JPH11255786A - トルクロホスメチルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、トリクロホスメチルのハプテン化
合物、抗体及び測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、トリクロホ
スメチル又はその部分にスペーサーアーム及び結合のた
めの官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｏ−２，６−ジク
ロロ−ｐ−トリル Ｏ，Ｏ−ジメチル ホスホロチオア
ート（以下、本明細書中「トルクロホスメチル」と言
う）のハプテン化合物、抗原、抗体及びそのフラグメン
トに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】トルクロホスメチルは、以下の式
（２）：

【化３】 で表される構造を有する、有機リン系の殺菌剤である。
トルクロホスメチルは、リゾクトニア菌に対し強い抗菌
力を示すほか、白紋羽病菌、白絹病菌、コムギ雪腐菌核
病菌、イネ小粒菌核病菌、トマト実腐病菌に対しても抗
菌力を有している。リゾクトニア菌や白絹病菌を本剤で
処理すると、菌糸の内容物の漏出が認められ、殺菌性を
示す。菌核に対しても同様の殺菌性がある。トウモロコ
シ裸黒穂病菌に対しては、細胞分裂の異常を引き起こ
し、次いで細胞内容物の吐出が観察される。藻菌類に対
する抗菌力は弱いが、遊走子の遊泳運動の阻害が認めら
れる。トルクロホスメチル剤の作用点は明らかではない
が、同じ有機リン系殺菌剤に属するイプロベンホス剤
（ＩＢＰ剤）やエジフェンホス剤（ＥＤＤＰ剤）とは異
なり、細胞の運動機能や細胞分裂の制御機能に何らかの
影響を与えて殺菌性を発揮すると考えられている。トル
クロホスメチル剤は予防効果があり、残効性を有する
（農薬ハンドブック 第１９４頁−第１９８頁、１９９
４年版、日本植物防疫協会；「最新農薬の残留分析法」
第６３５頁−第６３６頁、農薬残留分析法研究班編集
中央法規出版）。

【０００４】近年、水、土壌、大気等の環境中や食品中
の残留農薬が人の健康に及ぼす影響について大きな社会
的関心が寄せられている。トルクロホスメチルは、食品
衛生法により、農産物中の残留農薬基準値が、穀類で
０．１ｐｐｍ、豆類で０．５ｐｐｍ、いも類で１．０ｐ
ｐｍ、野菜で２．０ｐｐｍ、果実で０．１ｐｐｍ等と定
められている（「残留農薬基準便覧」１９９５年、第１
７０頁−第１７３頁、厚生省生活衛生局食品化学課監
修、社団法人 日本食品衛生協会）。また、水質に関し
ても環境庁による「ゴルフ場で使用される農薬による水
質汚濁の防止に係る暫定指導指針」（１９９０年）にお
いて、トルクロホスメチルのゴルフ場農業排水に係る暫
定指導指針値が０．８ｍｇ／ｌと定められている（用水
と排水 Ｖｏｌ．３５ Ｎｏ．９（１９９３） ｐ．３
９−５１）。よって、環境や食品に関する安全確保のた
めには、これらに含有される、トルクロホスメチルの量
を迅速、かつ正確に測定することが必要である。

【０００５】従来、例えば農産物中のトルクロホスメチ
ルは、麦穀、果実、野菜、いも類、豆類、てんさい等の
試料から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラフィー
（ＧＣ）により分析されてきた。例えば、試料をアセト
ンで抽出し、その濃縮液を最初にＣ₁₈ミニカラム、次い
でフロリジルミニカラムで精製後に、ＧＣで分析する方
法が採用されてきた（「最新農薬の残留分析法」、前
出）。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手間
と時間を必要とし、分析に熟練を有すること、並びに、
測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点
がある。トルクロホスメチルの測定は短時間で膨大な数
の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでな
く、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方
法が要求されてきている。

【０００６】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【０００７】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１ （１９９０） に記載
されている。

【０００８】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、トルクロホスメチルのよう
な低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引
き出すことができない。これらの分子は免疫原性を有す
る高分子化合物に結合させることによって初めて一団の
エピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫
応答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体
が産生される。このように高分子化合物と結合させて初
めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言
う。

【０００９】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１０】しかしながら、トルクロホスメチルについ
てはその必要性が非常に高かったにもかかわらず、適切
な抗体はもとより、そのような抗体を作製するためのハ
プテンも本発明前には得られていなかった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、トルクロホ
スメチルに反応する新規な抗体もしくはそのフラグメン
ト、及びその作製方法を提供することを目的とする。
尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗
原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味
する。

【００１２】本発明はその一態様において、トルクロホ
スメチルに反応性を有するモノクローナル抗体を提供す
る。

【００１３】本発明は、また、トルクロホスメチルに反
応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成す
るハプテン化合物となる、当該化合物の誘導体を提供す
ることを目的とする。

【００１４】本発明は、さらに、トルクロホスメチル誘
導体と高分子化合物との結合体を提供することを目的と
する。当該結合体はトルクロホスメチルに反応性を有す
る抗体を作製するための抗原となる。

【００１５】本発明は、さらにまた、前記抗体及びその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１６】本発明は、さらに、前記抗体もしくはその
フラグメント及び／又は前記トルクロホスメチル誘導体
と高分子化合物との結合体を使用することを含む、トル
クロホスメチルの免疫学的測定方法を提供することを目
的とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、トルクロホスメチル又はその部分にスペ
ーサーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官
能基を導入した、トルクロホスメチルの誘導体をハプテ
ンとして使用することにより、前記化合物に反応性を有
する抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。

【００１８】本発明の対象となるトルクロホスメチル
は、以下の式（２）：

【化４】 で表される化合物である。

【００１９】本発明の抗体は、例えば、トルクロホスメ
チルにスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を
導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と
結合させたものを抗原として用いることによって得るこ
とができる。例えば、以下の式（１）：

【化５】 ［式（１）中、Ｒ¹は、所望により枝分かれしていても
よい炭素数１−４のアルキル基であり；Ｒ²は、水素原
子又はメチル基であり；そしてｎは、１−１０の整数で
ある］で表される構造を有する化合物を、抗体作製のた
めのハプテンとして使用する。本発明において、化合物
の立体異性体は特に限定されず全ての立体異性体を含
む。

【００２０】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、トルクロホスメチル
に反応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン
化合物又は該抗体を用いるトルクロホスメチルの免疫学
的測定方法に関する。

【００２１】トルクロホスメチル誘導体の作製 式（１）で表されるトルクロホスメチル誘導体は、公知
の方法に従って製造することができる。限定するわけで
はないが、例えば以下のような方法を用いることができ
る。

【００２２】まず、以下の式（Ｘ１）：

【化６】 ［式（Ｘ１）中、Ｌ¹及びＬ²はハロゲン原子であり（本
明細書中、ハロゲン原子はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを意味
する）、同一であっても、又は異なっていてもよい；そ
してＲ¹は先に定義した通りである］で表されるジハロ
ゲン化チオリン酸エステルに、以下の式（Ｘ２）：

【化７】 ［式（Ｘ２）中、Ｒ²は先に定義した通りである］で表
される化合物を、有機溶媒中、塩基の存在下で反応させ
ることにより、以下の式（Ｘ３）：

【化８】 ［式（Ｘ３）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｌ¹（Ｌ²）及びｎは先に定
義した通りである］で表される化合物を合成する。

【００２３】式（Ｘ３）の化合物の合成のための有機溶
媒としては、例えば、アセトニトリル、アセトン、ヘキ
サン、ペンタン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタ
ン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチ
ル、エタノール、ジグリム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等、又はこれらの
混合溶液を用いることができる。塩基としては、例え
ば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭
酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウ
ムエチラート、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ニリン、水酸化ナトリウム、リチウムジイソプロピルア
ミド等を用いることができる。

【００２４】反応は、マイナス７８℃から溶媒の沸点の
温度、好ましくは０℃から６０℃で、１時間から４０時
間、好ましくは１時間から２４時間行う。

【００２５】次に、式（Ｘ３）の化合物と、以下の式
（Ｘ４）：

【化９】 ［式（Ｘ４）中、Ｐはカルボキシル基の保護基であり；
そしてｎは先に定義した通りである］で表されるエステ
ル化合物とを有機溶媒中、塩基の存在下で反応させて、
以下の式（Ｘ５）：

【化１０】 ［式（Ｘ５）中、Ｐ、Ｒ¹、Ｒ²及びｎは先に定義した通
りである］で表される化合物を合成する。

【００２６】式（Ｘ４）で表されるエステル化合物は、
公知の方法、例えば、Ｓｋｅｒｒｉｔらの文献（Ｊ．Ａ
ｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９９２，４０，１４
６６−１４７０）に記載されている方法に従って、容易
に合成することができる。

【００２７】有機溶媒及び塩基は、上述した式（Ｘ３）
の化合物を合成する場合と同様のものを使用することが
できる。

【００２８】反応は、マイナス７８℃から溶媒の沸点の
温度、好ましくは０℃から６０℃で、１時間から５０時
間、好ましくは１時間から２４時間行う。

【００２９】Ｐで示されるカルボキシル基の保護基は公
知のものでよく、具体例として、例えばメチル基、エチ
ル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシ
ベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロ
ロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジ
メチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、
トリメチルシリルエトキシメチル基等を挙げることがで
きる。

【００３０】さらに、式（Ｘ５）の化合物からＰで表さ
れるカルボキシル基の保護基を除去することにより、式
（１）の化合物を得ることができる。カルボキシル基の
保護基の除去は、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公
知の方法で行うことができる。

【００３１】すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｘ
５）の化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジ
クロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に
溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素、トリフル
オロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ−トルエ
ンスルホン酸を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好まし
くは１時間から５時間撹拌反応させることにより式
（１）の化合物を得ることができる。

【００３２】また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｘ
５）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノール、
テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機溶媒
に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム
又は水酸化カリウム水溶液を加えて、０℃から溶媒の沸
点の温度、好ましくは０℃から室温で、５分から１０時
間、好ましくは１時間から２時間撹拌反応させることに
より式（１）の化合物を得ることができる。

【００３３】更に、Ｐがベンジル基の場合、除去は水素
による加水素分解によっても行うことができる。

【００３４】更にまた、Ｒがシリル基の場合、脱保護は
テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニ
ウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬に
よっても行うことができる。

【００３５】上述したような製造方法によって得られた
化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又
は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製
品とすることができる。

【００３６】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００３７】トルクロホスメチル誘導体と高分子化合物
との結合体の作製 上述のように合成されたトルクロホスメチル誘導体は適
当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使
用する。

【００３８】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シ貝のへモシアニン（以下「ＫＬＨ」と言う）、卵白ア
ルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アルブ
ミン（以下「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブミン
（以下「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及びＢＳ
Ａが好ましい。

【００３９】トルクロホスメチル誘導体と高分子化合物
との結合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌ
ａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
３４１０９０‐１０９４（１９５４））、又は活性化エ
ステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒ
ｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４２ ３０１−３０９（１９
９４））等の公知の方法によって行うことができる。

【００４０】混合酸無水物法において用いられる混合酸
無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得ら
れ、これを高分子化合物と反応させることにより目的と
するハプテン−高分子化合物結合体が作製される。ショ
ッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われ
る。塩基性化合物としてはショッテン−バウマン反応に
慣用の化合物を使用することができ、例えば、トリ−ｎ
−ブチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミ
ン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリ
ン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カ
リウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素
ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通
常マイナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５
０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好
ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物
と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１
５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、
反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時
間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。
溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれ
の溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、
クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素
類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素
類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラ
ン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢
酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリア
ミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸
無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとして
は、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロ
ロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチ
ル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻
酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から
適宜選択され得る。

【００４１】一方、活性化エステル法は、一般に以下の
ように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機
溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロ
キシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく
酸イミド活性化エステルを生成する。

【００４２】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用でき
る。反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：
１、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０℃か
ら５０℃、好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は
５分−２４時間、好ましくは１時間から２時間である。
反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことが
できる。

【００４３】カップリング反応後、反応液を遠心し、上
清液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させる
と、例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場
合、当該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の
間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０℃から
６０℃、好ましくは５℃から４０℃、より好ましくは２
２℃から２７℃で、反応時間は５分から２４時間、好ま
しくは１時間から１６時間、より好ましくは１時間から
２時間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって
精製して、トルクロホスメチル誘導体と高分子化合物と
の結合体を得ることができる。

【００４４】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をトルクロホスメチル誘導体に結合させたもの
を、免疫学的測定方法において使用することができる。
標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下
「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵
素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍
光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質な
どがある。

【００４５】ポリクローナル抗体の作製 トルクロホスメチル誘導体と高分子化合物との結合体を
使用して、慣用化された方法により本発明のポリクロー
ナル抗体を作製することができる。例えば、トルクロホ
スメチル誘導体−ＫＬＨ結合体をリン酸ナトリウム緩衝
液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完
全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョ
ウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として
動物を免疫することによって得ることができる。免疫さ
れる動物としては当該分野で常用されるものをいずれも
使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤ
ギ、ウマ等を挙げることができる。

【００４６】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００４７】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、トルクロホスメチルと反応するポ
リクローナル抗体の存在を評価することができる。

【００４８】モノクローナル抗体の作製 トルクロホスメチル誘導体と高分子化合物との結合体を
使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗
体を作製することができる。

【００４９】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００５０】（ａ）免疫用抗原として使用するトルクロ
ホスメチル誘導体と高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合とハイブ
リドーマの選択的培養（ｆ）目的とする抗体を産生する
ハイブリドーマのスクリーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定
等。

【００５１】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ），コールド スプリング ハーバー ラボラト
リーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下
修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６
年）に記載されている。

【００５２】以下、本発明のトルクロホスメチルに対す
るモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに
制限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００５３】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５４】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００５５】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ/ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１, １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）
（Ｎａｔｕｒｅ, ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５,
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５
３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来
の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）（Ｎ
ａｔｕｒｅ, ２７７，１３１−１３３,（１９７９））
等を使用できる。

【００５６】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日
に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００５７】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ)らの方法（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９
８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的
に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細
胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別
の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法
を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学
５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜
採用することもできる。また、細胞の使用比率も公知の
方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細
胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００５８】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００５９】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、トルクロホスメチルに対する抗体活
性を測定する。

【００６０】さらに、測定によりトルクロホスメチルに
反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマ
の細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法と
しては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドー
マが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒
天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュ
レーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソー
ターによって１個の細胞を分離する「ソータークローン
法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単でありよく用い
られる。

【００６１】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗トルクロホスメチ
ルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択
する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例え
ば、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又は
ＩＭＤＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例
えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％
湿度の恒温器中）で培養するのが好ましい。

【００６２】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００６３】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗トルクロホスメチルモノクローナル抗体とし
て使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウ
ムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分
を集め精製することにより抗トルクロホスメチルモノク
ローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要
な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合
わせることにより実施できる。

【００６４】以上のようにして得られた抗トルクロホス
メチルモノクローナル抗体は、例えば後述したＥＬＩＳ
Ａ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価
等を決定することができる。

【００６５】抗体によるトルクロホスメチルの測定 本発明で使用する抗体によるトルクロホスメチルの測定
法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、
ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９
８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般
に抗体の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラ
ニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００６６】トルクロホスメチルの測定は、各種ＥＬＩ
ＳＡ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、
以下のような手順により行うことができる。（ａ）ま
ず、抗原であるトルクロホスメチル誘導体と高分子化合
物との結合体を担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着し
ていない固相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質
によりブロッキングする。（ｃ）これに各種濃度のトル
クロホスメチルを含む試料及び抗体を加え、該抗体を前
記固相化抗原及びトルクロホスメチルに競合的に結合さ
せて、固相化抗原−抗体複合体及びトルクロホスメチル
−抗体複合体を生成させる。（ｄ）固相化抗原−抗体複
合体の量を測定することにより、予め作成した検量線か
ら試料中のトルクロホスメチルの量を決定することがで
きる。

【００６７】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００６８】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、１４５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭのＰＢＳを
挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲
から選択できるが、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００
μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５
μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェル
のマイクロタイタープレートを使用する場合には、３０
０μｌ／ウェル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ
／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの
条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキ
ュベーションが適している。

【００６９】なお、抗体に固相化させる抗原としては、
抗体に作製したトルクロホスメチル誘導体と高分子化合
物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他の
誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもでき
る。例えば、式（１）で表される化合物でｎの数が相違
する抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いることもで
きる。さらに、式（１）に含まれない、他のトルクロホ
スメチル類似化合物も、固相化抗原として使用すること
も可能である。

【００７０】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（トル
クロホスメチル誘導体と高分子化合物との結合体）を固
相化した担体において、トルクロホスメチル誘導体部分
以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する
場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロ
ッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬、コードＮｏ．ＵＫ−２５
Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使
用することもできる。具体的には、限定されるわけでは
ないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエー
スを適量加え、約４℃で、一晩インキュベーションした
後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液とし
ては特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．２）、０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０２％
（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２
０の組成のものが適している。

【００７１】次いで（ｃ）工程において、トルクロホス
メチルを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体
を固相化抗原及びトルクロホスメチルと反応させること
により、固相化抗原−抗体複合体及びトルクロホスメチ
ル−抗体複合体が生成する。

【００７２】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のトルクロホスメチルに対する抗体を加え、更に
第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗
体を順次加えて反応させる。

【００７３】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、３７℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固
相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。この反
応に用いる試薬としては、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．
２）、０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／
ｖ）ＫＣｌの組成のものが好ましい。

【００７４】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当
である。担体に結合した第一抗体に約５００−１０００
０倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好ましくは
０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反応さ
せる。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではな
いが、反応は約３７℃で約１時間行い、反応後、緩衝液
で洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に
結合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、そ
の場合、第二抗体は不要である。

【００７５】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からトルクロホスメ
チルの量を算出することができる。

【００７６】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はο
−フェニレンジアミン（以下「ＯＰＤ」という）を含む
発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけ
ではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間
反応させた後、２Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応
を停止させる。ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸
光度を測定する。３，３’，５，５’−テトラメチルベ
ンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加
えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する
方法が適している。

【００７７】トルクロホスメチルを添加しない反応溶液
の吸光度に対して、トルクロホスメチルを添加して抗体
と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算
する。既知の濃度のトルクロホスメチルを添加した反応
液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、
試料中のトルクロホスメチルの濃度を算出できる。

【００７８】あるいはトルクロホスメチルの測定は例え
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。

【００７９】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を、担体に固相化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。 （ｃ）各種濃度のトルクロホスメチルを含む試料、及び
トルクロホスメチル誘導体と酵素を結合させた酵素結合
ハプテンを、担体に固相化した抗体と反応させる。 （ｄ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した、検量線から試料
中のトルクロホスメチルの量を決定する。

【００８０】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例え
ば、９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられ
る。モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクロー
ナル抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベート
することによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００８１】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のトルクロホ
スメチル及び酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無
関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それ
を防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前
述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用でき
る。

【００８２】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、トルクロホスメチル誘導体を酵素に結合す
る方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行っても
よい。例えば、前述した活性化エステル法を採用するこ
とができる。調製した酵素結合ハプテンはトルクロホス
メチルを含む試料と混合する。

【００８３】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したトルクロホ
スメチル誘導体のみならず、式（１）で表される他の誘
導体を用いることもできる。例えば、式（１）で表され
る化合物でｎの数が相違する抗原を各々抗体作製用と標
識競合用に用いることもできる。さらに、式（１）に含
まれない、他のトルクロホスメチル類似化合物も、酵素
に結合させるハプテンとして使用可能である。 （ｃ）工程においてトルクロホスメチルを含む試料及び
酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触させ、トルク
ロホスメチルと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応によ
り、これらと固相化担体との複合体が生成する。トルク
ロホスメチルを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用
する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温
でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄
し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除
去する。洗浄後は、例えばＰＢＳを使用することができ
る。

【００８４】さらに（ｄ）工程において酵素結合ハプテ
ンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することによ
り、検量線からトルクロホスメチルの量を算出すること
ができる。

【００８５】本発明のモノクロ−ナル抗体ＴＣＭ３−１
０は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でトルクロホスメチル
の量を０．３ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌの範囲で測
定できる（実施例９、図１）。

【００８６】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差
反応性を調べることができる。

【００８７】例えば、本発明のモノクローナル抗体ＴＣ
Ｍ３−１０はトルクロホスメチルオキソン及びプロチオ
ホスに弱く反応するものの、トリルフルアニドには交差
反応性を示さない（実施例１０、図２）。

【００８８】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００８９】

【実施例】実施例１ トルクロホスメチル誘導体−１の合成

【化１１】

【００９０】ジクロロチオリン酸エチル（１）３．６ｇ
（２０ｍｍｏｌ）と２，６−ジクロロ−４−メチルフェ
ノール３．６ｇ（２０ｍｍｏｌ）をベンゼン５０ｍｌに
溶解させ、炭酸カリウム８．４ｇ（６１ｍｍｏｌ）を加
えて６０℃で３時間撹拌した。反応液をセライトでろ過
して、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー
（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=４９：１）で精製する
と、透明液体として４．３４ｇ（収率６８％）の（２）
を得た。

【００９１】クロロチオリン酸誘導体（２）４．３４ｇ
（１３、６ｍｍｏｌ）と６−アミノカプロン酸ｔｅｒｔ
−ブチル２．６ｇ（１３、９ｍｍｏｌ）のアセトニトリ
ル溶液１００ｍｌに、炭酸カリウム２．０ｇ（１４、５
ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１時間撹拌した。反応溶液
をセライトでろ過し、ろ液を濃縮後にシリカゲルクロマ
トグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=１９：１→
９：１）で精製すると、３．７２ｇ（収率５８％）の
（３）を得た。

【００９２】ハプテンエステル（３）３．７ｇ（７、９
ｍｍｏｌ）を７０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ト
リフルオロ酢酸５ｍｌを加えて室温で２．５時間撹拌し
た。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラ
フィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=４：１→１：１）
で精製すると、３．２ｇ（収率１００％）の（４）を得
た。

【００９３】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．３１−１．４９（重複，５Ｈ）、１．５０−１．７
４（重複，４Ｈ） ２．２９（ｓ，３Ｈ）、 ２．３１−２．４
２（ｔ，２Ｈ） ３．０５−３．２３（重複，３Ｈ）、４．１９−４．３
９（ｍ，２Ｈ） ７．１４（ｓ，２Ｈ）

【００９４】実施例２ トルクロホスメチル誘導体−２の合成

【化１２】

【００９５】ジクロロチオリン酸エチル（１）１．８ｇ
（１０ｍｍｏｌ）と２，６−ジクロロフェノール１．６
３ｇ（１０ｍｍｏｌ）をベンゼン５０ｍｌに溶解させ、
炭酸カリウム１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加えて６０℃
で３時間撹拌した。反応液をセライトでろ過して、濃縮
後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル=４９：１）で粗精製した。

【００９６】クロロチオリン酸誘導体（２）を含む粗精
製物２ｇと６−アミノカプロン酸ｔｅｒｔ−ブチル１．
３ｇ（７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液５０ｍｌに、
炭酸カリウム１．０ｇ（７． ２ｍｍｏｌ）を加えて６
０℃で１時間撹拌した。反応溶液をセライトでろ過し、
ろ液を濃縮後にシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘ
キサン：酢酸エチル=１９：１→９：１）で精製する
と、１．６８ｇ（（１）からの通算収率３７％）の
（３）を得た。

【００９７】ハプテンエステル（３）１．６８ｇ（３．
７ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、
トリフルオロ酢酸５ｍｌを加えて室温で３、５時間撹拌
した。反応溶液を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグ
ラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル=４：１→１：
１）で精製すると、１．３２ｇ（収率９０％）の（４）
を得た。

【００９８】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １．３２−１．４９（重複，５Ｈ）、１．５１−１．７
６（重複，４Ｈ） ２．３０−２．４３（ｔ，２Ｈ）、 ３．１７−３．３
４（重複，３Ｈ） ４．２０−４．３９（ｍ，２Ｈ）、 ７．００−７．０
９（ｔ，１Ｈ） ７．２８−７．３９（ｄ，２Ｈ）

【００９９】実施例３ 免疫用抗原の作製 実施例１で作製したトルクロホスメチル誘導体−１をハ
プテンとして免疫用抗原を混合酸無水物法により作製し
た。

【０１００】先ず、トルクロホスメチル誘導体−１の７
ｍｇを無水ジオキサン０．７ｍｌに溶解し、１０℃から
１２℃に冷却した後、トリ−ｎ−ブチルアミン４μｌ及
びクロロ蟻酸イソブチル２４μｌを添加し、１０℃から
１２℃にて３０分間撹拌した（以下これを「Ａ液」とい
う）。

【０１０１】一方、蒸留水１ｍｌにＫＬＨを２０ｍｇ溶
解し、０．５％ＮａＨＣＯ₃ ｐＨ９．４を外液として
一晩透析した。透析後３０００ｒｐｍ、３０分間遠心し
得られた上清１．５ｍｌにＡ液をゆっくり添加した。４
℃にて２時間反応させた後、スパーテル１杯のグリシン
を添加してさらに４℃にて３０分間撹拌することにより
反応を終了させた。この反応液を１４５ｍＭ ＮａＣｌ
−１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１週間透析して
免疫用抗原を得た。

【０１０２】このようにして得られたトルクロホスメチ
ル誘導体−１とＫＬＨとの結合体（以下、「トルクロホ
スメチル誘導体１−ＫＬＨ結合体」と言う）を免疫用抗
原として用いた。

【０１０３】実施例４ スクリーニング用抗原の作製 スクリーニング用抗原として実施例３と同様の方法によ
りトルクロホスメチル誘導体１−ＢＳＡ結合体を得た。

【０１０４】実施例５ 免疫感作 実施例３において調製したトルクロホスメチル誘導体１
−ＫＬＨ結合体を免疫用抗原としてマウスに免疫をおこ
なった。実施例３で調製した免疫用抗原１００μｇをＰ
ＢＳ １００μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジ
ュバントと混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種し
た。１７日後にフロイント不完全アジュバントを用いて
調製した免疫用抗原を、前記と同様の操作によりマウス
に追加免疫をおこなった。また、４１日後にはＰＢＳに
溶解した免疫抗原をマウスに追加免疫した。

【０１０５】実施例６ 抗血清による測定 実施例５で調製した抗血清の力価を、実施例４で調製し
たスクリーニング用抗原を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳ
Ａ法によって評価した。

【０１０６】先ず、実施例４で調製したトルクロホスメ
チル誘導体１−ＢＳＡ結合体の溶液（０．１μｇ／ｍ
ｌ)を１００μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコ
ーティングした。洗浄の後、４倍に希釈したブロックエ
ース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」：大日本製薬、コードＮ
ｏ．ＵＫ−２５Ｂ）でブロッキングした後、抗血清希釈
液と各種濃度のトルクロホスメチルあるいはその類似化
合物を含む１０％メタノ−ル溶液とを等量混合し、その
１００μｌをウェルに入れ、３７℃にて１時間反応させ
た。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳに
て１回洗浄の後、ＰＢＳを用いて５０００倍希釈したペ
ルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（カッペル
社製）を１００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃にて
１時間反応させた。さらに反応終了後、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０−ＰＢＳにて２回洗浄し、０．４ｍｇ／ｍｌ
ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、及び０．０４％
過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２
０分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μ
ｌを各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍ
の吸光度を測定した。

【０１０７】実施例７ ハイブリドーマ細胞の作製 実施例５に続き、血清中の抗トルクロホスメチル抗体の
活性が高くなったマウスの脾臓細胞と、マウスミエロー
マ細胞（Ｐ３Ｕ１）とを電気融合法にて細胞融合をおこ
なった。細胞増殖が認められた培養上清液について以下
の方法でトルクロホスメチルに対する抗体活性を調べ
た。トルクロホスメチル誘導体１−ＢＳＡ結合体の溶液
（０．１μｇ／ｍｌ)を５０μｌ／ウェルにて９６ウェ
ルプレートにコーティングした。洗浄の後、４倍に希釈
したブロックエースでブロッキングした後、培養上清液
と各種濃度のトルクロホスメチルあるいはその類似化合
物を含む１０％メタノール溶液とを等量混合し、その１
００μｌをウェルに入れ、３７℃にて１時間反応させ
た。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳに
て１回洗浄の後、ＰＢＳを用いて、５０００倍希釈した
ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（カッペ
ル社製）を５０μｌずつ各ウェルにて３７℃１時間反応
させた。さらに反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
−ＰＢＳにて２回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌ ｏ−フ
ェニレンジアミン（ＯＰＤ）、及び０．０４％過酸化水
素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０分間
放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各
ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光
度を測定し、特異性のある抗体活性が認められたものを
選抜した。

【０１０８】次に、選抜されたウェルの細胞について限
界希釈法を用いた細胞クローニングをおこなった。その
結果、抗トルクロホスメチル抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞株をクローン化した。そのうちのＴＣＭ３−１
０を平成１０年３月１０日に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
６６９８として工業技術院生命工学工業技術研究所（〒
３０５−００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）
に寄託した。

【０１０９】実施例８ トルクロホスメチル誘導体とＨ
ＲＰとの結合体作製 実施例３と同様な混合酸無水物法により実施例１で作製
したトルクロホスメチル誘導体−１とＨＲＰの結合体を
作製した。１ｍｇのトルクロホスメチル誘導体を無水ジ
オキサン０．２ｍｌに溶解した後、トリ−ｎ−ブチルア
ミン０．５μｌ、クロロ蟻酸イソブチル０．３μｌを添
加し、１０℃から１２℃にて３０分間撹拌した。（以
下、これを「Ｂ液」とする）

【０１１０】一方、０．５％ＮａＨＣＯ₃をＮａＯＨで
ｐＨ９．４に調整した溶液１ｍｌにＨＲＰ５ｍｇを溶解
し、Ｂ液をこの中に滴下した。４℃にて２時間撹拌し、
さらにグリシンを添加して３０分間撹拌することにより
反応を終了させた。反応物をＰＢＳにて透析することに
より、トルクロホスメチル誘導体１−ＨＲＰ結合体を得
た。

【０１１１】実施例９ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
るトルクロホスメチルの測定 実施例７で得られたハイブリドーマ細胞（ＴＣＭ３−１
０）をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得られ
た腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗体
を精製した。この操作によって、抗トルクロホスメチル
抗体、ＴＣＭ３−１０を得た（以降、モノクローナル抗
体はこれらを産生するハイブリドーマと同一名称を用い
る）。モノクローナル抗体ＴＣＭ３−１０を用いて以下
の試験法にてトルクロホスメチルを測定した。

【０１１２】モノクローナル抗体溶液（ＴＣＭ３−１０
抗体６μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルで９６ウェル
プレートに加え、４℃で一晩静置し、翌日４倍希釈した
ブロックエースでブロッキングした後、トルクロホスメ
チル及び実施例８で作製した適度に希釈されたトルクロ
ホスメチル誘導体１−ＨＲＰ結合体を含む１０％メタノ
ール−ＰＢＳ溶液を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃１
時間静置した。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
−ＰＢＳにて２回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰ
Ｄ、及び０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸
クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェ
ルにいれ室温にて２０分間放置し、発色させた。反応
後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止
させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１１３】結果を図１に示す。ＴＣＭ３−１０は直接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法においてトルクロホスメチルを測
定することができ、その測定範囲はトルクロホスメチル
０．３ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌであった。

【０１１４】実施例１０ モノクローナル抗体の評価 トルクロホスメチル誘導体−１を用いて得られたモノク
ローナル抗体ＴＣＭ３−１０について、実施例９と同様
の方法を用いてトルクロホスメチル及びその代謝物であ
るトルクロホスメチルオキソン、並びにトルクロホスメ
チルに類縁する他の有機リン系化合物に対する反応性に
ついて調べた。

【０１１５】結果を図２に示す。モノクローナル抗体Ｔ
ＣＭ３−１０はトルクロホスメチルオキソンおよびプロ
チオホスに弱く反応するものの、トリルフルアニドとは
交差反応性を示さなかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体ＴＣＭ３
−１０の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるトルクロホス
メチルの測定を示す。

【図２】図２は、モノクローナル抗体ＴＣＭ３−１０の
直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるトルクロホスメチル及
び他の類縁似化合物との交差反応性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｊ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｓ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 香川 康浩 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡辺 和明 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、Ｒ¹は、所望により枝分かれしていても
   よい炭素数１−４のアルキル基であり；Ｒ²は、水素原
   子又はメチル基であり；そしてｎは、１−１０の整数で
   ある］で表される構造を有する化合物。
2. 【請求項２】請求項１に記載の化合物と高分子化合物又
   は標識化合物との結合体。
3. 【請求項３】請求項１に記載の化合物と高分子化合物を
   結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いる
   ことにより、以下の式（２）： 【化２】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（２）で表される化合物に
   反応性を示す抗体の製造方法。
4. 【請求項４】請求項２に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（２）で表される化合物に
   反応性を示す抗体又はそのフラグメント。
5. 【請求項５】モノクローナル抗体である、請求項４に記
   載の抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】ＴＣＭ３−１０である、請求項４又は５に
   記載の抗体又はそのフラグメント。
7. 【請求項７】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体を産生するハイブリドーマ。
8. 【請求項８】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６９８で寄託
   されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
9. 【請求項９】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
   （２）で表される化合物の免疫学的測定方法。