JP3947283B2 - イプロジオン及びその代謝物のハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents
イプロジオン及びその代謝物のハプテン化合物、抗体及び測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3947283B2 JP3947283B2 JP31788397A JP31788397A JP3947283B2 JP 3947283 B2 JP3947283 B2 JP 3947283B2 JP 31788397 A JP31788397 A JP 31788397A JP 31788397 A JP31788397 A JP 31788397A JP 3947283 B2 JP3947283 B2 JP 3947283B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- iprodione
- antibody
- antigen
- compound
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 0 C*(C)*(CC(N1c(cc2C)cc(C)c2O*)=O)C1=O Chemical compound C*(C)*(CC(N1c(cc2C)cc(C)c2O*)=O)C1=O 0.000 description 2
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、３−（３，５−ジクロロフェニル）−Ｎ−イソプロピル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−カルボキサミド（以下、本明細書中「イプロジオン」と言う）及び／またはその代謝化合物であるＮ−（３，５−ジクロロフェニル）−３−イソプロピル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−カルボキサミド（以下、「イプロジオン代謝物」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントに関する。
【０００２】
本発明は、さらに前記抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
イプロジオンは、以下の式（２）：
【化４】
で表される構造を有する化合物である。イプロジオンはジカルボキシイミド系殺菌剤の一種で、アルタナリア属菌、ボトリチス属菌及びスクレロチニア属菌等に殺菌性を示し、野菜、豆類、果樹などの灰色かび病及び菌核病等の各種病害に効果がある（「最新農薬の残留分析法」 第３６８頁−第３６９頁、農薬残留分析法研究班編集 中央法規出版；農薬ハンドブック 第２０８頁−第２１１頁、１９９４年版、日本植物防疫協会）。
【０００４】
また、イプロジオンは植物体中では、以下の式（３）：
【化５】
で表される構造を有する、Ｎ−（３，５−ジクロロフェニル）−３−イソプロピル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−カルボキサミド（以下、「イプロジオン代謝物」と言う）を生成する（食品衛生学雑誌，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．２、ｐ．２８３−２８８，１９９５；増補：残留農薬分析法 ｐ．１２３−１２５，ソフトサイエンス社）。本明細書中、「イプロジオン」という用語は文脈により、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を意味する。
【０００５】
近年、水、土壌、大気等の環境中や食品中の残留農薬が人の健康に及ぼす影響について大きな社会的関心が寄せられている。イプロジオンについては、食品衛生法に基づき農産物中の残留基準値が、イプロジオン及びイプロジオン代謝物の合計値で、穀類で３−１０ｐｐｍ、豆類で０．２−１ｐｐｍ、いも類で０．１−０．５ｐｐｍ、てんさいで１ｐｐｍ、野菜で０．１−２５ｐｐｍ、果実で５−２５ｐｐｍ、オイルシードで１０−２０ｐｐｍ、ナッツ類で１０ｐｐｍ、茶で２０ｐｐｍ等、と定められている（「最新農薬の残留分析法」、前出）。また、水質に関しても環境庁による「ゴルフ場で使用される農薬による水質汚濁の防止に係る暫定指導指針」（１９９０年）において、イプロジオンのゴルフ場農薬排水に係る暫定指導指針値が３ｍｇ／ｌと定められている（用水と廃水 Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．９（１９９３） ｐ．３９−５１）。よって、環境や食品に関する安全確保のためには、これらに含有される、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の量を迅速、かつ正確に測定することが必要である。
【０００６】
従来、例えば農産物中のイプロジオンは、穀類、果実、野菜、豆類、いも類等の試料から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。例えば、試料をアセトンで抽出し、ヘキサンに転溶、フロリジルカラムクロマトグラフィーで精製した後、イプロジオン及びイプロジオン代謝物をＧＣで分析する方法が採用されてきた。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。イプロジオンの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。
【０００７】
免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適用されてきた。
【０００８】
免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ ０−７２０４−４２００−１ （１９９０） に記載されている。
【０００９】
一般に、分子量が大きな分子については、それ以上修飾することなく動物に接種することにより、適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生させることができる。しかし、イプロジオンのような低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生される。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。
【００１０】
しかし、低分子化合物を高分子化合物と結合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そのものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなければならない。
【００１１】
イプロジオンについての従来の研究は、本発明とは異なるハプテンを用いて抗体作製を行った報告がある（Ｐｅｓｔｉｃ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｃｏｎｇｒ． Ｐｅｓｔｉｃ． Ｃｈｅｍ．， ６ｔｈ（１９８７）， Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ，１９８６）。しかしながら、得られた抗体はイプロジオンに対するよりも類似化合物に高い反応性を有するものであり、より適切な抗体の作製が望まれていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応する新規な抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント、及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦａｂ断片等を意味する。
【００１３】
本発明はその一態様において、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【００１４】
本発明は、また、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン化合物となる、当該化合物の誘導体を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明は、さらに、イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を提供することを目的とする。当該結合体はイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応性を有する抗体を作製するための抗原となる。
【００１６】
本発明は、さらにまた、前記抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【００１７】
本発明は、さらに、前記抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント及び／又は前記イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を使用することを含む、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、イプロジオンにスペーサーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基を導入した、イプロジオンの誘導体をハプテンとして使用することにより、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。
【００１９】
本発明の対象となるイプロジオンは、以下の式（２）：
【化６】
で表される化合物である。
【００２０】
本発明の抗体は、例えば、イプロジオンにスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させたものを抗原として用いることによって得ることができる。例えば、以下の式（１）：
【化７】
［式（１）中、ｎは１−１０の整数、好ましくは３−８である］
で表される構造を有する化合物を、抗体作製のためのハプテンとして使用する。本発明において、化合物の立体異性体は特に限定されず全ての立体異性体を含む。
【００２１】
また、以下の式（４）：
【化８】
［式（４）中、ｎは１−１０の整数、好ましくは３−８である］
で表される構造を有する化合物も、本発明の抗体作製のためのハプテンとして使用することができる。
【００２２】
本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン化合物と高分子化合物との結合体、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物または該抗体を用いるイプロジオンの免疫学的測定方法に関する。
【００２３】
イプロジオン誘導体の作製
式（１）で表されるイプロジオン誘導体は、公知の方法に従って製造することができる。限定するわけではないが、例えば以下のような方法を用いることができる。
【００２４】
先ず、以下の式（Ｘ１）：
【化９】
で表される構造を有する４−アミノ−２，６−ジメチルフェノールを、以下の式（Ｘ２）：
【化１０】
［式（Ｘ２）中、
ＬはＣｌ，Ｂｒ，Ｉ等のハロゲン原子であり;
Ｐ1はカルボキシル基の保護基であり；そして
ｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する、保護基で保護されたカルボキシル基を有する化合物とを反応させて、以下の式（Ｘ３）：
【化１１】
［式（Ｘ３）中、Ｌ及びｎは先に定義した通りである。］
で表される構造を有する化合物を得る。
【００２５】
Ｐ1で示されるカルボキシル基の保護基は公知のものでよく、具体例として、例えばメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチルシリルエトキシメチル基等を挙げることができる。
【００２６】
反応は、例えばエタノール、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド及び水等の溶媒中で、水素化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン等の塩基の存在下において、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から５０℃において、０．５−１５時間、好ましくは１時間−５時間行う。
【００２７】
次いで、式（Ｘ３）の化合物を以下の式（Ｘ４）：
【化１２】
［式（Ｘ４）中、Ｐ2はカルボキシル保護基である］
で表される構造を有する、２−イソシアナト酢酸エステル化合物と反応させて、以下の式（Ｘ５）：
【化１３】
［式（Ｘ５）中、Ｐ1、Ｐ2及びｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【００２８】
反応は、例えば、ＴＨＦ、アセトニトリル、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、等の適当な有機溶媒中で、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１５０℃において、０．５時間−１５時間、好ましくは１時間−５時間行う。
【００２９】
カルボキシル保護基Ｐ2は、Ｐ1について上述したものと同様の公知のものでよく、Ｐ1と同一であっても、あるいは異なっていてもよい。
【００３０】
次いで、式（Ｘ５）の化合物を、縮合環化反応させることにより、以下の式（Ｘ６）：
【化１４】
［式（Ｘ６）中、ｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。縮合環化反応は、例えば濃塩酸、臭化水素酸等の強酸中、０℃から２００℃、好ましくは室温から１５０℃において、０．５時間−１５時間、好ましくは１時間−５時間行う。
【００３１】
さらに、式（Ｘ６）の化合物を、以下の式（Ｘ７）：
【化１５】
で表される構造を有するイソシアナトイソプロピルと反応させることによって、式（１）のイプロジオン誘導体を得ることができる。反応は、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等の塩基の存在下、０℃から２００℃、好ましくは室温から１５０℃において、０．５時間−１５時間、好ましくは０．５時間−５時間行う。
【００３２】
上述したような製造方法によって得られた化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とすることができる。
【００３３】
以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うことができる。
【００３４】
イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体の作製
上述のように合成されたイプロジオン誘導体は適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用する。
【００３５】
好ましい高分子化合物の例としては、スカシ貝のへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及びＢＳＡが好ましい。
【００３６】
イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．234 1090‐1094（1954）），または活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．42 301−309（１９９４））等の公知の方法によって行うことができる。
【００３７】
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、カルボン酸と蟻酸エステルとの反応により得られ、これを高分子化合物と反応させることにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が作製される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基性化合物としては、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエ−テル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエ−テル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
【００３８】
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド活性化エステルを生成する。
【００３９】
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾ−ル、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比は好ましくは１：１０−１０：１、最も好ましくは１：１ある。反応温度は、０−５０℃、好ましくは２２−２７℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
【００４０】
カップリング反応後反応液を遠心し、上清液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０−６０℃、好ましくは５−４０℃、より好ましくは２２−２７℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６時間、より好ましくは１−２時間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製して、イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を得ることができる。
【００４１】
また、上記と同様の方法により、酵素等の標識物質をイプロジオン誘導体に結合させたものを、免疫学的測定方法において使用することができる。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、 ３２ Ｐ、 １２５ Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などがある。
【００４２】
ポリクロ−ナル抗体の作製
イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を使用して、慣用化された方法により本発明のポリクロ−ナル抗体を作製することができる。例えば、イプロジオン誘導体−ＫＬＨ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫原として哺乳動物を免疫化することによって行う。免疫化される動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。
【００４３】
免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は1回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし5週間の問隔で複数回行うことができる。
【００４４】
免疫化した動物から血液を採取し、そこから分離した血清を用い、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物と反応するポリクローナル抗体の存在を評価することができる。
【００４５】
モノクロ−ナル抗体の作製
イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を使用して、公知の方法により本発明のモノクロ−ナル抗体を作製することができる。
【００４６】
モノクロ−ナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下記のような作業工程が必要である。
【００４７】
（ａ）免疫用抗原として使用するイプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体の作製
（ｂ）動物への免疫
（ｃ）血液を採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製
（ｄ）ミエロ−マの調製
（ｅ）抗体産生細胞とミエロ−マとの細胞融合とハイブリドーマの選択的培養（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリド−マのスクリ−ニングと細胞クローニング
（ｇ）ハイブリドーマの培養または動物へのハイブリドーマの移植によるモノクローナル抗体の調製
（ｈ）調製されたモノクロ−ナル抗体の反応性の測定等
モノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマテクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ−ルドスプリングハーバーラボラトリ−ズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，1980年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、1986年）に記載されている。
【００４８】
以下、本発明のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に対するモノクロ−ナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限されないことは当業者によって明らかであろう。
【００４９】
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクロ−ナル抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができる。
【００５０】
（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液またはこれらの組み合わせから得ることができるが脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
【００５１】
（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ−マ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ/Ｃマウス由来骨髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１, １−７（１９８７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６））、Ｓｐ ２／Ｏ−Ａｇ １４（Ｓｐ ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ, ２７６，２６９−２７０（１９７８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５, １−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）（Ｎａｔｕｒｅ, ２７７，１３１−１３３,（１９７９））等を使用できる。
【００５２】
上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に約3Ｘ103以上の細胞数を確保する。
【００５３】
（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例えばミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ)らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法を適宜採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜採用することができる。また、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエロ−マ細胞に対して脾細胞を３−１０倍程度用いればよい。
【００５４】
脾細胞とミエロ−マとが融合し、抗体産生能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行うことができる。
【００５５】
（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド−マ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥＬＩＳＡ法により、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に対する抗体活性を測定する。
【００５６】
さらに、測定によりイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリド−マが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって1個の細胞を取り出す方法；セルソ−タ−によって１個の細胞を分離する「ソータークローン」法等が挙げられる。限界希釈法が簡単でありよく用いられる。
【００５７】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを1−4回繰り返して安定して抗体価の得られたものを、抗イプロジオンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株及び／または抗イプロジオン代謝物モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭまたはＩＭＤＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温器中）で培養するが好ましい。
【００５８】
（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量培養はフォローファイバー型の培養装置等によって行われる。または、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させることも可能である。
【００５９】
これらにより得られた培養上清液あるいは腹水液を抗イプロジオンモノクローナル抗体及び／または抗イプロジオン代謝物モノクローナル抗体として使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精製することにより抗イプロジオンモノクローナル抗体及び／または抗イプロジオン代謝物モノクローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせることにより実施できる。
【００６０】
以上のようにして得られた抗イプロジオンモノクローナル抗体及び／または抗イプロジオン代謝物モノクローナル抗体は、例えば後述したＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定することができる。
【００６１】
抗体によるイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の測定
本発明で使用するポリクロ−ナル抗体によるイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の測定法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラ−ク法、スポット法、凝集法、オクタロニ−（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般に抗体の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリド−マ法とモノクロ−ナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。
【００６２】
イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の測定は、各種ＥＬＩＳＡ法のうち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。（ａ）まず、抗原であるイプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。（ｃ）これに各種濃度のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に競合的に結合させて、固相化抗原−抗体複合体及び、イプロジオン−抗体複合体及び／またはイプロジオン代謝物−抗体複合体を生成させる。（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の量を決定することができる。
【００６３】
（ａ）工程において、抗原を固相化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレ−トが挙げられる。
【００６４】
抗原を担体に固相化させるには、例えば、抗原を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベ−ションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば、１４５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５−５μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレ−トを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０−１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベ−ションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベ−ションが適している。
【００６５】
なお、抗体に固相化させる抗原としては、抗体に作製したイプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他の誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもできる。さらに、式（１）に含まれない他のイソキサチオン類似化合物も、固相化抗原として使用することも可能である。
【００６６】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化した担体において、イプロジオン誘導体部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエ−ス（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬、コ−ドＮｏ．ＵＫ−25Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエ−スを適量加え、約４℃で、一晩インキュベ−ションした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液としては特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが適している。
【００６７】
次いで（ｃ）工程において、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化抗原及び、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物と反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体及ぴ、イプロジオン−抗体複合体及び／またはイプロジオン代謝物−抗体複合体が生成する。
【００６８】
この際、抗体としては、第一抗体として本願発明のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に対する抗体を加え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応させる。
【００６９】
第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限定されるわけではないが、反応は、３７℃程度で約1時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の第一抗体を除去する。この反応に用いる試薬としては、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌの組成のものが好ましい。
【００７０】
次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素（例えば、ペルオキシダ−ゼまたはアルカリホスファタ−ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当である。担体に結合した第一抗体に約５０００−１００００倍、好ましくは最終吸光度が１．０−１．５となるように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は約３７℃で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。
【００７１】
次いで（ｄ）工程において担体に結合した第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の量を算出することができる。
【００７２】
第二抗体に結合する酵素としてペルオキシダ−ゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素及びο−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた後、２Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファタ−ゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
【００７３】
イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を添加しない反応溶液の吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の濃度を算出できる。
【００７４】
あるいはイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の測定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。
【００７５】
（ａ）まず、本発明のモノクロ−ナル抗体を、担体に固相化する。
（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。
（ｃ）上記工程とは別に各種濃度のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を含む試料にイプロジオン誘導体と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。
（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。
（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、あらかじめ作成した、検量線から試料中のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の量を決定する。
【００７６】
（ａ）工程においてモノクローナル抗体を固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ法において常用されるものを用いることができ、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートが挙げられる。モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートすることによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。あるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用することもできる。
【００７７】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する試料中のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物、並びに酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。
【００７８】
（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテンの調製はイプロジオン誘導体を酵素に結合する方法であれば、特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用することができる。調製した酵素結合ハプテンはイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を含む試料と混合する。
【００７９】
なお、酵素に結合させるハプテンとしては、抗体作製に使用したイプロジオン誘導体自体のみならず、式（１）で表される他の誘導体を用いることもできる。例えば、式（１）においてｎの数が相違する化合物を各々抗体作製用と標識競合用の化合物として用いることができる。さらに、式（１）に含まれない他のイプロジオン類似化合物も、酵素に結合させるハプテンとして使用可能である。
【００８０】
（ｄ）工程において当該化合物を抗体固相化担体に接触させ、混合物中のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物と酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用することができる。
【００８１】
さらに（ｅ）工程において酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより、検量線からイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の量を算出することができる。
【００８２】
上記に記載の方法において、イプロジオン及びイプロジオン代謝物の両方に反応性を有する抗体を用いてそれらの同時測定法に適用することも可能であるし、イプロジオンあるいはイプロジオン代謝物に特異的な抗体を用いて、各々の個別測定に適用することも可能である。さらに、反応性の異なる抗体を組み合わせることにより、イプロジオン及びイプロジオン代謝物を同時に測定することも可能である。
【００８３】
本発明のモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ２−５４は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でイプロジオンの量を３−３０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３０−３０００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる。また、イプロジオン代謝物の量を１−１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３−３００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例８、図１）。よって、ＩＰＤ２−５４はイプロジオンに対する反応性に比べイプロジオン代謝物に約１０倍の高感度で反応する。
【００８４】
また、モノクローナル抗体ＩＰＤ４−１８８は直接競合阻害ＥＩＬＳＡ法でイプロジオンの量を０．０３−３００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．１−３０ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例８、図２）。また、イプロジオン代謝物には約１％の交差反応性を認めるだけである（実施例９、図４）。
【００８５】
本発明の抗体の交差反応性
上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法または間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調べることができる。
【００８６】
例えば、ＩＰＤ２−５４は、前述したように直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でイプロジオンに対する反応性に比べイプロジオン代謝物に約１０倍の高感度で反応する。しかしながら、他のジカルボキシイミド系化合物であるプロシミドン、ビンクロゾリンとは反応しない（実施例９、図３）。また、ＩＰＤ４−１８８は非常に特異性が高く、直接競合阻害ＥＩＬＳＡ法でイプロジオンとのみ反応し、イプロジオン代謝物には約１％の交差反応性を認めるだけで、他のジカルボキシイミド系化合物であるプロシミドン、ビンクロゾリンとは反応しない（実施例９、図４）。
【００８７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８８】
【実施例】
実施例 1 イプロジオン誘導体の合成
【化１６】
【００８９】
６−（４−アミノ−２，６−ジクロロフェノキシ）ヘキサン酸エチルエステル（１）の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１００ｍｌに４−アミノ−２，６−ジクロロフェノール１０.０ｇ（５６ｍｍｏｌ）を溶解し、この溶液に６０％水素化ナトリウム２.５ｇ（６３ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。つぎにこの溶液に６−ブロモヘキサン酸エチルエステル１３.５ｇ（６１ｍｍｏｌ）を５−１０℃で加え、室温で１時間撹拌反応させた。反応混合物を濃縮後、トルエンで抽出し、トルエン層を水洗後、硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮し、残渣をシリカゲルクロマログラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、１２.５ｇ（収率７０％）の（１）を得た。
【００９０】
６−［２，６−ジクロロ−４−（Ｎ’−エトキシカルボニルメチルウレイド）フェノキシ］ヘキサン酸エチルエステル（２）の合成
テトラヒドロフラン８０ｍｌに６−（４−アミノ−２，６−ジクロロフェノキシ）ヘキサン酸エチルエステル（１）６.４ｇ（２０ｍｍｏｌ）と２−イソシアナート酢酸エチルエステル２.８ｇ（２２ｍｍｏｌ）を溶解し、この溶液を環流下に２時間撹拌した。反応混合物を濃縮後、トルエンで抽出し、トルエン層を水、５Ｎ塩酸、水の順に洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した．残渣の固体をｎ−ヘキサンで洗い、６.２ｇ（収率６９％）の（２）を得た。
融点＝９４−９６℃
【００９１】
６−［２，６−ジクロロ−４−（２，４−ジオキソイミダゾリジン−３−イル）フェノキシ］ヘキサン酸（３）の合成
濃塩酸５０ｍｌに６−［２，６−ジクロロ−４−（Ｎ’−エトキシカルボニルメチルウレイド）フェノキシ］ヘキサン酸エチルエステル（２）４.５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、この縣濁液を環流下で１時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却後、濾過した。得られた固体を水洗、乾燥後、ベンゼンで再結し２.５ｇ（６６％）の（３）を得た。
融点＝１６０−１６２℃
【００９２】
６−［２，６−ジクロロ−４−（１−イソプロピルカルバモイル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−３−イル）フェノキシ］ヘキサン酸（４）の合成
６−［２，６−ジクロロ−４−（２，４−ジオキソイミダゾリジン−３−イル）フェノキシ］ヘキサン酸（３）１.１ｇ（３ｍｍｏｌ）、イソシアナトイソプロピル０.５ｇ（６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン０.６ｇ（６ｍｍｏｌ）の混合物を１１０℃で３０分間加熱撹拌した。反応混合物を室温まで冷却後、ジエチルエーテル５０ｍｌと１Ｎ塩酸を加えた。エーテル層を水洗後、硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマログラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、０.８ｇ（収率５７％）の（４）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ-Ｄ6,δ)
1.17 (6Ｈ,ｄ), 1.47-1.62 (4Ｈ,ｍ),
1.56-1.82 (2Ｈ, ｍ), 2.25 (2Ｈ,ｔ),
3.86-3.93 (1Ｈ, ｍ), 4.01-4.05 (2Ｈ,ｍ),
4.33 (2Ｈ,ｓ), 7.55 (2Ｈ,ｓ),
7.65 (1Ｈ,ｄ), 12.01 (1Ｈ,ｓ)
【００９３】
実施例２ 免疫用抗原の作製
免疫用抗原としてイプロジオン誘導体とＫＬＨとの結合体を以下のように混合酸無水物法により作製した。
【００９４】
実施例１によって作製されたイプロジオン誘導体の７ｍｇを無水ジオキサン０．７ｍｌに溶解し、１０−１２℃に冷却した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン４μｌ及びクロロ蟻酸イソブチル２４μｌを添加し、１０−１２℃にて３０分間撹拌した（以下、これを「Ａ液」とする）。
【００９５】
一方、蒸留水１ｍｌにＫＬＨを２０ｍｇ溶解し、０．５％ＮａＨＣＯ3 ｐＨ９．４を外液として一晩透析した。透析後３０００ｒｐｍ、３０分間遠心し得られた上清１．５ｍｌにＡ液をゆっくり添加した。４℃にて２時間反応させた後、スパーテル１杯分のグリシンを添加してさらに４℃にて３０分間撹拌することにより反応を終了させた。この反応液を１４５ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１週間透析して免疫用抗原を得た。このようにして得られたイプロジオン誘導体−ＫＬＨ結合体を免疫用抗原として用いた。
【００９６】
実施例３ スクリーニング用抗原の作製
スクリーニング用抗原として実施例２と同様の方法によりイプロジオン誘導体−ＢＳＡ結合体を得た。
【００９７】
実施例４ 免疫感作
実施例２において調製した免疫用抗原を用いて、マウスに免疫を行った。免疫用抗原１００μｇをＰＢＳ １００μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジュバントと混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種した。１７日後にフロイント不完全アジュバントを用いて調製した免疫用抗原を、前記と同様の操作によりマウスに追加免疫をおこなった。また、４１日後にはＰＢＳに溶解した免疫抗原をマウスに追加免疫した。
【００９８】
実施例５ 抗血清によるイプロジオンとの反応性
実施例４で調製した抗血清を、以下の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でイプロジオンを測定し、抗血清を評価した。
【００９９】
実施例３で調製したスクリーニング用抗原の溶液（０．１μｇ／ｍｌ)を５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコーティングした。洗浄の後、４倍に希釈したブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」：大日本製薬、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）でブロッキングした後、抗血清希釈液と各種濃度のイプロジオンあるいはイプロジオン代謝物，その類似化合物を含む１０％メタノ−ル溶液とを等量混合し、その１００μｌをウェルに入れ、３７℃にて１時間反応させた。
【０１００】
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて1回洗浄の後、ＰＢＳを用いて５０００倍希釈したペルオキシダ−ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃にて1時間反応させた。さらに反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて2回洗浄し、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０１】
実施例６ ハイブリド−マ細胞の作製
実施例４に続き、血清中の抗イプロジオン抗体の活性が高くなったマウスの脾臓細胞と、マウスミエロ−マ細胞（Ｐ３Ｕ１）とを電気融合法にて細胞融合をおこなった。細胞増殖が認められた培養上清液について以下の方法でイプロジオン及びイプロジオン代謝物に対する抗体活性を調べた。
【０１０２】
実施例３で調製したスクリーニング用抗原の溶液（０．１μｇ／ｍｌ)を５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコーティングした。洗浄の後、４倍に希釈したブロックエースでブロッキングした後、培養上清液と各種濃度のイプロジオンあるいはイプロジオン代謝物，その類似化合物を含む１０％メタノ−ル溶液とを等量混合し、その１００μｌをウェルに入れ、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて１回洗浄の後、ＰＢＳを用いて、５０００倍希釈したペルオキシダ−ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０μｌずつ各ウェルにて３７℃１時間反応させる。さらに反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて2回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定し、抗体活性が認められたものを選抜した。
【０１０３】
次に、選抜されたウェルの細胞について限界希釈法を用いた細胞クロ−ニングをおこなった。その結果、主にイプロジオン代謝物に対して反応性を示す抗体を産生するハイブリド−マ細胞株をクロ−ン化し、そのうちのＩＰＤ２−５４を平成９年１１月１３日に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５１９として工業技術院生命工学工業研究所（〒３０５ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。また同様に、抗イプロジオン抗体を産生するハイブリド−マ細胞株をクロ−ン化した。そのうちのＩＰＤ４−１８８を平成９年１１月１３日に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２０として工業技術院生命工学工業研究所に寄託した。
【０１０４】
実施例７ イプロジオン誘導体とＨＲＰとの結合体作製
実施例２と同様な混合無水物法により実施例１で作製したイプロジオン誘導体とＨＲＰの結合体を作製した。１ｍｇのイプロジオン誘導体を無水ジオキサン０．２ｍｌに溶解した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン０．５μｌ，クロロ蟻酸イソブチル０．３μｌを添加し、１０−１２℃にて３０分間撹拌した。（以下、これを「Ｂ液」とする）
【０１０５】
一方、０．５％ＮａＨＣＯ3をＮａＯＨでｐＨ９．４に調整した溶液１ｍｌにＨＲＰ５ｍｇを溶解し、Ｂ液をこの中に滴下した。４℃にて２時間撹拌し、さらにグリシンを添加して３０分間撹拌することにより反応を終了させた。反応物をＰＢＳにて透析することにより、精製ＨＲＰ結合イプロジオン誘導体を得た。
【０１０６】
実施例８ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイプロジオン及びイプロジオン代謝物の測定
実施例６で得られたハイブリド−マ細胞（ＩＰＤ２−５４及びＩＰＤ４−１８８）をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得られた腹水を採取し、硫安分画法によりモノクロ−ナル抗体を分取し、以下の試験法にてイプロジオンを測定した。
【０１０７】
それぞれのモノクロ−ナル抗体溶液（ ＩＰＤ２−５４抗体２μｇ／ｍｌ、ＩＰＤ４−１８８抗体５μｇ／ｍｌ ）を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレ−トに加え、４℃で一晩静置し、翌日４倍希釈したブロックエ−スでブロッキングした後、イプロジオンあるいはイプロジオン代謝物、及び実施例７で作製した適度に希釈されたＨＲＰ結合イプロジオン誘導体を含む１０％メタノ−ル−ＰＢＳ溶液を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃１時間静置した。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて2回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０８】
ＩＰＤ２−５４抗体の結果を図１に示す。直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、イプロジオン及びイプロジオン代謝物を測定することができ、その測定範囲はイプロジオン代謝物１−１０００ｎｇ／ｍｌ，イプロジオン３−３０００ｎｇ／ｍｌであった。
【０１０９】
ＩＰＤ４−１８８抗体の結果を図２に示す。直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、イプロジオンを測定することができ、その測定範囲は０．０３−３００ｎｇ／ｍｌであった。
【０１１０】
実施例９ モノクロ−ナル抗体の評価
イプロジオン誘導体に由来する、クロ−ン化したハイブリド−マＩＰＤ２−５４の産生するモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ２−５４ならびにハイブリド−マＩＰＤ４−１８８の産生するモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ４−１８８について実施例８と同様の方法を用いてイプロジオン及びイプロジオン代謝物と他の類似するジカルボキシイミド系化合物に対する反応性について調べた。
【０１１１】
その結果、モノクローナル抗体ＩＰＤ２−５４はイプロジオンに対する反応性に比べイプロジオン代謝物に約１０倍の高感度で反応し、他のジカルボキシイミド系化合物であるプロシミドン、ビンクロゾリンとは反応しないことが判明した（図３）。また、モノクローナル抗体ＩＰＤ４−１８８は非常に特異性が高く、イプロジオンとのみ反応し、イプロジオン代謝物には約１％の交差反応性を認めるだけで、他のジカルボキシイミド系化合物であるプロシミドン、ビンクロゾリンとは反応しないことが判明した（図４）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ２−５４の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイプロジオン及びイプロジオン代謝物の測定を示す。
【図２】図２は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ４−１８８の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイプロジオンの測定を示す。
【図３】図３は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ２−５４の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイプロジオン及びイプロジオン代謝物、並びに他の類似するジカルボキシイミド系化合物の測定を示す。
【図４】図４は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ４−１８８の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイプロジオン及びイプロジオン代謝物と他の類似するジカルボキシイミド系化合物の測定を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、３−（３，５−ジクロロフェニル）−Ｎ−イソプロピル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−カルボキサミド（以下、本明細書中「イプロジオン」と言う）及び／またはその代謝化合物であるＮ−（３，５−ジクロロフェニル）−３−イソプロピル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−カルボキサミド（以下、「イプロジオン代謝物」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントに関する。
【０００２】
本発明は、さらに前記抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
イプロジオンは、以下の式（２）：
【化４】
【０００４】
また、イプロジオンは植物体中では、以下の式（３）：
【化５】
【０００５】
近年、水、土壌、大気等の環境中や食品中の残留農薬が人の健康に及ぼす影響について大きな社会的関心が寄せられている。イプロジオンについては、食品衛生法に基づき農産物中の残留基準値が、イプロジオン及びイプロジオン代謝物の合計値で、穀類で３−１０ｐｐｍ、豆類で０．２−１ｐｐｍ、いも類で０．１−０．５ｐｐｍ、てんさいで１ｐｐｍ、野菜で０．１−２５ｐｐｍ、果実で５−２５ｐｐｍ、オイルシードで１０−２０ｐｐｍ、ナッツ類で１０ｐｐｍ、茶で２０ｐｐｍ等、と定められている（「最新農薬の残留分析法」、前出）。また、水質に関しても環境庁による「ゴルフ場で使用される農薬による水質汚濁の防止に係る暫定指導指針」（１９９０年）において、イプロジオンのゴルフ場農薬排水に係る暫定指導指針値が３ｍｇ／ｌと定められている（用水と廃水 Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．９（１９９３） ｐ．３９−５１）。よって、環境や食品に関する安全確保のためには、これらに含有される、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の量を迅速、かつ正確に測定することが必要である。
【０００６】
従来、例えば農産物中のイプロジオンは、穀類、果実、野菜、豆類、いも類等の試料から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。例えば、試料をアセトンで抽出し、ヘキサンに転溶、フロリジルカラムクロマトグラフィーで精製した後、イプロジオン及びイプロジオン代謝物をＧＣで分析する方法が採用されてきた。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。イプロジオンの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。
【０００７】
免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適用されてきた。
【０００８】
免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ ０−７２０４−４２００−１ （１９９０） に記載されている。
【０００９】
一般に、分子量が大きな分子については、それ以上修飾することなく動物に接種することにより、適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生させることができる。しかし、イプロジオンのような低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生される。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。
【００１０】
しかし、低分子化合物を高分子化合物と結合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そのものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなければならない。
【００１１】
イプロジオンについての従来の研究は、本発明とは異なるハプテンを用いて抗体作製を行った報告がある（Ｐｅｓｔｉｃ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｃｏｎｇｒ． Ｐｅｓｔｉｃ． Ｃｈｅｍ．， ６ｔｈ（１９８７）， Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ，１９８６）。しかしながら、得られた抗体はイプロジオンに対するよりも類似化合物に高い反応性を有するものであり、より適切な抗体の作製が望まれていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応する新規な抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント、及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦａｂ断片等を意味する。
【００１３】
本発明はその一態様において、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【００１４】
本発明は、また、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン化合物となる、当該化合物の誘導体を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明は、さらに、イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を提供することを目的とする。当該結合体はイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応性を有する抗体を作製するための抗原となる。
【００１６】
本発明は、さらにまた、前記抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【００１７】
本発明は、さらに、前記抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント及び／又は前記イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を使用することを含む、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、イプロジオンにスペーサーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基を導入した、イプロジオンの誘導体をハプテンとして使用することにより、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。
【００１９】
本発明の対象となるイプロジオンは、以下の式（２）：
【化６】
【００２０】
本発明の抗体は、例えば、イプロジオンにスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させたものを抗原として用いることによって得ることができる。例えば、以下の式（１）：
【化７】
で表される構造を有する化合物を、抗体作製のためのハプテンとして使用する。本発明において、化合物の立体異性体は特に限定されず全ての立体異性体を含む。
【００２１】
また、以下の式（４）：
【化８】
で表される構造を有する化合物も、本発明の抗体作製のためのハプテンとして使用することができる。
【００２２】
本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン化合物と高分子化合物との結合体、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物または該抗体を用いるイプロジオンの免疫学的測定方法に関する。
【００２３】
イプロジオン誘導体の作製
式（１）で表されるイプロジオン誘導体は、公知の方法に従って製造することができる。限定するわけではないが、例えば以下のような方法を用いることができる。
【００２４】
先ず、以下の式（Ｘ１）：
【化９】
【化１０】
ＬはＣｌ，Ｂｒ，Ｉ等のハロゲン原子であり;
Ｐ1はカルボキシル基の保護基であり；そして
ｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する、保護基で保護されたカルボキシル基を有する化合物とを反応させて、以下の式（Ｘ３）：
【化１１】
で表される構造を有する化合物を得る。
【００２５】
Ｐ1で示されるカルボキシル基の保護基は公知のものでよく、具体例として、例えばメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチルシリルエトキシメチル基等を挙げることができる。
【００２６】
反応は、例えばエタノール、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド及び水等の溶媒中で、水素化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン等の塩基の存在下において、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から５０℃において、０．５−１５時間、好ましくは１時間−５時間行う。
【００２７】
次いで、式（Ｘ３）の化合物を以下の式（Ｘ４）：
【化１２】
で表される構造を有する、２−イソシアナト酢酸エステル化合物と反応させて、以下の式（Ｘ５）：
【化１３】
で表される構造を有する化合物を得る。
【００２８】
反応は、例えば、ＴＨＦ、アセトニトリル、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、等の適当な有機溶媒中で、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１５０℃において、０．５時間−１５時間、好ましくは１時間−５時間行う。
【００２９】
カルボキシル保護基Ｐ2は、Ｐ1について上述したものと同様の公知のものでよく、Ｐ1と同一であっても、あるいは異なっていてもよい。
【００３０】
次いで、式（Ｘ５）の化合物を、縮合環化反応させることにより、以下の式（Ｘ６）：
【化１４】
で表される構造を有する化合物を得る。縮合環化反応は、例えば濃塩酸、臭化水素酸等の強酸中、０℃から２００℃、好ましくは室温から１５０℃において、０．５時間−１５時間、好ましくは１時間−５時間行う。
【００３１】
さらに、式（Ｘ６）の化合物を、以下の式（Ｘ７）：
【化１５】
【００３２】
上述したような製造方法によって得られた化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とすることができる。
【００３３】
以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うことができる。
【００３４】
イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体の作製
上述のように合成されたイプロジオン誘導体は適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用する。
【００３５】
好ましい高分子化合物の例としては、スカシ貝のへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及びＢＳＡが好ましい。
【００３６】
イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．234 1090‐1094（1954）），または活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．42 301−309（１９９４））等の公知の方法によって行うことができる。
【００３７】
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、カルボン酸と蟻酸エステルとの反応により得られ、これを高分子化合物と反応させることにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が作製される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基性化合物としては、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエ−テル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエ−テル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
【００３８】
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド活性化エステルを生成する。
【００３９】
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾ−ル、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比は好ましくは１：１０−１０：１、最も好ましくは１：１ある。反応温度は、０−５０℃、好ましくは２２−２７℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
【００４０】
カップリング反応後反応液を遠心し、上清液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０−６０℃、好ましくは５−４０℃、より好ましくは２２−２７℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６時間、より好ましくは１−２時間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製して、イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を得ることができる。
【００４１】
また、上記と同様の方法により、酵素等の標識物質をイプロジオン誘導体に結合させたものを、免疫学的測定方法において使用することができる。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、 ３２ Ｐ、 １２５ Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などがある。
【００４２】
ポリクロ−ナル抗体の作製
イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を使用して、慣用化された方法により本発明のポリクロ−ナル抗体を作製することができる。例えば、イプロジオン誘導体−ＫＬＨ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫原として哺乳動物を免疫化することによって行う。免疫化される動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。
【００４３】
免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は1回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし5週間の問隔で複数回行うことができる。
【００４４】
免疫化した動物から血液を採取し、そこから分離した血清を用い、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物と反応するポリクローナル抗体の存在を評価することができる。
【００４５】
モノクロ−ナル抗体の作製
イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を使用して、公知の方法により本発明のモノクロ−ナル抗体を作製することができる。
【００４６】
モノクロ−ナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下記のような作業工程が必要である。
【００４７】
（ａ）免疫用抗原として使用するイプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体の作製
（ｂ）動物への免疫
（ｃ）血液を採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製
（ｄ）ミエロ−マの調製
（ｅ）抗体産生細胞とミエロ−マとの細胞融合とハイブリドーマの選択的培養（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリド−マのスクリ−ニングと細胞クローニング
（ｇ）ハイブリドーマの培養または動物へのハイブリドーマの移植によるモノクローナル抗体の調製
（ｈ）調製されたモノクロ−ナル抗体の反応性の測定等
モノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマテクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ−ルドスプリングハーバーラボラトリ−ズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，1980年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、1986年）に記載されている。
【００４８】
以下、本発明のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に対するモノクロ−ナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限されないことは当業者によって明らかであろう。
【００４９】
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクロ−ナル抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができる。
【００５０】
（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液またはこれらの組み合わせから得ることができるが脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
【００５１】
（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ−マ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ/Ｃマウス由来骨髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１, １−７（１９８７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６））、Ｓｐ ２／Ｏ−Ａｇ １４（Ｓｐ ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ, ２７６，２６９−２７０（１９７８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５, １−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）（Ｎａｔｕｒｅ, ２７７，１３１−１３３,（１９７９））等を使用できる。
【００５２】
上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に約3Ｘ103以上の細胞数を確保する。
【００５３】
（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例えばミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ)らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法を適宜採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜採用することができる。また、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエロ−マ細胞に対して脾細胞を３−１０倍程度用いればよい。
【００５４】
脾細胞とミエロ−マとが融合し、抗体産生能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行うことができる。
【００５５】
（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド−マ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥＬＩＳＡ法により、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に対する抗体活性を測定する。
【００５６】
さらに、測定によりイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリド−マが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって1個の細胞を取り出す方法；セルソ−タ−によって１個の細胞を分離する「ソータークローン」法等が挙げられる。限界希釈法が簡単でありよく用いられる。
【００５７】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを1−4回繰り返して安定して抗体価の得られたものを、抗イプロジオンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株及び／または抗イプロジオン代謝物モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭまたはＩＭＤＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温器中）で培養するが好ましい。
【００５８】
（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量培養はフォローファイバー型の培養装置等によって行われる。または、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させることも可能である。
【００５９】
これらにより得られた培養上清液あるいは腹水液を抗イプロジオンモノクローナル抗体及び／または抗イプロジオン代謝物モノクローナル抗体として使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精製することにより抗イプロジオンモノクローナル抗体及び／または抗イプロジオン代謝物モノクローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせることにより実施できる。
【００６０】
以上のようにして得られた抗イプロジオンモノクローナル抗体及び／または抗イプロジオン代謝物モノクローナル抗体は、例えば後述したＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定することができる。
【００６１】
抗体によるイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の測定
本発明で使用するポリクロ−ナル抗体によるイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の測定法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラ−ク法、スポット法、凝集法、オクタロニ−（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般に抗体の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリド−マ法とモノクロ−ナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。
【００６２】
イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の測定は、各種ＥＬＩＳＡ法のうち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。（ａ）まず、抗原であるイプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体を担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。（ｃ）これに各種濃度のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に競合的に結合させて、固相化抗原−抗体複合体及び、イプロジオン−抗体複合体及び／またはイプロジオン代謝物−抗体複合体を生成させる。（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の量を決定することができる。
【００６３】
（ａ）工程において、抗原を固相化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレ−トが挙げられる。
【００６４】
抗原を担体に固相化させるには、例えば、抗原を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベ−ションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば、１４５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５−５μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレ−トを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０−１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベ−ションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベ−ションが適している。
【００６５】
なお、抗体に固相化させる抗原としては、抗体に作製したイプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他の誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもできる。さらに、式（１）に含まれない他のイソキサチオン類似化合物も、固相化抗原として使用することも可能である。
【００６６】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（イプロジオン誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化した担体において、イプロジオン誘導体部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエ−ス（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬、コ−ドＮｏ．ＵＫ−25Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエ−スを適量加え、約４℃で、一晩インキュベ−ションした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液としては特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが適している。
【００６７】
次いで（ｃ）工程において、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化抗原及び、イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物と反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体及ぴ、イプロジオン−抗体複合体及び／またはイプロジオン代謝物−抗体複合体が生成する。
【００６８】
この際、抗体としては、第一抗体として本願発明のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物に対する抗体を加え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応させる。
【００６９】
第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限定されるわけではないが、反応は、３７℃程度で約1時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の第一抗体を除去する。この反応に用いる試薬としては、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌの組成のものが好ましい。
【００７０】
次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素（例えば、ペルオキシダ−ゼまたはアルカリホスファタ−ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当である。担体に結合した第一抗体に約５０００−１００００倍、好ましくは最終吸光度が１．０−１．５となるように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は約３７℃で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。
【００７１】
次いで（ｄ）工程において担体に結合した第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の量を算出することができる。
【００７２】
第二抗体に結合する酵素としてペルオキシダ−ゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素及びο−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた後、２Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファタ−ゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
【００７３】
イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を添加しない反応溶液の吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の濃度を算出できる。
【００７４】
あるいはイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の測定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。
【００７５】
（ａ）まず、本発明のモノクロ−ナル抗体を、担体に固相化する。
（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。
（ｃ）上記工程とは別に各種濃度のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を含む試料にイプロジオン誘導体と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。
（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。
（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、あらかじめ作成した、検量線から試料中のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の量を決定する。
【００７６】
（ａ）工程においてモノクローナル抗体を固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ法において常用されるものを用いることができ、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートが挙げられる。モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートすることによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。あるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用することもできる。
【００７７】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する試料中のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物、並びに酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。
【００７８】
（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテンの調製はイプロジオン誘導体を酵素に結合する方法であれば、特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用することができる。調製した酵素結合ハプテンはイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を含む試料と混合する。
【００７９】
なお、酵素に結合させるハプテンとしては、抗体作製に使用したイプロジオン誘導体自体のみならず、式（１）で表される他の誘導体を用いることもできる。例えば、式（１）においてｎの数が相違する化合物を各々抗体作製用と標識競合用の化合物として用いることができる。さらに、式（１）に含まれない他のイプロジオン類似化合物も、酵素に結合させるハプテンとして使用可能である。
【００８０】
（ｄ）工程において当該化合物を抗体固相化担体に接触させ、混合物中のイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物と酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。イプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物を含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用することができる。
【００８１】
さらに（ｅ）工程において酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより、検量線からイプロジオン及び／またはイプロジオン代謝物の量を算出することができる。
【００８２】
上記に記載の方法において、イプロジオン及びイプロジオン代謝物の両方に反応性を有する抗体を用いてそれらの同時測定法に適用することも可能であるし、イプロジオンあるいはイプロジオン代謝物に特異的な抗体を用いて、各々の個別測定に適用することも可能である。さらに、反応性の異なる抗体を組み合わせることにより、イプロジオン及びイプロジオン代謝物を同時に測定することも可能である。
【００８３】
本発明のモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ２−５４は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でイプロジオンの量を３−３０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３０−３０００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる。また、イプロジオン代謝物の量を１−１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３−３００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例８、図１）。よって、ＩＰＤ２−５４はイプロジオンに対する反応性に比べイプロジオン代謝物に約１０倍の高感度で反応する。
【００８４】
また、モノクローナル抗体ＩＰＤ４−１８８は直接競合阻害ＥＩＬＳＡ法でイプロジオンの量を０．０３−３００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．１−３０ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例８、図２）。また、イプロジオン代謝物には約１％の交差反応性を認めるだけである（実施例９、図４）。
【００８５】
本発明の抗体の交差反応性
上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法または間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調べることができる。
【００８６】
例えば、ＩＰＤ２−５４は、前述したように直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でイプロジオンに対する反応性に比べイプロジオン代謝物に約１０倍の高感度で反応する。しかしながら、他のジカルボキシイミド系化合物であるプロシミドン、ビンクロゾリンとは反応しない（実施例９、図３）。また、ＩＰＤ４−１８８は非常に特異性が高く、直接競合阻害ＥＩＬＳＡ法でイプロジオンとのみ反応し、イプロジオン代謝物には約１％の交差反応性を認めるだけで、他のジカルボキシイミド系化合物であるプロシミドン、ビンクロゾリンとは反応しない（実施例９、図４）。
【００８７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８８】
【実施例】
実施例 1 イプロジオン誘導体の合成
【化１６】
６−（４−アミノ−２，６−ジクロロフェノキシ）ヘキサン酸エチルエステル（１）の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１００ｍｌに４−アミノ−２，６−ジクロロフェノール１０.０ｇ（５６ｍｍｏｌ）を溶解し、この溶液に６０％水素化ナトリウム２.５ｇ（６３ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。つぎにこの溶液に６−ブロモヘキサン酸エチルエステル１３.５ｇ（６１ｍｍｏｌ）を５−１０℃で加え、室温で１時間撹拌反応させた。反応混合物を濃縮後、トルエンで抽出し、トルエン層を水洗後、硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮し、残渣をシリカゲルクロマログラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、１２.５ｇ（収率７０％）の（１）を得た。
【００９０】
６−［２，６−ジクロロ−４−（Ｎ’−エトキシカルボニルメチルウレイド）フェノキシ］ヘキサン酸エチルエステル（２）の合成
テトラヒドロフラン８０ｍｌに６−（４−アミノ−２，６−ジクロロフェノキシ）ヘキサン酸エチルエステル（１）６.４ｇ（２０ｍｍｏｌ）と２−イソシアナート酢酸エチルエステル２.８ｇ（２２ｍｍｏｌ）を溶解し、この溶液を環流下に２時間撹拌した。反応混合物を濃縮後、トルエンで抽出し、トルエン層を水、５Ｎ塩酸、水の順に洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した．残渣の固体をｎ−ヘキサンで洗い、６.２ｇ（収率６９％）の（２）を得た。
融点＝９４−９６℃
【００９１】
６−［２，６−ジクロロ−４−（２，４−ジオキソイミダゾリジン−３−イル）フェノキシ］ヘキサン酸（３）の合成
濃塩酸５０ｍｌに６−［２，６−ジクロロ−４−（Ｎ’−エトキシカルボニルメチルウレイド）フェノキシ］ヘキサン酸エチルエステル（２）４.５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、この縣濁液を環流下で１時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却後、濾過した。得られた固体を水洗、乾燥後、ベンゼンで再結し２.５ｇ（６６％）の（３）を得た。
融点＝１６０−１６２℃
【００９２】
６−［２，６−ジクロロ−４−（１−イソプロピルカルバモイル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−３−イル）フェノキシ］ヘキサン酸（４）の合成
６−［２，６−ジクロロ−４−（２，４−ジオキソイミダゾリジン−３−イル）フェノキシ］ヘキサン酸（３）１.１ｇ（３ｍｍｏｌ）、イソシアナトイソプロピル０.５ｇ（６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン０.６ｇ（６ｍｍｏｌ）の混合物を１１０℃で３０分間加熱撹拌した。反応混合物を室温まで冷却後、ジエチルエーテル５０ｍｌと１Ｎ塩酸を加えた。エーテル層を水洗後、硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマログラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、０.８ｇ（収率５７％）の（４）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ-Ｄ6,δ)
1.17 (6Ｈ,ｄ), 1.47-1.62 (4Ｈ,ｍ),
1.56-1.82 (2Ｈ, ｍ), 2.25 (2Ｈ,ｔ),
3.86-3.93 (1Ｈ, ｍ), 4.01-4.05 (2Ｈ,ｍ),
4.33 (2Ｈ,ｓ), 7.55 (2Ｈ,ｓ),
7.65 (1Ｈ,ｄ), 12.01 (1Ｈ,ｓ)
【００９３】
実施例２ 免疫用抗原の作製
免疫用抗原としてイプロジオン誘導体とＫＬＨとの結合体を以下のように混合酸無水物法により作製した。
【００９４】
実施例１によって作製されたイプロジオン誘導体の７ｍｇを無水ジオキサン０．７ｍｌに溶解し、１０−１２℃に冷却した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン４μｌ及びクロロ蟻酸イソブチル２４μｌを添加し、１０−１２℃にて３０分間撹拌した（以下、これを「Ａ液」とする）。
【００９５】
一方、蒸留水１ｍｌにＫＬＨを２０ｍｇ溶解し、０．５％ＮａＨＣＯ3 ｐＨ９．４を外液として一晩透析した。透析後３０００ｒｐｍ、３０分間遠心し得られた上清１．５ｍｌにＡ液をゆっくり添加した。４℃にて２時間反応させた後、スパーテル１杯分のグリシンを添加してさらに４℃にて３０分間撹拌することにより反応を終了させた。この反応液を１４５ｍＭ ＮａＣｌ−１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１週間透析して免疫用抗原を得た。このようにして得られたイプロジオン誘導体−ＫＬＨ結合体を免疫用抗原として用いた。
【００９６】
実施例３ スクリーニング用抗原の作製
スクリーニング用抗原として実施例２と同様の方法によりイプロジオン誘導体−ＢＳＡ結合体を得た。
【００９７】
実施例４ 免疫感作
実施例２において調製した免疫用抗原を用いて、マウスに免疫を行った。免疫用抗原１００μｇをＰＢＳ １００μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジュバントと混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種した。１７日後にフロイント不完全アジュバントを用いて調製した免疫用抗原を、前記と同様の操作によりマウスに追加免疫をおこなった。また、４１日後にはＰＢＳに溶解した免疫抗原をマウスに追加免疫した。
【００９８】
実施例５ 抗血清によるイプロジオンとの反応性
実施例４で調製した抗血清を、以下の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でイプロジオンを測定し、抗血清を評価した。
【００９９】
実施例３で調製したスクリーニング用抗原の溶液（０．１μｇ／ｍｌ)を５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコーティングした。洗浄の後、４倍に希釈したブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」：大日本製薬、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）でブロッキングした後、抗血清希釈液と各種濃度のイプロジオンあるいはイプロジオン代謝物，その類似化合物を含む１０％メタノ−ル溶液とを等量混合し、その１００μｌをウェルに入れ、３７℃にて１時間反応させた。
【０１００】
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて1回洗浄の後、ＰＢＳを用いて５０００倍希釈したペルオキシダ−ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃にて1時間反応させた。さらに反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて2回洗浄し、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０１】
実施例６ ハイブリド−マ細胞の作製
実施例４に続き、血清中の抗イプロジオン抗体の活性が高くなったマウスの脾臓細胞と、マウスミエロ−マ細胞（Ｐ３Ｕ１）とを電気融合法にて細胞融合をおこなった。細胞増殖が認められた培養上清液について以下の方法でイプロジオン及びイプロジオン代謝物に対する抗体活性を調べた。
【０１０２】
実施例３で調製したスクリーニング用抗原の溶液（０．１μｇ／ｍｌ)を５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコーティングした。洗浄の後、４倍に希釈したブロックエースでブロッキングした後、培養上清液と各種濃度のイプロジオンあるいはイプロジオン代謝物，その類似化合物を含む１０％メタノ−ル溶液とを等量混合し、その１００μｌをウェルに入れ、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて１回洗浄の後、ＰＢＳを用いて、５０００倍希釈したペルオキシダ−ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０μｌずつ各ウェルにて３７℃１時間反応させる。さらに反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて2回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定し、抗体活性が認められたものを選抜した。
【０１０３】
次に、選抜されたウェルの細胞について限界希釈法を用いた細胞クロ−ニングをおこなった。その結果、主にイプロジオン代謝物に対して反応性を示す抗体を産生するハイブリド−マ細胞株をクロ−ン化し、そのうちのＩＰＤ２−５４を平成９年１１月１３日に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５１９として工業技術院生命工学工業研究所（〒３０５ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。また同様に、抗イプロジオン抗体を産生するハイブリド−マ細胞株をクロ−ン化した。そのうちのＩＰＤ４−１８８を平成９年１１月１３日に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２０として工業技術院生命工学工業研究所に寄託した。
【０１０４】
実施例７ イプロジオン誘導体とＨＲＰとの結合体作製
実施例２と同様な混合無水物法により実施例１で作製したイプロジオン誘導体とＨＲＰの結合体を作製した。１ｍｇのイプロジオン誘導体を無水ジオキサン０．２ｍｌに溶解した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン０．５μｌ，クロロ蟻酸イソブチル０．３μｌを添加し、１０−１２℃にて３０分間撹拌した。（以下、これを「Ｂ液」とする）
【０１０５】
一方、０．５％ＮａＨＣＯ3をＮａＯＨでｐＨ９．４に調整した溶液１ｍｌにＨＲＰ５ｍｇを溶解し、Ｂ液をこの中に滴下した。４℃にて２時間撹拌し、さらにグリシンを添加して３０分間撹拌することにより反応を終了させた。反応物をＰＢＳにて透析することにより、精製ＨＲＰ結合イプロジオン誘導体を得た。
【０１０６】
実施例８ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイプロジオン及びイプロジオン代謝物の測定
実施例６で得られたハイブリド−マ細胞（ＩＰＤ２−５４及びＩＰＤ４−１８８）をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得られた腹水を採取し、硫安分画法によりモノクロ−ナル抗体を分取し、以下の試験法にてイプロジオンを測定した。
【０１０７】
それぞれのモノクロ−ナル抗体溶液（ ＩＰＤ２−５４抗体２μｇ／ｍｌ、ＩＰＤ４−１８８抗体５μｇ／ｍｌ ）を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレ−トに加え、４℃で一晩静置し、翌日４倍希釈したブロックエ−スでブロッキングした後、イプロジオンあるいはイプロジオン代謝物、及び実施例７で作製した適度に希釈されたＨＲＰ結合イプロジオン誘導体を含む１０％メタノ−ル−ＰＢＳ溶液を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃１時間静置した。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて2回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０８】
ＩＰＤ２−５４抗体の結果を図１に示す。直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、イプロジオン及びイプロジオン代謝物を測定することができ、その測定範囲はイプロジオン代謝物１−１０００ｎｇ／ｍｌ，イプロジオン３−３０００ｎｇ／ｍｌであった。
【０１０９】
ＩＰＤ４−１８８抗体の結果を図２に示す。直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、イプロジオンを測定することができ、その測定範囲は０．０３−３００ｎｇ／ｍｌであった。
【０１１０】
実施例９ モノクロ−ナル抗体の評価
イプロジオン誘導体に由来する、クロ−ン化したハイブリド−マＩＰＤ２−５４の産生するモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ２−５４ならびにハイブリド−マＩＰＤ４−１８８の産生するモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ４−１８８について実施例８と同様の方法を用いてイプロジオン及びイプロジオン代謝物と他の類似するジカルボキシイミド系化合物に対する反応性について調べた。
【０１１１】
その結果、モノクローナル抗体ＩＰＤ２−５４はイプロジオンに対する反応性に比べイプロジオン代謝物に約１０倍の高感度で反応し、他のジカルボキシイミド系化合物であるプロシミドン、ビンクロゾリンとは反応しないことが判明した（図３）。また、モノクローナル抗体ＩＰＤ４−１８８は非常に特異性が高く、イプロジオンとのみ反応し、イプロジオン代謝物には約１％の交差反応性を認めるだけで、他のジカルボキシイミド系化合物であるプロシミドン、ビンクロゾリンとは反応しないことが判明した（図４）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ２−５４の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイプロジオン及びイプロジオン代謝物の測定を示す。
【図２】図２は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ４−１８８の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイプロジオンの測定を示す。
【図３】図３は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ２−５４の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイプロジオン及びイプロジオン代謝物、並びに他の類似するジカルボキシイミド系化合物の測定を示す。
【図４】図４は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＩＰＤ４−１８８の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイプロジオン及びイプロジオン代謝物と他の類似するジカルボキシイミド系化合物の測定を示す。
Claims (9)
- 以下の式（１）：
で表される構造を有する化合物。 - 請求項１に記載された化合物とＢＳＡ及びＫＬＨからなる群から選択される高分子化合物又は標識物質との結合体。
- 請求項１に記載の化合物とＢＳＡ及びＫＬＨからなる群から選択される高分子化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以下の式（２）：
- 請求項２に記載の結合体を抗原として用いることにより製造された、式（２）及び／または（３）で表される化合物に反応性を示す抗体または抗原と結合可能なそのフラグメント。
- モノクローナル抗体である、請求項４に記載の抗体または抗原と結合可能なそのフラグメント。
- 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５１９またはＦＥＲＭ Ｐ−１６５２０で寄託されているハイブリドーマから産生される、請求項４または５に記載の抗体または抗原と結合可能なそのフラグメント。
- 請求項４ないし６のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
- 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５１９またはＦＥＲＭ Ｐ−１６５２０で寄託されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
- 請求項４ないし６のいずれか１項に記載の抗体または抗原と結合可能なそのフラグメントを用いることを特徴とする、式（２）及び／または（３）で表される化合物の免疫学的測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31788397A JP3947283B2 (ja) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | イプロジオン及びその代謝物のハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31788397A JP3947283B2 (ja) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | イプロジオン及びその代謝物のハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11147878A JPH11147878A (ja) | 1999-06-02 |
| JP3947283B2 true JP3947283B2 (ja) | 2007-07-18 |
Family
ID=18093125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31788397A Expired - Lifetime JP3947283B2 (ja) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | イプロジオン及びその代謝物のハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3947283B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107022024A (zh) * | 2017-04-25 | 2017-08-08 | 江南大学 | 一种异菌脲人工抗原的合成方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006282547A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Horiba Ltd | ニテンピラムのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマ、およびその測定手段、測定用キットまたは測定方法 |
| JP4916128B2 (ja) * | 2005-05-20 | 2012-04-11 | 株式会社堀場製作所 | フィプロニルのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法 |
| BRPI0809693A2 (pt) | 2007-04-05 | 2014-10-07 | Sanofi Aventis | Derivados de imidazolidina carboxamida como inibidores de lipase e fosfolipase |
| JP4800288B2 (ja) * | 2007-11-08 | 2011-10-26 | ハウス食品株式会社 | 光触媒を用いた食品等の有機化合物を含む試料中のイプロジオン及び／又はイプロジオン代謝物の分析方法 |
| CN105388281B (zh) * | 2015-12-23 | 2017-09-12 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 检测异菌脲的酶联免疫试剂盒及其应用 |
| CN105388286B (zh) * | 2015-12-23 | 2017-07-07 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种检测异菌脲的试纸条及其制备方法和应用 |
| CN109061153B (zh) * | 2018-09-21 | 2021-07-06 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种检测异菌脲的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 |
| CN109265401B (zh) * | 2018-09-21 | 2021-09-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种异菌脲半抗原与抗原的制备方法及应用 |
-
1997
- 1997-11-19 JP JP31788397A patent/JP3947283B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107022024A (zh) * | 2017-04-25 | 2017-08-08 | 江南大学 | 一种异菌脲人工抗原的合成方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11147878A (ja) | 1999-06-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3884586B2 (ja) | イミダクロプリドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP3947283B2 (ja) | イプロジオン及びその代謝物のハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP3940245B2 (ja) | アセタミプリドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP3188641B2 (ja) | ミクロブタニルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP3188642B2 (ja) | イマザリルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP3842919B2 (ja) | クロルフェナピルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP3950600B2 (ja) | フェニトロチオンのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP2000095769A (ja) | プロベナゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP2000191624A (ja) | カルバリルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP3026942B2 (ja) | ダイアジノンのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP2000086654A (ja) | イソプロチオランのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP4221119B2 (ja) | ドウモイ酸に対する特異的抗体及びドウモイ酸の免疫学的分析方法 | |
| JP3015306B2 (ja) | 酸アミド系化合物のハプテン化合物、抗体および測定方法 | |
| JP2993902B2 (ja) | トリフルミゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP2001255324A (ja) | フサライドの抗体及び測定方法 | |
| JPH10101615A (ja) | フェノキシ酢酸類のハプテン化合物、抗体および測定方法 | |
| JPH10262662A (ja) | ホキシムのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP2000270862A (ja) | プレチラクロールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JPH11140100A (ja) | イソキサチオンのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP2824049B2 (ja) | チオカルバマート系化合物のハプテン化合物、抗体および測定方法 | |
| JPH11255786A (ja) | トルクロホスメチルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JPH11269157A (ja) | ベンタゾンのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JPH1132762A (ja) | ダミノジッドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP2000247939A (ja) | プロピザミドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JPH11209368A (ja) | ベンダイオカルブのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041112 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041112 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20060607 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20060627 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060607 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060711 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060911 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060911 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061102 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061225 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20070223 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070315 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070413 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130420 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130420 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140420 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |