3H, d), 2.62(2H, t), 3.47(2H, t), 4.15(2H, q), 4.24(broad), 4.83(1H, q), 6.6~8.0(11H, m)
③ 합텐 D의 합성
d3 (200mg)을 1,4-디옥산 5ml에 녹인 다음 수산화리튬 일수화물(20mg, 2eq)를 1ml의 물에 녹여 가하고 상온에서 5~6시간 저어주었다. 반응액에 2N HCl로 pH 2로 산성화시킨 다음에 디클로로메탄으로 추출하였다 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하여 감압증류 하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 35mg의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:n-헥산=1:3, 0.1% 아세트산)
TLC:Rf=0.11(아세톤:헥산=3:7, 0.1% 아세트산)
LC/MS; 499(M+H), 501
NMR(아세톤 d6); 1.82(3H, d), 2.62(2H, t), 3.47(2H, t), 5.12(1H, q), 7.1~8.8(11H, m)
5) 합텐 E의 합성
① e2의 합성
4-아미노-3-히드록시 벤조산(e1, 7.0g)을 클로로포름 20ml에 첨가한 후 녹을 때까지 THF를 참가하였다. 여기에 DCC(10g, 1.1eq)와 DMAP 소량을 가한 후 메탄올 20ml를 천천히 첨가하고 8시간 동안 저어 주었다. 반응액을 여과하여 생성된 우레아를 제거하고 여액을 감압 농축 후 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 3.85g의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:헥산=1:2)
TLC:Rf=0.2(에틸 아세테이트:헥산=1:2)
GC/MS; 167(M+), 136, 108, 80
NMR(CDCl3); 3.84(3H, s), 6.66(1H,b), 6.68(2H, b), 7.3~7.6(6H, m)
② e3의 합성
e2 (3.3g)와 O-에틸 크산트산 칼륨염(3.5g, 1.1eq)를 피리딘 100ml에 녹인 후 3시간 동안 가열 환류하였다. 반응이 종료된 후 얼음이 채워진 10% HCl 용액에 반응액을 부은 후, 여과하였다. 여과된 고체를 건조 후 디에틸에테르:헥산=1:1 용액으로 재결정하여 4.1g의 생성물을 얻었다.
TLC:Rf=0.27(에틸 아세테이트:헥산=1:2)
GC/MS; 209(M+), 178, 146, 122
NMR(CDCl3); 3.83(3H, s), 7.07~7.31(3H, m)
④ e4의 합성
e3 (1.05g)와 PCl5(2.06g)을 클로로포름 25ml에 녹인 후 3시간 동안 가열 환류하였다. 물 20ml를 가하고 저어준 후 유기층을 취하여 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하여 감압증류 하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 460mg의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:n-헥산=1:20)
TLC:Rf=0.54(에틸 아세테이트:헥산=1:7)
GC/MS: 211(M+), 213, 180, 182, 152, 124
NMR(CDCl3); 3.83(3H, s), 7.27~7.61(3H, m)
⑤ e5의 합성
e4 (327mg)와 HPFMPA(447mg), K2CO3(100mg)을 DMF 10ml 에 녹인 후 1시간 동안 가열 환류하였다. 에틸 아세테이트 50ml를 가하고 물 50ml로 3회 추출하고 유기층을 취하여 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하여 감압증류 하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 350mg의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:n-헥산=1:3)
TLC:Rf=0.2(에틸 아세테이트:헥산=1:2)
GC/MS: 464(M+), 312, 180, 152, 123
NMR(CDCl3); 1.7(3H, d), 3.6(3H, s), 3.8(3H, s), 5.1(1H, q), 6.8~8.2(11H, m)
③ 합텐 E의 합성
e5 (300mg)을 1,4-디옥산 5ml에 녹인 다음 수산화리튬 일수화물(30mg, 2eq)를 1ml의 물에 녹여 가하고 상온에서 5~6시간 저어주었다. 반응액에 2N HCl로 pH 2로 산성화시킨 다음에 디클로로메탄으로 추출하였다 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하여 감압증류 하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 40mg의 생성물을 얻었다.
(에틸 아세테이트:n-헥산=1:3, 0.1% 아세트산)
TLC:Rf=0.14(아세톤:헥산=3:7, 0.1% 아세트산)
LC/MS; 451(M+H), 492(M+ACN)
NMR(아세톤 d6); 1.6(3H, d), 3.74(3H, s), 4.8(1H, q), 6.8~8.2(11H, m)
실시예 2: 합텐-담체 단백질 결합
합텐과 1.1 당량의 N-히드록시숙신이미드, 1.3 당량의 DCC를 DMF 1ml에 녹인 후 밤새 저어 주었다. 원심분리하여 우레아 침전을 제거하고, pH9.6 완충용액에 녹아 있는 단백질(KLH, BSA)에 0.5m씩 천천히 적가하였다. 12시간 동안 저어준 후, PBS 용액을 하루에 2회씩 갈아주면서 3일 동안 투석하였다. 결합에 사용한 단백질과 합텐의 양을 표 1에 나타내었다.
표 1. 합텐-단백질 결합 반응
합텐(mg) | 단백질(mg) | 합텐(mg) | 단백질(mg) | |||||||
A-KLH | 20 | 20 | A-BSA | 20 | 50 | |||||
B-KLH | 25 | 20 | B-BSA | 25 | 50 | |||||
D-KLH | 20 | 20 | C-BSA | 10 | 150 | |||||
E-KLH | 17 | 20 | D-BSA | 20 | 50 | |||||
E-BSA | 17 | 50 |
합텐과 단백질의 결합은 SDS-PAGE(12.5%, 80V)로 확인하였다. 도 1은 합텐-BSA 복합체 및 합텐-KLH 복합체의 형성을 보여주는 전기영동 사진이다. 도 1에서 A 패널은 합텐-BSA 복합체를 나타내며, B 패널은 합텐-KLH 복합체를 나타낸다. A 패널: 레인 1(마커), 레인 2(BSA), 레인 3(A-BSA), 레인 4(B-BSA), 레인 5(C-BSA), 레인 6(D-BSA), 및 레인 7(E-BSA). B 패널: 레인 1(마커), 레인 2(KLH), 레인 3(A-KLH), 레인 4(B-KLH), 레인 5(D-KLH) 및 레인 6(E-KLH). 도 1에서 보여주는 바와 같이, 합텐-BSA 복합체 및 합텐-KLH 복합체 모두 원하는 위치에 밴드를 확인할 수 있었다.
실시예
3: 항혈청 생산 및
역가
검정
1) 항혈청의 생산/역가 검정
합텐과 결합된 단백질의 양은 Bradford 법으로 정량하여(표 2) 다음 실험에 사용하였다.
표 2. 합텐-단백질 결합체의 단백질 농도
단백질(mg/ml) | 단백질(mg/ml) | |||
A-KLH | 1.18 | A-BSA | 6.15 | |
B-KLH | 2.05 | B-BSA | 7.40 | |
D-KLH | 2.98 | C-BSA | 9.93 | |
E-KLH | 0.66 | D-BSA | 6.33 | |
E-BSA | 6.09 |
합텐-KLH 복합체(A-KLH, B-KLH, D-KLH, E-KLH) 0.5mg이 용해된 PBS 용액을 프로인트 완전 애쥬반트(Freund complete adjuvant) 용액과 1:1로 혼합하여 유화액을 조제하고 2~4kg 토끼의 등 부위에 15~20군데 나누어서 주사하였다. 토끼는 각 항원당 2마리씩 사용하였다. 부스트(Boost) 주사시에는 합텐-KLH 복합체(A-KLH, B-KLH, D-KLH, E-KLH) 0.2mg이 용해된 PBS 용액을 프로인트 불완전 애쥬반트(Freund incomplete adjuvant)에 1:1로 혼합하여 유화액을 주사하고 최초 주사와 같은 방법으로 2주 간격으로 주사하였다. 주사 1주일 후 귀 정맥에서 혈액을 채취하여 항체 생성을 확인하고, 충분한 역가가 나타날 때가지 항원을 주사하였으며, 5번째 주사 후 심장 천자(heart puncture) 방법으로 혈액을 채취하였다.
2) 항혈청의 분리
채취한 혈액을 냉장고에서 하루 정도 응고 시킨 후, 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하여 사용시까지 -70℃에서 냉동보관하였다.
3) 항체의 순수 분리
항체를 순수 분리하기 위하여 PIERCE사의 protein A Immunoglobulin 정제 키 트를 이용하였다. 키트를 실온에서 안정화시킨 후 결합 완충액 5ml를 흘려주어 평형화시켰다. 결합 완충액과 1:1로 희석한 혈청을 로딩하고 결합 완충액 15ml로 세정하였다. 5ml의 용출 완충액으로 용출시켰다. 각 분획을 280nm에서 흡광도를 측정하고 흡광도가 측정된 E2-E3 부분을 합하여 다음 실험에 이용하였다. 도 2는 항체 분리의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서 레인 1은 분리 전의 항혈청을 나타내며, 레인 2는 분리 후의 항혈청을 나타낸다. 도 2에서 보여주는 바와 같이, SDS-PAGE 결과 정제 후 항체의 경쇄와 중쇄의 밴드가 나타남으로써 항체가 순수하게 분리되었음을 확인할 수 있었다.
4) 체크 보드 적정(check board titration)
ELISA에 필요한 코팅 항원과 항혈청의 희석배수를 결정하기 위하여 비경쟁 간접 ELISA를 수행한 결과, C-BSA와 A-KLH 항혈청의 경우에는 코팅항원과 항혈청의 희석배수는 각각 1:100, 1:1000 이었으며, A-BSA와 A-KLH 항혈청의 경우에도 코팅항원과 항혈청의 희석배수가 각각 1:100, 1:1000 이었다.
실시예
4: 간접경쟁 ELISA 분석 방법
메타미포프에 대한 민감도와 표준 직선을 확인하기 위하여 실시예 3에서 확인한 코팅항원과 항혈청의 희석배수로 간접경쟁 ELISA법을 이용하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
① 0.1M 카보네이트-비카보네이트 완충액(pH9.6)에 녹여 희석한 (5ng/웰, D-BSA) 코팅 항원 100㎕를 마이크로플레이트의 웰에서 인큐베이션시켰다(4℃, 12시간 이상).
② PBST(10mM 인산염완충식염수 + 0.05% Tween 20) 100㎕로 5회 세척하였다.
③ 1% BSA/PBS 100㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 블록킹시킨 후, PBS에 희석한 메타미포프 표준용액(100ppm~1ppt) 50㎕ 와 PBST로 희석한 항혈청(1:10,000) 50㎕를 웰에 넣어 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
④ PBST 100㎕로 5회 세척하였다.
⑤ PBST로 1:10,000으로 희석한 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 염소 항-토끼 IgG 용액 100㎕를 넣어 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
⑥ PBST 100㎕로 5회 세척하였다.
⑦ 포스페이트-시트레이트 완충액(pH 5.0)에 용해된 효소 기질 o-페닐렌디아민(OPD)(0.4 mg/ml) 100㎕를 넣은 후 37℃에서 30분간 반응시켰다.
⑧ 4N H2SO4 용액 50㎕를 넣어 반응을 중단시킨 후 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 3은 간접경쟁 ELISA 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 실험법으로 메타미포프를 PBS에 희석하고 D-BSA를 코팅항원으로 이용하고, A-KLH를 항혈청으로 이용하여 실험한 결과, 최대 흡광도를 50% 저해하는 분석 물질의 농도를 의미하며, ELISA의 민감도를 나타내는 IC50이 메타미포프에 대하여 0.04ppm 을 확인하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 메타미포프의 특정 합텐 화합물과 단백질이 결합된 복합체에 대한 항체를 이용함으로써 제초제 메타미포프를 신속하고 정량적으로 검출할 수 있다.
Claims (11)
- 제초제 메타미포프(metamifop)의 합텐 화합물과 단백질이 아미드 결합에 의해 결합된 복합체에 있어서,상기 단백질이 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 피브리노겐, 오발부민, 티로글로불린(thyroglobulin) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)이며,상기 메타미포프의 합텐 화합물이 하기 화학식 1의 화합물인 것을 특징으로 하는 복합체:<화학식 1>[식 중,R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기를 나타내고;R5 및 R6는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 1 내지 10의 카르복시알킬기, 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기, 또는상기 R7는 수소, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬기를 나타내고;R8, R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기를 나타내며;단, R1 내지 R12 중 하나 이상은 카르복실기 및 아미노기 중 하나 이상을 포함한다].
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 제초제 메타미포프의 효소면역학적 분석에 이용되는 것을 특징으로 하는 복합체.
- 하기 화학식 1의 구조를 갖는 메타미포프의 합텐 화합물:<화학식 1>[식 중,R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기를 나타내고;R5 및 R6는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 1 내지 10의 카르복시알킬기, 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기, 또는상기 R7는 수소, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬기를 나타내고;R8, R9, R10, R11 및 R12는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기, 히드록시기, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 할로겐 원자, 시아노기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 니트로기, 탄소수 2 내지 10의 카르복시알킬기, 또는 탄소수 1 내지 10의 히드록시알킬기를 나타내며;단, R1 내지 R12 중 하나 이상은 카르복실기 및 아미노기 중 하나 이상을 포함한다].
- 제1항의 복합체에 반응하여 생성되는, 메타미포프에 특이적으로 결합하는 항체.
- 제1항의 복합체로 비인간 포유동물을 면역시키는 단계 및 상기 비인간 포유동물로부터 메타미포프에 특이적인 항체를 선발하는 단계를 포함하는, 메타미포프에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법.
- 제9항의 항체를 포함하는, 시료 중의 메타미포프를 검출하는 키트.
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