JP2000239239A

JP2000239239A - クロルメコート類縁化合物のハプテン化合物、抗体及び測定方法

Info

Publication number: JP2000239239A
Application number: JP11043030A
Authority: JP
Inventors: Shigehisa Ito; 茂壽伊東; Shiyunichi Takewaki; 俊一竹脇; Shiro Miyake; 司郎三宅; Masaki Yamaguchi; 優樹山口; Katsuya Oide; 勝也大出
Original assignee: KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSH; Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho KK
Current assignee: KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSH; Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho KK
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 1999-02-22
Publication date: 2000-09-05

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、クロルメコート類縁化合物のハプ
テン化合物、抗体及び測定方法を提供することを目的と
する。【解決手段】本発明のハプテン化合物は、クロルメコ
ート又はその部分にスペーサーアーム及び結合のための
官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２−クロロエチル
トリメチルアンモニウム＝クロリド（以下、本明細書中
「クロルメコート」と言う）のハプテン化合物、抗原、
抗体及びそのフラグメントに関する。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】クロルメコートは、以下の式（３）：

【０００４】

【化３】

【０００５】で表される四級アンモニウム塩の構造を有
する植物成長調整剤である。ジベレリンは、イネばか苗
病菌培養濾液及び寒天培養の抽出液においてイネ苗に徒
長現象を起こす物質として発見され、アルコール、エー
テルに可溶、水に難溶、酸に比較的安定な耐熱性の結晶
として取り出された。ジベレリンの生理作用として、伸
長成長促進作用、休眠覚醒効果、単為結果、雄花形成、
頂芽優先、加水分解酵素活性促進などの種々の作用が知
られている。ジベレリンの植物体内における生合成過程
は、メバロン酸に始まりゲラニルゲラニルピロリン酸、
コパリルピロリン酸を経てｅｎｔ−カウレンに至り、さ
らにｅｎｔ−カウレン酸を経てすべてのジベレリン出発
物質であるジベレリン₁₂アルデヒドになり、ここから酸
化、水酸化を受けて様々なジベレリンに代謝・変換され
ると考えられている。

【０００６】クロルメコートは、上記ジベレリンの生合
成過程において、ゲラニルゲラニルピロリン酸からｅｎ
ｔ−カウレンへ至る環化あるいはｅｎｔ−カウレンから
ｅｎｔ−カウレン酸へ至る酸化を阻害することによりジ
ベレリンの生合成を阻害することにより伸長抑制効果を
もつものと推定される（農薬ハンドブック第４５２頁
−第４６２頁及び第６３８頁、１９９４年版、日本植物
防疫協会；「最新農薬の残留分析法」第１３０頁−第
１３２頁、農薬残留分析法研究班編集中央法規出
版）。

【０００７】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。クロルメコートについては、食品衛生法に基づき残
留基準値が、例えば、穀類（５−１０ｐｐｍ）、ぶどう
（１ｐｐｍ）、日本なし、西洋なし（３ｐｐｍ）、じゃ
がいも（１０ｐｐｍ）等定められている（「最新農薬の
残留分析法」同上）。よって、環境や食品に関する安
全確保のためには、農作物、特に穀類に含有される、ク
ロルメコートの量を迅速かつ正確に測定することが必要
である。

【０００８】従来、例えば農作物中のクロルメコート
は、穀類、野菜、果実等から抽出し、精製した後、ガス
クロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。即
ち、例えば、試料をメタノールで抽出し、イオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、アルミナカラムクロマトグラ
フィーで精製する。その後、クロルメコートをナトリウ
ムベンゼンチオラートで誘導体化して、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−２−（フェニルチオ）−エチルアミンを生成する。
これを、酸溶液及び有機溶媒で抽出後、ＧＣで測定する
方法等が採用されている。これらの方法は、試料の調製
が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要
すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必
要とする等の問題点がある。クロルメコートの測定は短
時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精
度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備し
た新規測定方法が要求されてきている。

【０００９】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を
行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経
済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法
においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、
酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、
金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが
適用されてきた。

【００１０】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅａｎｄｔｈｅｏｒｙｏｆ
ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｍｓｔｅｒ
ｄａｍＮｅｗＹｏｒｋ，ＯｘｆｏｒｄＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載され
ている。

【００１１】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、クロルメコートのような低
分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出
すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高
分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピ
トープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答
を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産
生される。このように高分子化合物と結合させて初めて
免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。

【００１２】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１３】クロルメコートについては、その必要性が
非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとよ
り、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発明
前には得られていなかった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、クロルメコ
ート及び／又はその類縁化合物に反応する新規な抗体も
しくはそのフラグメント、及びその作製方法を提供する
ことを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラ
グメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例え
ばＦ_ab断片等を意味する。尚、本明細書において、「ク
ロルメコート」とは、文脈により、クロルメコート及び
／又はその類縁化合物を意味する。

【００１５】本発明はその一態様において、クロルメコ
ートに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１６】本発明は、また、クロルメコートに反応性
を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハ
プテン化合物を提供することを目的とする。

【００１７】本発明は、さらに、クロルメコートハプテ
ンと高分子化合物との結合体を提供することを目的とす
る。

【００１８】本発明は、さらにまた、前記抗体又はその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１９】本発明は、さらに、前記抗体もしくはその
フラグメント及び／又は前記クロルメコートハプテンと
高分子化合物との結合体を使用することを含む、クロル
メコートの免疫学的測定方法を提供することを目的とす
る。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、クロルメコート又はその部分にスペーサ
ーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基
を導入した、クロルメコートの誘導体をハプテンとして
使用することにより、前記化合物に反応性を有する抗体
を得ることに成功し、本発明の完成に至った。

【００２１】本発明の対象となるクロルメコートは、以
下の式（３）：

【００２２】

【化４】

【００２３】で表される構造を有する化合物である。本
発明の抗体は、クロルメコート及び／又は以下の式
（２）：

【００２４】

【化５】

【００２５】［式（２）中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、枝分
かれしていてもよい炭素数１−５のアルキル基及びアミ
ノ基からなるグループから別個に選択される基であり；
Ｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されるハロゲン原
子、ＯＨ基又はＯＣＯＣＨ₃基であり；そしてＸは、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されるハロゲン原子であ
る］で表される構造を有するクロルメコート類縁化合物
に反応性を有する。

【００２６】本発明の抗体は、例えば、クロルメコート
の部分にスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基
を導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物
と結合させたものを抗原として用いることによって得る
ことができる。例えば、以下の式（１）：

【００２７】

【化６】

【００２８】［式（１）中、Ｒ¹及びＲ²は、枝分かれし
ていてもよい炭素数１−５のアルキル基及びアミノ基か
らなるグループから別個に選択される基であり；Ｌは、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されるハロゲン原子、Ｏ
Ｈ基又はＯＣＯＣＨ₃基であり；Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ
及びＩから選択されるハロゲン原子であり；そしてｎ
は、１ないし１０の整数である］で表される構造を有す
る化合物を、抗体作製のためのハプテンとして使用す
る。

【００２９】上記式（１）において、好ましくは、Ｒ¹
及びＲ²はＣＨ₃基である。さらに好ましくは、式（１）
において、Ｘ及びＬがＣｌ又はＢｒである。

【００３０】好ましくは、式（１）においてｎ＝５であ
る。本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン化合物と
高分子化合物との結合体、クロルメコートに反応する抗
体及びその作製方法、並びに該ハプテン化合物又は該抗
体を用いるクロルメコートの免疫学的測定方法に関す
る。クロルメコートハプテンの作製式（１）で表されるクロルメコートハプテンは、公知の
方法に従って製造することができる。限定するわけでは
ないが、例えば以下のような方法を用いることができ
る。

【００３１】まず、以下の式（Ｚ１）：

【００３２】

【化７】

【００３３】［式（Ｚ１）中、Ｒ¹及びＲ²は、先に定義
した通りである］で表される構造を有する化合物を、以
下の式（Ｚ２）：

【００３４】

【化８】

【００３５】［式（Ｚ２）中、Ｘ’は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ
及びＩから選択されるハロゲン原子であり；Ｐは、カル
ボキシル基の保護基であり；そしてｎは先に定義した通
りである］で表される構造を有する化合物と、有機溶媒
中、塩基の存在下で反応させて、以下の式（Ｚ３）：

【００３６】

【化９】

【００３７】［式（Ｚ３）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｐ及びｎは先
に定義した通りである］で表される構造を有する化合物
を得る。

【００３８】Ｐで示されるカルボキシル基の保護基は公
知のものでよく、具体例として、例えばメチル基、エチ
ル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシ
ベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロ
ロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジ
メチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、
トリメチルシリルエチル基等を挙げることができる。

【００３９】有機溶媒としては、メタノール、エタノー
ル、グリセロール等を、塩基としては、水酸化ナトリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、
ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等を用い
ることができる。

【００４０】反応は、０℃から溶媒の沸点、好ましくは
室温から１５０℃で、３０分から１０時間、好ましくは
１時間から３時間行う。

【００４１】次に、式（Ｚ３）の化合物に、以下の式
（Ｚ４）：

【００４２】

【化１０】

【００４３】［式（Ｚ４）中、Ｌ及びＸは先に定義した
通りである］で表される構造式を有する化合物を反応さ
せて、以下の式（Ｚ５）：

【００４４】

【化１１】

【００４５】［式（Ｚ５）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｌ、Ｐ、Ｘ及
びｎは先に定義した通りである］で表される構造を有す
る化合物を得る。

【００４６】反応は、メタノール、エタノール、グリセ
ロール等の溶媒中、又は式（Ｚ４）の化合物を溶媒も兼
ねて大過剰に用い、好ましくは、封管中、０℃から３０
０℃、好ましくは室温から１５０℃で、３０分から１０
時間、好ましくは１時間から５時間行う。

【００４７】さらに、式（Ｚ５）の化合物からＰで表さ
れるカルボキシル基の保護基を除去し、さらにハロゲン
化水素で処理することにより、式（１）の化合物を得る
ことができる。カルボキシル基の保護基の除去は、アル
カリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことが
できる。

【００４８】すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｚ
５）の化合物を、例えば酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロ
ロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒中、又
は溶媒なしに、塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエ
ーテル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンス
ルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて行う。ま
た、ハロゲン化水素酸を酸及び溶媒として大過剰用いて
反応を行うこともできる。反応は、０℃から溶媒の沸
点、好ましくは室温から１５０℃で、５分から１０時
間、好ましくは１時間から５時間撹拌して行う。

【００４９】また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｚ
５）の化合物を、例えばメタノール、エタノール、テト
ラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機溶媒に溶
解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭
酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム又は水
酸化カリウム水溶液等を加えて、０℃から溶媒の沸点、
好ましくは０℃から室温で、５分から１０時間、好まし
くは１時間から２時間撹拌反応させることにより加水分
解を行う。

【００５０】更に、Ｐがベンジル基の場合、除去は水素
による加水素分解によっても行うことができる。

【００５１】更にまた、Ｐがシリル原子を含む基の場
合、脱保護はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリ
ド、ピリジニウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生
させる試薬によっても行うことができる。

【００５２】上述したような製造方法によって得られた
化合物を、場合によってはハロゲン化水素酸で処理し、
式（１）の化合物を得ることができる。また必要に応じ
シリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操作等を行う
ことにより、さらに高純度の精製品とすることができ
る。

【００５３】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。クロルメコートハプテンと高分子化合物との結合体の作
製上述のように合成されたクロルメコートハプテンを適当
な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原もしくは固
相化用抗原として使用する。

【００５４】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。

【００５５】クロルメコートハプテンと高分子化合物と
の結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲ
Ｕｅｔａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅ
ｍ．４２３０１−３０９（１９９４））、又は混合酸
無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．：
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４１０９０‐１０９４
（１９５４））等の公知の方法によって行うことができ
る。

【００５６】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ド活性化エステルを生成させる。

【００５７】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」と言う）、ジオキサン等が使用できる。
反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、
より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは
１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好まし
くは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃
で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分か
ら６時間、より好ましくは１時間から２時間である。

【００５８】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反
応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６
時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物
を、透析、脱塩カラム等によって精製して、クロルメコ
ートハプテンと高分子化合物との結合体を得ることがで
きる。

【００５９】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、通常のショッテン−バウマン反応によ
り得られ、これを高分子化合物と反応させることにより
目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造され
る。ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下
に行われる。塩基性化合物としては、ショッテン−バウ
マン反応において慣用されている化合物を使用すること
ができる。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミ
ン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルホルマリン、ピリジ
ン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡ
ＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等
が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃から１５
０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反
応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間
である。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応
は、通常マイナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃
から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時
間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法
は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水
物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、
具体的にはジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒド
ロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロ
メタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化
炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族
炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極
性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用さ
れるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチ
ル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸
エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方
法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物
の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。

【００６０】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をクロルメコートハプテンに結合させたもの
を、免疫学的測定方法において使用することができる。
標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下
「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵
素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍
光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質な
どがある。ポリクローナル抗体の作製クロルメコートハプテンと高分子化合物との結合体を使
用して、慣用化された方法により本発明のポリクローナ
ル抗体を作製することができる。例えば、クロルメコー
トハプテン−ＢＳＡ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液
（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全
アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウ
バン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動
物に免疫することによって得ることができる。免疫され
る動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使
用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、
ウマ等を挙げることができる。

【００６１】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間から５週間の問隔
で複数回行うことができる。

【００６２】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、クロルメコートと反応するポリク
ローナル抗体の存在を評価することができる。

【００６３】本発明においてクロルメコートハプテンと
高分子化合物との結合体を免疫用抗原として得られた抗
血清は、後述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、
少なくとも約１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの濃度
でクロルメコートと反応した（実施例５、図１）。モノクローナル抗体の作製クロルメコートハプテンと高分子化合物との結合体を使
用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体
を作製することができる。

【００６４】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。（ａ）免疫用抗原として使用するクロルメコートハプテ
ンと高分子化合物との結合体の作製（ｂ）動物への免疫（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製（ｄ）ミエローマ細胞の調製（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマテクニック
ス（ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ
ールドスプリングハーバーラボラトリーズ（Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，1980年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本組
織細胞化学会編；学際企画、1986年）に記載されてい
る。

【００６５】以下、本発明のクロルメコートに対するモ
ノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限
されないことは当業者によって明らかであろう。

【００６６】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００６７】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００６８】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ/ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１, １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）
（Ｎａｔｕｒｅ,２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５,
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５
３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来
の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３．（Ｙ３）（Ｎ
ａｔｕｒｅ, ２７７，１３１−１３３,（１９７９））
等を使用できる。

【００６９】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を
含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイス
コフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融
合当日に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００７０】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ)らの方法（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１
９８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般
的に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例え
ば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されてい
る。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）によ
る方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医
学５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を
適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公
知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して
脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００７１】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００７２】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、クロルメコートに対する抗体活性を
測定する。

【００７３】さらに、測定によりクロルメコートに反応
する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細
胞クローニングを行う。この細胞クローニング法として
は、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが
含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培
地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレー
ターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーター
によって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」
等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いら
れる。

【００７４】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗クロルメコートモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温
器中）で培養するのが好ましい。

【００７５】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００７６】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗クロルメコートモノクローナル抗体として使
用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムに
よる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集
め精製することにより抗クロルメコートモノクローナル
抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合に
は、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせるこ
とにより実施できる。

【００７７】以上のようにして得られた抗クロルメコー
トモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法
などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を
決定することができる。抗体によるクロルメコートの測定本発明で使用する抗体によるクロルメコートの測定法と
しては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬ
ＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８
０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般
に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラ
ニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００７８】クロルメコートの測定は、各種ＥＬＩＳＡ
法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下
のような手順により行うことができる。

【００７９】（ａ）まず、固相化用抗原であるクロルメ
コートハプテンと高分子化合物との結合体を担体に固相
化する。

【００８０】（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相
表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッ
キングする。

【００８１】（ｃ）これに各種濃度のクロルメコートを
含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び
クロルメコートに競合的に反応させて、固相化抗原−抗
体複合体及び、クロルメコート−抗体複合体を生成させ
る。

【００８２】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のクロ
ルメコートの量を決定することができる。

【００８３】（ａ）工程において、固相化用抗原を固相
化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法
において常用されるものをいずれも使用することができ
る。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタ
イタープレートが挙げられる。

【００８４】固相化用抗原を担体に固相化させるには、
例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、イ
ンキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも
のが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることがで
きる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが
適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタ
イタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェ
ル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度
が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に
制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーション
が適している。

【００８５】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したクロルメコートハプテンと高分子化合物
との結合体自体のみならず、式（１）で表される他のハ
プテンと高分子化合物との結合体を用いることもでき
る。例えば、式（１）においてＲ¹、Ｒ²、Ｌ又はｎが抗
体作製用抗原と相違する化合物を、固相化抗原として使
用することも可能である。

【００８６】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（クロ
ルメコートハプテンと高分子化合物との結合体）を固相
化した担体において、クロルメコートハプテン部分以外
に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合
があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキ
ング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使
用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐
Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−25Ｂ）
等のブロッキング剤として市販されているものを使用す
ることもできる。具体的には、限定されるわけではない
が、例えば抗原を固相化した部分にブロッキング剤を含
む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭＮａＣｌを
添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適
量加え、約４℃から室温で、１時間から５時間インキュ
ベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われ
る。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、６０ｍ
ＭＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液をを用いることがで
きる。

【００８７】次いで（ｃ）工程において、クロルメコー
トを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固
相化抗原及びクロルメコートと反応させることにより、
固相化抗原−抗体複合体及びクロルメコート−抗体複合
体が生成する。

【００８８】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のクロルメコートに対する抗体を加え、更に第二
抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を
順次加えて反応させる。

【００８９】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、３７℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固
相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液
としては、例えば、６０ｍＭＮａＣｌを添加したホウ酸
緩衝液を用いることができる。

【００９０】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当
である。担体に結合した第一抗体に約５００倍から約１
００００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好ま
しくは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を
反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限
定されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、
反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗
体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用
いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。

【００９１】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からクロルメコート
の量を算出することができる。

【００９２】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加
えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する
方法が適している。

【００９３】クロルメコートを添加しない反応溶液の吸
光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液
の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度
のクロルメコートを添加した反応液の阻害率により予め
作成しておいた検量線を用いて、試料中のクロルメコー
トの濃度を算出できる。

【００９４】本発明のモノクローナル抗体ＣＭＱ１９−
４を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法ではクロルメコー
トの量を約０．００５μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌ、
好ましくは約０．０４μｇ／ｍｌから約３μｇ／ｍｌの
範囲で測定できる。また、ＣＭＱ２５−２７では、約
０．０５μｇ／ｍｌから約５０μｇ／ｍｌ、好ましくは
約０．２μｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌの範囲で測定
できる（実施例７、図２）。

【００９５】あるいはクロルメコートの測定は、例えば
以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用い
た直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。

【００９６】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を、担体に固相化する。（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。

【００９７】（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のクロ
ルメコートを含む試料に、クロルメコートハプテンと酵
素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製
する。

【００９８】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した、検量線から試料
中のクロルメコートの量を決定する。

【００９９】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【０１００】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のクロルメコ
ート並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無関
係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを
防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述
の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用でき
る。

【０１０１】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、クロルメコートハプテンを酵素に結合する
方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよ
い。例えば、前述した活性化エステル法を採用すること
ができる。調製した酵素結合ハプテンは、クロルメコー
トを含む試料と混合する。

【０１０２】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したクロルメコ
ートハプテン自体のみならず、式（１）で表される他の
ハプテンと高分子化合物との結合体を用いることもでき
る。例えば、式（１）においてＲ¹、Ｒ²、Ｌ又はｎが抗
体作製用抗原と相違する化合物を、固相化抗原として使
用することも可能である。

【０１０３】（ｄ）工程においてクロルメコートを含む
試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、クロルメコートと酵素結合ハプテンとの競合阻害反
応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。
クロルメコートを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使
用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室
温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗
浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを
除去する。洗浄液は、例えばＮａＣｌを添加したホウ酸
緩衝液を使用することができる。

【０１０４】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からクロルメコートの量を算出することがで
きる。

【０１０５】本発明のモノクローナル抗体ＣＭＱ１９−
４を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法では約１ｎｇ／ｍ
ｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは４ｎｇ／ｍｌか
ら３００ｎｇ／ｍｌの範囲でクロルメコートを測定でき
る（実施例１０、図３）。本発明の抗体の交差反応性上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差
反応性を調べることができる。

【０１０６】例えば、ＣＭＱ１９−４は、直接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法において塩化アセチルコリンに２．４％、
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリドに１．６
％の交差反応率を示す。しかしながら、その他の化合物
に対しては、すべて１％以下の交差反応率しか示さず、
クロルメコートに高い特異性をもつ抗体である（実施例
１１、表４）。以下、実施例によって本発明を具体的に
説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するた
めのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて
容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それら
は本発明の技術的範囲に含まれる。

【０１０７】

【実施例】実施例１クロルメコートハプテン−１の合成

【０１０８】

【化１２】

【０１０９】６−（ジメチルアミノ）ヘキサン酸エチル（１）の合成エタノール４０ｍｌに、５０％ジメチルアミン水溶液
４．１ｇ（４６ｍｍｏｌ）、６−ブロモヘキサン酸エチ
ル６．７ｇ（３０ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム５．０ｇ
（３６ｍｍｏｌ）を入れ、この混合物を環流下に１．５
時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却後濾過し、濾
液を濃縮した。残渣を１５０ｍｌのトルエンで抽出し、
トルエン層を水洗後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
濾過後、トルエンを濃縮留去し、３．９ｇ（収率７０
％）の（１）を無色透明液体として得た。塩化（５−エトキシカルボニルペンチル）（２−クロロ
エチル）ジメチルアンモニウム（２）の合成６−（ジメチルアミノ）ヘキサン酸エチル（１）１．９
ｇ（１０ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン２０ｍｌ
に溶解し、この溶液を封管中、１２０℃で５時間撹拌し
た。反応混合物をロータリーエバポレータ、次いで真空
ポンプで濃縮し、２．８ｇ（収率９７％）の（２）を褐
色の固体（潮解性）として得た。塩化（５−カルボキシペンチル）（２−クロロエチル）
ジメチルアンモニウム（３）の合成塩化（５−エトキシカルボニルペンチル）（２−クロロ
エチル）ジメチルアンモニウム（２）２．２ｇ（７．７
ｍｍｏｌ）を濃塩酸２０ｍｌに溶解し、この溶液を環流
下に１．５時間撹拌した。反応混合物をロータリーエバ
ポレータで濃縮し、残渣を３０ｍｌの水に溶かした。こ
の水溶液を活性炭処理し、濾過した。濾液をロータリー
エバポレータ、次いで真空ポンプで濃縮し、１．６ｇ
（収率８０％）の（３）をプリズム状結晶（潮解性）と
して得た。

【０１１０】上記クロルメコートハプテン−１（３）の
¹Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）及
びＩＲデータを以下に示す。

【０１１１】

【表１】¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ） δ １．２９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．５６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．７０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），２．２６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），３．１５（６Ｈ，ｓ，２ＣＨ₃），３．４１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），３．７８（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），４．１２（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂）ＩＲ（ｃｍ^-1）１７２５（ＣＯＯＨ）実施例２クロルメコートハプテン−２の合成

【０１１２】

【化１３】

【０１１３】臭化（５−エトキシカルボニルペンチル）
（２−ブロモエチル）ジメチルアンモニウム（４）の合
成６−（ジメチルアミノ）ヘキサン酸エチル（１）１．９
ｇ（１０ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｍｌに溶解し、次
いで１、２−ジブロモエタン５ｍｌを加えた溶液を封管
中、１００℃で１時間撹拌した。反応混合物をロータリ
ーエバポレータ、次いで真空ポンプで濃縮し、３．４ｇ
（収率９１％）の（４）を白色固体（潮解性）として得
た。臭化（５−カルボキシペンチル）（２−ブロモエチル）
ジメチルアンモニウム（５）の合成臭化（５−エトキシカルボニルペンチル）（２−ブロモ
エチル）ジメチルアンモニウム（４）３．０ｇ（８．０
ｍｍｏｌ）を４８％臭化水素酸２０ｍｌに溶解し、この
溶液を環流下に３０分撹拌した。反応混合物をロータリ
ーエバポレータで濃縮し、残渣を３０ｍｌの水に溶かし
た。この水溶液を活性炭処理し、濾過した。濾液をロー
タリーエバポレータ、次いで真空ポンプで濃縮し、２．
６ｇ（収率９３％）の（５）をプリズム状結晶（潮解
性）として得た。

【０１１４】上記クロルメコートハプテン−２（５）の
¹Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）及
びＩＲデータを以下に示す。

【０１１５】

【表２】¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ） δ １．２８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．５５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．６８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），２．２５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），３．１０（６Ｈ，ｓ，２ＣＨ₃），３．３５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），３．７７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），３．８９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）ＩＲ（ｃｍ^-1）１７２５（ＣＯＯＨ）実施例３クロルメコートハプテンと高分子化合物との
結合体の作製免疫原及びスクリーニング用抗原としてクロルメコート
ハプテンとＢＳＡもしくはＫＬＨとの結合体を活性化エ
ステル法を用いて作製した。

【０１１６】実施例１及び２で作製したクロルメコート
ハプテン−１及び２について、それらの３．６μｍｏｌ
をＤＭＳＯ１００μｌに溶解させた。次にＮ−ヒドロ
キシこはく酸イミド１６μｍｏｌを１０μｌのＤＭＳＯ
に溶解させた溶液をそれらに加えた。さらに１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
・塩酸塩（５．６μｍｏｌ）を２０μｌのＤＭＳＯに溶
解させた溶液を加え、室温にて１．５時間反応させた。
その後、これらの反応溶液に、８５ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．０）５００μｌに溶解したＢＳＡ又はＫＬＨ
１０ｍｇを加え、再び室温にて１．５時間反応させた。
反応終了後、ダルベッコのリン酸緩衝液（以下、「ＰＢ
Ｓ（−）」と言う）で透析し、クロルメコートハプテン
−１（もしくは−２）とＫＬＨとの結合体（以下、「ク
ロルメコートハプテン−１（もしくは２）／ＫＬＨ」と
言う）、並びにクロルメコートハプテン−１（もしくは
−２）とＢＳＡとの結合体（以下、「クロルメコートハ
プテン−１（もしくは２）／ＢＳＡ」と言う）を、各々
調製した。実施例４免疫感作免疫には、Ｂａｌｂ／ｃマウス（７週令・メス）を用い
た。実施例３で調製したクロルメコートハプテン−１又
は２／ＫＬＨの各々１００μｇを、ＰＢＳ（−）５０μ
ｌに溶解した。等量のフロイント完全アジュバントと乳
化混合した後、マウスの腹腔内に接種した。その１カ月
後に初回免疫量の１／４量を追加免疫し、さらにその一
週間後マウスの尾静脈から採血し、抗血清を調製した。
また、さらにその１．５カ月後に追加免疫と同量を最終
免疫した。実施例５抗血清のクロルメコートに対する反応性実施例４におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した
抗血清を希釈調製し、以下に詳述する間接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法にてクロルメコートを測定し、抗血清を評価し
た。

【０１１７】まずＰＢＳ（−）に溶解したクロルメコー
トハプテン−１／ＢＳＡ及びクロルメコートハプテン−
２／ＢＳＡ（４μｇ／ｍｌ）を、９６ウェルのマイクロ
タイタープレート（コーニング・コスター社製）の各ウ
ェルに１００μｌ／ウェルで加え、４℃で１晩静置する
ことによって固相化した。なお、免疫原にクロルメコー
トハプテン−１／ＫＬＨを用いた抗血清にはクロルメコ
ートハプテン−１／ＢＳＡを、免疫原にクロルメコート
ハプテン−２／ＫＬＨを用いた抗血清にはクロルメコー
トハプテン−２／ＢＳＡを使用した。

【０１１８】次に、３００μｌ／ウェルでブロッキング
緩衝液（１％ＢＳＡと６０ｍＭＮａＣｌを添加した８
５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））に置き換え、室
温で１時間ブロッキングした。このウェルに希釈液（１
５０ｍＭＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ９．０））で適当な濃度に段階的に希釈したクロ
ルメコートを５０μｌ／ウェルで加えた。その後、直ち
に同じ希釈液で適当な濃度（クロルメコート未添加条件
での本ＥＬＩＳＡの吸光度が抗体飽和時の１／２を示し
得る抗体農度）に希釈した抗体溶液を加えて混合し、室
温で１時間反応させた。

【０１１９】洗浄液（６０ｍＭＮａＣｌを添加した８
５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））で３回洗浄した
後、２次抗体希釈液（０．３％ＢＳＡと１５０ｍＭ
ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
０））で１０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）を１００μｌ
／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。再び、洗
浄液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質溶液
（１００μｇ／ｍｌの３，３’５，５’−テトラメチル
ベンチジン及び０．００６％過酸化水素を添加した０．
１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５））で１０分間
発色させ、１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍの吸光度
を測定した。

【０１２０】結果を図１に示す。ここで阻害率は以下の
式で計算した。

【０１２１】

【化１４】

【０１２２】クロルメコートハプテン−１／ＫＬＨ由来
抗血清及びクロルメコートハプテン−２／ＫＬＨ由来抗
血清共、同程度の反応性を示し、約１ｍｇ／ｍｌから約
１００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲でクロルメコートを測定す
ることが出来た。このように、クロルメコートハプテン
−１及び２のいずれの免疫原を用いても、クロルメコー
トとの反応性に差が認められなかった。以降、よりクロ
ルメコートに構造の近いクロルメコートハプテン−１／
ＫＬＨを免疫したマウスを用いて、モノクローナル抗体
の作製を行った。実施例６：モノクローナル抗体の作製モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るた
めの細胞融合は、最終免疫後３日目のマウスの脾臓細胞
を用いて行った。摘出した脾臓からダルベッコ改変イー
グル培地（以下、「ＤＭＥＭ」と言う）中に脾臓細胞を
取り出し、ＤＭＥＭにて３回洗浄した。次いで、マウス
のミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と細胞
数の比で５：１（脾臓細胞：ミエローマ細胞）となるよ
うに混合し、遠心（１，２００ｒｐｍ、５分間）して細
胞沈渣を集めた。この細胞沈渣へ予め３７℃に加温して
おいた５０％ポリエチレングリコール（分子量１５０
０）１ｍｌを加え、細胞を融合した。細胞融合は、ＤＭ
ＥＭ１０ｍｌを徐々に添加し、牛胎児血清（以下、
「ＦＢＳ」と言う）１ｍｌを更に添加することにより、
停止した。

【０１２３】融合した細胞を、ＤＭＥＭに１０％ＦＢ
Ｓ、ヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン
（０．４μＭ）、及びチミジン（１６μＭ）を添加した
ＨＡＴ培地に懸濁した。これを９６ウェルのマイクロプ
レートの各ウェルに２×１０⁵細胞／ウェルで分注し、
３７℃、５％二酸化炭素存在下で１０日間−１４日間培
養した。培養後、ウェルに生じたクロルメコートと反応
する抗体の有無を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いて調
べた。なお、クロルメコートの希釈液はｐＨ８．０を使
用した。

【０１２４】クロルメコートとの反応性を示したウェル
中のハイブリドーマを選抜し、限界希釈法によって細胞
クローニングした。その結果、抗クロルメコート抗体を
産生する細胞として、ＣＭＱ１９−４、ＣＭＱ２５−２
７及びＣＭＱ１４−８を得た。さらにＦＢＳを１０％添
加したＤＭＥＭ中でこれらのモノクローナル抗体産生細
胞を培養し、得られた培養上清を各々モノクローナル抗
体とした。（以降、各モノクローナル抗体は、これらを
産生するモノクローナル抗体産生細胞と同一の名称を用
いる。）作製したモノクローナル抗体のクラスは、以下
の表３に示す。

【０１２５】

【表３】表３作製したモノクローナル抗体のクラスモノクローナル抗体クラス（サブクラス）ＣＭＱ１９−４ＩｇＧ１ＣＭＱ２５−２７ＩｇＧ１ＣＭＱ１４−８ＩｇＭ以降の実施例では、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に適用し
やすい等の理由より、クラスがＩｇＧのモノクローナル
抗体であるＣＭＱ１９−４とＣＭＱ２５−２７を用い
た。さらに、クロルメコートに反応するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマのうち、ＣＭＱ１９−４
を平成１１年１月２２日に、寄託番号ＦＥＲＭＰ−１
７１５６で工業技術院生命工学工業研究所（〒３０５−
００４６茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託し
た。実施例７：クロルメコートに対するモノクローナル抗体
の反応性実施例６で得られたモノクローナル抗体ＣＭＱ１９−４
及びＣＭＱ２５−２７のクロルメコートに対する反応性
を、実施例５と同様にして間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
よって調べた。結果を図２に示す。

【０１２６】図２に示されるように、ＣＭＱ１９−４が
０．０４μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌ、ＣＭＱ２５−
２７が０．２μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの濃度範囲
でクロルメコートと反応した。このように、ＣＭＱ１９
−４はクロルメコートに対して特に高い反応性を示し
た。実施例８：モノクローナル抗体の精製クロルメコートに高い反応性を示すモノクローナル抗体
ＣＭＱ１９−４について、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法へ
適用するため精製を行った。まず、Ｂａｌｂ／ｃマウス
の腹腔内にＣＭＱ１９−４産生細胞を接種し、腹水を得
た。この腹水に３７％飽和となるように硫安を加え，４
℃で撹拌した後、遠心し、沈殿物を得た。これにＰＢＳ
（−）を加えて可溶化した後、さらにＰＢＳ（−）で２
晩透析し、ＣＭＱ１９−４精製抗体とした。精製した
抗体の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定した結果、少なくとも９０％以上であっ
た。実施例９：クロルメコートハプテンとＨＲＰとの結合体
の調製直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に用いるために、実施例３と
同様の活性化エステル法により、実施例１で作製したク
ロルメコートハプテン−１とＨＲＰとの結合体を作製し
た。（以下、「クロルメコートハプテン−１／ＨＲＰ」
と言う。）まずクロルメコートハプテン−１（１．２５
μｍｏｌ）を５０μｌのＤＭＳＯに溶解した。この溶液
へＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（５．５μｍｏｌ）を
３．４μｌのＤＭＳＯに溶解した溶液、及び１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
・塩酸塩（１．９μｍｏｌ）を６．８μｌのＤＭＳＯに
溶解した溶液を加え、室温にて１時間反応させた。この
反応液に１Ｍ炭酸水素ナトリウム４０μｌを加え、更に
ＨＲＰ（５ｍｇ）を２５０μｌの蒸留水に溶解した溶液
を加えて混合し、室温にて３時間反応させた。得られた
反応液からゲル濾過カラム（セファデックスＧ−２５）
を用いて低分子化合物を除去し、クロルメコートハプテ
ン−１／ＨＲＰ結合体とした。実施例１０：直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるモノク
ローナル抗体ＣＭＱ１９−４のクロルメコートに対する
反応性実施例８で精製したモノクローナル抗体ＣＭＱ１９−４
を用いて、クロルメコートとの反応性を直接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法で検討した。直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法は以
下の手順で実施した。

【０１２７】まず９６ウェルのマイクロタイタープレー
トの各ウェルに、ＰＢＳ（−）に溶解した抗マウスＩｇ
Ｇ抗体（カペル社製）（８μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／
ウェルで加えた後、４℃で１晩静置することにより固相
化した。つぎに３００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝
液で置き換え、室温で１時間ブロッキングした。これに
実施例８で精製したＣＭＱ１９−４をＰＢＳ（−）で１
μｇ／ｍｌに調製後、１００μｌ／ウェルで加え、室温
で１時間反応させた。

【０１２８】洗浄液で３回洗浄した後、希釈液で各々適
当な濃度に希釈したクロルメコートとＨＲＰ結合ハプテ
ンの混合液を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間
反応させた。適当な濃度とは、本実施例ではクロルメコ
ート未添加条件での本ＥＬＩＳＡの吸光度がハプテン−
ＨＲＰ結合体飽和時の１／２を示し得るハプテン−ＨＲ
Ｐ結合体濃度とした。さらに洗浄液で３回洗浄した後、
実施例５に示した間接競合ＥＬＩＳＡ法と同様に発色さ
せ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１２９】結果を図３に示す。図３に示すように、モ
ノクローナル抗体ＣＭＱ１９−４は４ｎｇ／ｍｌから３
００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でクロルメコートを測定でき
た。実施例１１：モノクローナル抗体ＣＭＱ１９−４の交差
反応性実施例１０に示した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、
モノクローナル抗体ＣＭＱ１９−４と、クロルメコート
及びその類縁化合物との交差反応性を調べた。その結果
を、ＩＣ５０値と交差反応率として以下の表４に示す。

【０１３０】

【表４】

【０１３１】表４においてＩＣ５０は、抗体とＨＲＰ結
合ハプテンの反応を、５０％阻害する化合物の濃度であ
る。交差反応率とは、クロルメコートのＩＣ５０値／対
象化合物のＩＣ５０値×１００である。

【０１３２】表４より明らかなように、モノクローナル
抗体ＣＭＱ１９−４は、塩化アセチルコリンに２．４
％、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリドに
１．６％の交差反応率を示したものの、その他の化合物
に対しては、すべて１％以下の交差反応率しか示さず、
クロルメコートに高い特異性をもつ抗体である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法による本発
明のクロルメコートハプテンを用いて得られた抗血清の
クロルメコートに対する反応性を示す。

【図２】図２は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法による本発
明のモノクローナル抗体ＣＭＱ１９−４及びＣＭＱ２５
−２７のクロルメコートに対する反応性を示す。

【図３】図３は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法による本発
明のモノクローナル抗体ＣＭＱ１９−４のクロルメコー
トに対する反応性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者三宅司郎東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者山口優樹東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者大出勝也東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 DA11 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 CA47 4H006 AA01 AB20 BM10 BM71 BM72 BM73 BM74 BN10 BS10 BT12 BU32 BU50 4H045 AA11 DA76 DA86 EA50 FA72

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式（１）：【化１】［式（１）中、Ｒ¹及びＲ²は、枝分かれしていてもよい炭素数１−５の
アルキル基及びアミノ基からなるグループから別個に選
択される基であり；Ｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選
択されるハロゲン原子、ＯＨ基又はＯＣＯＣＨ₃基であ
り；Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されるハロゲ
ン原子であり；そしてｎは、１ないし１０の整数であ
る］で表される構造を有する化合物。
【請求項２】式（１）において、Ｒ¹及びＲ²がＣＨ₃基
であり、Ｘ及びＬがＣｌ又はＢｒである、請求項１に記
載の化合物。
【請求項３】請求項１もしくは２に記載された化合物と
高分子化合物又は標識物質との結合体。
【請求項４】請求項１又は２に記載された化合物と高分
子化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗
原を用いることにより、以下の式（２）：【化２】［式（２）中、Ｒ³は、枝分かれしていてもよい炭素数１−５のアルキ
ル基又はアミノ基であり；そしてＲ¹、Ｒ²、Ｌ及びＸは
先に定義した通りである］で表される構造を有する化合
物に反応性を示す抗体を製造することを特徴とする、式
（２）で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗
体又はそのフラグメントの製造方法。
【請求項５】請求項３に記載の結合体を抗原として用い
ることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を
示す抗体又はそのフラグメント。
【請求項６】モノクローナル抗体である、請求項５に記
載の抗体又はフラグメント。
【請求項７】モノクローナル抗体ＣＭＱ１９−４であ
る、請求項５もしくは６に記載の抗体又はフラグメン
ト。
【請求項８】請求項５ないし７のいずれか１項に記載の
抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。
【請求項９】寄託番号ＦＥＲＭＰ−１７１５６で寄託
されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】請求項５ないし７のいずれか１項に記載
の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
（２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
【請求項１１】さらに、請求項１もしくは２に記載され
た化合物、又は請求項３に記載の結合体を用いることを
含む、請求項１０に記載の免疫学的測定方法。