JP3188642B2 - イマザリルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、１−（β−アリル
オキシ−２,４−ジクロロフェネチル）イミダゾール
（以下、本明細書中「イマザリル」と言う）のハプテン
化合物、抗原、抗体及びそのフラグメントに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】イマザリルは、以下の式（２）：

【化３】 で表される構造を有する化合物である。イマザリルは、
農薬の国内登録はないが、うどんこ病、黒点病などの果
実、野菜、鑑賞用植物などの病害に広範囲に効果を示
す。柑橘類、核果類、バナナなどの果実の貯蔵、保存中
の腐敗防止のための殺菌剤あるいは穀類、綿などの種実
の消毒剤としても使用される（「最新農薬の残留分析
法」 第３４９頁−第３５１頁、農薬残留分析法研究班
編集 中央法規出版）。

【０００４】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。イマザリルについても、食品衛生法に基づき残留基
準値が穀類で０.０１−０.０５ｐｐｍ、果実で２．０−
５．０ｐｐｍ、野菜で０．５−２．０ｐｐｍ、馬鈴薯で
５．０ｐｐｍ、綿実で０.０５ｐｐｍと定められている
（「最新農薬の残留分析法」 前出）。環境や食品に関
する安全確保のためには、これらに含有される、イマザ
リルの量を迅速、かつ正確に測定することが必要であ
る。

【０００５】従来、イマザリルは、穀類、果実、野菜等
の試料から抽出し、精製した後、高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）により分析されてきた。穀類の場
合、例えば試料をアセトンで抽出して、硫酸に転溶した
後、酢酸エチルに転溶しＨＰＬＣで分析する方法が採用
されている。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大
の手間と時間を必要とし、分析に熟練を有すること、並
びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の
問題点がある。イマザリルの測定は、特に輸入農産物等
の残留農薬の分析においては、短時間で膨大な数の試料
の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便
性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求
されてきている。

【０００６】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【０００７】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of e
nzyme immunoassays" in Laboratory techniques in bi
ochemistry and molecular biology, Elsevier Amsterd
am New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) に記
載されている。

【０００８】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、イマザリルのような低分子
化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すこ
とができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子
化合物に結合させることによって初めて一団のエピトー
プとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起
こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生さ
れる。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫
原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。

【０００９】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１０】イマザリルについてはその必要性が非常に
高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとより、抗体
を作製するためのハプテンも本発明前には得られていな
かった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、イマザリル
に特異的に反応する新規な抗体を作製するための抗原を
構成するハプテン化合物となる、当該化合物の誘導体を
提供することを目的とする。

【００１２】本発明は、また、イマザリル誘導体と高分
子化合物との結合体を提供することを目的とする。当該
結合体はイマザリルに特異的に反応する抗体を作製する
ための抗原となる。

【００１３】本発明は、さらに、イマザリルに反応する
新規な抗体もしくはそのフラグメント、及びその作製方
法を提供することを目的とする。尚、本明細書において
抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の
一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１４】本発明はその一態様において、イマザリル
に反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１５】本発明は、さらにまた、前記抗体及びその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１６】本発明は、さらに、前記抗体もしくはその
フラグメント及び／又は前記イマザリル誘導体と高分子
化合物との結合体を使用することを含む、イマザリル化
合物の免疫学的測定方法を提供することを目的とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、イマザリルにスペーサーアーム及び高分
子との結合に利用できる官能基を導入した、イマザリル
の誘導体をハプテンとして使用することにより、前記化
合物に特異的な抗体を得ることに成功し、本発明の完成
に至った。

【００１８】本発明の対象となるイマザリルは、以下の
式（２）：

【化４】 で表される化合物である。抗体作製のためのハプテンと
して使用される誘導体は、前記イマザリルの

【化５】 の部分を

【化６】 ［式中、ｎは１−１０の整数であり、好ましくは３−７
の整数である］に変化させたものである。即ち、本発明
のイマザリル誘導体は、以下の式（１）：

【化７】 ［式（１）中、ｎは先に定義した通りである］で表され
る構造を有する化合物である。

【００１９】本発明において、化合物の立体異性体は特
に限定されず全ての立体異性体を含む。

【００２０】本発明は、イマザリルにスペーサーアーム
及び結合に利用できる官能基を導入した誘導体をハプテ
ンとして適当な高分子化合物と結合させたものを抗原と
して用いることによって、イマザリルに特異的な抗体を
得ることを可能にした。

【００２１】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、イマザリルに反応す
る抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物ま
たは該抗体を用いるイマザリルの免疫学的測定方法に関
する。

【００２２】イマザリルの誘導体の作製 式（１）で表されるイマザリル誘導体は、公知の方法に
従って作製することができる。例えば以下に記載するよ
うな方法がある。

【００２３】式（Ｚ１）：

【化８】 で表される化合物を、例えば、テトラヒドロフラン、ジ
エチルエーテル、ジブチルエーテル、ジオキサン、１,
２−ジメトキシエタン、またはその１８−クラウン−６
−エーテルもしくはベンゾ−１８−クラウン−６−エー
テルとの混合物、あるいはジメチルホルムアミド、Ｎ−
メチルピロリドン等の溶媒中、水酸化ナトリウム、水酸
化リチウム、ブチルリチウム、ナトリムメトキシド等の
塩基の存在下、以下の式（Ｚ２）：

【化９】 ［式（Ｚ２）中、Ｑは、カルボキシル基の保護基であ
り；Ｘは、ハロゲン原子であり（本明細書中、ハロゲン
原子はＣｌ、ＢｒまたはＩを意味する）；そしてｎは、
先に定義した通りである］で表される化合物と反応さ
せ、式（Ｚ３）：

【化１０】 ［式（Ｚ３）中、Ｑおよびｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を得る。反応はマイナス８０℃か
ら溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃−６０℃で、５分
−２０時間、好ましくは１−１５時間行う。

【００２４】Ｑで示される保護基は公知のものでよく、
具体例として、例えば、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ
−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ト
リクロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブ
チルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシ
リル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル
基、トリメチルシリルエトキシメチル基等を挙げること
ができる次に、式（Ｚ３）の化合物からＱで表される保
護基を除去することにより、式（１）の化合物を得るこ
とができる。保護基の除去は、酸加水分解、アルカリ加
水分解等の公知の方法で行うことができる。

【００２５】例えば、アルカリ加水分解の場合は、式
（Ｚ３）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒、又はこれらの有機溶媒と水との混合溶媒に水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムまたは炭
酸カリウム等を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは室温から１００℃で、３０分−２時間撹拌反応
させることにより行うことができる。

【００２６】また、該保護基がｔｅｒｔ−ブチル基であ
る場合は、式（Ｚ３）の化合物を含む有機溶媒に酸触媒
を加えて、好ましくは撹拌下で反応させることにより行
われる。有機溶媒としては、例えば、ベンゼン等の芳香
族炭化水素類、ジクロロメタン、１,２−ジクロロエタ
ン等のハロゲン化炭化水素類、又はこれらの混合溶媒等
を使用できる。酸触媒としては公知のもの、例えばトリ
フルオロ酢酸等のカルボン酸、ｐ−トルエンスルホン酸
等のスルホン酸、塩酸、硝酸等の鉱酸などが使用できる
が、その中でもトリフルオロ酢酸が好ましい。反応温度
は、通常０℃−１００℃程度、好ましくは室温がよく、
反応時間は通常０.５−３時間程度とすればよい。

【００２７】更に、ベンジル基の除去は水素による接触
還元反応によっても行うことができる。

【００２８】また、トリメチルシリル基、tert−ブチル
ジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、
トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリ
メチルシリルエトキシメチル基は、フッ化水素、テトラ
ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフルオリ
ド等のフッ素イオンを発生させる試薬により特異的に除
去することもできる。

【００２９】以上の製造法によって得られた化合物を、
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶
操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とする
ことができる。

【００３０】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００３１】イマザリル誘導体と高分子化合物との結合
体の作製 上述のように合成されたイマザリル誘導体を適当な高分
子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用する。

【００３２】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。

【００３３】イマザリル誘導体と高分子化合物との結合
は、例えば、活性化エステル法（A.E. KARU et al.:J.
Agric. Food Chem. 42 301-309 (1994)）、または、混
合酸無水物法（B.F.Erlanger et al.:J.Biol.Chem. 234
1090-1094 (1954)）等の公知の方法によって行うこと
ができる。

【００３４】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ドエステルを生成する。

【００３５】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」という）、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハ
プテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比
は好ましくは１：１０−１０：１、より好ましくは、
１：１−１：１０、最も好ましくは１：１である。反応
温度は、０℃−１００℃、好ましくは５℃−５０℃、よ
り好ましくは２２℃−２７℃で、反応時間は５分−２４
時間、好ましくは３０分−６時間、より好ましくは１−
４時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温
度で行うことができる。

【００３６】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、０℃−６０℃、
好ましくは５℃−４０℃、より好ましくは２２℃−２７
℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６
時間、より好ましくは１−２時間である。反応物を、透
析、脱塩カラム等によって精製して、イマザリル誘導体
と高分子化合物との結合体を得ることができる。

【００３７】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反
応により得られ、これを高分子化合物と反応させること
により目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造
される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては例えば、Ｎ−メチルモルホリン、
トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、Ｎ,
Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等
の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素
カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げら
れる。該反応は、通常マイナス２０℃−１００℃、好ま
しくは０℃−５０℃において行われ、反応時間は５分−
１０時間、好ましくは５分−２時間である。得られた混
合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２
０℃−１５０℃、好ましくは０℃−１００℃において行
われ、反応時間は５分−１０時間、好ましくは５分−５
時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われ
る。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているい
ずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、
ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエ
タン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、
ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、
トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチ
ル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸
トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルと
しては、例えばクロロ蟻酸イソブチル、クロロ蟻酸メチ
ル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸
エチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハ
ロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲
から適宜選択され得る。

【００３８】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をイマザリル誘導体に結合させたものを、免疫
測定法において使用することができる。標識物質として
は、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」と
言う）やアルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレ
セインイソチオシアネートやローダミン等の発色物質、
³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質などがある。

【００３９】ポリクローナル抗体の作製 イマザリル誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗
体を作製することができる。例えば、イマザリル誘導体
−ＫＬＨ結合体をリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言
う）に溶解し、フロイント完全アジュバントまたは不完
全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合
したものを、免疫用抗原として動物に免疫することによ
って行う。免疫される動物としては当該分野で常用され
るものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラッ
ト、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。

【００４０】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。投与は１
回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間
の間隔で複数回行うことができる。

【００４１】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、イマザリルと反応するポリクロー
ナル抗体の存在を評価することができる。

【００４２】本発明のイマザリル誘導体と高分子化合物
との結合体により免疫感作させたマウスの抗血清は、後
述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、イマザリル
の量を約１μｇ／ｍｌ以上の範囲で測定できる（実施例
４、図１）。

【００４３】モノクローナル抗体の作製 イマザリル誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作
製することができる。

【００４４】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するイマザリル誘導体と高
分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養または動物へのハイブリド
ーマの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００４５】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Hybridoma Techniques），コールド
スプリング ハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Ha
rbor Laboratory），１９８０年版）、細胞組織化学
（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９
８６年）に記載されている。

【００４６】以下、上述の本発明のイマザリルに対する
モノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制
限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００４７】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００４８】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液またはこれらの組み合わせから得ることができる
が脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００４９】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e，25 6, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ
１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Microbiology and
Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519
(1976)）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Natu
re 276, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno.Meth., 3
5, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ
１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ３）（Nature 277, 1
31-133, (1979)）等を使用できる。

【００５０】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはイスコフ
改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当
日に１×１０⁶以上の細胞数を確保する。

【００５１】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルシュタイン（Milstein）らの方法（Methods in
Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことがで
きる。現在最も一般的に行われているのは、融合作業も
簡単なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法
である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、
山下修二ら（上述）に記載されている。その他の融合方
法としては、電気処理（電気融合）による方法等を適宜
採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学 ５．
１３１５−１９、１９８７）。また、細胞の使用比率も
公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対し
て脾細胞を３−１０倍程度用いればよい。脾細胞とミエ
ローマ細胞とが融合し、抗体産生能及び増殖能を獲得し
たハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞
株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭ
ＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チ
ミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行う
ことができる。

【００５２】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、イマザリルに対する抗体活性を測定
する。さらに、測定によりイマザリルに反応する抗体を
産生することが判明したハイブリドーマの細胞クローニ
ングを行う。この細胞クローニング法としては、限界希
釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるよ
うに希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒き
コロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによっ
て１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによって１
個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が挙げら
れる。限界希釈法が簡単でありよく用いられる。

【００５３】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法により細胞クローニングを１−４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗イマザリルモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。

【００５４】ハイブリドーマを培養する培地としては、
例えば、ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭまたはＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度中の恒
温器中）で培養するのが好ましい。

【００５５】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。または、同系統のマウス（例えば、上述のＢａ
ｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブ
リドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも
可能である。

【００５６】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗イマザリルモノクローナル抗体として使用す
ることできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる
塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精
製することにより抗イマザリルモノクローナル抗体を得
ることができる。さらに精製が必要な場合には、イオン
交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、オープンカラムクロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用され
ている方法を使用して抗体画分を集める操作を１回、ま
たは複数回行うことにより実施できる。

【００５７】以上のようにして得られた抗イマザリルモ
ノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法など
の公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定
することができる。

【００５８】抗体によるイマザリルの測定 本発明で使用する抗体によるイマザリルの測定方法とし
ては、放射性同位元素免疫測定方法（ＲＩＡ法）、ＥＬ
ＩＳＡ法（Engvall,E.,Meth. Ensymol., 70, 419-439
(1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法等の一
般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブ
リドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプ
ラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００５９】イマザリルの測定は各種ＥＬＩＳＡ法のう
ち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のよ
うな手順により行うことができる。（ａ）まず、抗原で
あるイマザリル誘導体と高分子化合物との結合体を担体
に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を
抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキング
する。（ｃ）これに各種濃度のイマザリルを含む試料及
び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び遊離イマザ
リルに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及
び遊離イマザリル−抗体複合体を生成させる。（ｄ）固
相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め
作成した検量線から試料中の遊離イマザリルの量を決定
することができる。

【００６０】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００６１】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えばリン酸緩衝液を挙げることができる。緩衝液中の抗
原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１−
１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.０５−１０μｇ
／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマ
イクロタイタープレートを使用する場合には、３００μ
ｌ／ウェル以下で５０−１５０μｌ／ウェル程度が望ま
しい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限は
ないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適し
ている。

【００６２】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体作製に使用したイマザリル誘導体と高分子化合物と
の結合体自体のみならず、式（１）で表される他の誘導
体と高分子化合物との結合体を用いることもできる。さ
らに、式（１）に含まれない他のイマザリル類似化合物
も、固相化抗原として使用することも可能である。

【００６３】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原との結
合体を固相化した担体において、イマザリル誘導体部分
以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する
場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロ
ッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５
Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使
用することもできる。具体的には、限定されるわけでは
ないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロッキング
剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８.
０）］を適量加え、約４℃で、一晩インキュベーション
した後、緩衝液で洗浄することにより行われる。洗浄液
としては特に制限はないが、例えば、ＰＢＳが適してい
る。

【００６４】次いで（ｃ）工程において、イマザリルを
含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化
抗原及び遊離イマザリルと反応させることにより、固相
化抗原−抗体複合体及び遊離イマザリル−抗体複合体が
生成する。

【００６５】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のイマザリルに対する抗体を加え、更に第二抗体
として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次
加えて反応させる。

【００６６】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、
ＰＢＳが好ましい。

【００６７】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるの
が適当である。担体に結合した第一抗体に最終吸光度が
４以下で、好ましくは０．５−３.０となるように希釈
した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝
液を用いる。限定されるわけではないが、反応は室温で
約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応
により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識し
た第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要
である。

【００６８】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度
を測定することによって検量線からイマザリルの量を算
出することができる。

【００６９】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば基質として過酸化水
素、発色試薬としてオルトフェニレンジアミン（以下、
「ＯＰＤ」と言う）を使用することができる。限定され
るわけではないが、発色溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。ＯＰＤを使用する場合、４９０ｎｍの吸光
度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてア
ルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−
ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮ
ａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度
を測定する方法が適している。

【００７０】上述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば、本発明のモノクローナル抗体９Ｃ９−１−１は、イ
マザリルを約０.１−約１０００ｎＭ、好ましくは１−
１００ｎＭの範囲で測定できる。モノクローナル抗体９
Ｃ１−１−１は、イマザリルに特異的に反応し、他のア
ゾール系化合物とはほとんど反応しない（実施例６、図
２）。

【００７１】あるいは、イマザリルの測定は、例えば以
下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた
直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。 （ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を担体に固相
化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のイマザリルを含む
試料に、イマザリル誘導体と酵素を結合させた酵素結合
ハプテンを加えた混合物を調製する。 （ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のイマザリルの量を決定する。

【００７２】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。

【００７３】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のイマザリル
及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に吸着
される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的
で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競
合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００７４】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、イマザリル誘導体を酵素に結合する方法で
あれば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよい。例
えば、前述した活性化エステル法を採用することができ
る。調製した酵素結合ハプテンは、イマザリルを含む試
料と混合する。

【００７５】なお、酵素に結合させるハプテンとして
は、抗体作製に使用したイマザリル誘導体自体のみなら
ず、式（１）で表される他の誘導体を用いることもでき
る。さらに、式（１）に含まれない他のイマザリル類似
化合物も、酵素に結合させるハプテンとして使用するこ
とも可能である。

【００７６】（ｄ）工程において当該混合物を抗体固相
化担体に接触させ、混合物中のイマザリルと酵素結合ハ
プテンとの競合阻害反応により、これらと固相化抗体と
の複合体が生成する。イマザリルを含む試料は適当な緩
衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、
反応は例えば室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩
衝液で担体を洗浄し、未反応の酵素結合ハプテンを除去
する。洗浄液は、例えばＰＢＳを採用することができ
る。

【００７７】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からイマザリルの量を算出することができ
る。

【００７８】本発明のモノクローナル抗体９Ｃ９−１−
１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約０.０１−
１０００ｎｇ／ｍｌ，好ましくは０．１−１００ｎｇ／
ｍｌの範囲でイマザリルを測定できる（実施例８、図
３）。

【００７９】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００８０】

【実施例】実施例１ イマザリル誘導体の合成

【化１１】

【００８１】６−［１−（２,４−ジクロロフェニル）
−２−（１−イミダゾリル）エトキシ］へキサン酸エチ
ルエステル（２）の合成 テトラヒドロフラン１０ｍｌに６０％水素化ナトリウム
０.３５ｇ（８.８ｍｍｏｌ）を懸濁した。これに、特公
昭５０−３９６６６号に記載された方法で合成した１−
（２,４−ジクロロフェニル）−２−（１−イミダゾリ
ル）エタノール（１）２．１ｇ（８ｍｍｏｌ）をＮ,Ｎ
−ジメチルホルムアミド３ｍｌに溶解した溶液を５０℃
加温下に加えた後、環流下に１時間撹拌した。次に、こ
れに６−ブロモヘキサン酸エチルエステル２.３ｇ（１
０.３ｍｍｏｌ）を氷水冷却下、１０−１５℃で加え、
環流下に４時間撹拌反応させた。この反応混合物を濃縮
後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−へキサ
ン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、１.６ｇ（収率５
０％）の６−［１−（２,４−ジクロロフェニル）−２
−（１−イミダゾリル）エトキシ］へキサン酸エチルエ
ステル（２）を得た。

【００８２】６−［１−（２,４−ジクロロフェニル）
−２−（１−イミダゾリル）エトキシ］ヘキサン酸
（３）の合成 エタノール４０ｍｌに６−［１−（２,４−ジクロロフ
ェニル）−２−（１−イミダゾリル）エトキシ］ヘキサ
ン酸エチルエステル（２）１．４ｇ（３.５ｍｍｏｌ）
を溶解した。この溶液に水５ｍｌに溶かした水酸化ナト
リウム０.７ｇ（１８ｍｍｏｌ）を加え、室温下に１時
間撹拌反応させた。反応混合物を濃縮し、残渣に水３０
ｍｌを加え、酢酸エチルで分液した。水層を希塩酸でｐ
Ｈ６.５にして、クロロホルムで抽出した。クロロホル
ム層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮し、
残渣の結晶をｎ−ヘキサンで洗い、０.８ｇ（収率６２
％）の６−［１−（２,４−ジクロロフェニル）−２−
（１−イミダゾリル）エトキシ］ヘキサン酸（３）を得
た。 融点：１０４−１０５℃¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，ｐｐｍ） １．２３（２Ｈ，ｍ） １．４４（４Ｈ，ｍ） ２．１７（２Ｈ，ｍ） ３．２５（２Ｈ，ｍ） ４．２０（２Ｈ，ｍ） ４．８７（１Ｈ，ｍ） ６．８５（１Ｈ，ｓ） ７．０５（１Ｈ，ｓ） ７．３４（１Ｈ，ｄ） ７．４６（２Ｈ，ｍ） ７．６４（１Ｈ，ｄ） １２．０ （１Ｈ，ｂｒ）

【００８３】実施例２ 免疫用抗原の作製 免疫用抗原としてイマザリル誘導体と高分子化合物との
結合体を用いるため、活性化エステル法を利用した結合
体の作製を行った。

【００８４】実施例１で作製したイマザリル誘導体を
０.０５ｍｍｏｌ秤量し、無水ＤＭＦ０.２５ｍｌに溶解
した。次にＮ−ヒドロキシこはく酸イミド０.０５ｍｍ
ｏｌ、ジシクロヘキシルカルボジイミド０.０５ｍｍｏ
ｌを加え、室温にて３.５時間撹拌し、反応させた。反
応後、１０,０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清と沈
殿とに分離した。一方、ＢＳＡ２５ｍｇをＰＢＳ２.５
ｍｌに溶解し、無水ＤＭＦ０.５ｍｌを加えた溶液を調
製した。当該溶液に前述の上清０.１２５ｍｌを加え、
４℃にて１晩撹拌し、反応させた。反応後、ＢＳＡ結合
イマザリル誘導体を蒸留水によって透析し、精製した。
こうして得られたイマザリル誘導体−ＢＳＡ結合体を免
疫用抗原として用いた。

【００８５】また、測定用抗原としてＢＳＡの代わりに
ＲＳＡとの結合体を用いるため、上記と同様の方法で作
製を行った。

【００８６】実施例３ 免疫感作 免疫用抗原１００μｇを１４５ｍＭ ＮａＣｌ−０.０１
Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７.２）（以下「ＰＢＳ」とい
う）１００μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジュ
バンドと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に接種し
た。さらに、２週間後にフロイント不完全アジュバンド
を用いて前記と同様に調製した免疫用抗原を追加免疫し
た。また、４週間目にＰＢＳに溶解した免疫用抗原をマ
ウスの尾静脈に追加免疫した。

【００８７】実施例４ 抗血清によるイマザリルの測定 実施例３におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した
抗血清を希釈調製してて、以下に詳述する間接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法を用いてイマザリルを測定した。

【００８８】測定用抗原であるＲＳＡ−イマザリル誘導
体の溶液（０.1μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルの量で
９６ウェルプレートにコーティングし、４倍希釈したブ
ロックエース（「Ｂ１ｏｃｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社
製）でブロッキングしてアッセイ用プレートを作製し
た。これに抗血清希釈液と、各種濃度のイマザリルを含
む２０％メタノール溶液とを等量混合し、その５０μｌ
をウェルに入れ、室温で１時間反応させた。

【００８９】ＰＢＳにて洗浄した後、１０倍希釈のブロ
ックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダ
ーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５
０μｌ／ウェルの量で加え、室温で１時間反応させた。

【００９０】ＰＢＳで洗浄後、２ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ及
び０.０２％の過酸化水素を含む０.１Ｍ クエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ５.０）を５０μｌ／ウェルの量で加
え、室温で１０分間反応させて発色きせた。

【００９１】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で
加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
その一例を図１に示す。図１より、マウスの抗血清（ポ
リクローナル抗体）を使用することにより、イマザリル
の量を１μｇ／ｍｌ以上の範囲で測定することができ
た。

【００９２】実施例５ ハイブリドーマの作製 実施例３に続いて、血清中のイマザリルに対する抗体活
性が高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞（Ｓ
ｐ２／Ｏ−Ａｇ１４）とを山下修二らの方法（組織細胞
化学：日本組織細胞化学会編：学際企画、１９８６年）
に従ってポリエチレングリコール法により融合し、ＨＡ
Ｔ選択培地にて培養した。細胞の増殖が認められた培養
上清液を、実施例４と同様の方法で作製したプレートに
それぞれ５０μｌ／ウェルの量で加え、室温で１時間反
応させた。

【００９３】ＰＢＳで洗浄の後、１０倍稀釈のブロック
エースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ
結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５０μ
ｌ／ウェルの量で加え、室温で１時間反応させた。

【００９４】ＰＢＳで洗浄後、２ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ及
び０.０２％の過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸−リン
酸緩衝液（ｐＨ５.０）を５０μｌ／ウェルの量で加
え、室温で１０分間反応させて発色させた。

【００９５】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で
加えて反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定し、
陽性を示したウェル中の細胞（ハイブリドーマ）を選抜
した。さらに、選抜したウェルの上清液を用いて実施例
４に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いてイマザ
リルとの反応を検討し、抗イマザリル抗体を産生してい
たウェル中の細胞について限界希釈法によりクローニン
グを行った。

【００９６】その結果、二十数株のハイブリドーマが抗
イマザリル抗体を産生する細胞としてクローン化され、
そのうちの９Ｃ９−１−１を平成９年３月１３日に、寄
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６１４０で、工業技術院生命工
学工業技術研究所（〒３０５茨城県つくば市東１丁目１
番３号）に寄託した。

【００９７】実施例６ モノクローナル抗体の評価：９
Ｃ９−１−１抗体の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法による反
応性 クローン化したハイブリドーマ９Ｃ９−１−１に由来す
るモノクローナル抗体９Ｃ９−１−１について、各種ア
ゾール系化合物に対する反応性の検討を行った。イマザ
リル以外のアゾール系化合物としてペンコナゾール、ヘ
キサコナゾール、プロピコナゾール及びジクロブトラゾ
ルを用い、実施例４に記載した方法に従って吸光度を測
定した。さらに、得られた各濃度における吸光度から以
下の式：

【化１２】 を用いて阻害率を算出し、各アゾール系化合物に対する
反応性を調べた。

【００９８】この結果を図２に示す。図２より、９Ｃ９
−１−１抗体はイマザリルに対して高い選択性を示すこ
とが確認できた。

【００９９】実施例７ イマザリル誘導体とＨＲＰとの
結合体の作製 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に必要なプローブ結合イマザ
リル誘導体を作製するため、活性化エステル法を用いて
ＨＲＰとイマザリル誘導体との結合を行った。

【０１００】イマザリル誘導体を、０.０５ｍｍｏｌ秤
量し、無水ＤＭＦ０.２５ｍｌに溶解した。次にＮ−ヒ
ドロキシこはく酸イミド０.０５ｍｍｏｌ、ジシクロヘ
キシルカルボジイミド０.０５ｍｍｏｌを加え、室温に
て３.５時間撹拌し、反応させた。反応後、１００００
ｒｐｍで１５分間遠心し、上清と沈殿とに分離した。

【０１０１】一方、ＨＲＰ２５ｍｇをＰＢＳ２.５ｍｌ
に溶解し、無水ＤＭＦ０.５ｍｌを加えた溶液を調製し
ておき、その溶液に上記の上清０.１２５ｍｌを加え、
４℃にて１晩撹拌し、反応させた。反応後、ＨＲＰ結合
イマザリル誘導体をＰＢＳによる透析によって精製し
た。

【０１０２】実施例８ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
るイマザリルの測定 実施例５で得られたハイブリドーマ９Ｃ９−１−１をマ
ウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得られた腹水を
採取した。得られた腹水液より硫安分画法を用いてモノ
クローナル抗体を精製し、以下の試験法（直接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法）にてイマザリルの量を測定した。

【０１０３】モノクローナル抗体溶液（１０μｇ／ｍ
ｌ）を５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルプレートに入
れ、４℃で一晩静置してコーティングし、さらに４倍希
釈のブロックエースでブロッキングを行い、アッセイ用
のプレートを作製した。

【０１０４】各濃度のイマザリル及び実施例７で作製し
たＨＲＰ結合イマザリル誘導体を含む１０％メタノール
−ＰＢＳ溶液を５０μｌずつ各ウェルに入れ、２５℃で
１時間反応させた。

【０１０５】反応後、ＰＢＳで洗浄した後、２ｍｇ／ｍ
ｌのＯＰＤ及び０.０２％の過酸化水素を含む０.１Ｍク
エン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５.０）を５０μｌずつ各
ウェルに入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行っ
た。

【０１０６】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌずつ各ウェルに
加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定
した。この結果を図３に示す。図３より直接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法において、本発明のモノクーナル抗体９Ｃ９
−１−１はイマザリルの量を０.０１〜１０００ｎｇ／
ｍｌの範囲で測定することが確認できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、マウス抗血清を用いた、間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法によるイマザリルの測定を示す。

【図２】 図２は、本発明のモノクローナル抗体９Ｃ９
−１−１のアゾール系化合物に対する感度を間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法によって調べた結果を示す。

【図３】 図３は、本発明のモノクローナル抗体９Ｃ９
−１−１を用いた、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイ
マザリルの測定の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｊ 33/531 Ａ 33/531 33/563 33/563 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 藤井 淳 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 面田 内記 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (56)参考文献 Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏ ｇｉｃａ ｅｔ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉ ｃａ Ｈｕｍｇａｒｉｃａ，（1996）, Ｖｏｌ．31（３−４），ｐｐ．293−301 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 16/00 - 19/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１） 【化１】 ［式（１）中、ｎは１−１０の整数である］で表される
   構造を有する化合物。
2. 【請求項２】請求項１に記載の化合物と高分子化合物ま
   たは標識物質との結合体であって、請求項１の化合物の
   カルボキシル基部位に高分子化合物又は標識物質が結合
   している、前記結合体。
3. 【請求項３】請求項１に記載の化合物のカルボキシル基
   部位に高分子化合物を結合させることにより抗原を作製
   し、当該抗原を用いることにより、以下の式（２）： 【化２】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（２）の化合物に反応性を
   示す抗体、あるいは前記抗体のフラグメントであって式
   （２）の化合物に反応性を示す前記フラグメント、の製
   造方法。
4. 【請求項４】請求項２に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を
   示す抗体、あるいは前記抗体のフラグメントであって式
   （２）の化合物に反応性を示す前記フラグメント。
5. 【請求項５】モノクローナル抗体である、請求項４に記
   載の抗体またはそのフラグメント。
6. 【請求項６】９Ｃ９−１−１である、請求項４または５
   に記載の抗体またはそのフラグメント。
7. 【請求項７】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体またはそのフラグメントを産生するハイブリドー
   マ。
8. 【請求項８】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６１４０で寄託
   されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
9. 【請求項９】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
   抗体またはそのフラグメントを用いることを特徴とす
   る、式（２）で表される化合物の免疫学的測定方法。