JP2000095769A - プロベナゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】３−アリルオキシ−１，２−ベンゾイソチアゾ
ール−１，１−ジオキシドのハプテン化合物、抗原、抗
体およびそのフラグメントの製造方法、およびこの化合
物の免疫学的測定方法を提供する。 【解決手段】下記式（１） ［式中、ｎは１−１０の整数である］で表される構造を
有する化合物およびこの化合物と高分子化合物又は標識
物質との結合体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、３−アリルオキシ
−１，２−ベンゾイソチアゾール−１，１−ジオキシド
（以下、本明細書中「プロベナゾール」と言う）のハプ
テン化合物、抗原、抗体およびそのフラグメントに関す
る。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体およびそ
のフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】プロベナゾールは、以下の式（２）：

【化３】 で表される構造を有し、イネいもち病、白葉枯病、もみ
枯細菌病用の薬剤として使用されている。いもち病に対
しては水面施用、根部浸漬、土壌混和、土壌灌注のいず
れの処理方法によっても防除効果が認められる。また野
菜の病害に対しても効果が見られる。

【０００４】プロベナゾール剤は水中で広く拡散し、イ
ネの根部や葉鞘から吸収されて地上部へと浸透移行し、
いもち病菌に対して侵入阻止作用、菌糸生育阻止作用、
病斑拡大阻止作用、胞子形成阻止作用を示す。また、付
着器形成阻害作用及び胞子発芽阻止作用も有する。生化
学的実験の結果、本剤で処理したイネでは無処理のもの
に比べていもち病菌感染時に形成されるα−リノレン酸
などの抗菌物質の量が多いことが示された。また、パー
オキシダーゼなどいもち病抵抗性に関連のある酵素の活
性も高まることが報告されている。このように、プロベ
ナゾール剤は、殺菌剤というよりは対病原菌抵抗性誘導
剤といえるものである。ゆえに予防的散布が有効であ
る。効果の持続性は長く、かけ流し、漏水、いっ水など
によって水田から有効成分が流出しない限り安定した防
除効果が得られ、雨間散布も可能である（農薬ハンドブ
ック １９９４年版、５８２頁、２４６頁−２４７頁、
（社）日本植物防疫協会；「最新農薬の残留分析法」
第５０６頁−第５０８頁、農薬残留分析法研究班編集
中央法規出版 ’９５．４．１発行）。

【０００５】近年、水、土壌、大気等の環境中や食品の
残留農薬が人の健康に及ぼす影響について大きな社会的
関心が寄せられている。従って、このように広く使用さ
れている農薬であるプロベナゾールについて、環境や食
品の安全性確保のためには、これらに残留するプロベナ
ゾールの量を迅速かつ正確に測定することが必要であ
る。

【０００６】プロベナゾールは、現在は、食品衛生法に
基づく残留農薬基準は設定されていない。しかしなが
ら、イネ、野菜を初め広く使用されている農薬であるこ
とから、農薬登録保留基準が定められている。基準値は
米で０．５ｍｇ／ｌ、野菜で０．１ｍｇ／ｌとなってい
る。

【０００７】また、プロベナゾールは公共用水域等にお
ける農薬の水質評価指針として、基準値が０．０５ｍｇ
／ｌと定められている。これは、公共用水域の水質保全
対策の一環として、水質汚濁に係る環境基準（いわゆる
水質環境基準）などの他に、農薬成分について環境庁が
示した指針である（最新農薬の規制・基準値便覧 １９
９５年版 ３２５頁、（社）日本植物防疫協会）。よっ
て、食品や環境に関する安全確保のためには、これらに
含有される、プロベナゾールの量を迅速かつ正確に測定
することが必要である。

【０００８】従来、例えば農産物中のプロベナゾール
は、米・野菜等の試料から抽出し、精製した後、ガスク
ロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。即
ち、試料をアセトンで抽出し、その濃縮液をヘキサン−
アセトニトリル分配し、フロリジルカラムクロマトグラ
フィーおよびシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精
製後に、ＧＣで分析する方法が採用されてきた（「最新
農薬の残留分析法」、前出）。この方法は、試料の調製
が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、分析に熟練を有
すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必
要とする等の問題点がある。プロベナゾールの測定は短
時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精
度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備し
た新規測定方法が要求されてきている。

【０００９】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【００１０】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載され
ている。

【００１１】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、プロベナゾールのような低
分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出
すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高
分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピ
トープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答
を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産
生される。このように高分子化合物と結合させて初めて
免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。

【００１２】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１３】しかしながら、プロベナゾールについては
その必要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗
体はもとより、抗体を作製するためのハプテンも本発明
前には得られていなかった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、プロベナゾ
ールに反応する新規な抗体もしくはそのフラグメント、
及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本
明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結
合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１５】本発明はその一態様において、プロベナゾ
ールに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１６】本発明は、また、プロベナゾールに反応性
を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハ
プテン化合物となる、当該化合物の誘導体を提供するこ
とを目的とする。

【００１７】本発明は、さらに、プロベナゾール誘導体
と高分子化合物との結合体を提供することを目的とす
る。当該結合体はプロベナゾールに反応性を有する抗体
を作製するための抗原となる。

【００１８】本発明は、さらにまた、前記抗体及びその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１９】本発明は、さらに、前記抗体もしくはその
フラグメント及び／又は前記プロベナゾール誘導体と高
分子化合物との結合体を使用することを含む、プロベナ
ゾールの免疫学的測定方法を提供することを目的とす
る。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、プロベナゾールにスペーサーアーム及び
高分子化合物との結合に利用できる官能基を導入した、
プロベナゾールの誘導体をハプテンとして使用すること
により、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに
成功し、本発明の完成に至った。

【００２１】本発明の対象となるプロベナゾールは、以
下の式（２）：

【化４】 で表される化合物である。

【００２２】本発明の抗体は、例えば、プロベナゾール
にスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入
した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合
させたものを抗原として用いることによって得ることが
できる。例えば、以下の式（１）：

【化５】 ［式（１）中、ｎは１−１０の整数、好ましくは３から
５である］で表される構造を有する化合物を、抗体作製
のためのハプテンとして使用する。

【００２３】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、プロベナゾールに反
応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合
物又は該抗体を用いるプロベナゾールの免疫学的測定方
法に関する。

【００２４】プロベナゾールの誘導体の作製 式（１）で表されるプロベナゾール誘導体は、公知の方
法に従って作製することができる。例えば、限定される
わけではないが、以下に記載するような方法がある。

【００２５】先ず、有機溶媒中、以下の式（Ｘ１）：

【化６】 ［式（Ｘ１）中、Ｌ¹はハロゲン原子であり（本明細書
中、ハロゲン原子はＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味す
る）；Ｐはカルボキシル基の保護基であり；そしてｎは
先に定義した通りである］で表される構造を有するエス
テル化合物を、以下の式（Ｘ２）：

【化７】 ［式（Ｘ２）中、Ｒは、炭素数が１−５の枝分かれして
いてもよいアルキル基であり；そしてＭは、銅（Ｉ）、
タリウム（Ｉ）、銀（Ｉ）などの金属、またはナトリウ
ム、カリウム等のアルカリ金属である］で表される構造
を有する金属塩と反応させて、以下の式（Ｘ３）：

【化８】 ［式（Ｘ３）中、Ｐ、Ｒおよびｎは先に定義した通りで
ある］で表される構造を有する化合物を得る。

【００２６】式（Ｘ３）の合成には有機溶媒としては、
例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジ
クロロメタン、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、
ペンタン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、１，２
−ジクロロエタン、酢酸エチル、ジグリム、ヘキサメチ
ルリン酸トリアミド等、又はこれらの混合溶媒を用いる
ことができる。反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは室温から１６０℃で、１０分から１５時間、好
ましくは、１時間から５時間行う。

【００２７】Ｐで示されるカルボキシル基の保護基は公
知のものでよく、具体例として、例えば、メチル基、エ
チル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキ
シベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリク
ロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチル
ジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、
トリメチルシリルエトキシメチル基等を挙げることがで
きる。

【００２８】次に、式（Ｘ３）の化合物を、加水分解す
ることにより、以下の式（Ｘ４）：

【化９】 ［式（Ｘ４）中、Ｐおよびｎは先に定義した通りであ
る］で表される構造を有する化合物を得る。

【００２９】例えば、アルカリ加水分解の場合は、式
（Ｘ３）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒に溶解し、次いで水酸化ナトリウム又は水酸化カリ
ウム水溶液を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは０℃から室温で、５分から５時間、好ましくは３
０分から２時間撹拌反応させることにより式（Ｘ４）の
化合物を得ることができる。あるいは、酸加水分解の場
合は、式（Ｘ３）のエステル化合物を、好ましくはベン
ゼン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有
機溶媒に溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素、
トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ
−トルエンスルホン酸を加えて、０℃から溶媒の沸点の
温度、好ましくは１０℃から１００℃で、１０分から１
０時間、好ましくは３０分から２時間撹拌反応させるこ
とにより式（Ｘ４）のエステル化合物を得ることができ
る。

【００３０】次に、式（Ｘ４）の化合物に、以下の式
（Ｘ５）：

【化１０】 ［式（Ｘ５）中、Ｌ²は塩素原子または臭素原子であ
り、Ｌ¹と同一であっても異なってもよい］で表される
構造を有する化合物を反応させて、以下の式（Ｘ６）：

【化１１】 ［式（Ｘ６）中、Ｐおよびｎは先に定義した通りであ
る］で表される構造を有するエステル化合物を得る。反
応は、ピリジン、炭酸カリウム、トリエチルアミン等の
塩基の存在下または非存在下に、アセトン、ベンゼン、
ジオキサン等の有機溶媒中で、０℃から溶媒の沸点の温
度、好ましくは１０℃から１２０℃において、１０分か
ら１５時間、好ましくは、３０分から２時間行う。な
お、触媒として活性炭もしくは活性炭−ジメチルホルム
アミドを使用することもできる。

【００３１】さらに、式（Ｘ６）のエステル化合物か
ら、Ｐで示されるカルボキシル基の保護基を除去するこ
とにより、式（１）のプロベナゾール誘導体を得ること
ができる。カルボキシル基の保護基の除去は、アルカリ
加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができ
る。

【００３２】すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｘ
６）のエステル化合物を、好ましくはベンゼン、ジクロ
ロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解
し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素、トリフルオロ
酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ−トルエンス
ルホン酸を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好まし
くは０℃から室温で、５分から１０時間、好ましくは１
時間から５時間撹拌反応させることにより式（１）のプ
ロベナゾール誘導体を得ることができる。

【００３３】また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｘ
６）のエステル化合物を、好ましくはメタノール、エタ
ノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の
有機溶媒に溶解し、次いで水酸化ナトリウム又は水酸化
カリウム水溶液を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、
好ましくは０℃から室温で、５分から５時間、好ましく
は１時間から２時間撹拌反応させることにより式（１）
のプロベナゾール誘導体を得ることができる。

【００３４】更に、Ｐがベンジル基の場合、除去はパラ
ジウムカーボン等の触媒を用いた加水素分解反応あるい
は液体アンモニウム−ナトリウムを用いたバーチ還元に
よっても行うことができる。

【００３５】更にまた、Ｐがシリル基の場合、脱保護は
テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニ
ウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬に
よっても行うことができる。

【００３６】以上の製造法によって得られた化合物を、
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操
作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とするこ
とができる。

【００３７】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００３８】プロベナゾール誘導体と高分子化合物との
結合体の作製 上述のように合成されたプロベナゾール誘導体は適当な
高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用す
る。

【００３９】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨお
よびＢＳＡが好ましい。

【００４０】プロベナゾール誘導体と高分子化合物との
結合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎ
ｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２
３４１０９０−１０９４ （１９５４））、又は活性化
エステル法（Ａ．Ｅ． ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．
Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ４２ ３０１
−３０９ （１９９４））等の公知の方法によって行う
ことができる。

【００４１】混合酸無水物法において用いられる混合酸
無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得ら
れ、これを高分子化合物と反応させることにより目的と
するハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショ
ッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われ
る。塩基性化合物としてはショッテン−バウマン反応に
慣用の化合物を使用することができ、例えば、トリ−ｎ
−ブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルア
ミン、トリメチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、
炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭
酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応
は、通常マイナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃
から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時
間、好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸
無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃
から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行
われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分か
ら５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行わ
れる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されている
いずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメ
タン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭
化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭
化水素類、ジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒド
ロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチ
ル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸
トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルと
しては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、
クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソ
ブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハ
ロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲
から適宜選択され得る。

【００４２】一方、活性化エステル法は、一般に以下の
ように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機
溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロ
キシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく
酸イミドエステルを生成する。

【００４３】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」と言う）、ジメチルスルホキシド（以
下、「ＤＭＳＯ」と言う）、ジオキサン等が使用でき
る。反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：
１、より好ましくは、１：１から１：１０、最も好まし
くは１：１である。反応温度は、０℃から５０℃、好ま
しくは２２℃から２７℃で、反応時間は５分から２４時
間、好ましくは１時間から２時間である。反応温度は各
々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。

【００４４】カップリング反応後、反応液を遠心し、上
清液を高分子化合物溶解液に加え反応させると、例えば
高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミ
ノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド
結合が生成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ま
しくは５℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７
℃で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間
から１６時間、より好ましくは１時間から２時間であ
る。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製して、
プロベナゾール誘導体と高分子化合物との結合体を得る
ことができる。

【００４５】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をプロベナゾール誘導体に結合させたものを、
免疫測定法において使用することができる。標識物質と
しては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲ
Ｐ」と言う）やアルカリフォスファターゼ等の酵素、フ
ルオレセインイソチオシアネートやローダミン等の発色
物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質など
がある。

【００４６】ポリクローナル抗体の作製 プロベナゾール誘導体と高分子化合物との結合体を使用
して、慣用化された方法により本発明のポリクローナル
抗体を作製することができる。例えば、プロベナゾール
誘導体−ＫＬＨ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以
下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジ
ュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン
等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に
免疫することによって得ることができる。免疫される動
物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用で
きるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ
等を挙げることができる。

【００４７】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間
隔で複数回行うことができる。

【００４８】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、プロベナゾールと反応するポリク
ローナル抗体の存在を評価することができる。

【００４９】モノクローナル抗体の作製 プロベナゾール誘導体と高分子化合物との結合体を使用
して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を
作製することができる。

【００５０】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００５１】（ａ）免疫用抗原として使用するプロベナ
ゾール誘導体と高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、並びに抗体産生細胞の調
製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本
組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載され
ている。

【００５２】以下、本発明のプロベナゾールに対するモ
ノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限
されないことは当業者によって明らかであろう。

【００５３】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５４】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００５５】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６， ４９５−４９７ （１９７５））、
Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８１ １−７
（１９８７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ
−１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６，５１１
−５１９ （１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓ
ｐ２／０）（Ｎａｔｕｒｅ ２７６， ２６９−２７０
（１９７８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔ
ｈ．， ３５， １−２１ （１９８０））、ＭＰＣ−
１１、Ｘ６３．６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、
あるいはラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．
３．（Ｙ３）（Ｎａｔｕｒｅ ２７７， １３１−１３
３，（１９７９））等を使用できる。

【００５６】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日
に３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００５７】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ７３，
３（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最
も一般的に行われているのはポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、
例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載され
ている。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）
による方法等を適宜採用することもできる（大河内悦子
ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その
他の方法を適宜採用することもできる。また、細胞の使
用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細
胞に対して脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００５８】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００５９】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、プロベナゾールに対する抗体活性を
測定する。

【００６０】さらに、測定によりプロベナゾールに反応
する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細
胞クローニングを行う。この細胞クローニング法として
は、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが
含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培
地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレー
ターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーター
によって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」
等が挙げられる。限界希釈法が簡単でありよく用いられ
る。

【００６１】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１回から４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗プロベナゾー
ルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択
する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例え
ば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤ
Ｍ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二
酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の
恒温器中）で培養するのが好ましい。

【００６２】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００６３】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗プロベナゾールモノクローナル抗体として使
用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムに
よる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集
め精製することにより抗プロベナゾールモノクローナル
抗体を得ることができる。さらに精製が必要な場合に
は、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、オープンカラムクロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など
の慣用されている方法を使用して抗体画分を集める操作
を１回又は複数回、あるいはこれらを組み合わせて行う
ことにより実施できる。

【００６４】以上のようにして得られた抗プロベナゾー
ルモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法
などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を
決定することができる。

【００６５】抗体によるプロベナゾールの測定 本発明で使用する抗体によるプロベナゾールの測定方法
としては、放射性同位元素免疫測定方法（ＲＩＡ法）、
ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ７０， ４１９−４３９
（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット
法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）
法等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法
（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会
社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５
７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点か
らＥＬＩＳＡ法が汎用されている。

【００６６】プロベナゾールの測定は、各種ＥＬＩＳＡ
法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下
のような手順により行うことができる。

【００６７】（ａ）まず、抗原であるプロベナゾール誘
導体と高分子化合物との結合体を担体に固相化する。

【００６８】（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗
原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングす
る。

【００６９】（ｃ）これに各種濃度のプロベナゾールを
含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び
プロベナゾールに競合的に反応させて、固相化抗原−抗
体複合体及びプロベナゾール−抗体複合体を生成させ
る。

【００７０】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のプロ
ベナゾールの量を決定することができる。

【００７１】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００７２】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、１４５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭのＰＢＳを
挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲
から選択できるが、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００
μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５
μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェル
のマイクロタイタープレートを使用する場合には、３０
０μｌ／ウェル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ
／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの
条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキ
ュベーションが適している。

【００７３】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体作製に使用したプロベナゾール誘導体と高分子化合
物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他の
誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもでき
る。例えば、式（１）で表される化合物でｎの相違する
抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いることもでき
る。さらに、式（１）に含まれない他のプロベナゾール
類似化合物も、固相化抗原として使用することも可能で
ある。

【００７４】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（プロ
ベナゾール誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化
した担体において、プロベナゾール誘導体部分以外に後
で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があ
り、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング
剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用で
きる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃ
ｅ」、大日本製薬、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブ
ロッキング剤として市販されているものを使用すること
もできる。具体的には、限定されるわけではないが、例
えば抗原を固相化した部分に、適当に希釈したブロック
エースを適量加え、約４℃で、一晩インキュベーション
した後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液
としては特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ ＰＢＳ
（ｐＨ７．２）、０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０
２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅ
ｎ２０の組成のものが適している。

【００７５】次いで（ｃ）工程において、プロベナゾー
ルを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固
相化抗原及びプロベナゾールと反応させることにより、
固相化抗原−抗体複合体及びプロベナゾール−抗体複合
体が生成する。

【００７６】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のプロベナゾールに対する抗体を加え、更に第二
抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を
順次加えて反応させる。

【００７７】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、３７℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固
相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。緩衝液
としては、例えば、１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）、
０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｋ
Ｃｌの組成のものが好ましい。

【００７８】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に約５００−１０
０００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好まし
くは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反
応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定
されるわけではないが、反応は約３７℃で約１時間行
い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第
二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体
を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。

【００７９】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度
を測定することによって検量線からプロベナゾールの量
を算出することができる。

【００８０】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば過酸化水素、並びに
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ−
フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含む
発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけ
ではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間
反応させた後、２Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応
を停止させる。ＯＰＤを使用する場合、４８０−５００
ｎｍの吸光度を測定する。３，３’，５，５’−テトラ
メチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度
を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアル
カリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニ
トロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａ
ＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を
測定する方法が適している。

【００８１】プロベナゾールを添加しない反応溶液の吸
光度に対して、プロベナゾールを添加して抗体と反応さ
せた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既
知の濃度のプロベナゾールを添加した反応液の阻害率に
より予め作製しておいた検量線を用いて、試料中のプロ
ベナゾールの濃度を算出できる。

【００８２】あるいは、プロベナゾールの測定は、例え
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。

【００８３】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を担体に固相化する。

【００８４】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキン
グする。

【００８５】（ｃ）各種濃度のプロベナゾールを含む試
料、並びにプロベナゾール誘導体と酵素を結合させた酵
素結合ハプテンを、担体に固相化した抗体と反応させ
る。

【００８６】（ｄ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合
体の量を測定することにより、あらかじめ作成した検量
線から試料中のプロベナゾールの量を決定する。

【００８７】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。

【００８８】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のプロベナゾ
ール及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に
吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ
目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間
接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００８９】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、プロベナゾール誘導体を酵素に結合する方
法であれば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよ
い。例えば、前述した活性化エステル法を採用すること
ができる。調製した酵素結合ハプテンは、プロベナゾー
ルを含む試料と混合する。

【００９０】なお、酵素に結合させるハプテンとして
は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相化抗原の場
合と同様に、抗体作製に使用したプロベナゾール誘導体
のみならず、式（１）で表される他の誘導体を用いるこ
ともできる。例えば、式（１）においてｎの数が相違す
る化合物を各々抗体作製用と標識競合化合物として用い
ることもできる。さらに、式（１）に含まれない他のプ
ロベナゾール類似化合物も、酵素に結合させるハプテン
として使用可能である。

【００９１】（ｃ）工程においてプロベナゾールを含む
試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、プロベナゾールと酵素結合ハプテンとの競合阻害反
応により、これらと固相化抗体との複合体が生成する。
プロベナゾールを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使
用する。限定されるわけではないが、反応は例えば室温
で約１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、
固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去す
る。緩衝液は、例えばＰＢＳを採用することができる。

【００９２】さらに、（ｄ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からプロベナゾールの量を算出することがで
きる。

【００９３】本発明のモノクローナル抗体ＰＢＺ１−１
３は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約１ｎｇ／ｍ
ｌから１００００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍ
ｌから１０００ｎｇ／ｍｌの範囲でプロベナゾールを測
定できる（実施例８および図１）。

【００９４】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差
反応性を調べることができる。

【００９５】例えば、本発明のモノクローナル抗体ＰＢ
Ｚ１−１３は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において類似
する他の化合物であるホスメット、サリチオン及びベノ
ミルとはいずれも交差反応性を示さない（実施例９およ
び図２）。

【００９６】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００９７】

【実施例】実施例１ プロベナゾール誘導体の合成

【化１２】 ６−アセトキシヘキサン酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル
（１）の合成 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍｌに６
−ブロモヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル２.5ｇ
（１０ｍｍｏｌ）および酢酸銀２.０ｇ（１１ｍｍｏ
ｌ）を入れ、環流下に３時間反応させた。反応混合物を
濃縮し、残渣に酢酸エチル１００ｍｌを加え、濾過し
た。濾液の酢酸エチル溶液を水洗、無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥後、濃縮し、（１）の粗精製物２.0ｇ（収率８
７％）を得た。

【００９８】６−ヒドロキシヘキサン酸 ｔｅｒｔ−ブ
チルエステル（２）の合成 エタノール１０ｍｌに６−アセトキシヘキサン酸 ｔｅ
ｒｔ−ブチルエステル（１）１.６ｇ（７.０ｍｍｏｌ）
を溶かし、この溶液に水１０ｍｌに溶かした水酸化ナト
リウム０.６ｇ（１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間
撹拌した。反応混合物からエタノールを減圧濃縮で除
き、残渣を３０ｍｌのジエチルエーテルで３回抽出し
た。エーテル層を水洗、無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、濃縮し、（２）の粗精製物1.0ｇ（収率７７％）を
得た。

【００９９】６−（１，１−ジオキソ−１、２−ベンズ
イソチアゾール−３−イルオキシ）ヘキサン酸 ｔｅ
ｒｔ−ブチルエステル（３）の合成 ピリジン１０ｍｌに６−ヒドロキシヘキサン酸 ｔｅｒ
ｔ−ブチルエステル（２）１.０ｇ（５．３ｍｍｏｌ）
を入れ、撹拌下に３−クロロ−１，２−ベンズイソチア
ゾール １，１−ジオキシド１.１ｇ（５．３ｍｍｏ
ｌ）を徐々に加えた。室温で１時間撹拌後、濃縮した。
残渣を１００ｍｌの酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層
を水洗、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、１.４ｇ（収率７
４％）の（３）を得た。

【０１００】６−（１，１−ジオキソ−１，２−ベンズ
イソチアゾール−３−イルオキシ）ヘキサン酸（４）の
合成 ジクロロメタン３０ｍｌに６−（１，１−ジオキソ−
１，２−ベンズイソチアゾール−３−イルオキシ）ヘキ
サン酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３）１.２ｇ
（３．４ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸３ｍｌを入れ、
室温下に２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣の
結晶をベンゼンから再結晶させ０.９０ｇ（収率９0％）
の（４）を得た。このプロベナゾール誘導体の物性値を
以下に示す。

【０１０１】 融点；１３４−１３６℃¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ） δ １．４５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， １．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， １．８４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， ２．２５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂）， ４．５６（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂）， ７．９０（３Ｈ，ｍ，Ａｒ：Ｈ）， ８．１４（１Ｈ，ｄ，Ａｒ：Ｈ）， １２．０６（１Ｈ，ｂｒ，ＣＯＯＨ）実施例2 免疫用抗原の作製 プロベナゾール誘導体とＫＬＨとの結合体を以下のよう
に混合酸無水物法により作製した。

【０１０２】実施例１によって作製されたプロベナゾー
ル誘導体の７ｍｇを無水ジオキサン０．７ｍｌに溶解
し、１０℃から１２℃に冷却した後、トリ−Ｎ−ブチル
アミン４μlおよびクロロ蟻酸イソブチル２４μlを添加
し、１０℃から１２℃にて３０分間撹拌した（以下、こ
れを「Ａ液」とする）。

【０１０３】一方、蒸留水１ｍｌにＫＬＨを２０ｍｇ溶
解し、０．５％ＮａＨＣＯ₃（ｐＨ９．４）を外液とし
て一晩透析した。透析後３０００ｒｐｍ、３０分間遠心
し得られた上清１．５ｍｌにＡ液をゆっくり添加した。
４℃にて２時間反応させた後、スパーテル１杯のグリシ
ンを添加してさらに４℃にて３０分間撹拌することによ
り反応を終了させた。この反応液を１４５ｍＭ ＮａＣ
ｌ−１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１週間透析し
て免疫用抗原を得た。このようにして得られたプロベナ
ゾール−ＫＬＨ結合体を免疫用抗原として用いた。

【０１０４】実施例３ スクリーニング用抗原の作製 スクリーニング用抗原として実施例２と同様の方法によ
りプロベナゾール誘導体−ＢＳＡ結合体を得た。

【０１０５】実施例４ 免疫感作 実施例２で調整した免疫用抗原を用いて、マウスに免疫
をおこなった。免疫用抗原１００μgをＰＢＳ１００μl
に溶解し、等量のフロイント完全アジュバントと混合し
た後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種した。１７日後にフロ
イント不完全アジュバントを用いて調製した免疫用抗原
を、前記と同様の操作によりマウスに追加免疫をおこな
った。また、４１日後にはＰＢＳに溶解した免疫抗原を
マウスに追加免疫した。

【０１０６】実施例５ 抗血清によるプロベナゾールと
の反応性 実施例４で調製した抗血清について、以下の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法でプロベナゾールを測定し、抗血清の力
価を評価した。

【０１０７】実施例３で調製したスクリーニング用抗原
の溶液（０．１μg／ｍｌ)を１００μl／ウェルにて９
６ウェルプレートにコーティングした。洗浄の後、４倍
に希釈したブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」：
大日本製薬、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）でブロッキン
グした後、抗血清希釈液と各種濃度のプロベナゾールあ
るいはその類似化合物を含む１０％メタノール溶液とを
等量混合し、その１００μlをウェルに入れ、３７℃に
て１時間反応させた。

【０１０８】反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−
ＰＢＳにて１回洗浄の後、ＰＢＳを用いて５０００倍希
釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体
（カッペル社製）を１００μlずつ各ウェルに添加し、
３７℃にて１時間反応させた。さらに反応終了後、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて２回洗浄し、０．４
ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ及び０．０４％過酸化水素を含む
０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１０
０μlずつ各ウェルに入れ、室温にて２０分間放置し発
色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μlを各ウェルに加
え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定し
た。

【０１０９】実施例６ ハイブリドーマの作製 実施例４に続き、血清中の抗プロベナゾール抗体の活性
が高くなったマウスの脾臓細胞と、マウスミエローマ細
胞（Ｐ３Ｕ１）とを電気融合法にて細胞融合を行った。
細胞増殖が認められた培養上清液について以下の方法で
プロベナゾールに対する抗体活性を調べた。

【０１１０】実施例３で調製したスクリーニング用抗原
の溶液（０．１μg／ml)を５０μl／ウェルにて９６ウ
ェルプレートにコーティングした。洗浄の後、４倍に希
釈したブロックエースでブロッキングした後、培養上清
液と各種濃度のプロベナゾール又はその類似化合物を含
む１０％メタノール溶液とを等量混合し、その１００μ
lをウェルに入れ、３７℃にて１時間反応させた。反応
終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて１回洗
浄の後、ＰＢＳを用いて、５０００倍希釈したペルオキ
シダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（カッペル社製）
を５０μlずつ各ウェルにて３７℃１時間反応させた。
さらに反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ
にて２回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ及び０．
０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝
液（ｐＨ４．５）を１００μlずつ各ウェルにいれ室温
にて２０分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１
００μlを各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９
０ｎｍの吸光度を測定し、特異性のある抗体活性が認め
られたものを選抜した。

【０１１１】次に、選抜されたウェルの細胞について限
界希釈法を用いた細胞クローニングをおこなった。その
結果、抗プロベナゾール抗体を産生するハイブリドーマ
細胞株をクローン化した。そのうちのＰＢＺ１−１３を
平成１０年７月２３日に寄託番号ＦＥＲＭ−１６９０６
として工業技術院生命工学工業研究所（〒３０５−００
４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。

【０１１２】実施例７ プロベナゾール誘導体とＨＲＰ
との結合体作製 実施例２と同様な混合無水物法により実施例１で作製し
たプロベナゾールハプテンとＨＲＰの結合体を作製し
た。１ｍｇのプロベナゾール誘導体を無水ジオキサン
０．２ｍｌに溶解した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン０．
５μl、クロロ蟻酸イソブチル０．３μlを添加し、１０
℃から１２℃にて３０分間撹拌した。（以下、これを
「Ｂ液」とする）一方、０．５％ＮａＨＣＯ₃をＮａＯ
ＨでｐＨ９．４に調整した溶液１ｍｌにＨＲＰ５ｍｇを
溶解し、Ｂ液をこの中に滴下した。４℃にて２時間撹拌
し、さらにグリシンを添加して３０分間撹拌することに
より反応を終了させた。反応物をＰＢＳにて透析するこ
とにより、精製ＨＲＰ結合プロベナゾール誘導体を得
た。

【０１１３】実施例８ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
るプロベナゾールの測定 実施例６で得られたハイブリドーマ細胞（ＰＢＺ１−１
３）をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得られ
た腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗体
を精製した。この操作によって、抗プロベナゾール抗体
ＰＢＺ１−１３を用いて以下の試験法にてプロベナゾー
ルを測定した。

【０１１４】モノクローナル抗体溶液（ＰＢＺ１−１３
抗体４０μｇ／ｍｌ）を１００μl／ウェルで９６ウェ
ルプレートに加え、４℃で一晩静置し、翌日４倍希釈し
たブロックエースでブロッキングした。その後、プロベ
ナゾール及び実施例７で作製した適度に希釈されたＨＲ
Ｐ結合プロベナゾールハプテンを含む１０％メタノール
−ＰＢＳ溶液を５０μl／ウェルで加え、３７℃１時間
静置した。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−Ｐ
ＢＳにて２回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ及び
０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸
緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μlずつ各ウェルにいれ
室温にて２０分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫
酸１００μlを各ウェルに加え、反応を停止させた後、
４９０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１１５】結果を図１に示す。直接競合阻害ＥＬＩＳ
Ａ法においても本発明のモノクローナル抗体ＰＢＺ１−
１３はプロベナゾールを測定することができ、その測定
範囲はプロベナゾール１ｎｇ／ｍｌから１００００ｎｇ
／ｍｌであった。

【０１１６】実施例９ モノクローナル抗体の評価 プロベナゾール誘導体を用いて得られたモノクローナル
抗体ＰＢＺ１−１３について、実施例８と同様の方法を
用いてプロベナゾールおよび他の類似化合物に対する反
応性について調べた。

【０１１７】結果を図２に示す。ここで、％最高吸光度
は以下の計算式で計算した。

【０１１８】

【化１３】 交差反応性は、％最高吸光度が５０を示すときのプロベ
ナゾールの濃度（μｇ／ｍｌ）を％最高吸光度が５０を
示すときの対象化合物（ホスメット等）の濃度（μｇ／
ｍｌ）で除して１００を乗じた数値（％）で判定する。

【０１１９】図２に示されるようにモノクローナル抗体
ＰＢＺ１−１３は他の類似化合物であるホスメット、サ
リチオン、ベノミルとはいずれも交差反応性は１％以下
であった（図２）。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体ＰＢＺ１
−１３を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるプロベ
ナゾールの測定を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＰＢＺ１
−１３を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるプロベ
ナゾール及び他の類似化合物との交差反応性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 香川 康浩 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡辺 和明 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 斉藤 恵 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Ｆターム(参考） 4C033 AA01 AA06 AA12 4H045 AA11 AA20 AA30 BA72 DA76 DA86 EA50 FA42 FA72 GA10

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、ｎは１−１０の整数である］で表される
   構造を有する化合物。
2. 【請求項２】請求項１に記載の化合物と高分子化合物又
   は標識物質との結合体。
3. 【請求項３】請求項１に記載の化合物と高分子化合物を
   結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いる
   ことにより、以下の式（２）： 【化２】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（２）の化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
4. 【請求項４】請求項２に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（２）の化合物と反応性を
   示す抗体又はそのフラグメント。
5. 【請求項５】モノクローナル抗体である、請求項４に記
   載の抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】モノクローナル抗体ＰＢＺ１−１３であ
   る、請求項４又は５に記載の抗体又はそのフラグメン
   ト。
7. 【請求項７】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体を産生するハイブリドーマ。
8. 【請求項８】寄託番号ＦＲＥＭ Ｐ−１６９０６で寄託
   されている請求項７に記載のハイブリドーマ。
9. 【請求項９】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
   （２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
10. 【請求項１０】さらに、請求項１に記載の化合物又は請
    求項２に記載の結合体を用いることを含む、請求項９に
    記載の免疫学的測定方法。