CN107354134B - 纳米棒阵列的靶细胞捕获基底及其制备方法和应用 - Google Patents

纳米棒阵列的靶细胞捕获基底及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底的制备方法，包括如下步骤：将钛酸四丁酯加入酸溶液中混合并搅拌，形成钛酸四丁酯浓度为1.6v/v％～2v/v％的反应液；将所述反应液倒入置有导电玻璃的反应釜中，在150℃反应4～24h，在所述导电玻璃的导电面上形成TiO2纳米棒阵列；在所述TiO2纳米棒阵列表面枝接抗粘附分子牛血清白蛋白，形成抗粘附层；使所述牛血清白蛋白与所述靶细胞亲和捕获分子偶联，在所述抗粘附层表面形成所述靶细胞的捕获层，获得所述靶细胞捕获基底。

Description

纳米棒阵列的靶细胞捕获基底及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学临床分离技术领域方法，具体的涉及一种基于多尺度TiO2纳米棒阵列结构的CTC高效捕获基底及其制备方法与应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)，是指从源发瘤体脱落进入人体外周血的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞进入血液循环后迁移到身体其他组织部位造成肿瘤的转移，也被称为扩散的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞的生物学分析是理解癌症转移生物学的关键，与癌症转移的早期诊断、治疗效果、癌症的复发及预后密切相关。然而，血液中CTC的含量极其稀少使其分离检测十分困难。为了得到更高效的分离捕获效果，越来越多的人开始试图从3D纳米材料入手以求突破。无机纳米材料由于易于加工成型而备受关注，硅纳米柱、碳纳米管、石墨烯等纳米结构材料已成功应用于CTC捕获基底的研究中。
细胞表面存在着几十到几百纳米的表面结构，如丝状伪足、片状伪足、微绒毛等。研究证实，这些细胞表面纳米尺度的结构形貌能够影响细胞的行为，如细胞吸附、细胞定向及细胞的运动性。目前的研究结果表明纳米尺度在150-500nm左右的纳米粗糙结构对于提高CTC的捕获效率十分有效，而小于100nm的纳米结构可以诱导细胞的粘附等行为。因此，基底纳米材料的设计对于提高细胞的捕获效率至关重要。
因此，如何利用不同尺度下纳米结构对CTC的作用模式以及尺度效应之间的协同效果以进一步的提高CTC的捕获效率有待考察，目前尚无多尺度纳米阵列结构，包括多尺度TiO2纳米棒阵列结构应用于CTC捕获的研究。
发明内容
本发明旨在提供一种生物相容性良好的基于多尺度TiO2纳米棒阵列结构的CTC高效捕获基底，该基底在不同尺度的纳米界面上对分子识别作用进行设计，将抗粘附分子与亲和捕获分子的作用进行有机结合，并利用细胞对不同尺度纳米结构的响应作用提高靶细胞的特异性识别，进而实现CTC的高效捕获。
这种基于TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底的制备方法，包括如下步骤：
将钛酸四丁酯加入酸溶液中混合并搅拌，形成钛酸四丁酯浓度为1.6v/v％～2v/v％的反应液；
将所述反应液倒入置有导电玻璃的反应釜中，在120～180℃反应4～24h，在所述导电玻璃的导电面上形成TiO2纳米棒阵列；
抗粘附层的制备：在所述TiO2纳米棒阵列表面枝接抗粘附分子牛血清白蛋白，形成抗粘附层；
捕获层的制备：使所述牛血清白蛋白与所述靶细胞亲和捕获分子偶联，在所述抗粘附层表面形成所述靶细胞的捕获层，获得所述靶细胞捕获基底。
其中，所述抗粘附层的制备步骤具体操作为：将所述TiO2纳米棒阵列置于体积浓度为0.5～3％的3-氨丙基三乙氧基硅烷-乙醇溶液中反应1～2h，而后于1～2.5v/v％的戊二醛溶液中反应2～4h，再与浓度为1～10mg/ml的牛血清白蛋白水溶液于4～25℃以下反应2～10h。该反应温度可以在室温(25±2℃)下进行，温度越高，反应时间可以相对缩短。
其中，所述捕获层的制备步骤具体操作为：将形成有所述抗粘附层的TiO2纳米棒阵列置于1～2.5v/v％的戊二醛溶液中反应2～4h，而后与浓度为0.1～10μmol/L上皮细胞粘附分子适配体水溶液或修饰化的上皮细胞粘附分子适配体水溶液反应6～10h。
其中，还包括醛基封闭步骤：将形成有所述捕获层的TiO2纳米棒阵列置于浓度为0.1～1mol/L的乙醇胺溶液中反应10～60min。
其中，所述靶细胞为循环肿瘤细胞；所述靶细胞的亲和捕获分子为上皮细胞粘附分子适配体或修饰化的上皮细胞粘附分子适配体。
其中，所述TiO2纳米棒阵列由若干根直径为150～300nm的纳米棒组成；每根纳米棒的由粒径为30～50nm的纳米粒子构成；所述纳米棒阵列高度为0.8～4μm。
本发明还提供这种基于TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底，从下至上依次包括：导电玻璃、TiO2纳米棒阵列、抗粘附层和捕获层；其中，本发明对上述各层的厚度并不作限制，仍可以达到本发明目的；
所述抗粘附层是由枝接在所述TiO2纳米棒阵列表面的抗粘附分子牛血清白蛋白构成；
所述捕获层是由偶联在所述抗粘附层表面的所述靶细胞亲和捕获分子构成。
其中，所述靶细胞为循环肿瘤细胞；所述靶细胞的亲和捕获分子为上皮细胞粘附分子适配体或修饰化的上皮细胞粘附分子适配体。
其中，所述TiO2纳米棒阵列由若干根直径为150～300nm的纳米棒组成；每根纳米棒的由粒径为30～50nm的纳米粒子构成；所述纳米棒阵列高度为0.8～4μm。
本发明还涉及这种基于TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底在循环肿瘤细胞捕获中的应用。
有益效果：
1)基于多尺度TiO2纳米棒阵列的CTC捕获与纯化基底可以提供细胞相容性良好的三维纳米界面，该界面能够提供不同纳米尺度的作用模式，可以更好的与细胞纳米结构匹配和作用；
2)该CTC捕获基底在修饰特异捕获分子的基础上，引入抗粘附分子能够保证高效捕获靶细胞的前提下降低非靶细胞的非特异粘附；
3)利用本发明的制备方法，可以制备不同直径和不同径高比的均一纳米棒阵列结构表面，其简单便捷，成本低；
4)该方法制得的TiO2纳米棒阵列结构基底具有一定的透明度，在CTC捕获基底的应用中实用性强。
附图说明
图1是本发明实施例中获得的a、b、c、d、e、f共6组的不同微观结构的TiO2纳米棒阵列的扫描电镜图。
图2本发明实施例基于TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底进行靶细胞捕获原理示意图。
图3是本发明实施例对TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底进行界面修饰的原理示意图。
图4a是本发明实施例中所制备的不同TiO2纳米棒阵列高径比结果对比。
图4b是本发明实施例中所制备的不同TiO2纳米棒直径随反应时间不同的对比图。
图4c是本发明实施例中所制备的不同TiO2纳米棒阵列基底对细胞的捕获效率对比图。
图5是本发明实施例中优化后的TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底在不同培养时间对靶细胞的捕获效率对比图。
图6a是本发明实施例中优化后的TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底在不同修饰界面对靶细胞捕获行为的对比图。
图6b是本发明实施例中优化后的TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底在不同修饰界面对靶细胞捕获结果的荧光对比图。
图7a是本发明实施例中优化后的TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底对不同细胞的捕获数量对比图。
图7b是本发明实施例中优化后的TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底对不同细胞捕获结果的光学显微镜图。
图8a是本发明实施例中优化后的TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底对在培养基中不同浓度的靶细胞混合样本的捕获效率对比图。
图8b是本发明实施例中优化后的TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底对在血液中不同浓度的靶细胞混合样本的捕获效率对比图。
具体实施方式
下面，将结合附图对本发明实施例做详细介绍。
本发明提供的基于多尺度TiO2纳米棒阵列结构的捕获靶细胞基底的制备方法。其中，本发明提供的靶细胞为循环肿瘤细胞(CTC)。本发明具体步骤如下：
步骤一：将导电玻璃(FTO)分别用洗洁精、水、工业酒精、无水乙醇超声清洗20分钟，将洗净的导电玻璃放入高压反应釜内，其导电面朝外。
取30毫升的去离子水和30毫升的盐酸(质量分数为36.0％-38.0％)混合搅拌10分钟，取1.2毫升的钛酸四丁酯加入混合溶液中，继续搅拌10分钟，形成反应液。优选地，控制钛酸四丁酯在反应液中的体积浓度为1.6v/v％～2v/v％。
步骤二：TiO2纳米棒阵列结构的制备：
将反应液倒入所准备的反应釜中，在150℃条件下进行若干组平行试验，即分别反应4、8、10、12、18、24h。分别得到a、b、c、d、e和f共6组具有不同微观形貌的TiO2纳米棒阵列。此时制得的TiO2纳米棒阵列结构具有未修饰的界面，a、b、c、d、e和f的TiO2纳米棒阵列结构扫描电镜表征图像分别见图1所示。
对a、b、c、d、e和f共6组具有不同微观形貌的TiO2纳米棒阵列进行性能分析实验，选取最优化的TiO2纳米棒阵列结构为下一步实验的基底。
步骤三：抗粘附层的制备，结合图2、图3所示：
将所述步骤二中选出的最优化的TiO2纳米棒阵列置于体积浓度为1v/v％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)-乙醇溶液中反应1～2h，而后置于2.5v/v％的戊二醛水溶液中反应2～4h，然后再将TiO2纳米棒阵列浸没于浓度为10mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)水溶液中、于温度为4℃反应过夜，从而在所述TiO2纳米棒阵列表面枝接BSA分子。此时所得TiO2纳米棒阵列结构表面形成了牛血清白蛋白(BSA)界面作为抗粘附层。
步骤四：捕获层的制备，结合图2、图3所示：
将上述步骤三中已接枝BSA分子的TiO2纳米棒阵列置于2.5v/v％的戊二醛溶液中反应2～4h，而后与浓度为0.1～10μmol/L修饰有氨基官能团的上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，简称EpCAM)适配体反应反应2～10h。
同时，平行制作两个对照组：
对照组1：未修饰的TiO2纳米棒阵列直接用于靶细胞的捕获；
对照组2：只枝接了BSA分子的TiO2纳米棒阵列直接用于靶细胞的捕获。
步骤五：醛基的封闭。
由于上述步骤三、步骤四的活化过程中引入了醛基，本步骤需要将该醛基进行活性的封闭。将步骤四中获得的TiO2纳米棒阵列置于浓度为0.1～1mol/L的乙醇胺溶液中反应10～60min，以封闭未完全反应的醛基基团，制得所述TiO2纳米棒阵列结构为具有靶细胞捕获层的界面。
此时，根据步骤二得到的TiO2纳米棒阵列结构不同，分别获得a、b、c、d、e和f共6组制备完成的靶细胞捕获基底即可应用于捕获靶细胞CTC(结合图2和图3所示)。
下面，本发明还提供几个应用实例来说明本发明获得的基于TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底的优异性能。
性能测试一
以EpCAM阳性的乳腺癌细胞株MCF-7为模型细胞，考察了不同微观形貌的TiO2纳米棒阵列对癌细胞的捕获行为，更为准确的评价各组靶细胞捕获基底的细胞捕获行为。
如图4a和图4b所示，首先分别分析了a、b、c、d、e共5组不同TiO2纳米棒阵列基底的结构特征，对细胞的特异性捕获量的影响。从图中可知，随着在步骤二的反应釜中反应时间的延长，TiO2纳米棒阵列中的每根纳米棒直径并非并非随之增大的，且第d组(反应12h所获得)的TiO2纳米棒阵列其每根纳米棒的“高/直径比”最大，显得相对较为“又窄又高”。
图4c分析了a、b、c、d、e和f共6组不同形貌的TiO2纳米棒阵列对癌细胞的捕获效率影响的对比，结果发现第d组(当水热反应时间为12h时制得)的TiO2纳米棒阵列对癌细胞的捕获效率最大，可判断该TiO2纳米棒阵列为最优选的TiO2纳米棒阵列结构。
性能测试二
以EpCAM阳性的乳腺癌细胞株MCF-7为模型细胞，系统地考察了TiO2纳米棒阵列靶细胞捕获基底表面对癌细胞的捕获效率和特异性，采用构筑未修饰界面和只做BSA修饰的界面作为对照。
将生长状态良好的MCF-7细胞利用0.25％的胰酶消化剥离，而后弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液将细胞吹打均匀，计数细胞，调整细胞悬液至105/ml。将已完成亲和捕获分子修饰的纳米基底置于24孔板中，向每个孔中注入1ml已配置的细胞悬液，在细胞培养箱中孵育10～60min后，利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗3～5次，利用荧光显微镜观察捕获到的细胞，并计数。
实验结果如图5所示，其表明，当孵育时间延长至40min时，细胞捕获效率急剧增大，继续延长孵育时间细胞捕获效率未发生明显提高，这表明40min时靶细胞与TiO2纳米棒阵列表面及其适配体的结合过程已较充分，实现了靶细胞的高效率捕获，确定本发明的靶细胞捕获基底用于靶细胞的捕获过程的需时约为40mn。
参见图6a、图6b所示，与未修饰表面相比，BSA修饰的表面上细胞粘附量明显被抑制，即BSA的引入能够有效的减少细胞的非特异性粘附；而本发明在修饰了BSA的基础上进一步偶联适配体，该界面对靶细胞的捕获能力急剧提高。结果表明，通过调控TiO2纳米棒阵列基底的表面纳米结构和界面性质可以得到具备高效捕获性能的3D纳米结构基底。
性能测试三:所述基底捕获特异性考察
首先制备白细胞(WBCs)溶液：采集静脉血2ml注入盛有0.1ml肝素的试管中混匀，加入等体积的PBS等倍稀释血液。吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。室温2000r/min离心20min。管内可分为四层，用毛细吸管轻轻吸出灰白色的单个核细胞，加入另一支已含有5ml PBS的离心管中，混匀。室温下,以1500rpm离心10min，可去除混杂的血小板。弃上清，重复洗涤一次。用完全1640培养基1ml定容，计数细胞，调整细胞悬液密度。
按照MCF-7细胞/白细胞数量比为1：1比例制成混合细胞样本待用。
将本发明方法获得靶细胞捕获基底安装在4孔培养板中，每孔中加入1ml制备好的细胞悬液，置于37℃，5％CO2条件下培养40min后，用PBS清洗2-5次。利用荧光显微镜观察捕获到的细胞，并计数。结果表明本发明获得的靶细胞捕获基底对靶细胞具有较高的捕获特异性，见图7a所示。图7b为捕获实验后基底上所捕获细胞的荧光显微照片，由此结果可以发现所捕获细胞中靶细胞数量量远远大于非特异的白细胞(黑色圈内细胞)，捕获纯度可达96.2％。
性能测试四：
所述基底对靶细胞捕获灵敏度的考察
向每毫升纯的培养基溶液或人急性淋巴白血病细胞细胞(CCRF-CEM)溶液中加入10、20、50、100、200个已预先用DiI染色的MCF-7细胞，制备成混合细胞样本待用。
本发明获得的靶细胞捕获基底对不同比例靶细胞的人工混合样本的捕获行为结果显示：采用适配体修饰的TiO2纳米棒阵列表面对靶细胞的捕获具有极高的灵敏度。尤其当靶细胞含量极低时，该表面对MCF-7细胞的捕获率高达80％以上，结果见图8a所示。
所述基底对血液样本中靶细胞捕获灵敏度的考察
向每毫升新鲜血液中加入10、20、50、100个已预先用DiI染色的MCF-7细胞制备成混合细胞样本待用。本发明的靶细胞捕获基底对不同比例靶细胞的血液样本的捕获行为结果见图8b。结构显示：85％～95％的靶细胞被捕获，表明本发明的靶细胞捕获基底对靶细胞具有极高的捕获效率和灵敏度。
综述之，本发明构筑了具有良好细胞相容性的多尺度TiO2纳米棒阵列结构基底表面，该表面具有极高的细胞捕获特异性和灵敏度。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (2)

1.一种基于TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将钛酸四丁酯加入酸溶液中混合并搅拌，形成钛酸四丁酯浓度为1.6v/v%~2 v/v %的反应液；
将所述反应液倒入置有导电玻璃的反应釜中，在120~180℃反应4~24 h，在所述导电玻璃的导电面上形成TiO2纳米棒阵列；所述TiO2纳米棒阵列由若干根直径为150~300 nm的纳米棒组成；每根纳米棒由粒径为30~50 nm的纳米粒子构成；所述纳米棒阵列高度为0.8~4 μm；
抗粘附层的制备：将所述TiO2纳米棒阵列置于体积浓度为0.5~3%的3-氨丙基三乙氧基硅烷-乙醇溶液中反应1~2 h，而后于1~2.5 v/v %的戊二醛水溶液中反应2~4 h，再与浓度为1~10 mg/ml的牛血清白蛋白水溶液于4~25℃反应2~10 h，在所述TiO2纳米棒阵列表面枝接抗粘附分子牛血清白蛋白，形成抗粘附层；
捕获层的制备：将形成有所述抗粘附层的TiO2纳米棒阵列置于1~2.5 v/v %的戊二醛溶液中反应2~4 h，而后与浓度为0.1~10 μmol/L的上皮细胞粘附分子适配体水溶液或修饰化的上皮细胞粘附分子适配体水溶液反应6~10 h，使所述牛血清白蛋白与所述靶细胞亲和捕获分子偶联，在所述抗粘附层表面形成所述靶细胞的捕获层；
醛基封闭：将形成有所述捕获层的TiO2纳米棒阵列置于浓度为0.1~1mol/L的乙醇胺溶液中反应10~60 min，获得所述靶细胞捕获基底；
其中，所述靶细胞为循环肿瘤细胞；所述靶细胞的亲和捕获分子为上皮细胞粘附分子适配体或修饰化的上皮细胞粘附分子适配体。
2.一种基于TiO2纳米棒阵列的靶细胞捕获基底，其特征在于，采用如权利要求1所述的制备方法制备获得，所述靶细胞捕获基底从下至上依次包括：导电玻璃、TiO2纳米棒阵列、抗粘附层和捕获层；
所述TiO2纳米棒阵列由若干根直径为150~300 nm的纳米棒组成；每根纳米棒由粒径为30~50 nm的纳米粒子构成；所述纳米棒阵列高度为0.8~4 μm；
所述抗粘附层是由接枝在所述TiO2纳米棒阵列表面的抗粘附分子牛血清白蛋白构成；
所述捕获层是由偶联在所述抗粘附层表面的所述靶细胞亲和捕获分子构成。
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Biocompatible TiO2 nanoparticle-based cell immunoassay for circulating tumor cells capture and identification from cancer patients;Rongxiang He等;《Biomed Microdevices》;20131231;第15卷;617-626 *
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TiO2（B）纳米带光催化剂的制备及分解水产氢性能;李曹龙等;《分子催化》;20150831;第29卷(第4期);382-389 *

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