JP2001039953A - ピリミノバックメチルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ピリミノバックメチル類縁化合物
のハプテン化合物、抗体及び測定方法を提供することを
目的とする。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、ピリミノバ
ックメチル類縁化合物又はその部分にスペーサーアーム
及び結合のための官能基を共有結合させた構造を有す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、メチル＝２−
（４，６−ジメトキシピリミジン−２−イルオキシ）−
６−（１−メトキシイミノエチル）ベンゾエート（以
下、本明細書中「ピリミノバックメチル」と言う）のハ
プテン化合物、抗原、抗体及びそのフラグメントに関す
る。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】ピリミノバックメチルは、以下の式
（３）：

【０００４】

【化３】

【０００５】で表される構造を有するピリミジニルカル
ボキシ系除草剤である。より詳細には、ピリミノバック
メチルは水稲用除草剤として開発された化合物で、ノビ
エにのみ除草効果を有し、低薬量で発生期ないし３葉期
までの処理適期を有する。ノビエ以外の雑草に有効な他
の除草剤と混合して用いられる。作用機構としては、雑
草の根や茎から吸収され、植物中のアセト乳酸合成酵素
（ＡＬＳ）の活性を阻害することにより、ロイシン、バ
リン、イソロイシンなどの分岐アミノ酸の生合成を阻害
し、植物の生育を抑制する。低薬量で高い除草活性を示
し、また、環境に対しても低毒性で影響が少ないという
優れた特性を具備している（農薬ハンドブック 第４２
４頁及び第７２４頁 １９９８年版 （社）日本植物防
疫協会）。

【０００６】さらに、ピリミノバックメチルと同様のピ
リミジニルカルボキシ系のアセト乳酸合成酵素阻害剤と
してピリチオバックがある。より詳細には、ピリチオバ
ックは以下の式（４）：

【０００７】

【化４】

【０００８】で表される構造を有する化合物であり、ワ
タ用の除草剤として開発された。ナトリウム塩として用
いられ、低薬量で出芽前土壌処理から生育期茎葉処理ま
での広い処理適期幅と高い除草効果を示す。特に近年ワ
タ栽培において問題となっているアサガオ類、オナモ
ミ、アオビユ等の広葉雑草に卓効を示す（新農薬の開発
展望 第１４６頁及び第１５８−第１６１頁、１９９７
年１１月２８日 （株）シーエムシー 発行）。

【０００９】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。ピリミノバックメチルについては、環境庁長官個別
設定の基準値が米で０．１ｐｐｍ等定められている。さ
らに水質に関しても、水質汚濁に係る登録保留基準値が
０．２ｍｇ／ｌと定められている（改訂３版 農薬登録
保留基準ハンドブック第６４５頁−第６４７頁、１９９
８年９月２５日、化学工業日報社 発行）。よって、環
境や食品に関する安全確保のためには、これらに含有さ
れる、ピリミノバックメチルの量を迅速かつ正確に測定
することが必要である。

【００１０】従来、例えば農作物中のピリミノバックメ
チルは米等から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラ
フィー（ＧＣ）により分析されてきた。即ち、例えば、
試料をアセトニトリルで抽出し、ヘキサンに転溶した
後、ヘキサン−酢酸エチルを溶媒として用いたシリカゲ
ルミニカラムクロマトグラフィーで精製後、ＧＣで測定
する方法等が採用されている。これらの方法は、試料の
調製が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練
を要すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用
を必要とする等の問題点がある。ピリミノバックメチル
の測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要
があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性
をも具備した新規測定方法が要求されてきている。

【００１１】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を
行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経
済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法
においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、
酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、
金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが
適用されてきた。

【００１２】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載され
ている。

【００１３】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、ピリミノバックメチルのよ
うな低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を
引き出すことができない。これらの分子は免疫原性を有
する高分子化合物（タンパク質や多糖類など）に結合さ
せることによって初めて一団のエピトープとして行動
し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結
果、一群のＢリンパ球により抗体が産生される。このよ
うに高分子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる
分子を総称して「ハプテン」と言う。

【００１４】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１５】ピリミノバックメチルについては、その必
要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はも
とより、そのような抗体を作製するためのハプテンも本
発明前には得られていなかった。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ピリミノバ
ックメチル及びその類縁化合物（以下、文脈により「ピ
リミノバックメチル類縁化合物」あるいは単に「ピリミ
ノバックメチル」という）に反応する新規な抗体若しく
はそのフラグメント、及びその作製方法を提供すること
を目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメ
ント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ
_ab断片等を意味する。

【００１７】本発明はその一態様において、ピリミノバ
ックメチル類縁化合物に反応性を有するモノクローナル
抗体を提供する。本発明は、また、ピリミノバックメチ
ル類縁化合物に反応性を有する新規な抗体を作製するた
めの抗原を構成するハプテン化合物（ピリミノバックメ
チルハプテン）を提供することを目的とする。

【００１８】本発明は、さらに、ピリミノバックメチル
ハプテンと高分子化合物との結合体を提供することを目
的とする。本発明は、さらにまた、前記抗体又はそのフ
ラグメントを産生するハイブリドーマを提供することを
目的とする。

【００１９】本発明は、さらに、前記抗体若しくはその
フラグメント及び／又は前記ピリミノバックメチルハプ
テンと高分子化合物若しくは標識物質との結合体を使用
することを含む、ピリミノバックメチル類縁化合物の免
疫学的測定方法を提供することを目的とする。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ピリミノバックメチル類縁化合物又はそ
の部分にスペーサーアーム及び高分子化合物との結合に
利用できる官能基を導入した、ピリミノバックメチルの
誘導体をハプテンとして使用することにより、前記化合
物に反応性を有する抗体を得ることに成功し、本発明の
完成に至った。

【００２１】本発明の対象となるピリミノバックメチル
類縁化合物は、以下の式（２）：

【００２２】

【化５】

【００２３】［式（２）中、Ｒ¹は、Ｃｌ又はＣＣＨ₃＝
Ｎ−ＯＣＨ₃であり；Ｒ²は、Ｈ、メチル基又はナトリウ
ムであり；Ｒ³は、枝分かれしていてもよい炭素数１な
いし３のアルキル基又はアルコキシ基であり；そしてＡ
は、酸素原子又は硫黄原子である］で表される構造を有
する化合物である。

【００２４】本発明はその一態様として、特に、以下の
式（３）：

【００２５】

【化６】

【００２６】で表される構造を有するピリミノバックメ
チルを対象とする。本発明は、また、その一態様とし
て、以下の式（４）：

【００２７】

【化７】

【００２８】で表される構造を有するピリチオバックを
対象とする。本発明の抗体は、例えば、ピリミノバック
メチル類縁化合物の部分にスペーサーアーム及び結合に
利用できる官能基を導入した誘導体をハプテンとして適
当な高分子化合物と結合させたものを抗原として用いる
ことによって得ることができる。例えば、以下の式
（１）：

【００２９】

【化８】

【００３０】［式（１）中、Ｒ¹は、Ｃｌ又はＣＣＨ₃＝
Ｎ−ＯＣＨ₃であり；Ｒ²は、Ｈ、メチル基又はナトリウ
ムであり；Ｒ³は、枝分かれしていてもよい炭素数１な
いし３のアルキル基又はアルコキシ基であり；Ａは、酸
素原子又は硫黄原子であり；そしてｎは、１ないし１０
の整数である］で表される構造を有する化合物を、抗体
作製のためのハプテンとして使用する。

【００３１】式（１）中、好ましくは、Ｒ¹がＣＣＨ₃＝
Ｎ−ＯＣＨ₃であり、Ｒ²がメチル基であり、Ｒ³がメト
キシ基であり、そしてＡが酸素原子である。好ましく
は、ｎは５である。

【００３２】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、ピリミノバックメチ
ル類縁化合物に反応する抗体及びその作製方法、並びに
該ハプテン化合物又は該抗体を用いるピリミノバックメ
チル類縁化合物の免疫学的測定方法に関する。ピリミノバックメチルハプテンの作製 式（１）で表されるピリミノバックメチルハプテンは、
公知の方法に従って製造することができる。限定するわ
けではないが、例えば以下のような方法を用いることが
できる。

【００３３】まず、以下の式（Ｚ１）：

【００３４】

【化９】

【００３５】［式（Ｚ１）中、Ｒ³は先に定義した通り
である］で表される構造を有する化合物に、有機溶媒
中、縮合剤の存在下、以下の式（Ｚ２）：

【００３６】

【化１０】

【００３７】［式（Ｚ２）中、Ｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又
はＩから選択されるハロゲン原子であり；Ｐは、カルボ
キシル基の保護基であり；そしてｎは、先に定義した通
りである］で表される構造を有する化合物を反応させ
て、以下の式（Ｚ３）：

【００３８】

【化１１】

【００３９】［式（Ｚ３）中、Ｒ³、Ｐ及びｎは先に定
義した通りである］で表される構造を有する化合物を合
成する。カルボキシル基の保護基Ｐは公知のものでよ
く、具体例として、例えば、メチル基、エチル基、ｔｅ
ｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル
基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチル
基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシ
リル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエ
チルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチル
シリルエチル基等を挙げることができる。

【００４０】式（Ｚ３）の化合物合成のための有機溶媒
としては、例えば、Ｎ．Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロホル
ム、四塩化炭素、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ア
セトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド等を用
いることができる。縮合剤としては、水素化ナトリウ
ム、ナトリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエ
チラート等を用いることができる。

【００４１】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは８０℃から１５０℃で、１０分から１５時間、好
ましくは、１時間から５時間行う。次に、式（Ｚ３）の
化合物を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸、蟻
酸、アセトン、アセトニトリル、ベンゼン、クロロホル
ム等の有機溶媒中、クロロ過安息香酸（ＣＰＢＡ）、ｍ
−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）、過酸化水素、過酢
酸、過ヨウ素酸ナトリウム等の酸化剤を用いて、メチル
チオ基の硫黄原子を酸化し、以下の式（Ｚ４）：

【００４２】

【化１２】

【００４３】［式（Ｚ４）中、Ｒ³、Ｐ及びｎは先に定
義した通りである］で表される構造を有する化合物を得
る。酸化反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましく
は室温から１００℃で、３０分から１０時間、好ましく
は１時間から３時間行う。

【００４４】次いで、（Ｚ４）の化合物に以下の式（Ｚ
５）：

【００４５】

【化１３】

【００４６】［式（Ｚ５）中、Ｒ¹、Ｒ²及びＡは先に定
義した通りである］で表される化合物を、塩基の存在下
で反応させて、以下の式（Ｚ６）：

【００４７】

【化１４】

【００４８】［式（Ｚ６）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ、Ｐ
及びｎは先に定義した通りである］で表される構造を有
する化合物を得る。式（Ｚ６）の化合物合成のための有
機溶媒としては、例えば、Ｎ．Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロ
ホルム、四塩化炭素、テトラヒドロフラン、ジオキサ
ン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド
等を用いることができる。塩基としては、炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等を
が挙げられる。

【００４９】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１５０℃で、５分から１０時間、好まし
くは３０分から２時間行う。最後に、式（Ｚ６）の化合
物からＰで表されるカルボキシル基の保護基を除去する
ことにより、式（１）の化合物が得られる。

【００５０】カルボキシル基の保護基Ｐの除去は、アル
カリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことが
できる。すなわち、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｚ
６）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノール、
テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機溶媒
に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム
又は水酸化カリウム等の水溶液を加えて、０℃から溶媒
の沸点、好ましくは１０℃から５０℃で、５分から１０
時間、好ましくは３０分から３時間撹拌反応させること
により式（１）の化合物を得ることができる。

【００５１】また、酸加水分解の場合は、式（Ｚ６）の
化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロ
メタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解
し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテ
ル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホ
ン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶
媒の沸点、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０
時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させること
により式（１）の化合物を得ることができる。

【００５２】更に、Ｐがベンジル基の場合、除去は水素
による加水素分解によっても行うことができる。更にま
た、Ｐがシリル原子を含む基の場合、脱保護はテトラ−
ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフル
オリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬によっても
行うことができる。上述したような製造方法によって得
られた化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフ
ィー又は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度
の精製品とすることができる。

【００５３】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。ピリミノバックメチルハプテンと高分子化合物との結合
体の作製 上述のように合成されたピリミノバックメチルハプテン
を適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原若し
くは固相化用抗原として使用する。

【００５４】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及
びＢＳＡが好ましい。

【００５５】ピリミノバックメチルハプテンと高分子化
合物との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．
ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ
Ｃｈｅｍ．４２ ３０１−３０９（１９９４））、又は
混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４ １０９０‐１
０９４（１９５４））等の公知の方法によって行うこと
ができる。

【００５６】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ド活性化エステルを生成させる。

【００５７】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」と言う）、ジオキサン等が使用できる。
反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、
より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは
１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好まし
くは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃
で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分か
ら６時間、より好ましくは１時間から２時間である。

【００５８】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、反応時間は５分から２４時間、好ましく
は１時間から１６時間である。反応物を、透析、脱塩カ
ラム等によって精製して、ピリミノバックメチルハプテ
ンと高分子化合物との結合体を得ることができる。

【００５９】一方、混合酸無水物法において用いられる
酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反応に
より得られ、これを高分子化合物と反応させることによ
り目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造され
る。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基
性化合物としては、例えば、トリブチルアミン、トリエ
チルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリ
ン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、Ｄ
ＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナ
トリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の
無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０
℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において
行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分
から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化合
物との反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好ま
しくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分
から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合
酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、
混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可
能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテル、
テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル
類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等
のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレ
ン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等の
エステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プ
ロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法にお
いて使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロ
ロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、
ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられ
る。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高
分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得
る。

【００６０】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をピリミノバックメチルハプテンに結合させた
ものを、免疫学的測定方法において使用することができ
る。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ
（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ
等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン
等の蛍光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光
物質などがある。ポリクローナル抗体の作製 ピリミノバックメチルハプテンと高分子化合物との結合
体を使用して、常法により本発明のポリクローナル抗体
を作製することができる。例えば、ピリミノバックメチ
ルハプテンとＫＬＨとの結合体をリン酸ナトリウム緩衝
液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完
全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョ
ウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として
動物に免疫することによって得ることができる。免疫さ
れる動物としては当該分野で常用されるものをいずれも
使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤ
ギ、ウマ等を挙げることができる。

【００６１】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００６２】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、ピリミノバックメチルと反応する
ポリクローナル抗体の存在を評価することができる。本
発明においてピリミノバックメチルハプテンと高分子化
合物との結合体を免疫用抗原として得られた抗血清は、
後述する間接競合ＥＬＩＳＡ法において少なくとも約
０．１μｇ／ｍｌの濃度でピリミノバックメチルＥ体
と、そして約１μｇ／ｍｌの濃度でピリミノバックメチ
ルＺ体と反応できる（実施例４、図１）。 モノクローナル抗体の作製 ピリミノバックメチルハプテンと高分子化合物との結合
体を使用して、公知の方法により本発明のモノクローナ
ル抗体を作製することができる。

【００６３】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するピリミノバックメチル
ハプテンと高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日
本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載さ
れている。

【００６４】以下、本発明のピリミノバックメチル類縁
化合物に対するモノクローナル抗体の作製方法を説明す
るが、これに制限されないことは当業者によって明らか
であろう。

【００６５】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。（ｃ）の工程における抗体産生細胞は
リンパ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ
節、末梢血液又はこれらの組み合わせから得ることがで
きるが脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終
免疫後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞
が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製す
る。

【００６６】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１， １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６
５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由
来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７７，１３１−１３３，（１９７
９））等を使用できる。

【００６７】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を
含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイス
コフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融
合当日に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００６８】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３
（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も
一般的に行われているのはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例え
ば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されてい
る。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）によ
る方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医
学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を
適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公
知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して
脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００６９】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００７０】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、ピリミノバックメチルに対する抗体
活性を測定する。

【００７１】さらに、測定によりピリミノバックメチル
に反応する抗体を産生することが判明したハイブリドー
マの細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法
としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリド
ーマが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟
寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピ
ュレーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソ
ーターによって１個の細胞を分離する「ソータークロー
ン法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく
用いられる。

【００７２】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗ピリミノバックメ
チルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選
択する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例え
ば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤ
Ｍ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二
酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の
恒温器中）で培養するのが好ましい。

【００７３】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００７４】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗ピリミノバックメチルモノクローナル抗体と
して使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニ
ウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画
分を集め精製することにより抗ピリミノバックメチルモ
ノクローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が
必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法
を組合わせることにより実施できる。

【００７５】以上のようにして得られた抗ピリミノバッ
クメチルモノクローナル抗体は、例えばＥＬＩＳＡ法な
どの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決
定することができる。抗体によるピリミノバックメチル類縁化合物の測定 本発明で使用する抗体によるピリミノバックメチル類縁
化合物の測定法としては、放射性同位元素免疫測定法
（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１
９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、
スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌ
ｏｎｙ）等の一般に抗原の検出に使用されている種々の
方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株
式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭
和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観
点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。

【００７６】ピリミノバックメチル類縁化合物の測定
は、各種ＥＬＩＳＡ法のうち例えば間接競合ＥＬＩＳＡ
法により、以下のような手順により行うことができる。 （ａ）まず、固相化用抗原であるピリミノバックメチル
ハプテンと高分子化合物との結合体を担体に固相化す
る。

【００７７】（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相
表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質によりブ
ロッキングする。 （ｃ）これに各種濃度のピリミノバックメチルを含む試
料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びピリミ
ノバックメチルに競合的に反応させて、固相化抗原−抗
体複合体及び、ピリミノバックメチル−抗体複合体を生
成させる。

【００７８】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のピリ
ミノバックメチルの量を決定することができる。 （ａ）工程において、固相化用抗原を固相化する担体と
しては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用
されるものをいずれも使用することができる。例えば、
ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレー
トが挙げられる。

【００７９】固相化用抗原を担体に固相化させるには、
例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、イ
ンキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも
のが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることがで
きる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが
適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタ
イタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェ
ル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度
が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に
制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーション
が適している。

【００８０】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したピリミノバックメチルハプテンと高分子
化合物との結合体自体のみならず、式（１）で表される
他のハプテンと高分子化合物との結合体を固相化抗原と
して使用することも可能である。例えば、式（１）にお
いてＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ又はｎが抗体作製用と相違する
化合物を、固相化抗原として使用することもできる。さ
らに、式（１）に含まれない他のピリミノバックメチル
類似化合物を固相化抗原として使用することも可能であ
る。

【００８１】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（ピリ
ミノバックメチルハプテンと高分子化合物との結合体）
を固相化した担体において、ピリミノバックメチルハプ
テン部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が
存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われ
る。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミ
ルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース
（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮ
ｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販され
ているものを使用することもできる。具体的には、限定
されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に
ブロッキング剤を含む緩衝液（例えば、１％ＢＳＡを含
むＰＢＳ溶液）を適量加え、約４℃で一晩インキュベー
ションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。
洗浄液としては特に制限はないが、例えば、１５０ｍＭ
ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液を用いる
ことができる。

【００８２】次いで（ｃ）工程において、ピリミノバッ
クメチルを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗
体を固相化抗原及びピリミノバックメチルと反応させる
ことにより、固相化抗原−抗体複合体及びピリミノバッ
クメチル−抗体複合体が生成する。

【００８３】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のピリミノバックメチルに対する抗体を加え、更
に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する
抗体を順次加えて反応させる。

【００８４】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、
好ましくは約２５℃から約３７℃で約１時間行えばよ
い。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に
結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液としては、
例えば、１５０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ ホ
ウ酸緩衝液を用いることができる。

【００８５】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合したマウス抗体に対する抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に約５００倍から
１００００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好
ましくは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体
を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。
限定されるわけではないが、反応は室温で約１時間行
い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第
二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体
を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。

【００８６】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からピリミノバック
メチルの量を算出することができる。

【００８７】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨ溶液
を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定
する方法が適している。

【００８８】ピリミノバックメチルを添加しない反応溶
液の吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させ
た溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知
の濃度のピリミノバックメチルを添加した反応液の阻害
率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中の
ピリミノバックメチルの濃度を算出できる。

【００８９】あるいはピリミノバックメチルの測定は、
例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体
を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。 （ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固
相化する。

【００９０】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質により、ブロ
ッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のピリミノバックメ
チルを含む試料に、ピリミノバックメチルハプテンと酵
素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製
する。

【００９１】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のピリミノバックメチルの量を決定する。

【００９２】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００９３】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のピリミノバ
ックメチル並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応と
は無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、
それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法
は、前述の間接競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用で
きる。

【００９４】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、ピリミノバックメチルハプテンを酵素に結
合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行っ
てもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用す
ることができる。調製した酵素結合ハプテンは、ピリミ
ノバックメチルを含む試料と混合する。

【００９５】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合ＥＬＩＳＡ法における固相化抗
原の場合と同様に、抗体作製に使用したピリミノバック
メチルハプテン自体のみならず、式（１）で表される他
のハプテンと高分子化合物との結合体を標識用抗原とし
て使用することも可能である。例えば、式（１）におい
てＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ又はｎが抗体作製用と相違する化
合物を、標識用抗原として使用することもできる。さら
に、式（１）に含まれない他のピリミノバックメチル類
似化合物も、標識用抗原として使用可能である。

【００９６】（ｄ）工程においてピリミノバックメチル
を含む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接
触させ、ピリミノバックメチルと酵素結合ハプテンとの
競合阻害反応により、これらと固相化抗体との複合体が
生成する。ピリミノバックメチルを含む試料は適当な緩
衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、
反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、
緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵
素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えば１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液を使用
することができる。

【００９７】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合Ｅ
ＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより
検量線からピリミノバックメチルの量を算出することが
できる。

【００９８】本発明のモノクローナル抗体ＰＢＭ２４−
１は、直接競合ＥＬＩＳＡ法において約０．１ｎｇ／ｍ
ｌから１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．４ｎｇ／ｍｌか
ら４ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でピリミノバックメチルＥ体
と、そして、約０．１ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌ、
好ましくは０．４ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの濃度
範囲でピリミノバックメチルＺ体と反応する（実施例
９、図３）。

【００９９】さらに、前述したように直接競合ＥＬＩＳ
Ａ法において抗体作製用と異なるハプテンを標識用抗原
として使用でき、その組み合わせによって直接競合ＥＬ
ＩＳＡ法において固有の反応性を示す。本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合ＥＬＩＳＡ法又は間接競合ＥＬＩＳＡ
法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を
調べることができる。

【０１００】例えば、モノクローナル抗体ＰＢＭ２４−
１はピリミノバックメチル類似化合物（ベンスルフロン
メチル、ピラゾスルフロンエチル、アジムスルフロン、
メフェナセット、メトラクロール、アトラジン）に反応
性を示さず、ピリミノバックメチルに対して非常に高い
特異性を有する（実施例１０、表２）。以下、実施例に
よって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の
技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本
明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加
えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれ
る。

【０１０１】

【実施例】実施例１ ピリミノバックメチルハプテンの
合成

【０１０２】

【化１５】

【０１０３】４−エトキシカルボニルペンチルオキシ−
６−メチル−２−メチルチオピリミジン（１）の合成 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３５ｍｌ中の４−メチル
−２−メチルチオ−６（１Ｈ）ピリミドン１．６ｇ（１
０ｍｍｏｌ）の溶液に、６０％の水素化ナトリウム０．
４４ｍｌ（１１ｍｍｏｌ）を室温下に加え、５０℃で３
０分間撹拌した。これに６−ブロモヘキサン酸エチル
２．５ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加え、１２０℃で１時間撹
拌し、濃縮した。残渣に水５０ｍｌを加えトルエンで抽
出した（３０ｍｌ×３）。トルエン層を水洗し、無水硫
酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣をカラムクロ
マトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）
で精製し、２．０ｇ（収率６７％）の（１）を得た。４−エトキシカルボニルペンチルオキシ−６−メチル−
２−メチルスルホニルピリミジン（２）の合成 テトラヒドロフラン３０ｍｌ中の４−エトキシカルボニ
ルペンチルオキシ−６−メチル−２−メチルチオピリミ
ジン（１）１．８ｇ（６．０ｍｍｏｌ）へメタクロロ過
安息香酸２．３ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を加え、室温下に
２時間撹拌し、濃縮した。残渣に２０ｍｌの水を加え酢
酸エチルで抽出した（３０ｍｌ×３）。酢酸エチル層を
水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残
渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エ
チル＝２：１）で精製し、１．７ｇ（収率８５％）の
（２）を得た。６−［２−（２−メトキシカルボニル−３−（１−メト
キシイミノエチル）フェノキシ）−６−メチルピリミジ
ン−４−イルオキシ］ヘキサン酸エチル（３）の合成 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍｌ中の２−ヒドロ
キシ−６−（１−メトキシイミノエチル）安息香酸メチ
ル１．５ｇ（６．７ｍｍｏｌ）、４−エトキシカルボニ
ルペンチルオキシ−６−メチル−２−メチルスルホニル
ピリミジン（２）２．２ｇ（６．７ｍｍｏｌ）及び炭酸
カリウム１．２ｇ（８．７ｍｍｏｌ）の懸濁液を９０℃
で３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に２０
ｍｌの水を加え酢酸エチルで抽出した（３０ｍｌ×
３）。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥後、濾過、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフ
ィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、
１．８ｇ（収率８６％）の（３）を得た。６−［２−（２−メトキシカルボニル−３−（１−メト
キシイミノエチル）フェノキシ）−６−メチルピリミジ
ン−３−イルオキシ］ヘキサン酸（４）の合成 メタノール１０ｍｌ中の６−［２−（２−メトキシカル
ボニル−３−（１−メトキシイミノエチル）フェノキ
シ）−６−メチルピリミジン−４−イルオキシ］ヘキサ
ン酸エチル（３）１．６ｇ（１．４ｍｍｏｌ）の溶液
に、水１０ｍｌ中の水酸化ナトリウム０．２ｇ（５．０
ｍｍｏｌ）の溶液を加え、室温で３時間撹拌した。減圧
下にメタノールを留去し、残渣を１Ｎ塩酸でｐＨ６に
し、酢酸エチルで抽出した（４０ｍｌ×３）。酢酸エチ
ル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮し
た。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル＝１：１）で精製し１．１ｇ（収率７３
％）の（４）を得た。

【０１０４】上記ピリミノバックメチルハプテン（４）
の¹Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）
を以下の表１に示す。

【０１０５】

【表１】表１¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ） δ １．２３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， １．４９（２Ｈ，
ｍ，ＣＨ₂），１．６３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， ２．１
６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ₃），２．２１（２Ｈ，ｍ，Ｃ
Ｈ₂）， ２．２６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ₃），３．６０（３
Ｈ，ｓ，ＣＨ₃）， ３．８２（３Ｈ，ｓ，ＣＨ₃），
４．１６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， ６．５３（１Ｈ，
ｓ，ピリミジン：Ｈ），７．３４（１Ｈ，ｄ，Ａｒ：
Ｈ），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ａｒ：Ｈ），７．５８（１
Ｈ，ｔ，Ａｒ：Ｈ），１２．０７（１Ｈ，ｂｒ，ＣＯＯ
Ｈ）実施例２ 免疫用抗原及びスクリーニング用抗原の作製 ピリミノバックメチルハプテンをＫＬＨに結合させた免
疫用抗原、及びＢＳＡに結合させたスクリーニング用抗
原を活性化エステル法により作製した。

【０１０６】まず、実施例１で作製したピリミノバック
メチルハプテンの３．６μｍｏｌをＤＭＳＯ １００μ
ｌに溶解させた。この溶液にＮ−ヒドロキシこはく酸イ
ミド（１６μｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液１０μｌ、及び１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩（５．６μｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液２０
μｌをそれぞれ加えた。

【０１０７】室温にて１．５時間反応させた後、これら
の反応溶液にＢＳＡあるいはＫＬＨ１０ｍｇを８５ｍＭ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００μｌに溶解後加え、
再び室温にて１．５時間反応させた。反応終了後、ダル
ベッコのリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ（−）と略す）で
透析し、ピリミノバックメチルハプテンとＫＬＨとの結
合体（以下、「ピリミノバックメチルハプテン／ＫＬ
Ｈ」と言う）、ピリミノバックメチルハプテンとＢＳＡ
との結合体（以下、「ピリミノバックメチルハプテン／
ＢＳＡ」と言う）を各々調製した。実施例３ 免疫感作 免疫には、Ｂａｌｂ／ｃマウス（７週令、メス）を用い
た。実施例２で調製した免疫用抗原（ピリミノバックメ
チルハプテン／ＫＬＨ）マウス１匹あたり１００μｇ／
５０μｌとなるようにＰＢＳ（−）で希釈した。さらに
等量のフロイント完全アジュバントと乳化混合した後、
マウスの腹腔内に接種した。その１カ月後に初回免疫量
の１／４量を追加免疫した。さらにその一週間後マウス
の尾静脈から採血し、得られた上清を抗血清とした。ま
た、さらにその１．５カ月後に追加免疫と同量を最終免
疫した。実施例４ 抗血清のピリミノバックメチルに対する反応
性 実施例２で調製したスクリーニング用抗原（ピリミノバ
ックメチルハプテン／ＢＳＡ）を用いた間接競合ＥＬＩ
ＳＡ法により、実施例３で調製した抗血清のピリミノバ
ックメチルに対する反応性を調べた。ピリミノバックメ
チルとしては、２種の異性体であるＥ体とＺ体を用い
た。（ピリミノバックメチルはＥ体とＺ体９：１の混合
物である。） まず、実施例２で調製したピリミノバックメチルハプテ
ン／ＢＳＡを４μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ（−）に
溶解した これを、９６ウェルのマイクロタイタープレ
ート（コーニング・コスター社製）の各ウェルに１００
μｌ／ウェルで加え、４℃で１晩静置することによって
固相化した。次に溶液を廃棄し、３００μｌ／ウェルで
ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣｌ
を添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））に置
き換え、室温で１時間ブロッキングした。

【０１０８】このウェルに希釈液−１（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
０））で適当な濃度に希釈したピリミノバックメチルＥ
体若しくはピリミノバックメチルＺ体を５０μｌ／ウェ
ルで加えた。その後、直ちに同じ希釈液で適当な濃度に
希釈した抗体溶液（抗体過剰域の１／２の反応性を示す
抗体濃度）を加えて混合し、室温で１時間反応させた。
洗浄液（６０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸
緩衝液（ｐＨ８．０））で３回洗浄した後、２次抗体希
釈液（０．３％ＢＳＡと１５０ｍＭ ＮａＣｌを添加し
た８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））で１０００倍
希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇ
Ｇ抗体（カペル社製）を１００μｌ／ウェルで添加し、
室温で１時間反応させた。再び洗浄液で３回洗浄した
後、ペルオキシダーゼの基質溶液（１００μｇ／ｍｌの
３，３’５，５’−テトラメチルベンチジン及び０．０
０６％過酸化水素を添加した０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５））で１０分間発色させ、１Ｎ硫酸で
反応停止後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１０９】結果を図１に示す。本願発明の抗血清は、
ピリミノバックメチルＥ体と０．１μｇ／ｍｌ以上の濃
度で反応し、一方ピリミノバックメチルＺ体とは１μｇ
／ｍｌ以上の濃度で反応した。実施例５ ハイブリドーマの作製 実施例４で抗血清の力価を測定したマウスについて、モ
ノクローナル抗体の作製を試みた。

【０１１０】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを得るための細胞融合は、実施例３の最終免疫後３
日目のマウスの脾臓細胞を用いて行った。摘出した脾臓
からＤＭＥＭ中に脾臓細胞を取り出し、ＤＭＥＭにて３
回洗浄した後、マウスのミエロ−マ細胞Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８．６５３と細胞数の比で５：１（脾臓細胞：ミエ
ローマ細胞）となるように混合し、遠心（１，２００ｒ
ｐｍ、５分間）して細胞沈渣を集めた。この細胞沈渣に
予め３７℃に加温しておいた５０％ポリエチレングリコ
ール（分子量１５００）１ｍｌを加え、細胞を融合し
た。ＤＭＥＭ １０ｍｌを徐々に添加し、ウシ胎児血清
（以下「ＦＢＳ」と言う）１ｍｌを更に添加することに
より、細胞融合を停止した。融合した細胞は、ＤＭＥＭ
に１０％のＦＢＳ、ヒポキサンチン（１００μＭ）、ア
ミノプテリン（０．４μＭ）、及びチミジン（１６μ
Ｍ）を添加したＨＡＴ培地に懸濁後、９６ウェルのマイ
クロプレートの各ウェルに２×１０⁵細胞／ウェルで分
注した。３７℃、５％二酸化炭素存在下で１０日ないし
１４日間培養した後、各ウェルにハイブリドーマのコロ
ニーが形成された。実施例６ モノクローナル抗体の作製 実施例５でコロニーが形成された各ウェルのうち、それ
らの培養上清中にピリミノバックメチルＥ体に反応する
モノクローナル抗体を産生しているものを、間接競合Ｅ
ＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングした。

【０１１１】各ウェルの反応性を定性的にスクリーニン
グした後、ピリミノバックメチルとの反応性を示したウ
ェルのハイブリドーマを、限界希釈法によって細胞クロ
ーニングし、ピリミノバックメチルのＥ体と高い反応性
を示すモノクローナル抗体の産生細胞（ＰＢＭ２４−
１）を得た（図２）。このハイブリドーマＰＢＭ２４−
１を平成１１年７月２２日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１７４８４で工業技術院生命工学工業研究所（〒３０５
−００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託
した。

【０１１２】さらにＦＢＳを１０％添加したＤＭＥＭ中
でこれらのモノクローナル抗体産生細胞を培養し、得ら
れた培養上清をモノクローナル抗体とした。（以後、各
モノクローナル抗体は、これらを産生するモノクローナ
ル抗体産生細胞と同一の名称を用いる。）作製したモノ
クローナル抗体のサブクラスは、ＩｇＧ２ｂだった。 実施例７ モノクローナル抗体の精製 実施例６で得られたモノクローナル抗体の精製を行っ
た。まず、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内にモノクローナ
ル抗体産生細胞ＰＢＭ２４−１を接種し、腹水を得た。
ＰＢＭ２４−１由来の腹水には、３５％飽和となるよう
に硫安を加え、４℃で２時間撹拌したのち遠心し、沈殿
物を得た。これをＰＢＳ（−）で可溶化した後、さらに
ＰＢＳ（−）で２晩透析し、精製抗体を得た。その純度
は、ＳＤＳーポリアクリルアミドゲル電気泳動により、
少なくとも９０％以上と確認された。実施例８ ＨＲＰ結合ハプテンの調製 実施例１で作製したピリミノバックメチルハプテンの
１．２５μｍｏｌをＤＭＳＯ ５０μｌに溶解した。こ
の溶液へＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（５．５μｍｏ
ｌ）のＤＭＳＯ溶液３．４μｌ、及び１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
（１．９μｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液６．８μｌを加え、
室温にて１時間反応させた。この反応液に１Ｍ炭酸水素
ナトリウム４０μｌを加え、さらにＨＲＰ（５ｍｇ）を
蒸留水２５０μｌに溶解した溶液を加えて、室温で３時
間反応させた。得られた反応液から、ゲル濾過カラム
（セファデックスＧ−２５）を用いて低分子化合物を除
去し、ＨＲＰ結合ピリミノバックメチルハプテンとし
た。実施例９ 直接競合ＥＬＩＳＡ法によるピリミノバック
メチルの測定 実施例７で得られたモノクローナル抗体ＰＢＭ２４−１
を用い、以下のように直接競合ＥＬＩＳＡ法によりピリ
ミノバックメチルを測定した。

【０１１３】まず、実施例７で精製したモノクローナル
抗体ＰＢＭ２４−１を２μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ
（−）に溶解し、９６ウェルのマイクロタイタープレー
トの各ウェルに１００μｌ／ウェルで加え、４℃で１晩
静置することにより固相化した。つぎに３００μｌ／ウ
ェルのブロッキング緩衝液で置き換え、室温で１時間ブ
ロッキングした。一方、希釈液−２（１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを添加した１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．
０））で適当な濃度に段階的に希釈したピリミノバック
メチルＥ体若しくはピリミノバックメチルＺ体と、０．
３％ＢＳＡを添加した希釈液で同じく適当な濃度（ピリ
ミノバックメチル未添加の条件での本ＥＬＩＳＡ法の吸
光度がＨＲＰ結合ハプテン飽和時の１／２を示し得る、
ＨＲＰ結合ピリミノバックメチルハプテン濃度）に希釈
したＨＲＰ結合ピリミノバックメチルハプテンの混合液
とを混合し、先のブロッキング済みの各ウェルに１００
μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。洗浄液
で３回洗浄した後、実施例４に示した間接競合ＥＬＩＳ
Ａ法と同様の方法で発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測
定した。

【０１１４】結果を、図３に示す。図３より、ＰＢＭ２
４−１はピリミノバックメチルＥ体と約０．４ｎｇ／ｍ
ｌないし４ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、またＺ体と０．４
ｎｇ／ｍｌないし１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で反応し
た。実施例１０ モノクローナル抗体ＰＢＭ２４−１の交差
反応性 実施例９に記載した直接競合ＥＬＩＳＡ法により、モノ
クローナル抗体ＰＢＭ２４−１のピリミノバックメチル
類似化合物に対する交差反応性を調べた。

【０１１５】結果を以下の表２に示す。

【０１１６】

【表２】

【０１１７】表２中、「ＩＣ₅₀値」は抗体とＨＲＰ結合
ハプテンの反応を５０％阻害する化合物の濃度であり、
「交差反応率」は（ピリミノバックメチルのＩＣ₅₀値／
対象化合物のＩＣ₅₀値）×１００である。表２から明ら
かなとおり、本発明のモノクローナル抗体はピリミノバ
ックメチル以外の類似する化合物とは全く反応せず、ピ
リミノバックメチルに高い特異性を持つことが分かっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のピリミノバックメチルハプテ
ンを用いて得られた抗血清の間接競合ＥＬＩＳＡ法によ
るピリミノバックメチルとの反応性を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体の間接競
合ＥＬＩＳＡ法によるピリミノバックメチルＥ体との反
応性を示す。

【図３】図３は、本発明のモノクローナル抗体の直接競
合ＥＬＩＳＡ法によるピリミノバックメチルとの反応性
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/44 Ｃ０７Ｋ 16/44 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｊ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/531 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/531 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ (72)発明者 山口 優樹 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 大出 勝也 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA41 DA02 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 AA30 BA51 DA83 EA50 FA74

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、 Ｒ¹は、Ｃｌ又はＣＣＨ₃＝Ｎ−ＯＣＨ₃であり；Ｒ²は、
   Ｈ、メチル基又はナトリウムであり；Ｒ³は、枝分かれ
   していてもよい炭素数１ないし３のアルキル基又はアル
   コキシ基であり；Ａは、酸素原子又は硫黄原子であり；
   そしてｎは、１ないし１０の整数である］で表される構
   造を有する化合物。
2. 【請求項２】式（１）において、Ｒ¹がＣＣＨ₃＝Ｎ−Ｏ
   ＣＨ₃であり、Ｒ²がメチル基であり、Ｒ³がメトキシ基
   であり、そしてＡが酸素原子である、請求項１に記載の
   化合物。
3. 【請求項３】式（１）において、ｎが５である請求項１
   又は２に記載の化合物。
4. 【請求項４】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   化合物と高分子化合物又は標識物質との結合体。
5. 【請求項５】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   化合物と高分子化合物を結合させることにより抗原を作
   製し、当該抗原を用いることにより、以下の式（２）： 【化２】 ［式（２）中、 Ｒ¹は、Ｃｌ又はＣＣＨ₃＝Ｎ−ＯＣＨ₃であり；Ｒ²は、
   Ｈ、メチル基又はナトリウムであり；Ｒ³は、枝分かれ
   していてもよい炭素数１ないし３のアルキル基又はアル
   コキシ基であり；そしてＡは、酸素原子又は硫黄原子で
   ある］で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗
   体を製造することを特徴とする、式（２）で表される構
   造を有する化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメ
   ントの製造方法。
6. 【請求項６】式（２）において、Ｒ¹がＣＣＨ₃＝Ｎ−Ｏ
   ＣＨ₃であり、Ｒ²がメチル基であり、Ｒ³がメトキシ基
   であり、そしてＡが酸素原子である、請求項５に記載の
   製造方法。
7. 【請求項７】請求項４に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメント。
8. 【請求項８】モノクローナル抗体である、請求項７に記
   載の抗体又はフラグメント。
9. 【請求項９】モノクローナル抗体ＰＢＭ２４−１であ
   る、請求項７若しくは８に記載の抗体又はフラグメン
   ト。
10. 【請求項１０】請求項７ないし９のいずれか１項に記載
    の抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。
11. 【請求項１１】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４８４で寄
    託されている、請求項１０に記載のハイブリドーマ。
12. 【請求項１２】請求項７ないし９のいずれか１項に記載
    の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
    （２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
13. 【請求項１３】さらに、請求項１ないし３のいずれか１
    項に記載の化合物、又は請求項４に記載の結合体を用い
    ることを含む、請求項１２に記載の免疫学的測定方法。