CN107022024A - 一种异菌脲人工抗原的合成方法 - Google Patents

一种异菌脲人工抗原的合成方法 Download PDF

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Abstract

一种异菌脲人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以异菌脲与3‑巯基丙酸反应得到具有羧基的产物，即为半抗原IPMA，用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联，用紫外法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了异菌脲人工抗原，合成步骤简洁、有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原。

Description

一种异菌脲人工抗原的合成方法
技术领域
本发明涉及一种异菌脲人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
异菌脲（iprodione，又称扑海因）是一种二甲酰亚胺类高效广谱、触杀型低毒杀菌剂，适用于防治多种果树、蔬菜、瓜果类等作物早期落叶病、灰霉病、早疫病等病害。科学研究信息表明，若根据现有标签使用，异菌脲对人类健康造成的风险已不符合标准，因此加拿大有害生物管理局（PMRA）于2016年建议取消杀菌剂异菌脲的所有用途。我国农药残留限量标准规定香蕉、苹果、油菜籽中异菌脲的最大残留限量值（MRL）分别为 10、5、2 mg/kg。CAC、日本、美国和欧盟也制定了其在水果、蔬菜和粮食中的 MRL值，并对其残留量进行监测。因此，建立快速有效的检测异菌脲含量的方法具有重要意义及市场价值。
酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。
发明内容
本发明的目的是提供一种异菌脲人工抗原的合成方法，所制备的产品用于异菌脲免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。
本发明的技术方案，一种异菌脲人工抗原的合成方法，其由异菌脲与3-巯基丙酸反应得到具有羧基的产物，即半抗原IPMA，用碳二亚胺法将半抗原IPMA与载体蛋白偶联，即得到异菌脲人工抗原；步骤为：
（1）半抗原IPMA的合成：
合成路线如下：
将化合物1异菌脲（15.0 g，45.45 mmol）, 三乙胺（4.59 g，45.45 mmol），3-巯基丙酸化合物2（4.82 g，45.45 mmol）和四三苯基磷钯（5.24 g，4.545 mmol）加入到乙二醇二甲醚（50.0 mL），氮气保护下升温至100℃过夜。向反应液中加纯水（100 mL），二氯甲烷萃取（100mL×3），饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品，制备得半抗原IPMA。
（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原IPMA，与KLH偶联得到偶联物完全抗原IPMA-KLH；或与BSA偶联得到偶联物完全抗原IPMA-BSA。
步骤（2）所述完全抗原IPMA-KLH制备方法如下：
a、称取步骤（1）制得的IPMA 4.2mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐7mg，N-羟基琥珀酰亚胺4mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4～5h (称为A液)；取匙孔血蓝蛋白KLH 1.47mL(6.8mg/mL, IPMA与KLH摩尔比为4500︰1)，加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物IPMA-KLH混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物IPMA-KLH混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天3次换液，即得完全抗原IPMA-KLH。
步骤（2）所述完全抗原IPMA-BSA制备方法如下：
a、称取步骤（1）制得的IPMA 2.5mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐4mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.5mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4～5h (称为A液)；称取10mg 牛血清蛋白BSA（IPMA与BSA摩尔比为30︰1），溶解于2mL硼酸缓冲溶液中，称为B液；在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物IPMA-BSA混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物IPMA-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天3次换液，即得完全抗原IPMA-BSA。
异菌脲的人工抗原的鉴定
（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。
（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。
用PBS配制0.5 mg/mL的蛋白溶液与完全抗原溶液，以PBS建立基线，在波长200~500 nm间扫描，得到蛋白溶液与完全抗原溶液在半抗原的紫外吸收特征峰处的吸光值分别为A1，A2；用甲醇配制5~50 μg/mL的半抗原即为X μg/mL，以甲醇建立基线，在波长200~500nm间扫描，得到半抗原紫外吸收特征峰处的吸光值A3，半抗原的相对分子质量为M1，蛋白的相对分子质量为M2，则偶联比=[(A2-A1) (X/M1)/A3]/(0.5/M2)
本发明的有益效果：本发明成功合成了异菌脲的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径。
附图说明
图1半抗原IPMA的NMR鉴定图。
图2半抗原IPMA的LC-MS鉴定图，为IPMA的色谱图。
图3半抗原IPMA的LC-MS鉴定图，为IPMA的质谱图。
图4 IPMA-KLH人工抗原的免疫原紫外鉴定图。
图5 IPMA-BSA人工抗原的免疫原紫外鉴定图。
具体实施方式
实施例1 半抗原IPMA的合成
将化合物1（15.0 g，45.45 mmol）, 三乙胺（4.59 g，45.45 mmol），化合物2（4.82 g，45.45 mmol）和 四三苯基磷钯（5.24 g，4.545 mmol）加入到乙二醇二甲醚（50.0 mL），氮气保护下升温至100度过夜。向反应液中加水（100 mL），二氯甲烷萃取（100 mL×3），饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品，制备得半抗原IPMA。
（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原IPMA，与KLH偶联得到偶联物完全抗原IPMA-KLH；或与BSA偶联得到偶联物完全抗原IPMA-BSA。
实施例2所述完全抗原IPMA-KLH制备方法如下：
a、称取步骤（1）制得的IPMA 4.2mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐7mg，N-羟基琥珀酰亚胺4mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4～5h (称为A液)。取匙孔血蓝蛋白KLH 1.47mL(6.8mg/mL, IPMA与KLH摩尔比为4500︰1)，加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物IPMA-KLH混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物IPMA-KLH混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天3次换液，即得完全抗原IPMA-KLH。
实施例3所述完全抗原IPMA-BSA制备方法如下：
a、称取步骤（1）制得的IPMA 2.5mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐4mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.5mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4～5h (称为A液)。称取10mg 牛血清蛋白BSA（IPMA与BSA摩尔比为30︰1），溶解于2mL硼酸缓冲溶液中(称为B液)，在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物IPMA-BSA混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物IPMA-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天3次换液，即得完全抗原IPMA-BSA。
实施例4 异菌脲人工抗原的鉴定
（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。
（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。
偶联物蛋白浓度测定：将反应前蛋白的质量除以透析后偶联物的体积即可得到偶联中蛋白的含量。
实施例2中IPMA-KLH免疫原的紫外鉴定图如图4所示。
实施例3中IPMA-BSA免疫原的紫外鉴定图如图5所示。
根据偶联比公式：
偶联物IPMA-KLH的特征吸收峰在261 nm处，此处的吸光值A2=1.347873，KLH在此处的吸光值A1=0.61594，IPMA的特征吸收峰A3=0.294646，IPMA的相对分子质量M1=369.67，KLH的相对分子质量M2=4000000，X为15 μg/mL，则根据公式：
偶联比=[(A2-A1) (X/M1)/A3]/(0.5/M2)，IPMA-KLH中半抗原IPMA与蛋白KLH的偶联比为806.38︰1。
同法估算IPMA-BSA中IPMA与BSA的偶联比为14.05︰1。

Claims (3)

1.一种异菌脲人工抗原的合成方法，其特征在于其由异菌脲与3-巯基丙酸反应得到具有羧基的产物，即半抗原IPMA，用碳二亚胺法将半抗原IPMA与载体蛋白偶联，即得到异菌脲人工抗原；步骤为：
（1）半抗原IPMA的合成：
合成路线如下：
将化合物1异菌脲15.0 g，三乙胺4.59 g，3-巯基丙酸化合物2 4.82 g和 四三苯基磷钯5.24 g，加入到50.0 mL乙二醇二甲醚中，氮气保护下升温至100℃过夜；向反应液中加100 mL纯水，100 mL/次二氯甲烷萃取3次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品，制备得半抗原IPMA；
（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原IPMA，与KLH偶联得到偶联物完全抗原IPMA-KLH；或与BSA偶联得到偶联物完全抗原IPMA-BSA。
2.如权利要求1所述异菌脲人工抗原的合成方法，其特征在于：步骤（2）所述完全抗原IPMA-KLH制备方法如下：
a、称取步骤（1）制得的IPMA 4.2mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐7mg，N-羟基琥珀酰亚胺4mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4～5h，称为A液；取匙孔血蓝蛋白KLH 1.47mL，6.8mg/mL，IPMA与KLH摩尔比为4500︰1，加入等体积硼酸缓冲溶液，称为B液；在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物IPMA-KLH混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物IPMA-KLH混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天3次换液，即得完全抗原IPMA-KLH。
3.如权利要求1所述异菌脲人工抗原的合成方法，其特征在于：步骤（2）所述完全抗原IPMA-BSA制备方法如下：
a、称取步骤（1）制得的IPMA 2.5mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐4mg，N-羟基琥珀酰亚胺2.5mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4～5h，称为A液；称取10mg 牛血清蛋白BSA，IPMA与BSA摩尔比为30︰1，溶解于2mL硼酸缓冲溶液中，称为B液；在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物IPMA-BSA混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物IPMA-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天3次换液，即得完全抗原IPMA-BSA。
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