CN1908664B - 多簇抗原及制备方法、宽谱特异性多克隆抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多簇抗原的制备方法，选用2～15种不同的小分子化合物半抗原，以蛋白质分子为载体，依次进行以下步骤：1)在蛋白质分子上通过偶联方法偶联上一种小分子化合物半抗原分子，进行透析纯化；2)以上述步骤所得的产物为载体，继续偶联另一种小分子化合物半抗原分子，再进行透析纯化；3)重复步骤2)直至偶联完所有的小分子化合物半抗原。本发明还公开了上述制备方法制得的多簇抗原，以及根据上述多簇抗原制得的宽谱特异性多克隆抗体。本发明的宽谱特异性多克隆抗体的用途是：用于对含有上述小分子化合物的样品进行检测。
Description
技术领域
本发明属于小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析技术领域，具体涉及一种多簇抗原及制备方法、以及一种多克隆抗体及其用途。
背景技术
目前用于免疫化学分析的抗体主要是单克隆抗体和多克隆抗体两类，大多是针对单一目标化合物的检测，有很高的专一性和特异性。但对于农药、兽药等小分子化合物多残留分析，免疫学方法通常有两种途径，一种是先针对不同的农药等小分子化合物，分别制备相应的特异性抗体，然后将这些抗体一起使用，可同时检测多种农药等小分子化合物。另一种方法是针对一类农药等小分子化合物同系物的共性结构来设计和合成半抗原，从而得到对于特定的一类(或其中几种)化合物都具有识别和检测能力的抗体，即具有宽谱特异性(broad specificity)。
目前用于农药、毒品等小分子化合物多残留分析的免疫技术多为针对同系物的母核结构而设计的半抗原来制备针对同类化合物的宽谱特异性抗体。该方法在增加识别范围的同时，检测灵敏度却有所下降，而且该类抗体的识别范围预先不能确定。另外，该方法在对不同结构类型的化合物多残留检测上的应用受到了限制，至今还未见相关文献报道一种抗体可同时识别多种不同结构类别的小分子化合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种宽谱特异性多克隆抗体，该多克隆抗体能用于快速、简便地同时检测出样品中的多种相同或不同结构类别的残留小分子化合物，本发明还提供了用于制备该多克隆抗体的多簇抗原以及该多簇抗原的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的全新思路为：在合成小分子化合物半抗原的基础上，设计并将不同种类的小分子化合物半抗原分子偶联到同一载体蛋白分子上，制备得到含多个抗原决定簇的人工抗原(简称多簇抗原)，再将该多簇抗原免疫动物制备出同时抗对应多种化合物的宽谱特异性多克隆抗体，从而建立适用于小分子化合物多残留快速检测的酶联免疫吸附测定方法。具体如下：
本发明提供一种多簇抗原的制备方法，选用2～15种不同的小分子化合物半抗原，以蛋白质分子为载体，依次进行以下步骤：
1)、在蛋白质分子上通过偶联方法偶联上一种小分子化合物半抗原分子，进行透析纯化；
2)、以上述步骤所得的产物为载体，继续偶联另一种小分子化合物半抗原分子，再进行透析纯化；
3)、重复步骤2)直至偶联完所有的小分子化合物半抗原。
作为本发明的多簇抗原的制备方法的改进：蛋白质分子为牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)的分子。
作为本发明的多簇抗原的制备方法的进一步改进：偶联方法为碳二亚胺法、混合酸酐法、重氮化法或戊二醛法。
作为本发明的多簇抗原的制备方法的进一步改进：小分子化合物半抗原为农药小分子化合物半抗原、兽药小分子化合物半抗原、环境小分子有机污染物半抗原或毒品/兴奋剂小分子化合物半抗原。农药可选用有机磷类农药、拟除虫菊酯类农药、氨基甲酸酯类农药、有机杂环类农药、除草剂类农药或杀菌剂类农药等，兽药可选用氯霉素、克仑特罗、非诺特罗、特布他林、沙丁醇胺、四环素、土霉素、金霉素、二甲胺四环素、氨苯磺胺、磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、睾酮、雌二醇或雌酮等等，毒品/兴奋剂可选用吗啡、可卡因、大麻、海洛因、甲基苯丙胺等等。进一步说：有机磷类农药选用甲基对硫磷、乙基对硫磷、甲胺磷、三唑磷、甲基毒死蜱、毒死蜱、二嗪磷、倍硫磷等等；拟除虫菊酯类农药选用苯醚菊酯、氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、S-氰戊菊酯等等；氨基甲酸酯类农药选用克百威、丁硫克百威、丙硫百克威等等；苯甲酰脲类农药选用氟啶脲、氟苯脲、氟铃脲、除虫脲等等；有机杂环类农药选用吡虫啉、氟虫腈、噻嗪酮、噻虫醛、虫螨腈等等；除草剂类农药选用2甲4氯、二氯喹啉酸、乙草胺、绿磺隆、甲磺隆、丙苯磺隆、醚唑磺隆等等；杀菌剂类农药选用百菌清、福美双、腈菌唑、三唑酮、三唑醇等等。
本发明还提供了依照上述制备方法所制得的多簇抗原。
本发明还提供了利用上述多簇抗原所制得的宽谱特异性多克隆抗体。
本发明还提供了上述宽谱特异性多克隆抗体的用途：用于对含有所述小分子化合物的样品进行检测。
本发明所获得的多簇抗原(即多抗原决定簇人工抗原)是用作动物免疫的抗原体系的原料。
本发明所获得的多克隆抗体为宽谱特异性多克隆抗体，能利用该抗体可用于小分子化合物(如农药、兽药、环境有机污染物和毒品/兴奋剂等)多残留快速检测的免疫吸附分析方法及试剂盒的研究。
本发明涉及的宽谱特异性多克隆抗体，是通过如下方法实现的：选用8-10周大，体重为2-3公斤左右，健康的雄性家兔。实验免疫剂量：基础免疫为0.25～2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～4.0mg/kg。用生理盐水分别稀释适量人工抗原复合物，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。基础免疫后3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后，就进行采血。
本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，放置于37℃温箱中半小时，待收集在血清瓶中的血液凝固后，用接种针沿血清瓶边缘将血块与玻璃瓶壁脱离，再放到4℃下过夜，待血块收缩后，用吸管将血清吸入试管中，离心(4000rpm，15分钟，4℃下)分离出血清。抗血清纯化一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析法。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清中只有IgG。纯化后的抗体溶液经低温冷冻干燥制的冻干粉，-20℃下保存。该抗体能与对应结合到免疫原上2～15种的小分子化合物或其半抗原分子全部或其中部分形成特异性结合。该抗体用途，是用作小分子化合物的多残留免疫化学分析方法及其试剂盒的研究与开发。
本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和生物技术手段，将含有胺基、羟基、羧基、巯基等活性基团的小分子目标分析物半抗原与载体蛋白质逐一偶联，制备有效多簇人工抗原，免疫动物制备对相应小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，定量地检测样本中多种超微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。
利用本发明可以对不同类别的小分子化合物采用同一种简便的方法进行快速多残留检测，而无须像目前通行的残留检测方法一样要进行分类处理后才可检测；还可以根据检验任务的需要，通过抗原的预先设计，有目的的制备出能够识别需要检测的对象的宽谱特异性抗体来构建ELISA分析方法，从而满足不同作物、特殊产品(如进出口产品)检验任务的需要，节约财力、物力，大幅度提高工作效率。这对农药、兽药、兴奋剂、毒品和小分子环境有机污染物(POPs、环境内激素等)多残留免疫检测技术研究与应用具有重要的价值。
具体实施方式
实施例1、
所用的半抗原为乙基对硫磷半抗原(PA)、氰戊菊酯半抗原(JU)，结构式如下：
免疫原JU-BSA-PA的制备
(1)、免疫原的合成利用碳二亚胺法：将80微摩尔有机磷农药乙基对硫磷的半抗原化合物PA溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL10～20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用。
(2)、以上述步骤所得的产物为载体，采用同样的方法继续偶联另一种小分子化合物半抗原分子JU，再进行透析纯化；分装，于-20℃下保存。
具体为：将80微摩尔拟除虫菊酯类农药氰戊菊酯的半抗原化合物JU溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8ml含10～20mg/mLPA-BSA的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，分装，于-20℃下保存。
包被抗原的合成与纯化
包被抗原的合成利用混合酸酐法。将80微摩尔有机磷农药乙基对硫磷的半抗原化合物PA与80微摩尔拟除虫菊酯类农药氰戊菊酯的半抗原化合物JU分别溶解在2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，分别加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温下反应1～2小时，反应液100～800μL分别加入到5～10mL10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～4小时，然后分别装入透析袋，先分别用蒸馏水透析1～4次，然后用分别用生理盐水透析，分装，于-20℃下保存。
人工抗原的鉴定
按照合成免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。
经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：
PA∶JU∶BSA＝6.4∶8.7∶1；JU∶OVA＝5.3∶1；PA∶OVA＝7.2∶1。
免疫动物制备抗血清
实验选用8-10周大，体重为2-3公斤，健康的雄性家兔。免疫三只兔子。实验免疫剂量基础免疫为0.25～2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～4.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量人工抗原复合物，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后，就进行采血。
本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，放置于37℃温箱中半小时，待收集在血清瓶中的血液凝固后，用接种针沿血清瓶边缘将血块与玻璃瓶壁脱离，再放到4℃下过夜，待血块收缩后，用吸管将血清吸入试管中，离心(4000rpm，15分钟，4℃)分离出血清。
抗血清效价测定
按常规方法免疫兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价，半抗原-OVA结合物包被浓度均为10ug/ml。末免后采全血，抗血清的对PA和JU的效价分别为1∶89600、1∶12800。
抗体的纯化与鉴定
一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析法。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。
最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定
用方阵滴定法确定最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度(间接ELISA法)，同时稀释抗体和固相抗原包被液。在同一包被浓度下，随着抗体的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一抗体稀释浓度下，随着包被浓度的下降，所得OD值也呈下降趋势。通常选择OD值1.0左右时的抗体和包被抗原浓度作为工作浓度。从实验可知，当抗体0.4μg·mL-1，包被抗原PA-OVA浓度为0.6μg·mL-1时OD值约等于1.0；当抗体为1.5μg·mL-1，包被抗原JU-OVA浓度为4.0μg·mL-1时，OD值约等于1.0。
标准曲线和检测灵敏度
将PA-OVA或JU-OVA偶联复合物，用包被液稀释至各自的工作浓度包被96孔微量反应板。每孔加入上述包被液100μL，于37℃温箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST缓冲液洗涤，每孔加入封闭液300μL，于37℃温箱中孵育0.5h。甩掉封闭液，用PBST缓冲液洗涤，加入预先配制的氰戊菊酯(或乙基对硫磷)各浓度标准液50μL/孔，每浓度3孔重复，再加入预先配制的抗体稀释液(PA-OVA包被孔加抗体：0.8μg·mL-1，JU-OVA包被孔加抗体：3.0μg·mL-1)50μL/孔，设不加药对照和无抗体空白对照。加入预先以PBS稀释1000倍的酶标二抗(goat anti-rabbit IgG-HRP)100μL/孔，放入37℃温箱中孵育1h，甩去孔内液体，用PBST溶液洗涤。加入OPD-过氧化氢底物溶液100μL/孔，37℃温箱中孵育15min后加入2mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应。在酶标仪上测定490nm波长下的吸光值。根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：
式中：ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药x时的吸光值，ODmin为无抗体空白对照孔的吸光值。
由上述公式计算得农药各浓度的抑制率，作图。氰戊菊酯在10-2000μg·L-1范围内，抑制率与氰戊菊酯浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9781，抑制率为50％时氰戊菊酯的浓度(I50)为417.4μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时氰戊菊酯的浓度(I10)]为23.3μg·L-1；乙基对硫磷在16-2000μg·L-1范围内，抑制率与乙基对硫磷浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9673，抑制率为50％时乙基对硫磷的浓度(I50)为893.6μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时乙基对硫磷的浓度(I10)]为41.3μg·L-1。
实施例2、
所用的半抗原为乙基对硫磷半抗原(PA)、克百威半抗原(BFNB)，结构式如下：
免疫原PA-BSA-BFNB的制备
(1)、免疫原的合成利用碳二亚胺法：将80微摩尔氨基甲酸酯类农药克百威的半抗原化合物BFNB溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8ml含10～20mg/mL BFNB-BSA的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用。
(2)、以上述步骤所得的产物为载体，采用同样的方法继续偶联另一种小分子化合物半抗原分子BFNB，再进行透析纯化；分装，于-20℃下保存。
具体为：将80微摩尔有机磷类农药乙基对硫磷的半抗原化合物PA溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8ml含10～20mg/mL的BFNB-BSA结合物的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，分装，于-20℃下保存。
包被抗原的合成与纯化
包被抗原的合成利用混合酸酐法。将80微摩尔氨基甲酸酯类农药克百威的半抗原化合物BFNB溶解在2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温下反应1～2小时，反应液100～800μL加入到5～10mL10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～4小时，然后分别装入透析袋，先分别用蒸馏水透析1～4次，然后用生理盐水透析，分装，于-20℃下保存。
人工抗原的鉴定
按照合成免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。
经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：
PA∶BFNB∶BSA＝6.1∶7.9∶1；BFNB∶OVA＝8.3∶1。
免疫动物制备抗血清
实验选用8-10周大，体重为2-3公斤，健康的雄性家兔。免疫三只兔子。实验免疫剂量基础免疫为0.25～2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～4.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量人工抗原复合物，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后，就进行采血。
本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，放置于37℃温箱中半小时，待收集在血清瓶中的血液凝固后，用接种针沿血清瓶边缘将血块与玻璃瓶壁脱离，再放到4℃下过夜，待血块收缩后，用吸管将血清吸入试管中，离心(4000rpm，15分钟，4℃下)分离出血清。
抗血清效价测定
按常规方法免疫兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价，半抗原-OVA结合物包被浓度均为10ug/ml。末免后采全血，抗血清的对PA和BFNB的效价分别为1∶51200、1∶47400。
抗体的纯化与鉴定
一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析法。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。
最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定
用方阵滴定法确定最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度(间接ELISA法)，同时稀释抗体和固相抗原包被液。在同一包被浓度下，随着酶标抗体的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一抗体稀释浓度下，随着包被浓度的下降，所得OD值也呈下降趋势。通常选择OD值1.0左右时的抗体和包被抗原浓度作为工作浓度。从实验可知，当抗体0.5μg·mL-1，包被抗原PA-OVA浓度为1.0μg·mL-1时OD值约等于1.0；当抗体为0.8μg·mL-1，包被抗原BFNB-OVA浓度为0.8μg·mL-1时，OD值约等于1.0。
标准曲线和检测灵敏度
将PA-OVA或BFNB-OVA偶联复合物，用包被液稀释至各自的工作浓度包被96孔微量反应板。每孔加入上述包被液100μL，于37℃温箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST缓冲液洗涤，每孔加入封闭液300μL，于37℃温箱中孵育0.5h。甩掉封闭液，用PBST缓冲液洗涤，加入预先配制的克百威(或乙基对硫磷)各浓度标准液50μL/孔，每浓度3孔重复，再加入预先配制的抗体稀释液(PA-OVA包被孔加抗体：1.0μg·mL-1，BFNB-OVA包被孔加抗体：1.6μg·mL-1)50μL/孔，设不加药对照和无抗体空白对照。加入预先以PBS稀释1000倍的酶标二抗(goat anti-rabbitIgG-HRP)100μL/孔，放入37℃温箱中孵育1h，甩去孔内液体，用PBST溶液洗涤。加入OPD-过氧化氢底物溶液100μL/孔，37℃温箱中孵育15min后加入2mol/LH2SO4 50μL/孔终止反应。在酶标仪上测定490nm波长下的吸光值。根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：
式中：ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药x时的吸光值，ODmin为无抗体空白对照孔的吸光值。
由上述公式计算得农药各浓度的抑制率，作图。克百威在16-1000μg·L-1范围内，抑制率与克百威浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9733，抑制率为50％时克百威的浓度(I50)为349.8μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时克百威的浓度(I10)]为19.8μg·L-1；乙基对硫磷在16-2000μg·L-1范围内，抑制率与乙基对硫磷浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9814，抑制率为50％时乙基对硫磷的浓度(I50)为763.7μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时乙基对硫磷的浓度(I10)]为62.9μg·L-1。
实施例3、
所用的半抗原为三唑磷半抗原(THBu)、毒死蜱半抗原(DSP)和克百威半抗原(BFNB)，结构式如下：
免疫原
的制备
(1)、BSA-DSP结合物的制备：将80微摩尔有机磷农药毒死蜱的半抗原化合物DSP溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL10～20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用。
(2)、以上述步骤所得的产物为载体，采用同样的方法继续偶联另一种小分子化合物半抗原分子BFNB，再进行透析纯化；于-20℃下保存备用。
DSP-BSA-BFNB结合物的制备具体为：将80微摩尔氨基甲酸酯类农药克白威的半抗原化合物BFNB溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL含10～20mg/mL的DSP-BSA结合物的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用。
(3)、重复步骤(2)，偶联上第三种小分子化合物半抗原分子THBu，再进行透析纯化，分装，于-20℃下保存。
结合物的制备具体为：将80微摩尔有机磷农药三唑磷的半抗原化合物THBu溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL含10～20mg/mL的DSP-BSA-BFNB结合物的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，分装，于-20℃下保存。
包被抗原的合成与纯化
包被抗原的合成利用混合酸酐法。将80微摩尔有机磷农药毒死蜱的半抗原化合物DSP与80微摩尔三唑磷的半抗原化合物THBu分别溶解在2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，分别加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温下反应1～2小时，取反应液100～800μL分别加入到5～10mL10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～4小时，分别然后装入透析袋，先用蒸馏水透析1～4次，然后用生理盐水透析，分别分装，于-20℃下保存。
人工抗原的鉴定
按照合成免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。
经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：
DSP∶BFNB∶THBu∶BSA＝7.4∶5.8∶6.3∶1；DSP∶OVA＝9.8∶1；THBu∶OVA＝11.7∶1
免疫动物制备抗血清
实验选用8-10周左右，体重为2-3公斤，健康的雄性家兔。实验免疫剂量基础免疫为0.25～2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～4.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量人工抗原复合物，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后，就进行采血。
本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，放置于37℃温箱中半小时，待收集在血清瓶中的血液凝固后，用接种针沿血清瓶边缘将血块与玻璃瓶壁脱离，再放到4℃下过夜，待血块收缩后，用吸管将血清吸入试管中，离心(4000rpm，15分钟，4℃下)分离出血清。
抗血清效价测定
按常规方法免疫兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价，半抗原-OVA结合物包被浓度均为10ug/ml。末免后采全血，抗血清的对DSP、THBu和BFNB的效价分别为1∶18600、1∶24600、1∶89800。
抗体的纯化与鉴定
一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析法。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。
最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定
用方阵滴定法确定最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度(间接ELISA法)，同时稀释抗体和固相抗原包被液。在同一包被浓度下，随着酶标抗体的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一抗体稀释浓度下，随着包被浓度的下降，所得OD值也呈下降趋势。通常选择OD值1.0左右时的抗体和包被抗原浓度作为工作浓度。从实验可知，当抗体1.0μg·mL-1，包被抗原THBu-OVA浓度为5.0μg·mL-1时OD值约等于1.0；当抗体为0.6μg·mL-1，包被抗原BFNB-OVA浓度为0.6μg·mL-1时，OD值约等于1.0；当抗体为0.1μg·mL-1，包被抗原DSP-OVA浓度为3.0μg·mL-1时，OD值约等于1.0。
标准曲线和检测灵敏度
将THBu-OVA或BFNB-OVA或DSP-OVA偶联复合物，用包被液稀释至各自的工作浓度包被96孔微量反应板。每孔加入上述包被液100μL，于37℃温箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST缓冲液洗涤，每孔加入封闭液300μL，于37℃温箱中孵育0.5h。甩掉封闭液，用PBST缓冲液洗涤，加入预先配制的克百威(或三唑磷、毒死蜱)各浓度标准液50μL/孔，每浓度3孔重复，再加入预先配制的抗体稀释液(THBu-OVA包被孔加抗体：2.0μg·mL-1，BFNB-OVA包被孔加抗体：1.2μg·mL-1；DSP-OVA包被孔加抗体：0.2μg·mL-1)50μL/孔，设不加药对照和无抗体空白对照。加入预先以PBS稀释1000倍的酶标二抗(goat anti-rabbit IgG-HRP) 100μL/孔，放入37℃温箱中孵育1h，甩去孔内液体，用PBST溶液洗涤。加入OPD-过氧化氢底物溶液100μL/孔，37℃温箱中孵育15min后加入2mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应。在酶标仪上测定490nm波长下的吸光值。根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：
式中：ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药x时的吸光值，ODmin为无抗体空白对照孔的吸光值。
由上述公式计算得农药各浓度的抑制率，作图。在毒死蜱1-500μg·L-1范围内，抑制率与毒死蜱浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9813，抑制率为50％时毒死蜱的浓度(I50)为62.9μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时毒死蜱的浓度(I10)]为1.5μg·L-1；三唑磷在1-500μg·L-1范围内，抑制率与三唑磷浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9814，抑制率为50％时三唑磷的浓度(I50)为69.0μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时三唑磷的浓度(I10)]为5.1μg·L-1；克百威在10-1000μg·L-1范围内，抑制率与克百威浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9793，抑制率为50％时克百威的浓度(I50)为395.8μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时克百威的浓度(I10)]为18.9g·L-1。
实施例4、
所用的半抗原为乙基对硫磷半抗原(PA)、氰戊菊酯半抗原(JU)、克百威半抗原(BFNB)和毒死蜱半抗原(DSP)，结构式如下：
免疫原
的制备
(1)、将80微摩尔有机磷农药毒死蜱的半抗原化合物DSP溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL10～20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用。
(2)、以上述步骤所得的产物为载体，采用同样的方法继续偶联另一种小分子化合物半抗原分子BFNB，再进行透析纯化；分装，于-20℃下保存。
DSP-BSA-BFNB结合物的制备具体为：将80微摩尔氨基甲酸酯类农药克白威的半抗原化合物BFNB溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL含10～20mg/mL的DSP-BSA结合物的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用。
(3)、重复步骤(2)，依次再偶联上小分子化合物半抗原分子THBu和PA，再进行透析纯化，分装，于-20℃下保存。
DSP-BSA-BFNB-JU结合物的制备具体为：将80微摩尔有机磷农药三唑磷的半抗原化合物THBu溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL含10～20mg/mL的DSP-BSA-BFNB结合物的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用。
PA-DSP-BSA-BFNB-JU结合物的制备具体为：将80微摩尔有机磷农药乙基对硫磷的半抗原化合物PA溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL含10～20mg/mL DSP-BSA-BFNB-JU结合物的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，分装，于-20℃下保存。
人工抗原的鉴定
按照合成免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。
经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：
DSP∶PA∶BFNB∶JU∶BSA＝8.1∶11.3∶5.7∶4.5∶1
免疫动物制备抗血清
实验选用8-10周大，体重为2-3公斤，健康的雄性家兔。免疫三只兔子。实验免疫剂量基础免疫为0.25～2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～4.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量人工抗原复合物，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后，就进行采血。
本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，放置于37℃温箱中半小时，待收集在血清瓶中的血液凝固后，用接种针沿血清瓶边缘将血块与玻璃瓶壁脱离，再放到4℃下过夜，待血块收缩后，用吸管将血清吸入试管中，离心(4000rpm，15分钟，4℃下)分离出血清。
抗血清效价测定
按常规方法免疫兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价，半抗原-OVA结合物包被浓度均为10ug/ml。末免后采全血，抗血清的对PA、JU、DSP和BFNB的效价分别为1∶71860、1∶8000、1∶44900、1∶98300。
抗体的纯化与鉴定
一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析法。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。
最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定
用方阵滴定法确定最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度(间接ELISA法)，同时稀释抗体和固相抗原包被液。在同一包被浓度下，随着酶标抗体的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一抗体稀释浓度下，随着包被浓度的下降，所得OD值也呈下降趋势。通常选择OD值1.0左右时的抗体和包被抗原浓度作为工作浓度。从实验可知，当抗体1.0μg·mL-1，包被抗原PA-OVA浓度为1.5μg·mL-1时OD值约等于1.0；当抗体为0.9μg·mL-1，包被抗原BFNB-OVA浓度为0.6μg·mL-1时，OD值约等于1.0；当抗体为0.5μg·mL-1，包被抗原DSP-OVA浓度为2.0μg·mL-1时，OD值约等于1.0；当抗体为2.0μg·mL-1，包被抗原JU-OVA浓度为3.0μg·mL-1时，OD值约等于1.0。
标准曲线和检测灵敏度
将PA-OVA(或BFNB-OVA、DSP-OVA、JU-OVA等)偶联复合物，用包被液稀释至各自的工作浓度包被96孔微量反应板。每孔加入上述包被液100μL，于37℃温箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST缓冲液洗涤，每孔加入封闭液300μL，于37℃温箱中孵育0.5h。甩掉封闭液，用PBST缓冲液洗涤，加入预先配制的对硫磷(或三唑磷、毒死蜱、克百威)各浓度标准液50μL/孔，每浓度3孔重复，再加入预先配制的抗体稀释液(PA-OVA包被孔加抗体：2.0μg·mL-1，BFNB-OVA包被孔加抗体：1.8μg·mL-1；DSP-OVA包被孔加抗体：1.0μg·mL-1；JU-OVA包被孔加抗体：4.0μg·mL-1；)50μL/孔，设不加药对照和无抗体空白对照。加入预先以PBS稀释1000倍的酶标二抗(goat anti-rabbit IgG-HRP)100μL/孔，放入37℃温箱中孵育1h，甩去孔内液体，用PBST溶液洗涤。加入OPD-过氧化氢底物溶液100μL/孔，37℃温箱中孵育15min后加入2mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应。在酶标仪上测定490nm波长下的吸光值。根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：
式中：ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药x时的吸光值，ODmin为无抗体空白对照孔的吸光值。
由上述公式计算得农药各浓度的抑制率，作图。克百威在1-500μg·L-1范围内，抑制率与克百威浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9780，抑制率为50％时克百威的浓度(I50)为273.0μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时克百威的浓度(I10)]为24.9μg·L-1对硫磷在1-1000μg·L-1范围内，抑制率与对硫磷浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9688，抑制率为50％时对硫磷的浓度(I50)为796.3μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时对硫磷的浓度(I10)]为71.6μg·L-1；毒死蜱在1-500μg·L-1范围内，抑制率与毒死蜱浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9890，抑制率为50％时毒死蜱的浓度(I50)为46.3μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时毒死蜱的浓度(I10)]为3.7μg·L-1。氰戊菊酯在10-2000μg·L-1范围内，抑制率与氰戊菊酯浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9677，抑制率为50％时氰戊菊酯的浓度(I50)为450.8μg·L-1，最低检测限[抑制率为10％时氰戊菊酯的浓度(I10)]为32.7μg·L-1。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种多簇抗原，其特征在于：选用乙基对硫磷半抗原和氰戊菊酯半抗原，以牛血清蛋白为载体，按照以下步骤制备而得：
1)、在牛血清蛋白上通过碳二亚胺法偶联上乙基对硫磷半抗原，进行透析纯化：
将80微摩尔有机磷农药乙基对硫磷的半抗原化合物PA溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL 10～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用；
2)、以上述步骤所得的产物为载体，继续通过碳二亚胺法偶联氰戊菊酯半抗原，再进行透析纯化：
将80微摩尔拟除虫菊酯类农药氰戊菊酯的半抗原化合物JU溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8ml含10～20mg/mL PA-BSA的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，分装，于-20℃下保存；
所述乙基对硫磷的半抗原化合物PA的结构式为：
所述氰戊菊酯的半抗原化合物JU的结构式为：
2.根据权利要求1所述的多簇抗原制得的宽谱特异性多克隆抗体。
3.如权利要求2所述的宽谱特异性多克隆抗体的用途，其特征是：用于对含有乙基对硫磷或氰戊菊酯的样品进行检测。
4.一种多簇抗原，其特征在于：选用乙基对硫磷半抗原和克百威半抗原，以牛血清蛋白为载体，按照以下步骤制备而得：
1)、在牛血清蛋白上通过碳二亚胺法偶联上克百威半抗原，进行透析纯化：
将80微摩尔氨基甲酸酯类农药克百威的半抗原化合物BFNB溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8ml含10～20mg/mL BSA的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用；
2)、以上述步骤所得的产物为载体，继续通过碳二亚胺法偶联乙基对硫磷半抗原，再进行透析纯化：
将80微摩尔有机磷类农药乙基对硫磷的半抗原化合物PA溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8ml含10～20mg/mL的BFNB-BSA结合物的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，分装，于-20℃下保存；
所述乙基对硫磷的半抗原化合物PA的结构式为：
所述克百威的半抗原化合物BFNB的结构式为：
5.根据权利要求4所述的多簇抗原制得的宽谱特异性多克隆抗体。
6.如权利要求5所述的宽谱特异性多克隆抗体的用途，其特征是：用于对含有乙基对硫磷或克百威的样品进行检测。
7.一种多簇抗原，其特征在于：选用三唑磷半抗原、毒死蜱半抗原和克百威半抗原，以牛血清蛋白为载体，按照以下步骤制备而得：
1)、在牛血清蛋白上通过碳二亚胺法偶联上毒死蜱半抗原，进行透析纯化：
将80微摩尔有机磷农药毒死蜱的半抗原化合物DSP溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL10～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用；
2)、以上述步骤1)所得的产物为载体，继续通过碳二亚胺法偶联克百威半抗原，再进行透析纯化：
将80微摩尔氨基甲酸酯类农药克百威的半抗原化合物BFNB溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL含10～20mg/mL的DSP-BSA结合物的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，于-20℃下保存备用；
3)、以上述步骤2)所得的产物为载体，继续通过碳二亚胺法偶联三唑磷半抗原，再进行透析纯化：
将80微摩尔有机磷农药三唑磷的半抗原化合物THBu溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4～8mL含10～20mg/mL的DSP-BSA-BFNB结合物的碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析，分装，于-20℃下保存；
所述三唑磷的半抗原化合物THBu的结构式为：
毒死蜱的半抗原化合物DSP的结构式为：
所述克百威的半抗原化合物BFNB的结构式为：
8.根据权利要求7所述的多簇抗原制得的宽谱特异性多克隆抗体。
9.如权利要求8所述的宽谱特异性多克隆抗体的用途，其特征是：用于对含有三唑磷、毒死蜱或克百威的样品进行检测。
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| CN1908664A (zh) | 2007-02-07 |
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Application publication date: 20070207 Assignee: Ningbo NewCon Co., Ltd. Assignor: Zhejiang University Contract record no.: 2014330000337 Denomination of invention: Multiple cluster antigen and its preparation, wide spectrum specific multiple clone antigen and its use Granted publication date: 20110622 License type: Common License Record date: 20140825 |
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