CN113663646A - 一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法与应用 - Google Patents

一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法与应用，首先制备纳米级的磁性MnFe2O4纳米粒子，之后将磁性MnFe2O4纳米粒子、均苯三甲酸加到N，N‑二甲基甲酰胺中搅拌均匀，水热法合成磁性金属有机骨架材料MnFe2O4@M I L‑100(Fe)，采用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化MnFe2O4@M I L‑100(Fe)后，然后加入宽谱特异性抗体进行孵育，制备得到宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料。将本发明宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料用于样品前处理，基于材料磁性及免疫性能，能够实现对多种有机磷类农药残留的有效富集浓缩，极大地简化了样品前处理过程，从而实现农产品样品中小分子危害物的超灵敏检测。

Description

一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及纳米材料科学、免疫化学以及现代分离分析领域，尤其是涉及一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，具体涉及新型磁性金属有机骨架材料的制备与宽谱抗体合成及修饰，适用于环境、食品和生物等复杂基质样品中痕量农兽药残留的选择性分离富集。
背景技术
目前我国食品种类丰富、数量充足、流通便捷，但是在满足数量需求的同时，食品安全工作却面临很多困难和挑战。形形色色的食品安全事件降低了老百姓对食品安全的信任程度，食品安全问题已经成为群众最为关注的问题之一。《中国食品安全发展报告(2019)》指出，2018年国家市场监管总局食品安全监督抽检发现，农兽药残留不符合标准占不合格样品总量的15.4％，较2017年、2016年分别上升了4.8个百分点、9.9个百分点。对于食品样品而言，因其基质复杂、待测物含量低，如何实现能复杂样本中痕量待测物的灵敏准确检测，样品前处理技术就变得非常重要。近年来，针对复杂基质中待测物分离分析的难点，国内外众多的研究人员开展了固相萃取材料研发、多种技术联用等方面的研究。在这其中基于磁性固相萃取的前处理技术发展迅速，其利用外磁场实现分离，避免了高速离心，简化了操作流程。目前商品化的分离材料种类有限，存在选择性不好、萃取容量低，易受到样本中基体或者杂质干扰等问题。
金属有机骨架(metal-organic frameworks,MOFs)材料是由金属离子或金属原子簇和有机配体通过自组装形成的具有周期性网络结构和多孔特征的晶态材料。与传统无机材料相比，MOFs具有比表面积大、孔隙率高、组分易调控等优势，成为复合材料的理想组分之一。近年来MOFs材料引起了研究人员强烈关注和广泛的研究兴趣，在吸附、储存与分离等诸多研究领域展现出潜在的应用前景。在众多MOFs复合材料中，core/shell或yolk/shell结构的微纳米功能粒子@多孔金属有机骨架材料以简单有效的方式实现两种材料功能的有机结合。但是，MOFs材料富集主要是依赖非特异性吸附，选择性较差，因此需要对其进行功能性修饰，以满足复杂样品前处理中高选择性、高灵敏性、方便快捷等要求。
基于抗原-抗体由特异性免疫分析技术具有灵敏度高、稳定性好、操作简单等优点，在农兽药残留分析领域的应用逐渐受到重视，也是国内外的研究热点。由于农兽药种类繁多，在实际的农产品生产过程中会使用多种药物，并且在食品安全标准以及进出口贸易中对一种农产品往往也规定若干种药物的限量标准，在前处理过程中如果能同时对多种农药进行分离富集将更具有现实意义和经济效益。此外，抗体制备过程繁琐，并且有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等都具有结构共性，采用宽谱特异性抗体来建立农兽药多残留免疫前处理方法具有非常重要的现实意义。宽谱特异性抗体是按照结构的共性设计、合成通过半抗原，得到对一类(或者其中几种)特定结构的目标物都具有识别和较高的交叉反应率的通用抗体，并且在免疫分析领域得到了广泛关注。结合MOFs材料的表面积大、容易修饰等特点，以及宽谱抗体高选择性及通用性等特点，发展宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料在复杂样品前处理中具有重要意义。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，包括以下步骤：
a、将FeCl3·6H2O和MnCl2·4H2O及乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)投入搅拌设备中进行搅拌使其完全溶解，然后加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和无水乙酸钠继续搅拌直至完全溶解，将混和溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，升温到190℃～220℃，反应9h～11h，洗涤真空干燥后得到磁性MnFe2O4纳米粒子；
b、将得到的磁性MnFe2O4纳米粒子加入到溶有均苯三甲酸(H3BTC)的水溶液中，搅拌5min～20min，将混和溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，升温到60℃～80℃，反应60min～70min，产物依次超纯水、乙醇各洗涤3～5次，真空干燥后得到磁性金属有机骨架材料MnFe2O4@MIL-100(Fe)；
c、在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化上述磁性金属有机骨架纳米颗粒MnFe2O4@MIL-100(Fe)，将磁性金属有机骨架纳米颗粒在含有宽谱特异性抗体的溶液中进行孵育，制得宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架纳米颗粒，于缓冲液中低温保存；
d、将所述宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架纳米材料加入水溶液有机磷检材中并振荡，采用磁铁吸附所述基于抗体识别的磁性材料，然后将上述吸附有机磷的磁性材料分散于解吸液中，取上清液上机进行检测；
其中，所述步骤a中的搅拌设备包括搅拌桶、固定设于搅拌桶中心处的进料管、设于搅拌桶内的搅拌装置、设于搅拌桶上的控压装置、可移动设于搅拌桶内的活塞板、一端可移动设于搅拌桶上且另一端固定设于活塞板上的第一导向杆、套设于第一导向杆上且两端分别固定设于搅拌桶和活塞板上的第一弹簧、设于搅拌桶上的排料口、设于排料口处的第一电动门、固定设于搅拌桶上的基座、固定设于基座上其与进料管连通的储料箱、设于出料箱上的第二电动门、设于进料管内的螺旋送料桨、固定设于出料箱上用于驱动螺旋送料桨转动的第一电机；开启第二电动门，把FeCl3·6H2O和MnCl2·4H2O混合放入储料箱内，启动第一电机，带动螺旋送料桨转动，把储料箱内的FeCl3·6H2O和MnCl2·4H2O混合料送入搅拌桶内，通过压力装置把乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)注入搅拌装置内，通过搅拌装置边注入边对四者进行搅拌，通过控压装置控制搅拌桶内的压力，对搅拌桶内的增加和减压，通过活塞板往复移动及第一弹簧设置自适配搅拌桶内的压力，反应完成后启动第一电动门，搅拌桶的物料通过排料口排出。
所述步骤a中制备得到的磁性MnFe2O4纳米粒子粒径在80nm～300nm，EG/DEG混合溶剂的体积比例为:0/20～20/0。
所述步骤b中的磁性MnFe2O4纳米粒子与均苯三甲酸(H3BTC)的投料比为10：1～15：1。
所述步骤c中的抗体为有机磷宽谱特异性抗体，所述有机磷类农药为对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷和水胺硫磷，所述的磁性金属有机骨架纳米颗粒与所述抗体的质量比为8：1～5：1，所述的孵育的温度可为37℃，时间为40～60min。
所述搅拌装置包括转动套设于进料管上的空心套管、等距环形分布且与空心套管连通的多个空心搅拌叶、设于空心搅拌叶上的波浪通孔、等距阵列且贯穿转动设于空心搅拌叶上的多个第一转轴、等距环形分布且固定设于第一转轴上的多个混合板、与多个第一转轴一一对应且转动设于搅拌桶上的多个转盘、固定套设于第一转轴上的第一齿轮、固定设于搅拌桶上且与第一齿轮啮合设置的第二齿轮、转动设于搅拌桶上且与转盘啮合设置的第三齿轮、固定设于第三齿轮上的主动轴、固定设于基座上用于驱动主动轴转动的第二电机、设于空心搅拌叶上的出液孔、与空心搅拌叶连通且固定设于其上的连接管，所述第一转轴贯穿转动设于转盘上；通过第二电机驱动主动轴转动，主动轴转动带动第三齿轮转动，第三齿轮转动带动转盘转动，齿盘转动过程中带动第一转轴公转，第一转轴公转过程中带动第一齿轮公转，所述第二齿轮固定设于搅拌桶上且与第一齿轮啮合设置，从而带动第一齿轮自传，第一转轴自传，第一转轴自传过程中带动多个混合板以第一转轴为轴心转动对搅拌桶内的混合料进行搅拌，乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)通过连接管进入空心搅拌叶中，空心搅拌叶中的乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)通过出液孔排出，通过空心套管设置使多个空心搅拌叶连通。
所述混合板包括板体、对称设于板体上的两个第一斜面及第二斜面、等距阵列设于板体上的多个多边形孔；乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)从出液孔排出，后经过第一斜面和第二斜面分流并搅拌。
所述搅拌装置还包括固定套设于第一转轴上的第四齿轮、转动设于空心搅拌叶上且与第四齿轮啮合设置的第五齿轮、转动设于空心搅拌叶上的第二转轴、固定套设于第二转轴上且与第五齿轮啮合设置的第六齿轮、固定套设于第二转轴上的导流扇叶、固定设于转盘上且与导流扇叶对应的分流板；第一转轴转动过程中带动第四齿轮转动，第四齿轮带动第五齿轮转动，第五齿轮转动带动第六齿轮转动，第六齿轮转动带动第二转轴转动，第二转轴转动带动导流扇叶转动，把搅拌桶内的混合料进行导流，导流后的混合料经过分流板分流。
所述控压装置包括压力管、可移动设于压力管内的推块、贯穿固定设于推块上的空心轴、两端分别套设于空心轴和连接管上且与二者连通设置的空心转杆、与空心轴连通固定设于推块上的进液管、转动设于基座上的第三转轴及第四转轴、绕设于主动轴和第三转轴上的第一传动带、绕设于第三转轴和第四转轴上的第二传动带、一端固定设于推块上的长杆、固定设于长杆上的升降座、设于压力管上的多个进液孔、设于升降座上的滑槽、可移动设于滑槽内的第一移动板及第二移动板、一端位于第一移动板和第二移动板之间另一端转动设于第二传动带上的第五转轴、一端固定设于第一移动板上且可移动设于升降座上的第二导向杆、一端固定设于第二移动板上且可移动设于升降座上的第三导向杆、套设于第二导向杆上且两端分别固定设于第二导向杆另一端和升降座上的第二弹簧、套设于第三导向杆上且两端分别固定设于第三导向杆另一端和升降座上的第三弹簧；主动轴转动过程中带动第一传动带运转，第一传动带运转过程中带动第三转轴转动，第三转轴转动带动第二传动带运转，第二传动带运转过程中带动第五转轴往复移动，第五转轴移动过程中带动升降座往复移动，升降座往复移动带动长杆往复移动，最终带动推块位于压力管内往复移动，乙二醇(EG)、一缩二乙二醇(DEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、无水乙酸钠分别与多个进液孔连接，如需注入乙二醇(EG)，推块往复移动过程中使乙二醇(EG)进入压力管内，压力管内的乙二醇(EG)通过进液管进入空心轴内，空心轴内的乙二醇(EG)通过空心转杆进入连接管内，最终进入空心搅拌叶内。
所述的磁性金属有机骨架材料在有机磷农药中的应用，将所述磁性纳米颗粒MnFe2O4@MIL-100(Fe)分散于待测水样中，涡旋震荡60-90min,使得有机磷类农药残留完全吸附于磁性纳米颗粒上，然后弃去上清液加入解吸液，再次涡旋使得有机磷类农药残留解吸附，磁性分离取上清液，过滤后上机检测。
所述宽谱抗体修饰的磁性纳米颗粒用量为0.2～1mg/mL；所述的解吸液为PBS+5％牛血清蛋白BSA，洗脱时间为20min～30min。
本发明具有以下优点：结合目前国内外磁性固相萃取技术、金属有机骨架材料以及宽谱特异性抗体研究中存在的难题以及未来发展趋势，将制备磁性纳米粒子与金属有机骨架材料的复合纳米结构，再修饰高亲和力的宽谱特异性抗体，得到高通量、高效、简单便捷的宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架固相萃取材料，作为磁固相萃取吸附剂用于多种有机磷类农药残留的同时定量分析；具有高特异性，修饰不同的宽谱特异性抗体至磁性金属有机骨架材料，通过抗原抗体相互作用对相应靶目标物实现特异性识别及分子捕获，有效降低了样品基质对目标成分的影响；具有高萃取容量，宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料对一类(或者其中几种)特定结构的农兽药分子都具有识别和富集能力，前处理效率大大提高；利用磁铁可方便地实现靶目标物的分离富集，将富集的靶目标物解吸附，减少了样品基质中其它组分对检测灵敏度和回收率的影响；具有操作简单、高效、环保，极大地简化样品的前处理过程，提高分析方法灵敏度，能够满足复杂样品中痕量残留的分析需求，适宜推广应用。
附图说明
图1为磁性金属有机骨架纳米材料的样品前处理示意图。
图2为MnFe2O4的SEM照片和MnFe2O4@MIL-100(Fe)的TEM照片。
图3为有机磷宽谱抗体修饰的MnFe2O4@MIL-100(Fe)纳米颗粒的磁滞回线图。
图4为有机磷宽谱抗体修饰的MnFe2O4@MIL-100(Fe)纳米颗粒的红外光谱图。
图5为搅拌设备的结构示意图。
图6为搅拌设备的正面示意图。
图7为图6中的A-A线的剖视图。
图8为图7中的A处放大图。
图9为图7中的B-B线的剖视图。
图10为图9中的C-C线的剖视图。
图11为图10中的B处放大图。
图12为图10中的D-D线的部分剖视图。
图13为图10中的E-E线的部分剖视图。
图14为图10中的F-F线的部分剖视图。
图15为图7中的G-G线的部分剖视图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1：制备宽谱特异性抗体修饰的MnFe2O4@MIL-100(Fe)纳米颗粒
制备并表征磁性MnFe2O4磁性纳米颗粒，准确称取0.36mg的FeCl3·6H2O和0.18mg的MnCl2·4H2O溶于20mL乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)中(VEG/VDEG＝10/10)中磁力搅拌使其完全溶解，之后称取2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到混合溶液中在110℃的油浴中充分搅拌使其完全溶解，待冷却到室温后，称取2g无水乙酸钠继续加入，室温下搅拌40mins。将上述混合溶液转移到聚四氟乙烯高压反应釜中，并置于鼓风烘箱中控温200℃反应10h。反应结束后冷却到室温，将获得的黑色沉淀用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次，并置于真空烘箱中50℃烘干；本实施例成功合成了具有超顺磁性、粒径均匀(200nm)的MnFe2O4磁性纳米颗粒。
制备磁性金属有机骨架材料MnFe2O4@MIL-100(Fe)纳米颗粒，通过水热法合成磁性金属有机骨架纳米颗粒，准确称取0.1g MnFe2O4分散到20mL浓度为10mM的FeCl3·6H2O乙醇溶液中，在70℃下充分搅拌30mins,使用磁铁分离沉淀物并用无水乙醇洗涤一次，然后将上述沉淀物加入到20mL浓度10mM的均苯三甲酸(H3BTC)乙醇溶液中，升温到60℃反应1h。最终得到的产物用超纯水和无水乙醇洗涤各3次，置于真空干燥箱中40℃氮气保护下烘干。
制备宽谱特异性抗体修饰的MnFe2O4@MIL-100(Fe)纳米颗粒，有机磷宽谱特异性抗体由浙江大学农药与环境毒理研究所制备，将上述抗体与MnFe2O4@MIL-100(Fe)采用EDC与NHS法偶联：磁分离1mg的MnFe2O4@MIL-100(Fe)重悬于1mL的磷酸缓冲溶液(0.05M，pH5.0)中，加入300μL的EDC(20mg/mL)和300μL的NHS(20mg/mL)，在室温下活化30mins。磁体收集活化后的磁性纳米颗粒，并且用超纯水洗涤3次，用1mL的磷酸缓冲溶液(0.05M，pH7.4)的缓冲溶液重悬。
将宽谱特异性抗体200μg，配置成一定浓度的溶液(0.02～10mg/mL),取适宜的量加入磁性颗粒中，超声分散均匀，在摇床中控温37℃，200r/min，反应1h。反应完毕后，磁性分离，弃掉上清，使用清洗缓冲溶液即含有0.04％吐温的PBS(0.01M，pH7.4)缓冲溶液，轻摇重悬颗粒，磁性分离弃掉上清。
在上述的磁性颗粒中加入1mL的封闭剂(含5％脱脂奶的偶联缓冲溶液)，封闭未反应的活性位点，之后在摇床中37℃，200r/min，反应1.5h，最后用清洗缓冲溶液清洗3～4次，获得偶联抗体的磁性金属有机骨架纳米颗粒。将其重悬于1mL的保存缓冲溶液中(含0.15％NaN3和0.15％BSA的PBS缓冲溶液)中，置于4～8℃中保存备用。
实施例2：宽谱特异性抗体修饰的MnFe2O4@MIL-100(Fe)纳米颗粒萃取痕量有机磷类农药残留的方法，农药残留标准溶液按照如下方法制备：分别配置0.1mg/mL的对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷的溶液。精确称取1.00g BSA溶于20mL PBS缓冲溶液中制成PBS+5％BSA的吸附液。精确称取0.375g甘氨酸于50mL的容量瓶中，用稀盐酸调节pH至3，配制成0.1mol/L的解吸液。
将30mg上述宽谱特异性抗体修饰的MnFe2O4@MIL-100(Fe)纳米颗粒分散于含有有机磷样品溶液中，包含对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷和水胺硫磷，有机磷的浓度均为30ng/mL，之后涡旋振荡60mins，通过抗原抗体之间相互作用使得有机磷吸附到磁性材料表面；吸附完成后，在外加磁场的作用下，将结合了有机磷分子的磁性材料从样品溶液中分离；之后，加入解吸液解吸20min,解吸三次，合并解吸液，氮气吹干后定容至1mL,即完成对有机磷类农药残留的富集及洗脱，过0.22μm的滤膜后进行上机检测。
实施例3：考察不同用量宽谱特异性抗体修饰的免疫磁性纳米颗粒，对有机磷类农药残留萃取时，对富集效率的影响，依照实施例2所述的方法富集痕量有机磷类农药残留，区别在于，所用宽谱特异性抗体修饰的MnFe2O4@MIL-100(Fe)免疫磁性纳米颗粒的质量分别为10mg、20mg、30mg、40mg。随着上述免疫磁性纳米颗粒用量的增加，对所加入的对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷和水胺硫磷的萃取效率明显在增加，到吸附剂质量达到30mg时萃取效率大于96％。因此，本发明选用的免疫磁性纳米颗粒的质量为30mg。
实施例4：考察不同富集时间对痕量有机磷类农药残留萃取效率的影响，依照实施例2所述的方法富集痕量有机磷类农药残留，区别在于，涡旋震荡处理分别为20min、40min、60min、80min。随着富集时间的增加，有机磷的萃取效率在逐渐增加，在达到60min时趋于平衡。因此，本发明的吸附时间优化为60min。
实施例5：考察不同洗脱条件对有机磷类农药残留萃取时，对富集效率的影响，依照实施例2所述的方法萃取痕量有机磷类农药残留，区别在于，洗脱时间分别为5min、10min、20min、30min。随着洗脱时间的增加，有机磷的萃取效率也逐渐增加，在洗脱时间达到20min时，萃取趋于平衡也达到最大值。在保证萃取效率的同时并尽量缩短萃取时间。因此，本发明选择的洗脱时间优化为20min。
实施例6：在实际中的应用
为了验证该方法的有效性，选取实际样品来考察方法的可靠性。实际样品中未检出有机磷类化合物。在实际样品中分别加标10、25、50μg/L有机磷类化合物,通过上述实施例3-实施例5确定的最优条件下，加标回收率在82.4-102.8％，满足实际样品痕量分析的要求。以上实验结果表明，宽谱特异性抗体修饰的MnFe2O4@MIL-100(Fe)应用于实际样品中有机磷类化合物的分析是可行的。
所述宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料对多种有机磷农药残留具有特异性识别及富集性能，显出高效率富集能力以及快捷简便的磁分离，然后利用解吸液后进行上机检测，可用于农产品残留检测、食品前处理等领域。
上述步骤中的搅拌设备包括搅拌桶1、固定设于搅拌桶中心处的进料管2、设于搅拌桶内的搅拌装置3、设于搅拌桶上的控压装置4、可移动设于搅拌桶内的活塞板5、一端可移动设于搅拌桶上且另一端固定设于活塞板上的第一导向杆6、套设于第一导向杆上且两端分别固定设于搅拌桶和活塞板上的第一弹簧7、设于搅拌桶上的排料口8、设于排料口处的第一电动门9、固定设于搅拌桶上的基座10、固定设于基座上其与进料管连通的储料箱11、设于出料箱上的第二电动门12、设于进料管内的螺旋送料桨13、固定设于出料箱上用于驱动螺旋送料桨转动的第一电机14；开启第二电动门，把FeCl3·6H2O和MnCl2·4H2O混合放入储料箱内，启动第一电机，带动螺旋送料桨转动，把储料箱内的FeCl3·6H2O和MnCl2·4H2O混合料送入搅拌桶内，通过压力装置把乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)注入搅拌装置内，通过搅拌装置边注入边对四者进行搅拌，通过控压装置控制搅拌桶内的压力，对搅拌桶内的增加和减压，使混合的效果更好，通过活塞板往复移动及第一弹簧设置自适配搅拌桶内的压力，反应完成后启动第一电动门，搅拌桶的物料通过排料口排出，各部件之间利用合理，通过可移动的活塞板设置能够改变搅拌桶的空间，即改变位于搅拌桶内的混合料液面，在配合搅拌装置，大大提高了搅拌的效果，反应完全。
所述步骤c中，可采用含5％脱脂奶的磷酸缓冲溶液(0.05M，pH5.0)封闭未反应的活性位点，温度可为37℃，时间可为60～90min。
所述步骤a中制备得到的磁性MnFe2O4纳米粒子粒径在80nm～300nm，EG/DEG混合溶剂的体积比例为:0/20～20/0。
所述步骤b中的磁性MnFe2O4纳米粒子与均苯三甲酸(H3BTC)的投料比为10：1～15：1。
所述磁性金属有机骨架纳米颗粒、EDC和NHS的质量比为1：1：1～1：2：2。
所述孵育的温度可为室温20～25℃，时间为30～40min。
所述步骤c中的抗体为有机磷宽谱特异性抗体，所述溶有抗体的溶液可用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH7.4)，所述有机磷类农药为对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷和水胺硫磷，所述的磁性金属有机骨架纳米颗粒与所述抗体的质量比为8：1～5：1，所述的孵育的温度可为37℃，时间为40～60min。
所述搅拌装置3包括转动套设于进料管上的空心套管31、等距环形分布且与空心套管连通的多个空心搅拌叶32、设于空心搅拌叶上的波浪通孔33、等距阵列且贯穿转动设于空心搅拌叶上的多个第一转轴34、等距环形分布且固定设于第一转轴上的多个混合板35、与多个第一转轴一一对应且转动设于搅拌桶上的多个转盘36、固定套设于第一转轴上的第一齿轮37、固定设于搅拌桶上且与第一齿轮啮合设置的第二齿轮38、转动设于搅拌桶上且与转盘啮合设置的第三齿轮39、固定设于第三齿轮上的主动轴319、固定设于基座上用于驱动主动轴转动的第二电机310、设于空心搅拌叶上的出液孔311、与空心搅拌叶连通且固定设于其上的连接管318，所述第一转轴贯穿转动设于转盘上；通过第二电机驱动主动轴转动，主动轴转动带动第三齿轮转动，第三齿轮转动带动转盘转动，齿盘转动过程中带动第一转轴公转，第一转轴公转过程中带动第一齿轮公转，所述第二齿轮固定设于搅拌桶上且与第一齿轮啮合设置，从而带动第一齿轮自传，第一转轴自传，即第一转轴边公转边自传，通过上述设置能够起到很好的省力作用，第一转轴自传过程中带动多个混合板以第一转轴为轴心转动对搅拌桶内的混合料进行搅拌，乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)通过连接管进入空心搅拌叶中，空心搅拌叶中的乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)通过出液孔排出，均匀的分布搅拌桶内，通过空心套管设置使多个空心搅拌叶连通，提高整体的快速搅拌，及搅拌过程中省力，通过转盘设置使第一转轴运转稳定，最终使整体运转稳定。
所述混合板35包括板体351、对称设于板体上的两个第一斜面352及第二斜面353、等距阵列设于板体上的多个多边形孔354；乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)从出液孔排出，后经过第一斜面和第二斜面分流并搅拌，减少板体受到的阻力，通过多边形孔设置能够大大降低其堵塞，同时降低本体受到的阻力，提高搅拌效果，板体搅拌过程中通过多边形孔的设置还能够改变其流动方向，再次提高其混合的效果。
所述搅拌装置3还包括固定套设于第一转轴上的第四齿轮312、转动设于空心搅拌叶上且与第四齿轮啮合设置的第五齿轮313、转动设于空心搅拌叶上的第二转轴314、固定套设于第二转轴上且与第五齿轮啮合设置的第六齿轮315、固定套设于第二转轴上的导流扇叶316、固定设于转盘上且与导流扇叶对应的分流板317；第一转轴转动过程中带动第四齿轮转动，第四齿轮带动第五齿轮转动，第五齿轮转动带动第六齿轮转动，第六齿轮转动带动第二转轴转动，第二转轴转动带动导流扇叶转动，把搅拌桶内的混合料进行导流，导流后的混合料经过分流板分流，再次提高整体的混合效果，使反应的更为全面快速，可避免局部混合不到位情况的发生。
所述控压装置4包括压力管41、可移动设于压力管内的推块42、贯穿固定设于推块上的空心轴43、两端分别套设于空心轴和连接管上且与二者连通设置的空心转杆44、与空心轴连通固定设于推块上的进液管45、转动设于基座上的第三转轴46及第四转轴47、绕设于主动轴和第三转轴上的第一传动带48、绕设于第三转轴和第四转轴上的第二传动带49、一端固定设于推块上的长杆410、固定设于长杆上的升降座411、设于压力管上的多个进液孔412、设于升降座上的滑槽413、可移动设于滑槽内的第一移动板414及第二移动板415、一端位于第一移动板和第二移动板之间另一端转动设于第二传动带上的第五转轴416、一端固定设于第一移动板上且可移动设于升降座上的第二导向杆417、一端固定设于第二移动板上且可移动设于升降座上的第三导向杆418、套设于第二导向杆上且两端分别固定设于第二导向杆另一端和升降座上的第二弹簧419、套设于第三导向杆上且两端分别固定设于第三导向杆另一端和升降座上的第三弹簧420；主动轴转动过程中带动第一传动带运转，第一传动带运转过程中带动第三转轴转动，第三转轴转动带动第二传动带运转，第二传动带运转过程中带动第五转轴往复移动，第五转轴移动过程中带动升降座往复移动，升降座往复移动带动长杆往复移动，最终带动推块位于压力管内往复移动，乙二醇(EG)、一缩二乙二醇(DEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、无水乙酸钠分别与多个进液孔连接，如需注入乙二醇(EG)，推块往复移动过程中使乙二醇(EG)进入压力管内，压力管内的乙二醇(EG)通过进液管进入空心轴内，空心轴内的乙二醇(EG)通过空心转杆进入连接管内，最终进入空心搅拌叶内，第五转轴位于滑槽内移动，通过第一移动板和第二移动板设置，及第二导向杆、第三导向杆、第三弹簧和第二弹簧设置，使第二传动带驱动长杆往复移动过程中不会产生卡顿，整体连动性好，通过第一导向杆和第二导向杆使第一移动板和第二移动板移动过程中起到很好的导向作用，通过第二弹簧和第三弹簧设置起到很好的自适配性。
所述的磁性金属有机骨架材料在有机磷农药中的应用，将所述磁性纳米颗粒MnFe2O4@MIL-100(Fe)分散于待测水样中，涡旋震荡60-90min,使得有机磷类农药残留完全吸附于磁性纳米颗粒上，然后弃去上清液加入解吸液，再次涡旋使得有机磷类农药残留解吸附，磁性分离取上清液，过滤后上机检测。
所述宽谱抗体修饰的磁性纳米颗粒用量为0.2～1mg/mL；所述的解吸液为PBS+5％牛血清蛋白BSA，洗脱时间为20min～30min。
上述第一电机、第二电机为市场上购买得到的。

Claims (10)

1.一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、将FeCl3·6H2O和MnCl2·4H2O及乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)投入搅拌设备中进行搅拌使其完全溶解，然后加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和无水乙酸钠继续搅拌直至完全溶解，将混和溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，升温到190℃～220℃，反应9h～11h，洗涤真空干燥后得到磁性MnFe2O4纳米粒子；
b、将得到的磁性MnFe2O4纳米粒子加入到溶有均苯三甲酸(H3BTC)的水溶液中，搅拌5min～20min，将混和溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，升温到60℃～80℃，反应60min～70min，产物依次超纯水、乙醇各洗涤3～5次，真空干燥后得到磁性金属有机骨架材料MnFe2O4@MIL-100(Fe)；
c、在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化上述磁性金属有机骨架纳米颗粒MnFe2O4@MIL-100(Fe)，将磁性金属有机骨架纳米颗粒在含有宽谱特异性抗体的溶液中进行孵育，制得宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架纳米颗粒，于缓冲液中低温保存；
d、将所述宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架纳米材料加入水溶液有机磷检材中并振荡，采用磁铁吸附所述基于抗体识别的磁性材料，然后将上述吸附有机磷的磁性材料分散于解吸液中，取上清液上机进行检测；
其中，所述步骤a中的搅拌设备包括搅拌桶(1)、固定设于搅拌桶中心处的进料管(2)、设于搅拌桶内的搅拌装置(3)、设于搅拌桶上的控压装置(4)、可移动设于搅拌桶内的活塞板(5)、一端可移动设于搅拌桶上且另一端固定设于活塞板上的第一导向杆(6)、套设于第一导向杆上且两端分别固定设于搅拌桶和活塞板上的第一弹簧(7)、设于搅拌桶上的排料口(8)、设于排料口处的第一电动门(9)、固定设于搅拌桶上的基座(10)、固定设于基座上其与进料管连通的储料箱(11)、设于出料箱上的第二电动门(12)、设于进料管内的螺旋送料桨(13)、固定设于出料箱上用于驱动螺旋送料桨转动的第一电机(14)；开启第二电动门，把FeCl3·6H2O和MnCl2·4H2O混合放入储料箱内，启动第一电机，带动螺旋送料桨转动，把储料箱内的FeCl3·6H2O和MnCl2·4H2O混合料送入搅拌桶内，通过压力装置把乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)注入搅拌装置内，通过搅拌装置边注入边对四者进行搅拌，通过控压装置控制搅拌桶内的压力，对搅拌桶内的增加和减压，通过活塞板往复移动及第一弹簧设置自适配搅拌桶内的压力，反应完成后启动第一电动门，搅拌桶的物料通过排料口排出。
2.根据权利要求1所述的一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤a中制备得到的磁性MnFe2O4纳米粒子粒径在80nm～300nm，EG/DEG混合溶剂的体积比例为:0/20～20/0。
3.根据权利要求1所述的一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤b中的磁性MnFe2O4纳米粒子与均苯三甲酸(H3BTC)的投料比为10：1～15：1。
4.根据权利要求1所述的一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤c中的抗体为有机磷宽谱特异性抗体，所述有机磷类农药为对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷和水胺硫磷，所述的磁性金属有机骨架纳米颗粒与所述抗体的质量比为8：1～5：1，所述的孵育的温度可为37℃，时间为40～60min。
5.根据权利要求1所述的一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述搅拌装置(3)包括转动套设于进料管上的空心套管(31)、等距环形分布且与空心套管连通的多个空心搅拌叶(32)、设于空心搅拌叶上的波浪通孔(33)、等距阵列且贯穿转动设于空心搅拌叶上的多个第一转轴(34)、等距环形分布且固定设于第一转轴上的多个混合板(35)、与多个第一转轴一一对应且转动设于搅拌桶上的多个转盘(36)、固定套设于第一转轴上的第一齿轮(37)、固定设于搅拌桶上且与第一齿轮啮合设置的第二齿轮(38)、转动设于搅拌桶上且与转盘啮合设置的第三齿轮(39)、固定设于第三齿轮上的主动轴(319)、固定设于基座上用于驱动主动轴转动的第二电机(310)、设于空心搅拌叶上的出液孔(311)、与空心搅拌叶连通且固定设于其上的连接管(318)，所述第一转轴贯穿转动设于转盘上；通过第二电机驱动主动轴转动，主动轴转动带动第三齿轮转动，第三齿轮转动带动转盘转动，齿盘转动过程中带动第一转轴公转，第一转轴公转过程中带动第一齿轮公转，所述第二齿轮固定设于搅拌桶上且与第一齿轮啮合设置，从而带动第一齿轮自传，第一转轴自传，第一转轴自传过程中带动多个混合板以第一转轴为轴心转动对搅拌桶内的混合料进行搅拌，乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)通过连接管进入空心搅拌叶中，空心搅拌叶中的乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)通过出液孔排出，通过空心套管设置使多个空心搅拌叶连通。
6.根据权利要求5所述的一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述混合板(35)包括板体(351)、对称设于板体上的两个第一斜面(352)及第二斜面(353)、等距阵列设于板体上的多个多边形孔(354)；乙二醇(EG)/一缩二乙二醇(DEG)从出液孔排出，后经过第一斜面和第二斜面分流并搅拌。
7.根据权利要求5所述的一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述搅拌装置(3)还包括固定套设于第一转轴上的第四齿轮(312)、转动设于空心搅拌叶上且与第四齿轮啮合设置的第五齿轮(313)、转动设于空心搅拌叶上的第二转轴(314)、固定套设于第二转轴上且与第五齿轮啮合设置的第六齿轮(315)、固定套设于第二转轴上的导流扇叶(316)、固定设于转盘上且与导流扇叶对应的分流板(317)；第一转轴转动过程中带动第四齿轮转动，第四齿轮带动第五齿轮转动，第五齿轮转动带动第六齿轮转动，第六齿轮转动带动第二转轴转动，第二转轴转动带动导流扇叶转动，把搅拌桶内的混合料进行导流，导流后的混合料经过分流板分流。
8.根据权利要求5所述的一种宽谱特异性抗体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述控压装置(4)包括压力管(41)、可移动设于压力管内的推块(42)、贯穿固定设于推块上的空心轴(43)、两端分别套设于空心轴和连接管上且与二者连通设置的空心转杆(44)、与空心轴连通固定设于推块上的进液管(45)、转动设于基座上的第三转轴(46)及第四转轴(47)、绕设于主动轴和第三转轴上的第一传动带(48)、绕设于第三转轴和第四转轴上的第二传动带(49)、一端固定设于推块上的长杆(410)、固定设于长杆上的升降座(411)、设于压力管上的多个进液孔(412)、设于升降座上的滑槽(413)、可移动设于滑槽内的第一移动板(414)及第二移动板(415)、一端位于第一移动板和第二移动板之间另一端转动设于第二传动带上的第五转轴(416)、一端固定设于第一移动板上且可移动设于升降座上的第二导向杆(417)、一端固定设于第二移动板上且可移动设于升降座上的第三导向杆(418)、套设于第二导向杆上且两端分别固定设于第二导向杆另一端和升降座上的第二弹簧(419)、套设于第三导向杆上且两端分别固定设于第三导向杆另一端和升降座上的第三弹簧(420)；主动轴转动过程中带动第一传动带运转，第一传动带运转过程中带动第三转轴转动，第三转轴转动带动第二传动带运转，第二传动带运转过程中带动第五转轴往复移动，第五转轴移动过程中带动升降座往复移动，升降座往复移动带动长杆往复移动，最终带动推块位于压力管内往复移动，乙二醇(EG)、一缩二乙二醇(DEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、无水乙酸钠分别与多个进液孔连接，如需注入乙二醇(EG)，推块往复移动过程中使乙二醇(EG)进入压力管内，压力管内的乙二醇(EG)通过进液管进入空心轴内，空心轴内的乙二醇(EG)通过空心转杆进入连接管内，最终进入空心搅拌叶内。
9.权利要求1-8任一项所述的磁性金属有机骨架材料在有机磷农药中的应用，其特征在于：将所述磁性纳米颗粒MnFe2O4@MIL-100(Fe)分散于待测水样中，涡旋震荡60-90min,使得有机磷类农药残留完全吸附于磁性纳米颗粒上，然后弃去上清液加入解吸液，再次涡旋使得有机磷类农药残留解吸附，磁性分离取上清液，过滤后上机检测。
10.根据权利要求9所述的磁性金属有机骨架材料在有机磷农药中的应用，其特征在于：所述宽谱抗体修饰的磁性纳米颗粒用量为0.2～1mg/mL；所述的解吸液为PBS+5％牛血清蛋白BSA，洗脱时间为20min～30min。
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