CN111724954A - 一种氧化石墨烯磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其制备方法和在细胞分选中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种氧化石墨烯磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其制备方法和在细胞分选中的应用,属于材料学与生物学交叉技术领域,所述氧化石墨烯磁珠,包括氮化铁磁珠核心和包覆在所述氮化铁磁珠核心表面的石墨烯壳层,所述石墨烯壳层经过插层氧化修饰。本发明所述氧化石墨烯磁珠对石墨烯外壳进行氧化修饰,不需要额外包覆其他材料即可实现抗体偶联,因而没有外包材料阻碍磁响应性,最大限度的利用氮化铁磁珠的性质,进行磁性分离;偶联CD3抗体的免疫磁珠能够实现T细胞的分选,且可刺激所分离T细胞的增殖。所述氧化石墨烯磁珠的石墨烯外壳含有大量含氧基团,亲水性使其便于在水中分散,能够与细胞充分接触,提高细胞回收率。
Description
技术领域
本发明属于材料学与生物学交叉技术领域,尤其涉及一种氧化石墨烯磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其制备方法和在细胞分选中的应用。
背景技术
细胞分选是一种从多细胞样品中分离出目的细胞的技术,在多个领域的研究中被广泛应用,包括细胞基本的生物学研究、疾病的诊断以及细胞治疗等诸多领域。科研工作中对单一一种细胞展开研究的需求推动了细胞分选方法的发展,其中与人体免疫系统息息相关的T淋巴细胞一直是医学研究和疾病治疗的关键。无论研究T淋巴细胞作用机制,还是推进以免疫细胞治疗肿瘤为热点的临床应用,均需要从全血或其他混合样本中将T淋巴细胞分离出来,并激活使其扩增。
目前的细胞分选方法大致可分为两类,一类是物理筛选法,包括密度离心分选和孔筛分选等,物理筛选法相对简单快捷,但只能将密度或者大小差别很大的细胞分开,密度或者大小相近的细胞无法分离。如从全血中可以通过密度离心法初步得到密度在1.077的单个核细胞。另一类是免疫筛选法,包括流式细胞术分选和免疫磁珠分选,免疫筛选法较物理分选方法具有精确度高、回收率高等优点。其中,流式分选必须依赖有分选功能的流式细胞仪,这种大型仪器价格昂贵,操作复杂。而且细胞经过标记后,通过仪器内部微管,接受光学激发,会受到一定损伤,在应用上有局限性。免疫磁珠分选是用免疫磁珠在混合细胞中捕获特定细胞的方法,免疫磁珠即偶联抗体的磁性颗粒。磁珠上偶联的特异性抗体可以精确识别相应的靶细胞并与之稳定结合,之后在外加磁场下,细胞因与磁珠相连而聚集于磁极周围或滞留在磁力架上的试管中,从而达到分离目的。这种方法具有方便快捷、操作简便、不需要使用大型仪器,具有对细胞的影响较小,分选后的细胞生物活性好等优点,在生物医学领域中应用越来越广泛。
目前,市售的免疫磁珠是以Fe2O3、Fe3O4这类铁氧化合物或金属微粒作为内核,外壳采用硅化物或高分子材料,便于在这些外壳上引入功能基团。氮化铁磁性材料的磁响应性远大于氧化铁材料,而目前未见其在生物医学上应用。在中国专利ZL201611150118.2(CN106683813B)公开了一种具有核壳结构的石墨烯包覆磁性复合材料,壳体由多层石墨烯片组成,核芯为氮化铁磁性颗粒。在中国专利ZL201710059934.6(CN106710762B)中公开了在石墨烯磁珠表面包覆二氧化硅的方法,额外包覆SiO2使磁珠粒径趋于统一,但改变了原有的石墨烯外壳性质。同时额外包覆使磁珠粒径增大,一定程度上影响了磁响应性。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种氧化石墨烯包覆的氮化铁磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其制备方法和在细胞分选中的应用;所述氧化石墨烯磁珠是对石墨烯外壳进行氧化修饰,氧化后不需要包覆其他材料即可实现抗体偶联,因而没有外包材料阻碍磁响应性,最大限度的利用氮化铁性质,进行细胞的高效分离。所述氧化石墨烯磁珠的石墨烯外壳含有大量含氧基团,亲水性使其便于在水中分散,能够与细胞充分接触,提高细胞回收率。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种氧化石墨烯磁珠,包括氮化铁磁珠核心和包覆在所述氮化铁磁珠核心表面的石墨烯壳层,所述石墨烯壳层经过插层氧化修饰。
优选的,所述氧化石墨烯磁珠的粒径为500nm~2μm。
本发明提供了所述的氧化石墨烯磁珠的制备方法,包括以下步骤:
1)将石墨烯包覆的氮化铁磁珠、硝酸钠、硫酸和高锰酸钾混合获得第一混合料液;
2)将所述第一混合料液超声分散后,与水混合获得第二混合料液;
3)将所述第二混合料液进行插层氧化获得氧化石墨烯磁珠;所述插层氧化的温度为80~90℃,所述插层氧化的时间为3~8min。
优选的,步骤2)中所述超声分散的温度为30~40℃,所述超声分散的时间为25~35min。
优选的,步骤3)中所述插层氧化后还包括离心、水洗和烘干步骤。
优选的,所述离心的转速为7000~8000rpm,所述离心的时间为8~12min。
优选的,对所述方法制备的石墨烯磁珠进行均质处理,减少磁珠团聚。本发明提供了一种抗体偶联氧化石墨烯磁珠,在所述氧化石墨烯磁珠的石墨烯壳层偶联CD3抗体,包括以下步骤:
1)磁珠表面氧化石墨烯上的羧基活化,所述活化温度为15~25℃,所述活化时间为12~18min;2)活化后的磁珠与CD3抗体偶联,所述偶联温度为 15~25℃,所述偶联时间为2~4h;步骤1)中所述羧基活化剂为EDC和NHS,所述活化剂加入质量比为EDC:NHS=3:4。
本发明提供了所述的抗体偶联氧化石墨烯磁珠在细胞分选中的应用。
优选的,将所述抗体偶联氧化石墨烯磁珠与待分选的细胞混合后进行磁分离,收集磁珠、洗涤,洗涤液中即包括T细胞。
优选的,所述待分选的混合细胞的浓度为107~108cell/mL,混合细胞、磁珠共孵育时间为8~12min;置于磁极上磁分离时间为8~12min;洗涤2~4 次,每次洗涤时间为3~7min。
本发明的有益效果:本发明提供了一种氧化石墨烯磁珠,通过对石墨烯壳层的氧化,减少外包覆材料对核心磁响应性的阻碍,最大限度的利用氮化铁核心的性质,能够进行T细胞的高效分离;分选后的T细胞为正常的成团生长的形态,细胞活性不受影响。
附图说明
图1为氧化石墨烯磁珠均质后的效果及测得的平均粒径,其中左图为氧化石墨烯磁珠照片,右图为平均粒径数据;
图2为本发明提供的氧化石墨烯磁珠与市售氧化石墨烯的红外光谱图对比;
图3为本发明提供的氧化石墨烯磁珠的TEM图片,为两个视野下的磁珠,均可见磁珠壳核结构;
图4为TMB显色应用酶标仪检测的吸光度数值,可见磁珠组的数值明显高于空白组,与抗体对照组数值相近;
图5为偶联绿色荧光抗体的氧化石墨烯磁珠(未做均质处理)在共聚焦显微镜下照片,放大倍数为左:10X,右:60X,表面均可见绿色荧光;
图6为抗体偶联氧化石墨烯磁珠分选MT-4细胞(CD3表达34%)及细胞增殖的显微图,从左至右分别为分选当天、培养1天的细胞形态,可见细胞聚团增殖;
图7为应用BCA蛋白定量得到的标准曲线;
图8为检测偶联CD3抗体后抗体活性时酶标仪检测的吸光度数值,可见100倍稀释后磁珠组吸光度值高于空白组;
图9为磁珠分选出MT-4细胞从左至右增殖及形态变化,期间通过磁分离逐渐除去其中磁珠,从左至右分别为分选当天、培养3天、培养5天的细胞形态,可见细胞正常增殖。
具体实施方式
本发明提供了一种氧化石墨烯磁珠,包括氮化铁磁珠核心和包覆在所述氮化铁磁珠核心表面的石墨烯壳层,所述石墨烯壳层经过插层氧化修饰。
在本发明中,所述氧化石墨烯磁珠的粒径优选为500nm~2μm,更优选为1μm。
本发明还提供了所述的氧化石墨烯磁珠的制备方法,包括以下步骤:1) 将石墨烯包覆的氮化铁磁珠、硝酸钠、硫酸和高锰酸钾混合获得第一混合料液;2)将所述第一混合料液超声分散后,与水混合获得第二混合料液;3) 将所述第二混合料液进行插层氧化获得氧化石墨烯磁珠;所述插层氧化的温度为80~90℃,所述插层氧化的时间为3~8min。
在本发明中,将石墨烯包覆的氮化铁磁珠、硝酸钠、硫酸和高锰酸钾混合获得第一混合料液。在本发明中,优选的将石墨烯包覆的氮化铁磁珠与硝酸钠混合,然后再依次与硫酸和高锰酸钾混合。在本发明中,所述石墨烯包覆的氮化铁磁珠与硝酸钠的质量比优选为1:2。在本发明中,混合后的石墨烯包覆的氮化铁磁珠与硝酸钠优选的在冰浴环境下,加入硫酸。在本发明中,所述硫酸的体积与所述石墨烯包覆的氮化铁磁珠的质量比为85~95mL:1g,更优选为92mL:1g;在本发明中,所述硫酸优选为浓硫酸,本发明对所述浓硫酸的的浓度和来源没有特殊限定,采用本领域常规的市售浓硫酸即可。在本发明中,所述高锰酸钾与石墨烯包覆的氮化铁磁珠的质量比为(3~5):1,更优选为4:1。在本发明中,将所述石墨烯包覆的氮化铁磁珠、硝酸钠、硫酸和高锰酸钾混合后,优选的进行搅拌,所述搅拌的时间优选为8~12min,更优选为10min;本发明对所述搅拌的转速没有特殊限定,能够实现混匀即可。
在本发明中,将所述第一混合料液超声分散后,与水混合获得第二混合料液。在本发明中,所述超声分散的温度优选为30~40℃,更优选为35℃;所述超声分散的时间优选为25~35min,更优选为30min。本发明对所述超声分散的功率没有特殊限定,采用本领域常规的超声清洗仪使用的功率即可。本发明在所述超声分散后,优选的还进行机械搅拌,所述机械搅拌的转速优选为60rpm;所述机械搅拌的时间优选为25~35min,更优选为30min。在本发明中,优选的在所述机械搅拌结束后,与水混合。在本发明中,所述水的体积优选为硫酸体积的2倍。
在本发明中,将所述第二混合料液进行插层氧化获得氧化石墨烯磁珠。在本发明中,所述插层氧化的温度为80~90℃,优选为85℃;所述插层氧化的时间为3~8min,优选为5min。在本发明中,所述硫酸及硝酸钠中的硝酸根能够提供一个复合强酸的环境,在这一环境下,强氧化剂高锰酸钾将石墨烯的结构破坏,生成含氧基团。本发明在所述插层氧化结束后,优选的通过向插层氧化体系中添加过氧化氢中和过量的高锰酸钾来结束反应;所述过氧化氢优选为质量浓度为30%的过氧化氢溶液,添加所述过氧化氢后,会产生气泡,所述过氧化氢优选的添加至体系中不再产生气泡为止。
在本发明中,所述插层氧化后还包括离心、水洗和烘干步骤。在本发明中,所述离心的转速优选为7000~8000rpm,更优选为7500rpm;所述离心的时间优选为8~12min,更优选为10min。本发明在所述离心后,收集沉淀即为氧化石墨烯磁珠。在本发明中,所述水洗的次数优选为2~3次,本发明对所述水洗没有特殊限定,采用本领域常规的水洗方法即可。在本发明中,所述干燥优选为烘干,所述烘干的温度优选为55℃,所述烘干的时间优选为4h。
在本发明中,优选的在所述烘干后,还包括所述氧化石墨烯磁珠的分散步骤,在本发明中,所述分散优选的采用高压均质机进行,在本发明具体实施过程中,优选的将所述氧化石墨烯磁珠、乙醇和水混合,进行均质。在本发明中,所述氧化石墨烯磁珠、乙醇和水的质量比优选为1:160:2000;所述均质的压力优选为350~450bar,更优选为400bar,所述均质的时间优选为 3~8min,更优选为5min。本发明收集均质后的氧化石墨烯磁珠溶液,所述氧化石墨烯磁珠溶液中的磁珠分散均匀;本发明中所述分散步骤的目的是解决烘干步骤造成的磁珠团聚问题。
本发明还提供了一种抗体偶联氧化石墨烯磁珠,在所述氧化石墨烯磁珠的石墨烯壳层偶联CD3抗体。在本发明中,所述CD3抗体为T细胞表面抗原CD3对应的抗体。在本发明中,所述CD3抗体优选订制低BSA含量的抗体。在本发明中,优选的通过EDC/NHS法活化所述氧化石墨烯磁珠表面羧基,所述CD3抗体优选的通过与氧化石墨烯磁珠表面活化的羧基偶联。
在本发明中,所述抗体偶联氧化石墨烯磁珠的制备方法优选的包括以下步骤:S1)将氧化石墨烯磁珠置于MES缓冲液中进行超声分散获得氧化石墨烯磁珠液;S2)将所述氧化石墨烯磁珠液、EDC·HCl和NHS混合反应获得活化磁珠;S3)将所述活化磁珠与抗体混合孵育获得抗体偶联氧化石墨烯磁珠。在本发明中,所述氧化石墨烯磁珠液中氧化石墨烯磁珠优选为 1mg/mL。在本发明中,所述氧化石墨烯磁珠、EDC·HCl和NHS的质量比优选为20:7.65:11.5;所述混合反应的时间优选为10~20min,更优选为15min。本发明在获得所述活化磁珠后,优选的将进行洗涤,所述洗涤优选的使用 PCS缓冲液进行。在本发明中,所述抗体与氧化石墨烯磁珠的质量比优选为 1:(150~250),更优选为1:200。在本发明中,所述活化磁珠与抗体混合孵育的时间优选为2~4h,更优选为3h;所述混合孵育的温度优选为20℃;所述混合孵育的过程中优选的伴随震荡,所述震荡的频率优选为180rpm。
本发明还提供了所述的抗体偶联氧化石墨烯磁珠在细胞分选中的应用。在本发明中,优选的将所述抗体偶联氧化石墨烯磁珠与待分选的细胞混合后进行磁分离,洗涤被磁极吸附的细胞,并将其置于细胞培养基或缓冲液中,撤去磁极,则目标细胞分散于培养基或缓冲液中。在本发明中,所述待分选的细胞优选的分散于3%FBS的PBS缓冲液中,所述待分选的细胞的浓度优选为107~108cell/mL。在本发明中,所述磁分离优选的通过磁力试管架实现,所述磁分离的时间优选为8~12min,更优选为10min。在本发明在磁分离T 细胞后,可对T细胞进行培养,T细胞上所结合的CD3免疫磁珠具有促进T 细胞增殖的作用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
用碎冰提供冰浴环境,取烧杯依次加入0.25g石墨烯包覆纳米磁珠(制备方法详见中国专利ZL201611150118.2(CN106683813B)、0.5g硝酸钠、 23mL浓硫酸初步混匀,后缓慢并均匀的加入1g高锰酸钾,加入时维持续搅拌并使加入时间至少为10min。将包含混合物的烧杯置于35℃超声分散 30min,机械搅拌30min。一边搅动烧杯一边使用1mL的移液枪缓慢多次加入总量46mL的去离子水,于85℃反应15min。将烧杯放至25℃,加入30mL 30%的过氧化氢,离心水洗并烘干产物得到表面为氧化石墨烯的纳米磁珠。
使用傅里叶红外光谱仪测得磁珠的红外光谱图,如图2,通过红外特征峰可知本实施例制备的氧化石墨烯材料含有羟基、羧基等含氧基团。通过 TEM观察也可见此时磁珠颗粒完整,氧化方法对其损伤较小(图3)。
将氧化石墨烯磁珠分散于水中,加入20mL乙醇增加分散效果,均质机加压400bar循环打散磁珠5min,收集均质后的磁珠溶液,可观察到磁珠分散均匀,且用粒度分析仪测得磁珠粒径平均值为1062nm(如图1所示)
实施例2
磁珠偶联CD3抗体
取20mg实施例中制备的干燥氧化石墨烯磁珠加入10mL 0.1mol/L的MES缓冲液中超声5min使之彻底分散,用MES缓冲液将溶液补齐至20mL,称取7.65mg的EDC·HCl、11.5mg的NHS同时加入分散好的磁珠中,混匀反应15min,7500rpm离心5min后吸出MES,用PBS缓冲液将酸性体系洗涤至中性,加入100μL CD3抗体(购自BD biosciences pharmingen,纯化的人CD3抗体,货号:555330),于恒温混匀仪震荡2h-4h,使抗体与磁珠充分偶联。将加入磁珠的小管置于磁力架上,5min后吸去上清,用PBS缓冲液洗去游离抗体后得到表面偶联CD3抗体的磁珠。
实施例3
偶联HRP标记抗体的检测实验
配置TMB显色液,利用实施例2中的方法,制备HRP标记抗体(购自北京博奥森生物技术有限公司,山羊抗小鼠二抗,货号:bs-0368G-HRP)的磁珠,取100μL磁珠加入100μL显色液中,37℃孵育7min,加入50μL终止液将混合物加入磁力架上的小管中,静止5min后吸出液体加入微孔板,用多功能酶标仪设定波长450nm测吸光度,结果如图4,抗体组吸光度数值明显高于对照组,说明抗体仍可催化显色,具有生物活性。
实施例4
偶联FITC荧光标记抗体的检测实验
取100μL利用实施例2中方法,制备FITC荧光标记抗体(购自JacksonimmunoResearch,山羊抗兔二抗,货号:111-095-003)的磁珠,稀释5倍后于荧光显微镜下观察,如图5,可见绿色荧光。于荧光共聚焦显微镜下观察,如图可清晰看到磁珠表面包含绿色荧光。
实施例5
偶联抗体含量试验
采用实施例2中方法制备的磁珠,洗去游离抗体的上清可应用BCA试剂盒检测其中的蛋白含量,考虑到含有标记等其他影响,同时做已知抗体含量的对照组。取实施例2中制备的磁珠(吸去游离抗体前)0.25mg,吸去全部的上清溶液,应用BCA试剂盒检测上清中剩余的蛋白含量。由蛋白标准品画出标准曲线(图7),通过吸光度数值差距计算得到已偶联的蛋白含量 (表1),由已知对照组的含量计算可得到抗体偶联效率为每mg磁珠可偶联抗体3.12μg,偶联量占加入量的15.6%。
表1通过吸光度数值差距计算得到已偶联的蛋白含量
实施例6
偶联CD3抗体的生物活性检测
为判断偶联的CD3抗体生物活性,取利用实施例2中方法制备的磁珠悬液1μL,加入2%的BSA封闭30min,轻轻用PBS洗涤一次,加入稀释过的对应CD3抗体种属的带HRP标记二抗,孵育30min后用PBS洗涤3次,使用实施例3的方法检测。如图8所示磁珠组100倍稀释后吸光度值显著高于空白对照,说明CD3抗体仍然有效。
实施例7
应用偶联CD3抗体的磁珠从混合细胞中分选出T细胞系细胞
事先准备细胞量为1×107的混合细胞,重悬于5mL 3%FBS的PBS缓冲液中备用,其中包含表达CD3分子的T细胞系MT-4细胞。向每毫升细胞中加入50μL由实施例2中方法制备的磁珠,用移液器轻轻搅匀混合,轻轻震荡室温培养10min。将细胞磁珠混合物分装入小管,放置磁力架上静置 10min。小心吸出液体后将小管从架上拿下,补充PBS缓冲液,重复步骤洗涤3次,收集侧壁上的细胞进行后续实验。磁珠从混合细胞中抓取目的细胞 MT-4,经继续培养,结果如图9所示,MT-4细胞正常增殖且增殖明显,通过磁分离去除磁珠后为正常成团生长的形态,不影响后续实验。计算分选后与分选前细胞数,得细胞回收率为16%。
由上述实施例可知,本发明提供的抗体偶联的氧化石墨烯磁珠,能够进行T细胞的高效分离;分选后的T细胞为正常的成团生长的形态,细胞活性不受影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种氧化石墨烯磁珠,其特征在于,包括氮化铁磁珠核心和包覆在所述氮化铁磁珠核心表面的石墨烯壳层,所述石墨烯壳层经过插层氧化修饰。
2.根据权利要求1所述的氧化石墨烯磁珠,其特征在于,所述氧化石墨烯磁珠的粒径为500nm~2μm。
3.权利要求1或2所述的氧化石墨烯磁珠的制备方法,包括以下步骤:
1)将石墨烯包覆的氮化铁磁珠、硝酸钠、硫酸和高锰酸钾混合获得第一混合料液;
2)将所述第一混合料液超声分散后,与水混合获得第二混合料液;
3)将所述第二混合料液进行插层氧化获得氧化石墨烯磁珠;所述插层氧化的温度为80~90℃,所述插层氧化的时间为3~8min。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤2)中所述超声分散的温度为30~40℃,所述超声分散的时间为25~35min。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤3)中所述插层氧化后还包括离心、水洗和烘干步骤。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述离心的转速为7000~8000rpm,所述离心的时间为8~12min。
7.一种抗体偶联氧化石墨烯磁珠,其特征在于,在权利要求1或2所述氧化石墨烯磁珠的石墨烯壳层偶联CD3抗体。
8.权利要求7所述偶联CD3抗体的免疫磁珠的制备方法,包括以下步骤:
1)磁珠表面氧化石墨烯上的羧基活化,所述活化温度为15~25℃,所述活化时间为12~18min
2)活化后的磁珠与CD3抗体偶联,所述偶联温度为15~25℃,所述偶联时间为2~4h;
步骤1)中所述羧基活化剂为EDC和NHS。
9.权利要求7所述的抗体偶联氧化石墨烯磁珠在细胞分选中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,将所述抗体偶联氧化石墨烯磁珠与待分选的细胞混合后进行磁分离,收集磁珠、洗涤;所述抗体偶联氧化石墨烯磁珠对分选出的T细胞具有刺激增殖的作用。
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