JP2000159737A - イナベンフィドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、イナベンフィドのハプテン化合
物、抗体及び測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、イナベンフ
ィド又はその部分にスペーサーアーム及び結合のための
官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、４’−クロロ−
２’−（α−ヒドロキシベンジル）イソニコチンアニリ
ド（以下、本明細書中「イナベンフィド」と言う）のハ
プテン化合物、抗原、抗体及びそのフラグメントに関す
る。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】イナベンフィドは、以下の式（２）：

【化３】 で表される構造を有する、植物成長調整剤である。イナ
ベンフィドは土壌処理によりイネ科植物に対して草丈短
縮作用を示し、ジベレリン生合成系の阻害により伸長抑
制作用を示すと考えられる。

【０００４】ジベレリンは植物体内において、メバロン
酸から生合成され、ゲラニルゲラニルピロリン酸、コパ
リルピロリン酸を経てｅｎｔ−カウレンに至り、さらに
ｅｎｔ−カウレン酸を経てＧＡ₁₂アルデヒドになり、こ
こから酸化、水酸化を受けて様々なジベレリンに代謝・
変換される。これらの過程において、環化反応、酸化反
応、水酸化反応があり、そこには様々な酵素が関与して
いるが、ジベレリン生合成阻害剤はこれらの反応に関与
する酵素活性を阻害することによりジベレリン生合成を
抑え薬剤活性を示すものである（農薬ハンドブック 第
４５８頁−第４６０頁及び第６３８頁、１９９４年版、
日本植物防疫協会；「最新農薬の残留分析法」 第３６
１頁−第３６３頁、農薬残留分析法研究班編集 中央法
規出版）。

【０００５】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。イナベンフィドについては、食品衛生法に基づき残
留基準値が、米（０．０５ｐｐｍ）と定められている
（「最新農薬の残留分析法」 同上）。よって、環境や
食品に関する安全確保のためには、農作物、特に米に含
有される、イナベンフィドの量を迅速かつ正確に測定す
ることが必要である。

【０００６】従来、例えば農作物中のイナベンフィド
は、米から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラフィ
ー（ＧＣ）により分析されてきた。即ち、試料をアセト
ンで抽出し、ジクロロメタンに転溶した後、フロリジル
カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマト
グラフィーで精製後、ＧＣで測定する方法が採用されて
いる。この方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時
間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定
装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点があ
る。イナベンフィドの測定は短時間で膨大な数の試料の
分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便
性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求
されてきている。

【０００７】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を
行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経
済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法
においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、
酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、
金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが
適用されてきた。

【０００８】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１ （１９９０） に記載
されている。

【０００９】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、イナベンフィドのような低
分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出
すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高
分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピ
トープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答
を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産
生される。このように高分子化合物と結合させて初めて
免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。

【００１０】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１１】このように、イナベンフィドについては、
その必要性が非常に高かったにもかかわらず、抗体のみ
ならず、抗体を得るために必要なハプテンも本発明前に
は得られていなかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、イナベンフ
ィドに反応する新規な抗体もしくはそのフラグメント、
及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本
明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結
合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１３】本発明はその一態様において、イナベンフ
ィドに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１４】本発明は、また、イナベンフィドに反応性
を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハ
プテン化合物となる、当該化合物の誘導体を提供するこ
とを目的とする。

【００１５】本発明は、さらに、イナベンフィド誘導体
と高分子化合物との結合体を提供することを目的とす
る。当該結合体はイナベンフィドに反応性を有する抗体
を作製するための抗原となる。

【００１６】本発明は、さらにまた、前記抗体又はその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１７】本発明は、さらに、前記抗体もしくはその
フラグメント及び／又は前記イナベンフィド誘導体と高
分子化合物との結合体を使用することを含む、イナベン
フィドの免疫学的測定方法を提供することを目的とす
る。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、イナベンフィド又はその部分にスペーサ
ーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基
を導入した、イナベンフィドの誘導体をハプテンとして
使用することにより、前記化合物に反応性を有する抗体
を得ることに成功し、本発明の完成に至った。

【００１９】本発明の対象となるイナベンフィドは、以
下の式（２）：

【化４】 で表される構造を有する化合物である。

【００２０】本発明の抗体は、例えば、イナベンフィド
の類縁体にスペーサーアーム及び結合に利用できる官能
基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合
物と結合させたものを抗原として用いることによって得
ることができる。例えば、以下の式（１）：

【化５】 ［式（１）中、Ｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからな
るグループから選択されるハロゲン原子であり；ｎは、
１ないし１０の整数である］で表される構造を有する化
合物を、抗体作製のためのハプテンとして使用する。

【００２１】式（１）中、Ｌは好ましくは塩素原子であ
り、ｎは好ましくは５である。

【００２２】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、イナベンフィドに反
応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合
物又は該抗体を用いるイナベンフィドの免疫学的測定方
法に関する。

【００２３】イナベンフィド誘導体の作製 式（１）で表されるイナベンフィド誘導体は、公知の方
法に従って製造することができる。限定するわけではな
いが、例えば以下のような方法を用いることができる。

【００２４】まず、以下の式（Ｘ１）：

【化６】 ［式（Ｘ１）中、Ｐ¹は水酸基の保護基である］で表さ
れる構造を有する化合物に、塩化チオニル等のハロゲン
化チオニルを加えて還流を行う。

【００２５】水酸基の保護基Ｐ¹は、公知の保護基でよ
く、例えば、アセチル基、メチル基、エチル基、ｔｅｒ
ｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、
３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチル基等
を挙げることができる。

【００２６】還流は好ましくは、１時間ないし２時間行
う。

【００２７】その後、濃縮残渣を有機溶媒に溶解して、
塩基の存在下、以下の式（Ｘ２）：

【化７】 ［式（Ｘ２）中、Ｌは先に定義に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物と反応させて、以下の式
（Ｘ３）：

【化８】 ［式（Ｘ３）中、ＬおよびＰ¹は先に定義した通りであ
る］で表される構造を有する化合物を合成する。

【００２８】式（Ｘ３）の化合物のための有機溶媒とし
ては、例えば、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、
ペンタン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロ
ロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ジグ
リム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルリ
ン酸トリアミド等、又はこれらの混合溶媒を用いること
ができる。塩基としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、炭酸水
素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナ
トリウムメチラート、ナトリウムエチラート、トリエチ
ルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、リチウムジイソ
プロピルアミド等を用いることができる。

【００２９】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１２０℃で、１０分から５時間、好まし
くは３０分から２時間行う。

【００３０】次に、式（Ｘ３）の化合物から水酸基の保
護基を除去することにより、以下の式（Ｘ４）：

【化９】 ［式（Ｘ４）中、Ｌは先に定義した通りである］で表さ
れる構造を有する化合物を得る。

【００３１】水酸基の保護基の除去は、アルカリ加水分
解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができる。

【００３２】すなわち、アルカリ加水分解の場合は、式
（Ｘ３）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウ
ム又は水酸化カリウム水溶液等を加えて、０℃から溶媒
の沸点の温度、好ましくは０℃から室温で、５分から１
０時間、好ましくは１時間から２時間撹拌反応させるこ
とにより式（Ｘ４）の化合物を得ることができる。

【００３３】また、酸加水分解の場合は、式（Ｘ３）の
化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロ
メタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解
し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテ
ル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホ
ン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶
媒の沸点の温度、好ましくは０℃から５０℃で、５分か
ら１０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させ
ることにより式（Ｘ４）の化合物を得ることができる。

【００３４】更に、Ｐ¹がベンジル基の場合、除去は水
素による加水素分解によっても行うことができる。

【００３５】次に、式（Ｘ４）の化合物に、有機溶媒
中、塩基の存在下、以下の式（Ｘ５）：

【化１０】 ［式（Ｘ５）中、Ｌ’は、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからな
るグループから選択されるハロゲン原子であり；Ｐ²は
カルボキシル基の保護基であり；そしてｎは先に定義し
た通りである。］で表される構造を有する化合物を反応
させて、以下の式（Ｘ６）：

【化１１】 ［式（Ｘ６）中、Ｌ、Ｐ²およびｎは、先に定義した通
りである］で表される化合物を合成する。

【００３６】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１５０℃で、３０分から３０時間、好ま
しくは５時間から１５時間行う。

【００３７】式（Ｘ６）の化合物の合成のための溶媒と
しては、例えば、メタノール、エタノール、ベンゼン、
トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、
四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、
ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニ
トリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド及び水等を用いることができる。塩基とし
ては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウ
ムエチラート等が挙げられる。

【００３８】次に、式（Ｘ６）の化合物を還元すること
により、以下の式（Ｘ７）：

【化１２】 ［式（Ｘ７）中、Ｌ、Ｐ²およびｎは、先に定義した通
りである］で表される化合物を合成する。

【００３９】還元反応は、公知の方法を用いて行うこと
ができる。例えば、メタノール、エタノール、ベンゼ
ン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、テトラヒ
ドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチ
ル、酢酸及び水等の溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、
水素化リチウムアルミニウム等の還元剤を用いて行う。
反応は、マイナス８０℃から溶媒の沸点の温度、好まし
くは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好ましくは
１時間から５時間撹拌して行う。

【００４０】最後に、式（Ｘ７）の化合物からカルボキ
シル基の保護基Ｐ²を除去することにより、式（１）の
化合物を得ることができる。

【００４１】カルボキシル基の除去は、式（Ｘ４）の化
合物の合成に関して記載した水酸化の保護基の除去と同
様に、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で
行うことができる。

【００４２】上述したような製造方法によって得られた
化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又
は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製
品とすることができる。

【００４３】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００４４】イナベンフィド誘導体と高分子化合物との
結合体の作製 上述のように合成されたイナベンフィド誘導体を適当な
高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用す
る。

【００４５】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。

【００４６】イナベンフィド誘導体と高分子化合物との
結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ
ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．4
2 301−309（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．
Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．234 1090‐1094（1954））等の公知の方法によ
って行うことができる。

【００４７】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ド活性化エステルを生成させる。

【００４８】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハ
プテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比
は好ましくは１：１０から１０：１、より好ましくは
１：１から１：１０、最も好ましくは１：１である。反
応温度は、０℃から１００℃、好ましくは５℃から５０
℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５
分から２４時間、好ましくは３０分から６時間、より好
ましくは１時間から４時間である。反応温度は各々の融
点以上沸点以下の温度で行うことができる。

【００４９】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反
応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６
時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物
を、透析、脱塩カラム等によって精製して、イナベンフ
ィド誘導体と高分子化合物との結合体を得ることができ
る。

【００５０】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、カルボン酸とハロゲン蟻酸エステルと
の反応により得られ、これを高分子化合物と反応させる
ことにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が
製造される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われ
る。塩基性化合物としては、例えば、トリブチルアミ
ン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチル
ホルマリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｄ
ＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナト
リウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マ
イナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃
において行われ、反応時間は５分から１０時間、好まし
くは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高
分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０
℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応
時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間で
ある。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒
としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶
媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチル
エーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等の
エーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロ
エタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエ
ン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸
エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリア
ミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸
無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとして
は、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロ
ロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチ
ル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻
酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から
適宜選択され得る。

【００５１】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をイナベンフィド誘導体に結合させたものを、
免疫学的測定方法において使用することができる。標識
物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「Ｈ
ＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、
フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物
質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが
ある。

【００５２】ポリクローナル抗体の作製 イナベンフィド誘導体と高分子化合物との結合体を使用
して、慣用化された方法により本発明のポリクローナル
抗体を作製することができる。例えば、イナベンフィド
誘導体−ＫＬＨ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以
下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジ
ュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン
等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に
免疫することによって得ることができる。免疫される動
物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用で
きるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ
等を挙げることができる。

【００５３】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００５４】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、イナベンフィドと反応するポリク
ローナル抗体の存在を評価することができる。

【００５５】本発明においてイナベンフィド誘導体と高
分子化合物との結合体を免疫用抗原として得られた抗血
清は、後述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、少
なくとも約１μｇ／ｍｌの濃度でイナベンフィドと反応
できる（実施例４、表１）。

【００５６】モノクローナル抗体の作製 イナベンフィド誘導体と高分子化合物との結合体を使用
して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を
作製することができる。

【００５７】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００５８】（ａ）免疫用抗原として使用するイナベン
フィド誘導体と高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００５９】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ），コールド スプリング ハーバー ラボラト
リーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，1980年版）、細胞組織化学（山下修二
ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、1986年）に記載
されている。

【００６０】以下、本発明のイナベンフィドに対するモ
ノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限
されないことは当業者によって明らかであろう。

【００６１】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００６２】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００６３】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ/ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１, １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）
（Ｎａｔｕｒｅ, ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５,
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５
３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来
の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）（Ｎ
ａｔｕｒｅ, ２７７，１３１−１３３,（１９７９））
等を使用できる。

【００６４】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日
に約１×１０⁶以上の細胞数を確保する。

【００６５】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ)らの方法（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９
８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的
に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細
胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別
の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法
を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学
５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜
採用することもできる。また、細胞の使用比率も公知の
方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細
胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００６６】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００６７】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、イナベンフィドに対する抗体活性を
測定する。

【００６８】さらに、測定によりイナベンフィドに反応
する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細
胞クローニングを行う。この細胞クローニング法として
は、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが
含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培
地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレー
ターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーター
によって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」
等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いら
れる。

【００６９】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗イナベンフィドモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温
器中）で培養するのが好ましい。

【００７０】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００７１】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗イナベンフィドモノクローナル抗体として使
用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムに
よる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集
め精製することにより抗イナベンフィドモノクローナル
抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合に
は、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせるこ
とにより実施できる。

【００７２】以上のようにして得られた抗イナベンフィ
ドモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法
などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を
決定することができる。

【００７３】抗体によるイナベンフィドの測定 本発明で使用する抗体によるイナベンフィドの測定法と
しては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬ
ＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８
０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般
に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラ
ニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００７４】イナベンフィドの測定は、各種ＥＬＩＳＡ
法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下
のような手順により行うことができる。

【００７５】（ａ）まず、抗原であるイナベンフィド誘
導体と高分子化合物との結合体を担体に固相化する。

【００７６】（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗
原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングす
る。

【００７７】（ｃ）これに各種濃度のイナベンフィドを
含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び
イナベンフィドに競合的に反応させて、固相化抗原−抗
体複合体及び、イナベンフィド−抗体複合体を生成させ
る。

【００７８】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のイナ
ベンフィドの量を決定することができる。

【００７９】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００８０】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、ダルベッコのリン酸緩衝液を挙げることができ
る。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ
が適している。また、担体として９６ウェルのマイクロ
タイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウ
ェル以下で５０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程
度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特
に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーショ
ンが適している。

【００８１】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したイナベンフィド誘導体と高分子化合物と
の結合体自体のみならず、式（１）で表される他の誘導
体と高分子化合物との結合体を用いることもできる。例
えば、式（１）で表されている化合物でＬまたはｎが相
違する抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いることも
できる。さらに、式（１）に含まれない他のイナベンフ
ィド類似化合物も、固相化抗原として使用することも可
能である。

【００８２】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（イナ
ベンフィド誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化
した担体において、イナベンフィド誘導体部分以外に後
で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があ
り、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング
剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用で
きる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃ
ｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−25Ｂ）等の
ブロッキング剤として市販されているものを使用するこ
ともできる。具体的には、限定されるわけではないが、
例えば抗原を固相化した部分に、ブロッキング剤を含む
緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭＮａＣｌを添加
した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加
え、約４℃、室温で、１時間から５時間インキュベーシ
ョンした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗
浄液としては特に制限はないが、例えば、ＰＢＳを用い
ることができる。

【００８３】次いで（ｃ）工程において、イナベンフィ
ドを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固
相化抗原及びイナベンフィドと反応させることにより、
固相化抗原−抗体複合体及びイナベンフィド−抗体複合
体が生成する。

【００８４】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のイナベンフィドに対する抗体を加え、更に第二
抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を
順次加えて反応させる。

【００８５】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固
相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液
としては、例えば、ＰＢＳを用いることができる。

【００８６】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当
である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終吸光
度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となるよう
に希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈に
は緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は
室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上
の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、
標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体
は不要である。

【００８７】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からイナベンフィド
の量を算出することができる。

【００８８】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はο
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加
えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する
方法が適している。

【００８９】イナベンフィドを添加しない反応溶液の吸
光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液
の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度
のイナベンフィドを添加した反応液の阻害率により予め
作成しておいた検量線を用いて、試料中のイナベンフィ
ドの濃度を算出できる。

【００９０】あるいはイナベンフィドの測定は、例えば
以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用い
た直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。

【００９１】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を、担体に固相化する。

【００９２】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキ
ングする。

【００９３】（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のイナ
ベンフィドを含む試料に、イナベンフィド誘導体と酵素
を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製す
る。

【００９４】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。

【００９５】（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合
体の量を測定することにより、あらかじめ作成した、検
量線から試料中のイナベンフィドの量を決定する。

【００９６】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００９７】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のイナベンフ
ィド並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無関
係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを
防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述
の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用でき
る。

【００９８】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、イナベンフィド誘導体を酵素に結合する方
法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよ
い。例えば、前述した活性化エステル法を採用すること
ができる。調製した酵素結合ハプテンは、イナベンフィ
ドを含む試料と混合する。

【００９９】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したイナベンフ
ィド誘導体自体のみならず、式（１）で表される他の誘
導体を用いることもできる。例えば、式（１）で表され
る化合物でＬまたはｎが相違する化合物を各々抗体作製
用と標識競合用として用いることもできる。さらに、式
（１）に含まれない他のイナベンフィド類似化合物も、
酵素に結合させるハプテンとして使用可能である。

【０１００】（ｄ）工程においてイナベンフィドを含む
試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、イナベンフィドと酵素結合ハプテンとの競合阻害反
応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。
イナベンフィドを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使
用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室
温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗
浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを
除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用することがで
きる。

【０１０１】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からイナベンフィドの量を算出することがで
きる。

【０１０２】本発明のモノクローナル抗体２８Ｂ１３−
１−１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約０．０
１ｎｇ／ｍｌないし１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは
０．１ｎｇ／ｍｌないし１００ｎｇ／ｍｌ、より好まし
くは、０．１ｎｇ／ｍｌないし１０ｎｇ／ｍｌの範囲で
イナベンフィドを測定できる（実施例７、図１）。

【０１０３】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差
反応性を調べることができる。

【０１０４】例えば、２８Ｂ１３−１−１は上述した間
接競合ＥＬＩＳＡ法においてイナベンフィドに高い特異
性を示し、類縁化合物には低い反応性をしか示さない
（実施例７、表２）。

【０１０５】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【０１０６】

【実施例】実施例１ イナベンフィド誘導体の合成

【化１３】

【０１０７】４−アセトキシ−４’−クロロ−２’−ベ
ンゾイルベンズアニリド（１）の合成 ４−アセトキシ安息香酸１.８ｇ（１０ｍｍｏｌ）に塩
化チオニル３.６ｇ（３０ｍｍｏｌ）を加え、１時間環
流後、濃縮した。残渣を５０ｍｌのトルエンに溶かした
溶液を、２−アミノ−５−クロロベンゾフェノン２.３
ｇ（１０ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム１．０ｇ（１
２ｍｍｏｌ）をトルエン５０ｍｌ懸濁液に撹拌下、室温
で加えた。この混合物を１００℃で１時間撹拌後、更に
トルエン１００ｍｌと水５０ｍｌを加えた。トルエン層
を水、５％苛性ソーダ水溶液、水、５Ｎ塩酸、水の順に
洗い、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣
の結晶をエタノールから再結晶化させ、３.２ｇ（収率
８１％）の（１）を得た。 融点１２５−１２７℃

【０１０８】２’−ベンゾイル−４’−クロロ−４−ヒ
ドロキシベンズアニリド（２）の合成 エタノール１００ｍｌ中に４−アセトキシ−４’−クロ
ロ−２’−ベンゾイルベンズアニリド（１）３.０ｇ
（７．６ｍｍｏｌ）を含む懸濁液に、水２５ｍｌに溶解
した水酸化ナトリウム１.５ｇ（３８ｍｍｏｌ）を加
え、室温下で１時間撹拌した。減圧下にエタノールを留
去し、残渣に水３０ｍｌとエーテル３０ｍｌを加え、分
配後、水層を希塩酸で酸性にし、酢酸エチルで抽出し
た。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾
燥後、濃縮した。残渣の結晶を酢酸エチルとヘキサンの
混合溶媒（酢酸エチル：ヘキサン=１：１）から再結晶
化させ、２.２ｇ（収率８１％）の（２）を得た。 融点１９２−１９３℃

【０１０９】６−［４−（２−ベンゾイル−４−クロロ
アニリノカルボニル）フェノキシ］ヘキサン酸エチル
（３）の合成 エタノール２０ｍｌに２’−ベンゾイル−４’−クロロ
−４−ヒドロキシベンズアニリド（２）２.０ｇ（５．
７ｍｍｏｌ）、６−ブロモヘキサン酸エチル１.４ｇ
（６．３ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム０.９４ｇ
（６．８ｍｍｏｌ）を加え、１２時間撹拌、環流させ
た。反応混合物を濃縮後、酢酸エチルで抽出した。酢酸
エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃
縮した。残渣をカラムクロマログラフィー（ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル ＝２：１）で精製し、１.８ｇ（収率６
４％）の（３）を得た。 融点１１０−１１４℃

【０１１０】６−［４−（４−クロロ−２−（α−ヒド
ロキシベンジル）アニリノカルボニル）フェノキシ］ヘ
キサン酸エチル（４）の合成 メタノール７０ｍｌ中に６−［４−（２−ベンゾイル−
４−クロロアニリノカルボニル）フェノキシ］ヘキサン
酸エチル（３）１.６ｇ（３．２ｍｍｏｌ）を含む懸濁
液に水素化ホウ素ナトリウム０.１３ｇ（３．２ｍｍｏ
ｌ）を室温下に加え、室温で２時間撹拌後、濃縮した。
残渣に５Ｎ塩酸１０ｍｌを加え、酢酸エチルで抽出し
た。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾
燥後、濃縮した。残渣をカラムクロマログラフィー（ｎ
−ヘキサン：酢酸エチル ＝２：１）で精製し、１.０ｇ
（収率６３％）の（４）を得た。 融点９３−９６℃

【０１１１】６−［４−（４−クロロ−２−（α−ヒド
ロキシベンジル）アニリノカルボニル）フェノキシ］ヘ
キサン酸（５）の合成 エタノール１５ｍｌ中に６−［４−（４−クロロ−２−
（α−ヒドロキシベンジル）アニリノカルボニル）フェ
ノキシ］ヘキサン酸エチル（４）０.９０ｇ（１.８ｍｍ
ｏｌ）を含む懸濁液に、水５ｍｌに溶解した水酸化ナト
リウム０.７ｇ（１８ｍｍｏｌ）を加え、室温下で１時
間撹拌した。減圧下にエタノールを留去し、残渣に水３
０ｍｌとエーテル３０ｍｌを加え、分配後、水層を希塩
酸で酸性にし、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を
水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残
渣の結晶をエタノールから再結晶化させ、０.３４ｇ
（収率４０％）の（５）を得た。 融点１５３−１５５℃

【０１１２】上記イナベンフィド誘導体（５）の¹Ｈ−
ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）を以下に
示す。

【０１１３】¹ Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ）δ １．４３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， １．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， １．７４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， ２．２４（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂）， ３．４３（１Ｈ，ｍ，ＣＨ）， ４．０５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂）， ６．０１（１Ｈ，ｓ，ＯＨ）， ７．０５（２Ｈ，ｄ，２Ａｒ：Ｈ）， ７．２６（５Ｈ，ｍ，５Ａｒ：Ｈ）， ７．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ：Ｈ）， ７．５０（１Ｈ，ｄ， Ａｒ：Ｈ）， ７．７７（２Ｈ，ｄ，２Ａｒ：Ｈ）， ７．９２（１Ｈ，ｄ， Ａｒ：Ｈ），１０．１６（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）， １２．０ （１Ｈ，ｂｒ，ＣＯＯＨ）

【０１１４】実施例２ 免疫用抗原およびスクリーニン
グ用抗原の作製 免疫原およびスクリーニング用抗原としてイナベンフィ
ド誘導体とＢＳＡとの結合体を活性化エステル法を用い
て作製した。

【０１１５】実施例１で作製したイナベンフィド誘導体
０.２ｍｍｏｌをＤＭＳＯ１.０ｍＬに溶解し、Ｎ-ヒド
ロキシこはく酸イミド０.３ｍｍｏｌ及び１-エチル-３-
(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド０.３ｍｍ
ｏｌを加え、室温で３.５時間撹拌した。反応後、１０
０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清と沈殿に分離し
た。

【０１１６】一方、ＢＳＡ ５０ｍｇを１４５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ-０.０１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２）（以下「ＰＢ
Ｓ」と言う)５.０ｍＬに溶解し、ＤＭＳＯ １.０５ｍＬ
を加えた溶液を調製しておいた。当該溶液に上記の上清
０.２５ｍＬを加え、室温にて１６時間反応させた。反
応後、蒸留水にて４℃で透析し、イナベンフィド誘導体
とＢＳＡとの結合体（以下、「イナベンフィド誘導体−
ＢＳＡ結合体」と言う）を調製した。

【０１１７】また、同様の方法を用いて、イナベンフィ
ド誘導体とＲＳＡとの結合体（以下、「イナベンフィド
誘導体−ＲＳＡ結合体」と言う）、およびイナベンフィ
ド誘導体とＨＲＰとの結合体（以下、「イナベンフィド
誘導体−ＨＲＰ結合体」と言う）も調製した。

【０１１８】実施例３ 免疫感作 免疫にはＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で調製
したイナベンフィド誘導体−ＢＳＡ結合体１００μｇを
ＰＢＳ ５０μＬに溶解し、等量のフロイント完全アジ
ュバンドと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に接種
した。さらに、４週間後にフロイント不完全アジュバン
ドを用いて前記と同様に調製したイナベンフィド誘導体
−ＢＳＡ結合体を追加免疫した。また、６週間目に１８
０μＬのＰＢＳに溶解したイナベンフィド誘導体−ＢＳ
Ａ結合体３０μｇをマウス尾静脈より追加免疫した。

【０１１９】実施例４ 抗血清によるイナベンフィドの
反応性 実施例３におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した
抗血清を希釈調製して、以下に詳述するようにイナベン
フィド誘導体−ＲＳＡを用いたＥＬＩＳＡ法に用いてイ
ナベンフィドを測定し、抗血清を評価した。

【０１２０】実施例３で調製したイナベンフィド誘導体
−ＲＳＡ結合体溶液(０.５μｇ／ｍＬ)を５０μＬ／ウ
ェルの量で９６ウェルマイクロプレートにコーティング
し(２５ｎｇ /５０μｌ/ウェル)、４倍希釈したブロッ
クエース (「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コ
ードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ)でブロッキングしてアッセイ用
プレートを作製した。これに抗血清１００００倍希釈液
と、各種濃度のイナベンフィドを含む２０％メタノール
溶液とを等量混合し、その５０μＬを各ウェルに入れ、
室温で１時間反応させた。

【０１２１】ＰＢＳで５回洗浄した後に、１０倍希釈の
ブロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキ
シダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体 (Ｔａｇｏ社製)
を５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応さ
せた。ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰ
Ｄ及び０.０２％の過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸−
リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬ／ウェルの量で加
え、室温にて１０分間反応させて発色させた。

【０１２２】次に、１Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェルの量で
加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
結果の一例を表１に示す。

【０１２３】

【表１】

【０１２４】表１より、イナベンフィド１０００ｎｇ／
ｍＬにおいて阻害反応が認められたことから、用いた抗
血清はイナベンフィドに対して反応性があることが確認
された。

【０１２５】実施例５ ハイブリドーマの作製 実施例３に続いて、血清中の抗イナベンフィド抗体活性
が高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞(Ｓｐ
２/０−Ａｇ１４)とを山下修二らの方法(組織細胞化
学：日本組織細胞化学会編：学際企画．１９８６年)に
従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養し
た。実施例４と同様の方法でコーティング及びブロッキ
ングしたプレートに細胞の増殖が認められた培養上清液
をそれぞれ５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時
間反応させた。

【０１２６】ＰＢＳで５回洗浄した後、１０倍希釈のブ
ロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシ
ダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体(Ｔａｇｏ社製)を５
０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させ
た。ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ
及び０.０２％の過酸化水素を含む０.１Ｍ クエン酸−
リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬ／ウェルの量で加
え、室温にて１０分間発色させた。

【０１２７】次に、１Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェルの量で
加えて、反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し、
反応性を示す細胞(ハイブリドーマ)を選抜した。次に、
各ウェルのイナベンフィドとの反応性を実施例４に記載
した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で調べ、目的の抗体を産
生している細胞について限界希釈法によりクローニング
を行った。その結果、数株のハイブリドーマが抗イナベ
ンフィド抗体を産生する細胞としてクローン化された。
そのうちの２８Ｂ１３−１−１を平成１０年１０月１５
日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７０２３で、工業技術
院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６ 茨城
県つくば市１丁目１番３号）に寄託した。

【０１２８】実施例６ モノクローナル抗体の交差反応
性の評価 実施例５で得られたハイブリドーマ細胞２８Ｂ１３−１
−１が産生するモノクローナル抗体を精製し、抗イナベ
ンフィド抗体２８Ｂ１３−１−１を得た（以降、モノク
ローナル抗体は、これらを産生するハイブリドーマと同
一の名称を用いる）。

【０１２９】モノクローナル抗体２８Ｂ１３−１−１に
ついて、実施例４に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法
を用いて、３種類のイナベンフィド類縁化合物に対する
反応性を検討した。この結果を表２に示す。

【０１３０】

【表２】

【０１３１】ここで、ＩＣ₅₀（ｎｍｏｌ/Ｌ）は、イナ
ベンフィド等の化合物を添加しない反応溶液の吸光度に
対して吸光度を５０％減少させる反応溶液中の対象化合
物の濃度を示す。また、交差反応率（％）は、（イナベ
ンフィドのＩＣ₅₀／対象化合物のＩＣ₅₀）×１００で定
義される。イナベンフィドと類縁化合物の交差反応率の
数値が乖離している程、即ち、交差反応率の数値が低い
程、イナベンフィドと特異的に反応する抗体である。

【０１３２】表２に示したように、モノクローナル抗体
２８Ｂ１３−１−１はイナベンフィドに対しては高い反
応性を示したが、類縁化合物に対しては、低い反応性し
か示さなかった。

【０１３３】実施例７ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
るイナベンフィドの測定 実施例５で得られたハイブリドーマ２８Ｂ１３−１−１
をマウスの腹腔に移植し、１０日ないし１５日後に得ら
れた腹水を採取し、アフィニティークロマトグラフィー
によりモノクローナル抗体２８Ｂ１３−１−１を精製し
た。この２８Ｂ１３−１−１抗体を用いて直接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法にてイナベンフィドの量を測定した。

【０１３４】上記の２８Ｂ１３−１−１抗体溶液(１０
μｇ／ｍＬ)を５０μＬ／ウェルの量で９６ウェルマイ
クロプレートに入れ、４℃で一晩静置してコーティング
し、さらに４倍希釈のブロックエース(雪印乳業社製)で
ブロッキングを行い、アッセイ用のプレートを作製し
た。各濃度のイナベンフィドを含む２０％メタノール溶
液及び実施例２で作製したＨＲＰ結合イナベンフィド誘
導体を含むＰＢＳ溶液の等量混合液を５０μＬずつ各ウ
ェルに入れ、２５℃で１.５時間反応させた。

【０１３５】反応後、ＰＢＳで５回洗浄した後、２ｍｇ
／ｍＬのＯＰＤ及び０.０２%の過酸化水素を含むクエン
酸−リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬずつ各ウェル
に入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行った。

【０１３６】次に、１Ｎ硫酸を５０μＬずつ各ウェルに
加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定
した。この結果を図１に示した。この直接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法を用いると、本発明のモノクローナル抗体２８
Ｂ１３−１−１は、イナベンフィドを０.１ｎｇ/ｍＬな
いし１００ｎｇ/ｍＬの範囲で測定することができた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体２８Ｂ１
３−１−１の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイナベン
フィドの測定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/00 Ｃ 33/577 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 渡邊 繁幸 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 面田 内記 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 鎌田 良雄 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA07 AA11 BA53 BA61 GA03 HA15 4B064 AG26 AG27 CA10 CA20 CC24 DA10 DA11 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 CA24 CA25 CA41 CA46 CA47 4C055 AA01 BA01 CA01 DA18 4H006 AA01 AB20 BJ50 BM30 BM71 BM72 BM73 BM74 BN10 BP30 BS10 BV74

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、 Ｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなるグループから
   選択されるハロゲン原子であり；ｎは、１ないし１０の
   整数である］で表される構造を有する化合物。
2. 【請求項２】ＬがＣｌであり、ｎが５である、請求項１
   に記載の化合物。
3. 【請求項３】請求項１又は２に記載された化合物と高分
   子化合物又は標識物質との結合体。
4. 【請求項４】請求項１又は２に記載の化合物と高分子化
   合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を
   用いることにより、以下の式（２）： 【化２】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（２）で表される構造を有
   する化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの
   製造方法。
5. 【請求項５】請求項３に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】モノクローナル抗体である、請求項５に記
   載の抗体又はフラグメント。
7. 【請求項７】モノクローナル抗体２８Ｂ１３−１−１で
   ある、請求項５又は６に記載の抗体又はフラグメント。
8. 【請求項８】請求項５ないし７のいずれか１項に記載の
   抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。
9. 【請求項９】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７０２３で寄託
   されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】請求項５ないし７のいずれか１項に記載
    の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
    （２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
11. 【請求項１１】さらに、請求項１もしくは２に記載の化
    合物又は請求項３に記載の結合体を用いることを含む、
    請求項１０に記載の免疫学的測定方法。