CN107474130A - 一种阿莫西林人工抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种阿莫西林人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明包括：将阿莫西林母核结构类似物舒巴坦与阿莫西林半抗原进行偶联，得到新的阿莫西林半抗原，再通过氯甲酸异丁酯法将半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联，透析后得到阿莫西林完全抗原。通过凝胶电泳分析完全抗原和BSA的蛋白条带得出阿莫西林成功偶联到BSA上，并通过动物免疫得到的抗体证实了人工抗原成功合成。本合成方法增大了阿莫西林的分子量近一步增强了阿莫西林的免疫原性，增强免疫效果，为阿莫西林高灵敏抗体的制备提供了重要的依据。
Description
技术领域
一种阿莫西林人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
阿莫西林（AMX），又名安莫西林或安默西林，是一种最常用的半合成青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，是目前应用较为广泛的口服半合成青霉素之一，抗菌谱及抗菌活性与氨苄西林基本相同，但其耐酸性较氨苄西林强，其杀菌作用较后者强而迅速，半衰期约为61.3分钟，在酸性条件下更为稳定。阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞壁的能力也强，口服后药物分子中的内酰胺基立即水解生成肽键，迅速和菌体内的转肽酶结合使之失活。可广泛用于治疗人类与动物的尿道、呼吸道等的敏感菌感染，然而随着阿莫西林的广泛应用，其在动物原性食品中的残留问题引起人们的广泛关注，对阿莫西林残留物的检测成为关键。
目前检测阿莫西林的方法主要有分光光度法，如：紫外分光光度法、比色法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法、荧光分光光度法等；还包括高效液相色谱法（HPLC），虽然这些方法能够实现阿莫西林的检测，然而分光光度法检测灵敏度低，不能达到低残留样品的检测需求，而HPLC法需要昂贵的仪器和复杂的样品前处理流程，不能实现快速、普遍通用的检测效果。因此目前开发了基于抗原抗体反应的酶联免疫方法（ELISA），这种方法操作简单方便，不需要专业的操作人员，要想获得较好的检测效果，制备高灵敏高选择性的抗体是此类方法的必要因素，而高质量抗体的获得首先需要高免疫原性的抗原，因此抗原的制备是此类方法成功的关键。
目前阿莫西林抗原的合成方法用的最多的是碳二亚胺法，然而阿莫西林分子结构同时含有氨基和羧基，碳二亚胺法会使得阿莫西林自身氨基羧基发生偶联，使得合成产率较低，同时此方法本身合成副产物较多，较低合成后的抗原纯度。因此，急需开发一种高产率高纯度的阿莫西林抗原合成方法。
发明内容
要解决的技术问题：现有碳二亚胺合成阿莫西林抗原的方法产物合成率低，副产物较多，并且阿莫西林只有在酸性条件下较为稳定，并且进入机体后极易容易水解，从而降低抗原的免疫原性，因此需要近一步提高抗原的合成产率和免疫原性。
技术方案：一种阿莫西林人工抗原的合成方法，包括如下步骤：
（1）半抗原的合成
将阿莫西林与舒巴坦以1:1.2~1:2的摩尔比通过碳二亚胺法进行偶联，首先将舒巴坦用2-吗啉乙磺酸缓冲液进行溶解，然后舒巴坦与碳二亚胺以1:3~1:5的摩尔比加入碳二亚胺溶液，在磁力搅拌的状态下反应2h后，将反应液冷冻干燥，从而得到偶联舒巴坦的阿莫西林半抗原固体。
（2）完全抗原的合成
将步骤（1）得到的半抗原2mg用1mL N-N二甲基甲酰胺进行溶解，加入20μL三正丁胺，在4℃条件下反应20min后再加入35μL氯甲酸异丁酯继续反应2h，将其以30:1~70:1的摩尔比在搅拌状态下逐滴加入到0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液溶解的牛血清白蛋白BSA中反应5h；将偶联产物在4℃条件下用生理盐水进行透析，每隔3h换一次透析液，一共透析四次，得到阿莫西林完全人工抗原。
（3）人工抗原的鉴定
凝胶电泳鉴定：将步骤（2）得到的人工抗原通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE进行分析，BSA和人工抗原的上样量均为3μg，分析人工抗原和BSA的电泳条带位置；
蛋白质浓度测定：将BSA用超纯水配置成1mg/mL的浓度，然后将其稀释成0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL的浓度，每种浓度取100μL加入1.5mL离心管中，同时另取100μL水作为空白孔加入离心管中，取预先配置好的考马斯亮蓝试剂加入离心管中，每管400μL，室温下避光反应5min后，测定595nm的吸光值，从而得到BSA浓度和595nm吸光值关系的标准曲线。将人工抗原稀释到0.01-0.1mg/mL的浓度范围，用此方法测定人工抗原的蛋白浓度。
本发明所述的一种阿莫西林人工抗原的合成方法中阿莫西林与舒巴坦以1:1.2的摩尔比进行偶联。
本发明所述的一种阿莫西林人工抗原的合成方法中舒巴坦与碳二亚胺的摩尔比为1:4。
本发明所述的一种阿莫西林人工抗原的合成方法中所述的步骤（2）中半抗原与BSA的摩尔比为50:1。
本发明所述的一种阿莫西林人工抗原的合成方法中所述的SDS-PAGE的凝胶浓度为10%。
一种应用上述方法合成的人工抗原制备阿莫西林抗体的方法，包括如下步骤：
动物免疫
用上述方法制备的人工抗原作免疫原，取等量抗原与弗氏完全佐剂，两者在注射器中充分乳化后皮下注射5只10周龄的BALB/C雄性小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100μg，间隔三周后通过皮下注射进行加强免疫，加强免疫时将等量抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化，每只小鼠的免疫剂量为100μg。免疫五次后对小鼠进行尾部采血，并离心取血清。
测定抗体效价
将阿莫西林包被原用0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液进行溶解，配成浓度为1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL的包被浓度，每种包被浓度加入96孔酶标板的一列，每孔加样量为100μL，将其放入37℃烘箱中孵育2h，然后用含0.5%Tween-20的0.01MpH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，甩干后用 1% 的明胶作为封闭液在37℃封闭2h，取出洗涤三次甩干。将抗血清稀释1000、3000、9000、27000倍，每种稀释倍数的抗体加入到四条酶标板的一横行，每个孔加100μL，37℃孵育30min后洗涤干净，再加入1:3000的羊抗鼠二抗100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤干净，再用100μL/孔的显色液显色15min，最后加入50μL/孔的终止液，用酶标仪测定480nm处的吸光值。
间接ELISA的测定
用1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL的阿莫西林包被原包被3条酶标板100μL/孔，将其放入37℃烘箱中孵育2h，然后用含0.5%Tween-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，甩干后用 1% 的明胶作为封闭液在37℃封闭2h后，取出洗涤三次甩干。将阿莫西林标准品配成50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL的6个浓度梯度，3条酶标板的第一行加入50μL/孔的0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，从第二行开始每行依次加入从低浓度到高浓度的阿莫西林标准品50μL/孔，然后再加入50μL/孔的1:1000稀释的阿莫西林抗血清，37℃孵育30min后洗涤干净，再加入1:3000的羊抗鼠二抗100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤干净，再用100μL/孔的显色液显色15min，最后加入50μL/孔的终止液，用酶标仪测定480nm处的吸光值。
有益效果：本发明将阿莫西林母核结构类似物舒巴坦与阿莫西林半抗原进行偶联，得到新的阿莫西林半抗原。舒巴坦与阿莫西林的偶联不仅封闭了阿莫西林的氨基基团，仅保留阿莫西林的羧基基团与载体蛋白偶联，同时增加了阿莫西林母核结构类似物，增大了阿莫西林的分子量，近一步增强了阿莫西林的免疫原性，增强免疫效果。
附图说明
图1 阿莫西林与舒巴坦偶联的流程图。
图2 AMX-BSA和BSA的SDS-PAGE图。
具体实施方式
实施例1
一种阿莫西林人工抗原的合成方法，包括如下步骤：
（1）半抗原的合成
将阿莫西林与舒巴坦以1:1.5的摩尔比通过碳二亚胺法进行偶联，首先将舒巴坦用2-吗啉乙磺酸缓冲液进行溶解，然后舒巴坦与碳二亚胺以1:4的摩尔比加入碳二亚胺溶液，在磁力搅拌的状态下反应2h后，将反应液冷冻干燥，从而得到偶联舒巴坦的阿莫西林半抗原固体。
（2）完全抗原的合成
将步骤（1）得到的半抗原2mg用1mL N-N二甲基甲酰胺进行溶解，加入20μL三正丁胺，在4℃条件下反应20min后再加入35μL氯甲酸异丁酯继续反应2h，将其以50:1的摩尔比在搅拌状态下逐滴加入到0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液溶解的牛血清白蛋白BSA中反应5h；将偶联产物在4℃条件下用生理盐水进行透析，每隔3h换一次透析液，一共透析四次，得到阿莫西林完全人工抗原。
（3）人工抗原的鉴定
凝胶电泳鉴定：将步骤（2）得到的人工抗原通过10%SDS-PAGE进行分析，BSA和人工抗原的上样量均为3μg，分析人工抗原和BSA的蛋白条带得出，人工抗原的条带位置在BSA的上边，也就是说人工抗原的电泳速度比BSA慢，分子量比BSA大，从而说明阿莫西林成功偶联到了BSA上；
蛋白质浓度测定：将BSA用超纯水配置成1mg/mL的浓度，然后将其稀释成0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL的浓度，每种浓度取100μL加入1.5mL离心管中，同时另取100μL水作为空白孔加入离心管中，取预先配置好的考马斯亮蓝试剂加入离心管中，每管400μL，室温下避光反应5min后，测定595nm的吸光值，从而得到BSA浓度和595nm吸光值关系的标准曲线。将人工抗原稀释到0.01-0.1mg/mL的浓度范围，用此方法测定人工抗原的蛋白浓度为5mg/mL。
（4）阿莫西林抗体的制备方法：
a) 动物免疫
用制备好的人工抗原作为免疫原，取等量抗原与弗氏完全佐剂，两者在注射器中充分乳化后皮下注射5只10周龄的BALB/C雄性小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100μg，间隔三周后通过皮下注射进行加强免疫，加强免疫时将等量抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化，每只小鼠的免疫剂量为100μg。免疫五次后对小鼠进行尾部采血，并离心取血清。
b) 测定抗体效价
将阿莫西林包被原用0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液进行溶解，配成浓度为1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL的包被浓度，每种包被浓度加入96孔酶标板的一列，每孔加样量为100μL，将其放入37℃烘箱中孵育2h，然后用含0.5%Tween-20的0.01MpH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，甩干后用 1% 的明胶作为封闭液在37℃封闭2h，取出洗涤三次甩干。将抗血清稀释1000、3000、9000、27000倍，每种稀释倍数的抗体加入到四条酶标板的一横行，每个孔加100μL，37℃孵育30min后洗涤干净，再加入1:3000的羊抗鼠二抗100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤干净，再用100μL/孔的显色液显色15min，最后加入50μL/孔的终止液，用酶标仪测定480nm处的吸光值。
c) 间接ELISA的测定
用1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL的阿莫西林包被原包被3条酶标板100μL/孔，将其放入37℃烘箱中孵育2h，然后用含0.5%Tween-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，甩干后用 1% 的明胶作为封闭液在37℃封闭2h后，取出洗涤三次甩干。将阿莫西林标准品配成50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL的6个浓度梯度，3条酶标板的第一行加入50μL/孔的0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，从第二行开始每行依次加入从低浓度到高浓度的阿莫西林标准品50μL/孔，然后再加入50μL/孔的1:1000稀释的阿莫西林抗血清，37℃孵育30min后洗涤干净，再加入1:3000的羊抗鼠二抗100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤干净，再用100μL/孔的显色液显色15min，最后加入50μL/孔的终止液，用酶标仪测定480nm处的吸光值。从下表中看出，得到的抗体对阿莫西林的抑制效果明显。
。
Claims (9)
1.一种阿莫西林人工抗原的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
半抗原的合成
将阿莫西林与舒巴坦以1:1.2~1:2的摩尔比通过碳二亚胺法进行偶联，首先将舒巴坦用2-吗啉乙磺酸缓冲液进行溶解，然后舒巴坦与碳二亚胺以1:3~1:5的摩尔比加入碳二亚胺溶液，在磁力搅拌的状态下反应2h后，将反应液冷冻干燥，从而得到偶联舒巴坦的阿莫西林半抗原固体；
完全抗原的合成
将步骤（1）得到的半抗原2mg用1mL N-N二甲基甲酰胺进行溶解，加入20μL三正丁胺，在4℃条件下反应20min后再加入35μL氯甲酸异丁酯继续反应2h，将其以30:1~70:1的摩尔比在搅拌状态下逐滴加入到0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液溶解的牛血清白蛋白BSA中反应5h；将偶联产物在4℃条件下用生理盐水进行透析，每隔3h换一次透析液，一共透析四次，得到阿莫西林完全人工抗原；
人工抗原的鉴定
将步骤（2）得到的人工抗原通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分析阿莫西林与BSA的偶联效果，并通过考马斯亮蓝法测定偶联物蛋白的含量。
2.根据权利要求1所述的一种阿莫西林人工抗原的合成方法，其特征在于所述的阿莫西林与舒巴坦以1:1.5的摩尔比进行偶联。
3.根据权利要求1所述的一种阿莫西林人工抗原的合成方法，其特征在于所述的舒巴坦与碳二亚胺的摩尔比为1:4。
4.根据权利要求1所述的一种阿莫西林人工抗原的合成方法，其特征在于所述的步骤（2）中半抗原与BSA的摩尔比为50:1。
5.根据权利要求1所述的一种阿莫西林人工抗原的合成方法，其特征在于所述的SDS-PAGE的凝胶浓度为10%。
6.一种应用权利要求1所述的一种阿莫西林人工抗原的合成方法合成的人工抗原制备阿莫西林抗体的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）动物免疫
用权利要求1制备的人工抗原作免疫原，取等量抗原与弗氏完全佐剂，两者在注射器中充分乳化后皮下注射5只10周龄的BALB/C雄性小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100μg，间隔三周后通过皮下注射进行加强免疫，加强免疫时将等量抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化，每只小鼠的免疫剂量为100μg。
7.免疫五次后对小鼠进行尾部采血，并离心取血清；
测定抗体效价
将阿莫西林包被原用0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液进行溶解，配成浓度为1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL的包被浓度，每种包被浓度加入96孔酶标板的一列，每孔加样量为100μL，将其放入37℃烘箱中孵育2h，然后用含0.5%Tween-20的0.01MpH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，甩干后用 1% 的明胶作为封闭液在37℃封闭2h，取出洗涤三次甩干。
8.将抗血清稀释1000、3000、9000、27000倍，每种稀释倍数的抗体加入到四条酶标板的一横行，每个孔加100μL，37℃孵育30min后洗涤干净，再加入1:3000的羊抗鼠二抗100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤干净，再用100μL/孔的显色液显色15min，最后加入50μL/孔的终止液，用酶标仪测定480nm处的吸光值；
间接ELISA的测定
用1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL的阿莫西林包被原包被3条酶标板100μL/孔，将其放入37℃烘箱中孵育2h，然后用含0.5%Tween-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，甩干后用 1% 的明胶作为封闭液在37℃封闭2h后，取出洗涤三次甩干。
9.将阿莫西林标准品配成50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL的6个浓度梯度，3条酶标板的第一行加入50μL/孔的0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，从第二行开始每行依次加入从低浓度到高浓度的阿莫西林标准品50μL/孔，然后再加入50μL/孔的1:1000稀释的阿莫西林抗血清，37℃孵育30min后洗涤干净，再加入1:3000的羊抗鼠二抗100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤干净，再用100μL/孔的显色液显色15min，最后加入50μL/孔的终止液，用酶标仪测定480nm处的吸光值。
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