CN102718670A - 一种莱克多巴胺半抗原、人工抗原及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莱克多巴胺半抗原、人工抗原及其制备方法。本发明提供的莱克多巴胺半抗原，其结构式为如下式Ⅱ所示：

Description

一种莱克多巴胺半抗原、人工抗原及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种莱克多巴胺半抗原、人工抗原及其制备方法。

背景技术

莱克多巴胺是一种医药原料，具有广泛的生理效应，可用治疗充血性心力衰竭症的强心药，且常用于支气管哮喘、支气管痉挛和产科疾病的治疗。当其用量增加到临床用量的5-10倍时，可增加肌肉生长，减少脂肪蓄积，是良好的营养分配剂和生长促进剂。美国FDA在2000年批准，可以用于动物营养重新配剂，广泛地用于畜牧业和养殖业。可以同时提高动物的日增重，提高饲料利用率，提高动物的蛋白质含量。但是其在动物体内的残留一旦经食物链进入人体，会对食用者产生巨大危害，特别对心脏病、糖尿病、高血压、甲亢、青光眼、前列腺肥大等病人危害更大，甚至死亡，如瘦肉精在上海曾经引发几百人的中毒事件；在台湾由于从美国进口的猪肉里含有瘦肉精，几乎挑起一场政治争端。目前我国禁止将β-激动剂等药物动物促生长剂使用。但长期以来，各种因非法使用β-激动剂而造成的中毒事件时有发生。为打击非法用药，保护消费者的健康与安全，迫切需要健全相关的检测方法。

目前，兽药残留检测常用的方法有气相色谱、高效液相色谱以及气质联用等理化分析方法。虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析鉴于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，在莱克多巴胺的残留检测中起着越来越重要的作用。

影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。

目前莱克多巴胺抗体的制备一般采用琥珀酸酐与混合酸酐联用法，此法以莱克多巴胺的亚氨基为偶联位点，用多元酸酐法使其与戊二酸酐反应引入游离羧基，然后用混合酸酐法使其生成混合酐，再在载体蛋白的游离氨基反应生成酰胺键，从而与载体偶联，增加了一个五个碳原子的间隔臂；或采用1,4-丁二醚作为连接臂活化载体蛋白，活化载体上的1,4-丁二醚游离的环氧基团与莱克多巴胺的2个苯酚基团中的任何一个反应而完成抗原的合成，增加一个四个碳原子的间隔臂。但是含有五个或四个碳原子的间隔臂可以在空间自由旋转，使连接的莱克多巴胺分子有可能被载体蛋白遮蔽，影响动物机体的识别。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种莱克多巴胺半抗原。

本发明提供的莱克多巴胺半抗原，其结构式为如下式Ⅱ所示：

本发明的第二个目的是提供一种上述的莱克多巴胺半抗原的制备方法。

本发明提供的制备方法，包括如下步骤：

1）莱克多巴胺与溴苄间甲酸甲酯在60-80℃反应12-18小时，得到中间产物；

2）水解所述中间产物，即得到上述的莱克多巴胺半抗原。

上述方法中，步骤1）中，所述莱克多巴胺与所述溴苄间甲酸甲酯的摩尔比为1∶1-1.5；在实施例中具体为1∶1；

上述莱克多巴胺与所述溴苄间甲酸甲酯的质量比为300∶230。

所述反应是在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为含有K₂CO₃的丙酮溶液（溶质为K₂CO₃、溶剂为丙酮）；

步骤2）中，所述水解采用LiOH水溶液；所述水解的时间为3h-5h。

上述方法中，在所述步骤1）和步骤2）之间，还包括如下步骤：先将所述中间产物经乙酸乙酯萃取收集有机相，再将所述有机相干燥后经薄层色谱纯化收集R_f值为0.2的产物；其中，所述薄层层析的流动相具体为等体积的乙酸乙酯和石油醚=1∶1混合物；

在所述步骤2）中，在水解所述中间产物的步骤后还包括依次将所述水解产物经乙醚萃取，收集有机相A，调节有机相ApH值为2-3、乙酸乙酯萃取收集有机相B，再将所述有机相B经薄层色谱纯化收集R_f值为0.4的产物，得到所述莱克多巴胺半抗原；其中，所述薄层层析的流动相具体为体积比为9∶1的二氯甲烷和甲醇混合物。

本发明的第三个目的是提供一种莱克多巴胺抗原。

本发明提供的莱克多巴胺抗原，为将上述的莱克多巴胺半抗原和载体蛋白偶联，得到莱克多巴胺抗原。

上述莱克多巴胺抗原中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）。

上述莱克多巴胺抗原的结构式如式Ⅲ所示：

本发明的第四个目的是提供一种制备上述的莱克多巴胺抗原的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

将莱克多巴胺半抗原溶液加入载体蛋白溶液中，反应，得到所述的莱克多巴胺抗原。

上述方法中，所述莱克多巴胺半抗原溶液按照如下方法制备：将N,N-二甲基甲酰胺、1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、上述的莱克多巴胺半抗原和水混合，得到莱克多巴胺半抗原溶液；

所述载体蛋白溶液为将所述载体蛋白溶于pH为7.4、浓度为0.01M磷酸盐缓冲液得到的溶液。

上述方法中，所述反应的时间为12h-16h；

所述混合的时间为3h-5h；

所述N,N-二甲基甲酰胺、所述水、所述1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺、所述的莱克多巴胺半抗原的配比为2ml∶3ml∶30mg∶30mg∶20mg。

上述的莱克多巴胺半抗原或上述的莱克多巴胺抗原在检测莱克多巴胺或制备检测莱克多巴胺的产品中的应用也是本发明保护的范围。

由上述的莱克多巴胺半抗原或上述的莱克多巴胺抗原制备的抗体也是本发明保护的范围。

本发明的第五个目的是提供一种化合物，其结构式为如下式Ⅰ：

上述式Ⅰ所示的化合物的制备方法如下将莱克多巴胺与溴苄间甲酸甲酯在60℃-80℃反应12-18小时，得到式Ⅰ所示的化合物；所述莱克多巴胺与所述溴苄间甲酸甲酯的摩尔比1∶1-1.5；在实施例中具体为1∶1；

所述反应是在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为含有K₂CO₃的丙酮溶液；

本发明采用溴苄间甲酸作为莱克多巴胺和载体蛋白的间隔臂，莱克多巴胺与载体蛋白通过氧苄基连接，可以大大降低莱克多巴胺在空间的自由旋转，提高动物机体识别的几率，从而制备出具有更高亲和力和特异性的抗体。

本发明的实验证明，本发明的莱克多巴胺半抗原的设计位点在莱克多巴胺的-OH位置，把-OH通过化学合成改造成含有苄基苯甲酸的基团，使其具有一定长度的刚性连接臂，同时又具有与蛋白质偶联的-COOH。本发明合成的莱克多巴胺半抗原为国内外首创的新化合物，既最大程度地保留了莱克多巴胺的化学结构，又具有刚性的连接臂。用这一半抗原合成的莱克多巴胺抗原作为免疫原，免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好。所得抗体用于ELISA方法检测莱克多巴胺，半数抑制率可达0.16ng/mL（0.16ppb），检测灵敏度高，与其他β-兴奋剂类药物交叉反应率低。本发明的莱克多巴胺半抗原、人工抗原，合成方法简单，纯度和产率较高。

附图说明

图1为莱克多巴胺半抗原中间体的正离子与负离子质谱图

图2为莱克多巴胺半抗原的核磁共振氢谱图

图3为莱克多巴胺免疫原的紫外光谱图

图4为莱克多巴胺人工抗原获得的抗血清的检测

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用pH为7.4、浓度为0.01M磷酸盐缓冲液的配方如下：称7.9gNaCl、0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄和1.8g K₂HPO₄，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。

下述实施例中所用的0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液，配方如下：碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g、用双蒸水溶解至1000mL，pH 9.6。

实施例1、莱克多巴胺半抗原的制备

莱克多巴胺半抗原的合成过程如下：

1、莱克多巴胺半抗原中间体的合成

300mg莱克多巴胺溶于5ml丙酮中，于单口瓶中搅拌，加入230mg溴苄间甲酸甲酯，莱克多巴胺和溴苄间甲酸甲酯摩尔比1∶1，再加入K₂CO₃，水浴60°C加热搅拌18小时，薄层色谱监控反应。反应完成之后，加少量水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，收集有机相，再将所述有机相干燥，旋干，经薄层色谱（乙酸乙酯/石油醚=1∶1）纯化，获得在R_f值为0.2的物质150mg，即为莱克多巴胺半抗原中间体（结构如下式Ⅰ），产率34%。

用质谱确定其结构，见图1，上为正离子信号，下为负离子信号。

MS（ESIsource，positive）：450.1（M+1）

MS（ESIsource，negative）：448.0（M-1）

该物质的分子量为449，这正是莱克多巴胺半抗原中间体的分子量。初步说明莱克多巴胺半抗原合成成功。

2、莱克多巴胺半抗原的合成

100mg莱克多巴胺中间体加20%LiOH水溶液进行水解3h，用30ml乙醚萃取杂质，收集有机相加酸（1M HCl）调pH值至2，再用50ml乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液（有机相），用30ml NaCl洗涤，Na₂SO₄干燥，旋干，薄层色谱纯化（二氯甲烷/甲醇=9:1），Rf=0.4，获莱克多巴胺半抗原85mg，产率88%，结构如下式Ⅱ所示。

所得莱克多巴胺半抗原，用核磁确定其结构，见图2：¹H NMR：d₆-DMSO δ：0.88(m,3H,CH ₃ -CH),1.34-1.72(m,2H,CH₂-CH ₂ -CH),2.23(m,1H,),2.41-2.59(m,2H),3.47(m,2H,BIAN),3.78(m,2H),4.45(t,1H),6.76(m,5H),6.85(d,1H),7.02(dd,2H),7.28(m,2H),7.75(t,1H),7.89(s,1H)，证明该半抗原合成成功。

实施例2、莱克多巴胺人工抗原的制备

1、莱克多巴胺人工抗原的制备

称量20mg由实施例1得到的莱克多巴胺半抗原，用2ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和3ml H₂O溶解，加入30mg 1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和30mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温（25℃）磁力搅拌混合反应3h，反应完毕后称为A液。取BSA 100mg溶解于10ml的0.01M,pH 7.4磷酸盐缓冲液中，称为B液。将A液逐滴加入到B液中，边加边搅拌，置室温（25℃）下磁力搅拌反应过夜（12h），离心后取上清，4℃0.01M,pH 7.4磷酸盐缓冲液中透析3天。每天更换透析液2次，使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，得到产物，供免疫用。

2、莱克多巴胺人工抗原的鉴定

将上述产物用pH为7.4、浓度为0.01M磷酸盐缓冲液配成溶液进行紫外（200-400nm）光谱扫描，结果如图3所示，在220-240nm之间的吸收峰，BSA为235nm，莱克多巴胺（RAC）为229nm，产物（RAC-BSA）的吸收峰位移至BSA与RAC的吸收峰之间，为232nm。初步说明产物为莱克多巴胺人工抗原（式Ⅲ），莱克多巴胺半抗原与载体蛋白BSA成功偶联（见图3）。

实施例3、莱克多巴胺抗原的应用

1、抗血清的获得

采用新西兰大白兔为免疫动物，以由实施例2得到的莱克多巴胺人工抗原（莱克多巴胺抗原）为免疫原，免疫剂量1mg/kg，首免时将免疫原与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，颈背部皮下多点注射，间隔3周取等量免疫原与弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂，加强免疫一次，共免疫7次，最后一次不加佐剂。待检测免疫血清后，就可进行采血。本实验采用心脏采血法。每只兔子可得血80ml左右，取完血清后在4℃冰箱5小时，然后以5000rpm离心10min，分离血清。

2、抗血清的测定

由实施例2得到的莱克多巴胺抗原按上述方法免疫了五只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，七免之后采集血清测定其灵敏度，其中2号兔子的测定结果如下。

具体步骤为：

(1)包被：用包被缓冲液（0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液）将由实施例1得到的莱克多巴胺抗原稀释为0.05μg/ml，100μL/孔，4℃过夜；

(2)洗涤与封闭：倾去孔内液体，用洗涤液（0.01mol/L PBS含0.05%（体积百分含量）的Tween 20）洗涤3次，每次3分钟；每孔加入150μL封闭液（0.01mol/LPBS含5%（质量百分含量）的酪蛋白），37℃恒温封闭1h，然后洗涤3次，每次3分钟；

(3)加样：将50μL抗血清与等体积不同浓度的莱克多巴胺标准液（1mg莱克多巴胺溶解于1ml DMF，用PBS稀释系列浓度为0ng/ml、0.01ng/ml,0.05ng/ml,0.1ng/ml，0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml）加到酶标板上反应，37℃反应1小时，洗涤同步骤（2）；然后每孔加入100μL HRP-羊抗兔IgG（上海逸峰生物科技有限公司,SU2567），37℃反应1小时，洗涤同步骤（2）；

(4)显色测定：每孔加入TMB溶液100μL，37℃显色20min，然后每孔加入50μL2molL^-1 H₂SO₄以终止反应，最后用酶标仪测定各孔的OD_450nm值。

莱克多巴胺标准曲线结果如图4所示，半数抑制量（IC₅₀）为0.16ng/mL，说明获得的抗血清灵敏度很高，从而说明莱克多巴胺人工抗原合成成功。

3、抗血清的特异性检测

抗血清的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应率作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗血清的特异性越好。

按照抗血清测定的步骤，将莱克多巴胺、莱克多巴胺半抗原中间体、莱克多巴胺半抗原和莱克多巴胺结构类似物分别做系列稀释（0ng/ml、0.01ng/ml,0.05ng/ml,0.1ng/ml，0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml），结构类似物的配置方法与莱克多巴胺标准液的配置方法相同。分别与获得的2号兔子抗血清反应，制作标准曲线，计算类似物抑制率50%时的剂量，然后根据公式如下，计算出结构类似物的交叉反应率：

交叉反应率：（莱克多巴胺IC₅₀/类似物IC₅₀）×100%；

上述莱克多巴胺的结构类似物分别为沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、四环素、磺胺二甲嘧啶、阿莫西林、恩诺沙星、土霉素。

通过实验得出，与莱克多巴胺、莱克多巴胺半抗原中间体、莱克多巴胺半抗原的交叉反应率分别为100%、109%和120%，与β-兴奋剂其他药物及常用抗菌药，如沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、四环素、磺胺二甲嘧啶、阿莫西林、恩诺沙星、土霉素无交叉反应（<0.1%）。

Claims (10)

1.一种莱克多巴胺半抗原，其结构式为如下式Ⅱ所示：

2.一种权利要求1所述的莱克多巴胺半抗原的制备方法，包括如下步骤：

1）莱克多巴胺与溴苄间甲酸甲酯在60℃-80℃反应12-18小时，得到中间产物；

2）水解所述中间产物，即得到权利要求1所述的莱克多巴胺半抗原。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤1）中，所述莱克多巴胺与所述溴苄间甲酸甲酯的摩尔比1∶1-1.5；

所述反应是在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为含有K₂CO₃的丙酮溶液；

步骤2）中，所述水解采用LiOH水溶液；所述水解的时间为3h-5h。

4.一种莱克多巴胺抗原，为将权利要求1所述的莱克多巴胺半抗原和载体蛋白偶联，得到莱克多巴胺抗原。

5.根据权利要求4所述的莱克多巴胺抗原，其特征在于：

所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

6.根据权利要求4或5所述的莱克多巴胺抗原，其特征在于：

所述莱克多巴胺抗原的结构式如式Ⅲ所示：

7.一种制备权利要求4-6中任一所述的莱克多巴胺抗原的方法，包括如下步骤：

将莱克多巴胺半抗原溶液加入载体蛋白溶液中，反应，得到所述的莱克多巴胺抗原。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述莱克多巴胺半抗原溶液按照如下方法制备：将N,N-二甲基甲酰胺、1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、权利要求1所述的莱克多巴胺半抗原和水混合，得到所述莱克多巴胺半抗原溶液；

所述载体蛋白溶液为将所述载体蛋白溶于pH为7.4、浓度为0.01M磷酸盐缓冲液得到的溶液。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：

所述反应的时间为12h-16h；

所述混合的时间为3h-5h；

所述N,N-二甲基甲酰胺、所述水、所述1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺、权利要求1所述的莱克多巴胺半抗原的配比为2ml∶3ml∶30mg∶30mg∶20mg。

10.权利要求1所述的莱克多巴胺半抗原或权利要求4-6中任一所述的莱克多巴胺抗原在检测莱克多巴胺或制备检测莱克多巴胺的产品中的应用；

或由权利要求1所述的莱克多巴胺半抗原或权利要求4-6中任一所述的莱克多巴胺抗原制备的抗体；

或一种化合物，其结构式为如下式Ⅰ：

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