CN103105386B - 一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法 - Google Patents

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CN103105386B CN201310031804.3A CN201310031804A CN103105386B CN 103105386 B CN103105386 B CN 103105386B CN 201310031804 A CN201310031804 A CN 201310031804A CN 103105386 B CN103105386 B CN 103105386B
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杨黄浩
张晓龙
林立森
郑琤
田中群
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福州大学
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Abstract

本发明提供一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,是一种在磁性材料表面制备孔雀石绿的分子印迹材料,并应用于养殖水体及水产品中痕量孔雀石绿的分离富集,结合拉曼增强技术进行快速检测,属于材料化学和食品安全检测领域。本发明的磁性分子印迹材料结合了分子印迹技术的专一识别性能和磁性材料在磁场下快速分离的优点,减少了传统样品检测前处理中操作过程复杂和耗时的弱点;利用拉曼增强技术实现快速检测,有望用于养殖水体中孔雀石绿的现场快速样品处理和检测。

Description

一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于材料化学和食品安全检测领域,涉及一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,更具体涉及一种在磁性材料表面制备孔雀石绿的分子印迹材料,并应用于养殖水体及水产品中痕量孔雀石绿的分离富集,结合拉曼增强技术进行快速检测孔雀石绿。
背景技术
[0002] 孔雀石绿(Malachite green , MG),为金属光泽的深绿色结晶状固体,属于三苯甲烷类染料,它可用作杀菌剂、驱虫剂。在水产养殖业用来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等,而且为了使鳞受损的鱼延长生命,在运输过程中和存放池内也常用。具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用,因此美国、日本、英国等国家早已禁止其用于水产品养殖业,我国农业部也于2002年将其列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。
[0003] 但由于孔雀石绿在控制真菌感染和寄生虫侵袭等方面的显著效果,而且价格低廉,加之宣传力度不够等原因,使得不少业户还在小范围使用。2005年5月欧盟检出我国出口水产品中三苯甲烷类药物残留,给我国水产品出口带来很大影响,因此,对于孔雀石绿的监控格外重要,是近年来食用水产品卫生安全中重点监控的有机污染物。
[0004] 测定水产品中孔雀石绿等常用的方法有多种,如:分光光度法、薄层色谱法、液相色谱法(LC)、免疫分析法、气质联用法(GC -MS )、液质联用法(LC-MS)等(Roybal JE等,Journal of AOAC Internat1nal , 1995, 78 (2): 453-457 ;那广水等,海洋环境科学,2008,27(2): 95-108 ;赵春城等,中国食品卫生杂志,2009,21 (1): 23-27)。这些方法检测灵敏度高,但存在需要复杂精密仪器,对样品分离净化步骤相对繁琐,对操作技术要求闻等不足。
[0005] 分子印迹是制备对某一特定化合物具有选择性识别能力的聚合物的过程,该化合物叫做模板分子(Template Molecular)或者印迹分子(Imprinted Molecular)。分子印迹技术则是指为了获得在空间和结合位点(Biding Site)上与某一分子(模板分子、印迹分子)完全匹配的聚合物的制备技术。分子印迹聚合物作为新型的高效的分子识别材料,有优越的特异识别性能和高效的选择性的优点,又具有制备简单、成本低廉、功能预构、坚固耐用的特点,非常适用于复杂体系中目标化合物的选择性分离与分析。作为一种高选择性和高亲和性分离材料,分子印迹聚合可克服生物或环境样品基体复杂、预处理手续繁杂等不利因素,为样品的采集、富集和分析提供了极大的方便。
[0006] 表面分子印迹技术是在特定载体表面进行修饰制备分子印迹聚合物的一种方法。使印迹位点处于分子印迹聚合物表面,它能克服空间位阻的影响,使模板分子容易接近分子印迹的识别位点,以解决由包埋法得到的分子印迹结合位点不均一、可接近性差、识别动力学慢等问题。磁性分离是依据物质的磁性差异,在磁场作用力的驱动下,把磁性组分从非磁性组分混合物中分离出来的一种分离技术。预先制备一种磁性载体颗粒作为运载工具,借助于磁性分离装置,对目标分子进行负载、运载和卸载等分离操作,从而实现目标分子的磁性分离过程。将表面印迹技术与磁性纳米材料结合,可以结合表面印迹技术的选择性和特异识别性与磁性纳米材料可磁分离的特点,实现快速、特异分离富集食品中危害因子,有望实现待测物质快速分离和现场应用。
[0007] 拉曼光谱技术具有无须样品制备、不受水分子的干扰、可以进行无创快速检测,检测设备轻便等特点。表面增强拉曼光谱技术使其检测限提高了 4至10个数量级,甚至可达十万亿分之一(10_12 g/g),不仅在物质分子结构分析方面,而且在痕量化学物质快速检测方面也越来越显示出巨大的潜力。
[0008] 本发明将磁性分子印迹材料用于实际样品中孔雀石绿的分离与富集,可以把孔雀石绿从水体和水产品提取液中将孔雀石绿分离,除去影响基质;利用拉曼光谱增强技术实现对富集后的洗脱进行快速检测,可用于现场快速检测养殖水体和水产品存储水体,用于水产品中孔雀石绿的检测。对于养殖水体检测灵敏度达到0.5 PPb0
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种具有磁响应分子印迹聚合物的合成方法,及利用合成的磁性分子印迹聚合物分离富集实际样品中孔雀石绿,并结合拉曼增强光谱技术进行检测的方法。合成的磁性分子印迹聚合物具有快速吸附、特异性吸附、物理和化学稳定、可磁性快速分离等特点。
[0010] 为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
[0011] 一种孔雀石绿磁性分子印迹材料结合拉曼增强技术用于水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,包括如下步骤:
[0012](一)磁性纳米材料合成;
[0013] (二)磁性纳米材料的硅烷化;
[0014](三)二氧化硅包覆磁性纳米材料的乙烯基修饰;
[0015](四)磁性纳米材料分子印迹层的制备;
[0016](五)磁性印迹材料用于孔雀石绿的分离富集;
[0017](六)拉曼增强试剂的合成;
[0018](七)利用孔雀石绿分离富集及结合拉曼增强技术检测;
[0019] 步骤(一):磁性纳米材料为超顺磁磁材料,可采用水热法合成纳米尺寸磁性材料或化学共沉淀法合成纳米尺寸超顺磁磁材料:
[0020] ( I)水热法合成的具体步骤如下:
[0021] 称取1.3g-2.0g的六水合氯化高铁,加到40-60 mL的乙二醇中,搅拌溶解,后加入4.5 g-5.4 g乙酸钠和1.0-1.5 g聚乙二醇2000,搅拌混合I小时,将混合均匀的黄色溶液转移至10mL带有聚四氟乙烯的高压反应釜,至于200摄氏度烘箱加热反应10_15h ;冷却至室温,所得黑色溶液利用磁铁分离,用高纯水洗涤6遍,无水乙醇洗涤6遍,至于真空干燥箱60度干燥至恒重,得到磁性纳米材料;
[0022] (2)化学共沉淀法合成的具体步骤如下:
[0023] 称取四水合氯化亚铁1.59g-l.98g和六水合氯化高铁4.32g_5.4g,溶解于超声和通氮除氧的超纯水80-100 mL,机械搅拌溶解,其中Fe37Fe2+的摩尔比为2:1 ;升高温度至80摄氏度,在快速搅拌条件下加入10-15 mL浓氨水,反应1-1.5h ;冷却至室温,磁分离,用超纯水和无水乙醇各洗涤7遍,真空60度干燥至恒重,得到磁性纳米材料;
[0024] 步骤二:磁性纳米材料娃烧化包覆的具体步骤如下:
[0025] 称取300 mg-500 mg的磁性纳米材料超声分散于50-70 mL的异丙醇中,加入4-6mL的超纯水再超声10-15min,随后加入5_7mL氨水和2_3 mL的四乙氧基硅烷,室温反应12h ;所得颗粒产物磁性分离,水洗7遍,真空60度干燥至恒重;
[0026] 步骤三:二氧化硅包被磁性纳米材料的乙烯基化修饰的具体步骤如下::
[0027] 称取200-300 mg的二氧化硅包被磁性材料分散于50_60 mL的无水甲醇或无水乙醇中超声10_15min,在快速搅拌条件下慢慢滴加Y -甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS),室温搅拌下反应24h,产物磁性分离,无水甲醇或无水乙醇洗涤7遍,真空干燥至恒重;
[0028] 步骤四:孔雀石绿磁性纳米材料分子印迹层的制备:
[0029] 以孔雀石绿为模板,甲基丙烯酸为单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联体,乙腈为致孔剂,乙烯基修饰的磁性纳米颗粒为载体,偶氮二异丁腈为引发剂;称取100-200 mg乙烯基修饰的磁性纳米颗粒超声分散于30-40 mL的乙腈中,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯0.5mL-Ι.0 mL超声混匀;甲基丙烯酸66 μΐ~132 μί与模板0.091 g-0.182 g在乙腈30-40 mL中预组装l_2h ;把磁颗粒与预组装溶液混合后,加入偶氮二异丁腈20-40 mg,超声5min,通氮除氧1min ;密封后,移到摇床300转每min, 5(TC预聚合反应6h, 6(TC聚合24h ;得到聚合物,磁分离后,水洗5遍,无水乙醇洗涤5遍,真空干燥后,再用甲醇乙酸(v/v,9/1)溶液索氏提取72h,甲醇提取8h后,60°C真空干燥至恒重;得到孔雀石绿磁性分子印迹聚合物;
[0030] 步骤五:拉曼增强试剂的合成:所用拉曼增强试剂为银纳米溶胶或金纳米溶胶,可以通过柠檬酸酸钠还原硝酸银溶液或者通过盐酸羟胺还原硝酸银溶液获得。柠檬酸酸钠还原:200 mL含有36 mg硝酸银的水溶液加热至沸腾,剧烈搅拌下,加入4 mL 1%柠檬酸钠的水溶液,反应60-90min ;撤去热源,搅拌下冷却至室温,放于冰箱4度避光保存;盐酸羟胺还原法:室温条件,90 mL 1.11 mM硝酸银溶液在搅拌的条件下快速加入10 mL盐酸羟胺/氢氧化钠(15 mM/30 mM)混合液,反应持续30min,所得溶液放于冰箱保存;或柠檬酸酸钠还原氯金酸水溶液获得:0.7 mLl%柠檬酸钠快速加入至100 mL微沸的0.01% (wt%)氯金酸水溶液,搅拌下回流lh,所得溶液放于冰箱4度避光保存;
[0031] 步骤六:利用孔雀石绿分离富集及结合拉曼增强技术检测:
[0032] I)水样品中分离富集孔雀石绿的具体步骤如下::孔雀石绿磁性印迹材料经2 mL无水甲醇,2 mL超纯水活化后,加入至5 mL待测水体中,振荡5min,磁分离,弃去清液,I mL的超纯水淋洗,磁分离,弃去清液,用200 μί甲醇乙酸(v/v, 9/1)洗脱2min,收集洗脱液待测;
[0033] 2)水产品中分离富集孔雀石绿的具体步骤如下::
[0034] a.提取:称取5g捣碎的匀浆的海鲜肉于50 mL离心管,加入15mL乙腈,振荡提取2min,超声提取2min,振荡提取2min,6000 rpm离心5min,收集清液;再加入10 mL的乙腈至离心管,玻璃棒捣碎离心管沉淀,振荡2min,超声2min,振荡2min,5000 rpm离心5min,
合并清液,即得提取液;
[0035] b.净化:把约25 mL的提取液分次加至活化后的3 g中性氧化铝柱,收集滤液;再2 mL乙腈淋洗收集;把滤液再次过活化的3 g的中性氧化铝柱,收集滤液,用2 mL乙腈淋洗。把滤液移至100 mL梨形瓶,45°C旋转蒸发至0.9-1.1 mL后,残液加入3 mL的超纯水超声振荡提取,收集溶液;再加入2 mL超纯水超声振荡提取,收集溶液;溶液经0.2 μ m的滤膜过滤后,收集溶液;
[0036] c.分离富集:孔雀石绿磁性印迹材料经2 mL甲醇,2 mL水活化后,加入至提取后溶液中,振荡5min,磁分离,弃去清液,ImL的超纯水淋洗,磁分离,弃去清液,用200 μΐ甲醇乙酸(v/v, 9/1)洗脱2min,收集洗脱液待测;
[0037] 步骤七:结合拉曼增强技术检测:取40-100 μί银胶或金胶,加入0.1-1M,10-25μί (NaCl或KCl或KBr或KI)溶液,再加入30-75 μί的待测液,混匀,取30-50 μί于承载凹槽,激光聚集,拉曼光谱检测;
[0038] 本发明点显著优点:本发明的方法合成的孔雀石绿磁性分子印迹聚合物材料,可以从养殖水体中快速分离和富集痕量的孔雀石绿,可以快速的从水产品提取液中分离富集孔雀石绿简化传统操作步骤,结合拉曼光谱技术进行拉曼增强检测,可以快速得到检测结果,可望用于现场快速检测水体中和水产品中孔雀石绿。
[0039] 本发明的磁性分子印迹材料结合了分子印迹技术的专一识别性能和磁性材料在磁场下快速分离的优点,减少了传统样品检测前处理中操作过程复杂和耗时的弱点。
附图说明
[0040] 图1为孔雀石绿磁性分子印迹聚合物制备示意图;
[0041] 图2为制备的磁性分子印迹聚合物透射电镜图;
[0042] 图3为银胶拉曼增强试剂透射电镜图;
[0043] 图4为金纳米颗粒拉曼增强试剂透射电镜图;
[0044] 图5为不同孔雀石绿标准溶液拉曼增强谱图,浓度分别为:0,2 ng/mL, 5 ng/mL, 10ng/mL,20 ng/mL,50ng/mL,100 ng/mL,200ng/mL,500ng/mL ;
[0045] 图6为加标0.5ppb孔雀石绿的养殖水经分子印迹材料富集洗脱后拉曼检测图谱。
具体实施方式
[0046] 应用本发明的内容,采用孔雀石绿为模板分子,在磁性颗粒合成磁性表面分子印迹聚合物,并应用于养殖水体中的孔雀石绿的分离富集,结合表面增强拉曼进行快速检测。
[0047] 下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明,但是不能以此限制本发明的范围。
[0048] 实施例1
[0049] 以孔雀石绿为模板,制备磁性表面分子印迹聚合物(其制备示意图参见图1),包括如下步骤:
[0050] a.采用水热法合成磁性纳米材料:
[0051] 称取1.35 g的六水合氯化高铁,加到40 mL的乙二醇中,搅拌溶解,后加入3.6 g乙酸钠和0.2 g聚乙二醇2000,搅拌混合lh,将混合均匀的黄色溶液转移至50 mL带有聚四氟乙烯的高压反应釜,至于200摄氏度烘箱加热反应1h ;冷却至室温,所得黑色溶液利用磁铁分离,用高纯水洗涤6遍,无水乙醇洗涤6遍,至于真空干燥箱60度干燥至恒重,得到磁性纳米材料;
[0052] b.磁性纳米材料硅烷化包覆:
[0053] 称取300 mg的磁性纳米材料超声分散于50 mL的异丙醇中,加入4 mL的超纯水再超声15分钟,随后加入5 mL氨水和2 mL的四乙氧基硅烷,室温反应12小时;所得颗粒产物磁性分离,水洗7遍,无水乙醇洗3遍,60度真空干燥至恒重;
[0054] c.二氧化硅包被磁性纳米材料的乙烯基化修饰:
[0055] 称取200 mg的二氧化娃包被磁性材料分散于50 mL的无水乙醇中超声15分钟,在快速搅拌条件下慢慢滴加3 mL Y-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS),室温机械搅拌下反应24小时,产物磁性分离,乙醇洗涤7遍,60度真空干燥至恒重;
[0056] d.孔雀石绿磁性纳米材料分子印迹层的制备:
[0057] 以孔雀石绿为模板,甲基丙烯酸为单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联体,乙腈为致孔剂,乙烯基修饰的磁性纳米颗粒为载体,偶氮二异丁腈为引发剂;称取100 mg乙烯基修饰的磁性纳米颗粒超声分散于30 mL的乙腈中,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯1.0mL超声混匀;甲基丙烯酸132 uL与模板0.182 g在乙腈30mL中预组装2小时;把磁颗粒与预组装溶液混合后,加入偶氮二异丁腈40 mg,超声5分钟,通氮除氧10分钟;密封后,移到摇床以300转每分钟震荡,50°C预聚合反应6小时,60°C聚合24小时;得到聚合物,磁分离后,水洗5遍,无水乙醇洗涤5遍,真空干燥后,再用200 mL甲醇/乙酸(9/1,v/v)溶液索氏提取72小时洗脱模板,用150 mL甲醇提取8小时后,60 1:真空干燥至恒重;得到孔雀石绿磁性分子印迹聚合物(其透射电镜图见图2);
[0058] 实施例2:
[0059] 应用孔雀石绿磁性分子印迹材料分离富集养殖水体中孔雀石绿和分离富集水产品提取液中的孔雀石绿,具体步骤如下:
[0060] a.活化:称取10 mg孔雀石绿磁性分子印迹材料于5 mL离心管中,经2 mL无水甲醇,磁性分离后,倒去废液;用2 mL水振荡活化后,磁性分离倒去废液,得到活化好的孔雀石绿磁性分子印迹材料;
[0061] b.养殖水体(为淡水鱼存储所用水体)中孔雀石绿的分离富集:将待测水体过0.22微米的水膜后,取待测滤液水体10 mL,加入活化好的孔雀石绿磁性分子印迹材料振荡5分钟,磁分离,弃去清液;2 mL的超纯水淋洗,磁分离,弃去清液;用200 uL甲醇乙酸(v/v, 9/1)洗脱2分钟,收集洗脱液待测;
[0062] c.水产品中孔雀石绿的分离富集:
[0063] 提取:称取5 g捣碎的匀浆的虾肉于50 mL离心管,加入15 mL乙腈,振荡提取2分钟,超声提取2分钟,振荡提取2分钟,6000 rpm离心5分钟,收集清液;再加入10 mL的乙腈至离心管,玻璃棒捣碎离心管沉淀,振荡2分钟,超声2分钟,振荡2分钟,5000 rpm离心5分钟,合并清液;
[0064] 净化:把约25 mL的提取液分次加至活化后的3g中性氧化铝柱,收集滤液;再2mL乙腈淋洗收集;把滤液再次过活化的3 g的中性氧化铝柱,收集滤液,用2 mL乙腈淋洗。把滤液移至100 mL梨形瓶,45 °C旋转蒸发至I mL后,残液加入3 mL的超纯水超声振荡提取,收集溶液;再加入2 mL超纯水超声振荡提取,收集溶液;溶液经0.2 ym的滤膜过滤后,收集溶液;
[0065] 分离富集:活化后孔雀石绿磁性印迹材料,加入至提取后溶液中,振荡5分钟,磁分离,弃去清液,I mL的超纯水淋洗,磁分离,弃去清液,用200 uL甲醇乙酸(v/v, 9/1)洗脱2分钟,收集洗脱液待测;
[0066] 实施例3:
[0067] 结合表面增强拉曼光谱技术检测孔雀石绿,具体步骤如下:
[0068] a.表面拉曼增强粒子的合成
[0069] 所用拉曼增强试剂为银纳米溶胶或金纳米溶胶,可以通过柠檬酸酸钠还原硝酸银溶液或者通过盐酸羟胺还原硝酸银溶液或柠檬酸酸钠还原氯金酸获得。柠檬酸酸钠还原:200mL含有36mg硝酸银的水溶液加热至沸腾,剧烈搅拌下,加入4 mL 1%柠檬酸钠的水溶液,反应60分钟;撤去热源,搅拌下冷却至室温,放于冰箱4度避光保存(其透射电镜图如图3);盐酸羟胺还原法:室温条件,90 mL 1.1lmM硝酸银溶液在搅拌的条件下快速加入1mL盐酸羟胺/氢氧化钠(15mM/30mM)混合液,反应持续30分钟,所得溶液放于冰箱保存;金纳米颗粒合成,0.7毫升1%朽1檬酸钠快速加入至10mL微沸的0.01% (wt%)氯金酸水溶液,搅拌下回流I小时,所得溶液放于冰箱保存(其透射电镜图如图4);
[0070] b.表面增强拉曼检测孔雀石绿:
[0071] 取40uL银胶,加入10 uL 0.2 M (NaCl或KCl或KBr或者KI)溶液,再加入30 uL的待测液,混匀,取30uL于承载凹槽,激光聚集,拉曼光谱检测;激光功率为60mW,积分1s ;(不同浓度孔雀石绿标准溶液的拉曼检测图参见图5,用于待测检出信号的比对,当待测物出现孔雀石绿的特征峰即认为有孔雀石绿检出。)
[0072] 实施例4:
[0073] —种孔雀石绿磁性分子印迹材料结合拉曼增强技术用于水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,包括如下步骤:
[0074] 步骤一:采用化学共沉淀法合成纳米尺寸超顺磁磁材料:
[0075] 化学共沉淀法合成的具体步骤如下:称取四水合氯化亚铁1.78g和六水合氯化高铁4.32g,溶解于超声和通氮除氧的超纯水100 mL,机械搅拌溶解,其中Fe3+/Fe2+的摩尔比为2:1 ;升高温度至80摄氏度,在快速搅拌条件下加入15 mL浓氨水,反应Ih;冷却至室温,磁分离,用超纯水和乙醇各洗涤7遍,真空60度干燥至恒重,得到磁性纳米材料;
[0076] 步骤二:磁性纳米材料娃烧化包覆的具体步骤如下:称取500 mg的磁性纳米材料超声分散于70 mL的异丙醇中,加入6 mL的超纯水再超声12min,随后加入6mL氨水和3 mL的四乙氧基硅烷,室温反应12h ;所得颗粒产物磁性分离,水洗7遍,真空60度干燥至恒重;
[0077] 步骤三:二氧化硅包被磁性纳米材料的乙烯基化修饰的具体步骤如下:称取300mg的二氧化娃包被磁性材料分散于60 mL的甲醇或乙醇中超声15min,在快速搅拌条件下慢慢滴加Y-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS),室温搅拌下反应24h,产物磁性分离,甲醇洗涤7遍,真空干燥至恒重;
[0078] 步骤四:孔雀石绿磁性纳米材料分子印迹层的制备:以孔雀石绿为模板,甲基丙烯酸为单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联体,乙腈为致孔剂,乙烯基修饰的磁性纳米颗粒为载体,偶氮二异丁腈为引发剂;称取200 mg乙烯基修饰的磁性纳米颗粒超声分散于40 mL的乙腈中,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯1.0 mL超声混匀;甲基丙烯酸132 μί与模板0.182 g在乙腈40 mL中预组装Ih ;把磁颗粒与预组装溶液混合后,加入偶氮二异丁腈40mg,超声5min,通氮除氧1min ;密封后,移到摇床300rpm/min, 50°C预聚合反应6h,60°C聚合24h;得到聚合物,磁分离后,水洗多遍,乙醇洗涤多遍,真空干燥后,再用甲醇乙酸溶液索氏提取72h,甲醇提取8h后,60°C真空干燥至恒重;得到孔雀石绿磁性分子印迹聚合物(其透射电镜图如图2);
[0079] 其中步骤二到步骤三如图1所示;
[0080] 步骤五:拉曼增强试剂的合成:所用拉曼增强试剂为银纳米溶胶,通过盐酸羟胺还原硝酸银溶液获得。盐酸羟胺还原法:室温条件,90 mL 1.11 mM硝酸银溶液在搅拌的条件下快速加入10 mL盐酸轻胺/氢氧化钠(15 mM/30 mM)混合液,反应持续30min,所得溶液放于冰箱保存;或柠檬酸酸钠还原氯金酸水溶液获得:0.7 mLl%柠檬酸钠快速加入至100 mL微沸的0.01% (wt%)氯金酸水溶液,搅拌下回流lh,所得溶液放于冰箱4度避光保存;
[0081] 步骤六:利用孔雀石绿分离富集及结合拉曼增强技术检测:
[0082] I)水样品(所用水体为海水)中分离富集孔雀石绿的具体步骤如下:孔雀石绿磁性印迹材料经2 mL甲醇,2 mL水活化后,加入至待测水体5 mL,振荡5min,磁分离,弃去清液,
1 mL的超纯水淋洗,磁分离,弃去清液,用200 PL甲醇乙酸(v/v, 9/1)洗脱2min,收集洗脱液待测(加标至0.5ng/ml孔雀石绿的养殖水经磁性分子印迹材料分离富集检测的拉曼增强谱图参见图6);
[0083] 2)水产品中分离富集孔雀石绿的具体步骤如下::
[0084] a.提取:称取5g捣碎的匀浆的虾肉于50 mL离心管,加入15mL乙腈,振荡提取2min,超声提取2min,振荡提取2min,6000 rpm离心5min,收集清液;再加入10 mL的乙腈至离心管,玻璃棒捣碎离心管沉淀,振荡2min,超声2min,振荡2min,5000 rpm离心5min,
合并清液,即得提取液;
[0085] b.净化:把约25 mL的提取液分次加至活化后的3 g中性氧化铝柱,收集滤液;再
2 mL乙腈淋洗收集;把滤液再次过活化的3 g的中性氧化铝柱,收集滤液,用2 mL乙腈淋洗。把滤液移至100 mL梨形瓶,45°C旋转蒸发至I mL后,残液加入3 mL的超纯水超声振荡提取,收集溶液;再加入2 mL超纯水超声振荡提取,收集溶液;溶液经0.2 μ m的滤膜过滤后,收集溶液;
[0086] c.分离富集:孔雀石绿磁性印迹材料经2 mL甲醇,2 mL水活化后,加入至提取后溶液中,振荡5min,磁分离,弃去清液,ImL的超纯水淋洗,磁分离,弃去清液,用200 μΐ甲醇乙酸(ν/ν, 9/1)洗脱2min,收集洗脱液待测;
[0087] 步骤七:结合拉曼增强技术检测:取100 PL银胶或金胶,加入25 μί KCl溶液,再加入75 μί的待测液,混匀,取50 μί于承载凹槽,激光聚集,拉曼光谱检测;激光功率为60mW,积分1s ;(将待测物检出拉曼光谱与图5进行比对,出现孔雀石绿特征峰即为孔雀石绿检出)。

Claims (8)

1.一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,其特征在于,所述检测方法是结合分子印迹技术和磁性分离功能,在磁性纳米材料表面制备孔雀石绿的分子印迹层,用于痕量孔雀石绿分离富集,结合拉曼增强技术进行检测,包括如下步骤: (一)磁性纳米材料的合成; (二)磁性纳米材料的硅烷化,制得二氧化硅包覆的磁性纳米材料; (三)二氧化硅包覆的磁性纳米材料的乙烯基修饰,制得乙烯基修饰的磁性纳米材料; (四)乙烯基修饰的磁性纳米材料的分子印迹层的制备,制得磁性印迹材料; (五)拉曼增强试剂的合成,制得银胶或金胶; (六)磁性印迹材料用于孔雀石绿的分离富集; (七)利用拉曼增强技术检测; 所述磁性印迹材料用于孔雀石绿的分离富集,是用于水体中或水产品中的孔雀石绿的分离富集; 所述水体中孔雀石绿的分离富集方法如下:孔雀石绿磁性印迹材料经2mL甲醇,2mL水活化后,加入至5mL待测水体中,振荡5min,磁分离,弃去清液,ImL的超纯水淋洗,磁分离,弃去清液,用200 μ L甲醇乙酸洗脱2min,收集洗脱液待测;按体积比计,所述甲醇:乙酸=9:1 ; 所述水产品中孔雀石绿的分离富集方法如下: a.提取:称取5g捣碎的匀浆的海鲜肉于50mL离心管,加入15mL乙腈,振荡提取2min,超声提取2min,振荡提取2min,6000rpm离心5min,收集清液;再加入1mL的乙腈至离心管,玻璃棒捣碎离心管沉淀,振荡2min,超声2min,振荡2min, 5000rpm离心5min,合并清液,即为提取液; b.净化:把提取液分次加至活化后的3g中性氧化铝柱,收集滤液;再用2mL乙腈淋洗收集;把滤液再次过活化的3g的中性氧化铝柱,收集滤液,用2mL乙腈淋洗,把滤液移至10mL梨形瓶,45°C旋转蒸发至0.9-1.1mL后,残液加入3mL的超纯水超声振荡提取,收集溶液;再加入2mL超纯水超声振荡提取,收集溶液;溶液经0.2μπι的滤膜过滤后,收集溶液; c.分离富集:孔雀石绿磁性印迹材料经2mL甲醇,2mL水活化后,加入至水产品提取溶液中,振荡5min,磁分离,弃去清液,ImL的超纯水淋洗,磁分离,弃去清液,用200 μ L甲醇乙酸洗脱2分钟,收集洗脱液待测;按体积比计,所述甲醇:乙酸=9:1 ; 所述拉曼增强技术检测的具体方法为:取40-100 μ L银胶或金胶,加入0.1-1M10-25 μ L盐溶液再加入30-75 μ L的待测液,混勻,取30-50 μ L于承载凹槽,激光聚集,拉曼光谱检测;所述盐溶液为NaCl、KCl、KBr、KI溶液中的任一种。
2.根据权利要求1所述的一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,其特征在于,所述磁性纳米材料为超顺磁磁材料,采用水热法合成或化学共沉淀法合成。
3.根据权利要求2所述的一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,其特征在于:所述水热法合成的步骤如下:称取1.3g-2.0g的六水合氯化高铁,加到40-60mL的乙二醇中,搅拌溶解,后加入4.5g-5.4g乙酸钠和1.0-1.5g聚乙二醇2000,搅拌混合Ih,将混合均匀的黄色溶液转移至10mL带有聚四氟乙烯的高压反应釜,置于200°C烘箱加热反应10-15h ;冷却至室温,所得黑色溶液利用磁铁分离,用高纯水洗涤6遍,无水乙醇洗涤6遍,置于真空干燥箱60°C干燥至恒重,得到磁性纳米材料。
4.根据权利要求2所述的一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,其特征在于:所述化学共沉淀法合成的步骤如下:称取四水合氯化亚铁1.59g-l.98g和六水合氯化高铁4.32g-5.4g,溶解于超声和通氮除氧的超纯水80-100mL,机械搅拌溶解,其中Fe3+/Fe2+的摩尔比为2:1 ;升高温度至80°C,在快速搅拌条件下加入10-15mL浓氨水,反应1_1.5 h ;冷却至室温,磁分离,用超纯水和无水乙醇各洗涤7遍,真空60°C干燥至恒重,得到磁性纳米材料。
5.根据权利要求1所述的一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,其特征在于,所述磁性纳米材料的娃烧化的具体步骤如下:称取300mg-500mg的磁性纳米材料超声分散于50_70mL的异丙醇中,加入4_6mL的超纯水再超声10-15 min,随后加入5_7mL氨水和2-3mL的四乙氧基硅烷,室温反应12 h ;所得颗粒产物磁性分离,水洗7遍,真空60°C干燥至恒重。
6.根据权利要求1所述的一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,其特征在于,所述二氧化硅包覆的磁性纳米材料的乙烯基修饰的具体步骤如下;称取200-300mg的二氧化娃包覆的磁性材料分散于50-60mL的无水甲醇或无水乙醇中超声10-15min,在快速搅拌条件下慢慢滴加Y-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷,室温搅拌下反应24 h,产物磁性分离,甲醇或乙醇洗涤7遍,真空干燥至恒重。
7.根据权利要求1所述的一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,其特征在于,所述乙烯基修饰的磁性纳米材料的分子印迹层的制备步骤如下:以孔雀石绿为模板,甲基丙烯酸为单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联体,乙腈为致孔剂,乙烯基修饰的磁性纳米材料为载体,偶氮二异丁腈为引发剂;称取100-200mg乙烯基修饰的磁性纳米材料超声分散于30-40mL的乙腈中,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯0.5mL-l.0mL超声混勻;甲基丙烯酸66yL-132yL与模板0.091g_0.182g在乙腈30_40mL中预组装1-2 h ;把乙烯基修饰的磁性纳米材料与预组装溶液混合后,加入偶氮二异丁腈20-40mg,超声5min,通氮除氧1min ;密封后,移到300rpm/min的摇床,5(TC预聚合反应6h, 6(TC聚合24h ;得到聚合物,磁分离后,水洗5遍,无水乙醇洗涤5遍,真空干燥后,再用甲醇乙酸溶液索氏提取72h,甲醇提取8h后,60°C真空干燥至恒重;得到孔雀石绿磁性印迹材料。
8.根据权利要求1所述的一种水体及水产品中孔雀石绿的检测方法,其特征在于,所述拉曼增强试剂的合成如下:所用拉曼增强试剂为银胶或金胶,银胶通过柠檬酸钠还原硝酸银溶液或者通过盐酸羟胺还原硝酸银溶液获得,金胶通过柠檬酸钠还原氯金酸溶液获得;所述柠檬酸钠还原的具体步骤如下:200mL含有36mg硝酸银的水溶液加热至沸腾,剧烈搅拌下,加入4 mL 1%柠檬酸钠的水溶液,反应60-90min ;撤去热源,搅拌下冷却至室温,放于冰箱4°C避光保存;所述盐酸羟胺还原的具体步骤如下:室温条件,90 mL 1.1lmM硝酸银溶液在搅拌的条件下快速加入1mL盐酸羟胺/氢氧化钠混合液,反应持续30min,所得溶液放于冰箱保存;金胶合成:0.7 mL 1%柠檬酸钠快速加入至10mL微沸的0.01%氯金酸水溶液,搅拌下回流lh,所得溶液放于冰箱保存;所述盐酸羟胺/氢氧化钠混合液中,盐酸羟胺浓度为15mM,氢氧化钠的浓度为30mM。
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