CN114199835B - 一种循环肿瘤细胞的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种循环肿瘤细胞的检测方法及其应用，涉及循环肿瘤细胞的检测和捕获领域。该检测方法包括采用细胞松弛素D处理循环肿瘤细胞，使循环肿瘤细胞的丝状肌动蛋白破坏。该检测方法通过改变循环肿瘤细胞的细胞膜的力学性能，使处理后的肿瘤细胞的变形能起主导作用相比于黏附能，促进肿瘤细胞粘附于基底表面，进而提高肿瘤细胞的检测效率。与现有技术相比，该检测方法简单方便，不需要复杂的步骤，成本低，不需要昂贵的试剂和设备，且该检测方法使用的细胞松弛素D对细胞活性并不会造成伤害。
Description
技术领域
本发明涉及循环肿瘤细胞的检测和捕获领域，特别是涉及一种循环肿瘤细胞的检测方法 及其应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs)是一种在恶性肿瘤发展过程中在外周血液中扩散和存活的癌细胞， 在远距离的肿瘤转移中起着关键作用。CTCs的检测和分离对于早期癌症诊断和预后非常重 要。此外，CTCs携带大量的病原体。通过检测后的CTCs分析，可以实现个性化治疗。随着纳米技术的发展，各种纳米材料被引入作为检测CTCs的平台。具有纳米形态的基底表面由 于细胞与纳米结构表面之间的强相互作用而有利于其细胞的粘附。利用这一功能，通过纳米 结构基底表面从血液样本中捕获CTCs进行癌症检测被认为是一种很有前途的重要方法。
目前，为了提高细胞捕获效率，许多研究人员致力于基底表面的设计，这包括选择基底 表面的纳米形态和改变表面的化学性质。
许多形状不同的纳米结构，如纳米线、纳米纤维、纳米管和纳米花等被用于分析它们在 实验中对细胞的捕获能力。这是利用具有纳米结构的基底表面有更大的比表面积，可以为细 胞在基底的黏附提供了更多的结合位点。
另一方面，改变基底的表面化学特性也可以提高细胞捕获效率。例如，在纳米结构表面 上修饰抗体或适配体，利用抗体/适配体涂层的纳米基底表面与CTCs上的细胞表面成分(例 如糖蛋白)之间存在增强的局部地形相互作用来提高捕获效率。
然而，在基底表面上设计精密的纳米图案往往需要繁琐的步骤或是昂贵的设备；对基底 表面进行化学修饰的方法中抗体或适配体比较难于修饰到基底表面且修饰过程一般都较为复 杂；上述方法的细胞捕获效率还不够高，与实际应用还存在一定的差距。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种循环肿瘤细胞的检测方法，该检测方法通过使用特定浓 度范围的细胞松弛素D使循环肿瘤细胞保持活性的同时软化，提高循环肿瘤细胞的检测效率。
为了达到上述目的，本发明提供了一种循环肿瘤细胞的检测方法，该检测方法包括采用 细胞松弛素D处理循环肿瘤细胞，使循环肿瘤细胞的丝状肌动蛋白破坏。
本发明人在研究过程中发现，现有技术中为了提高循环肿瘤细胞的检测效率，常用的方 法是设计基底表面的纳米形态或改变表面的化学性质。具体而言，各种形状的多种类型的纳 米结构，例如纳米柱/纳米线、纳米纤、纳米、纳米花和石墨烯氧化物，用于分析它们在实验中对细胞的捕获能力。另一方面，改变基底的表面化学性质也可以提高细胞捕获效率。例如， 抗体或适配体在纳米结构表面上修饰以增强表面与细胞之间的相互作用。但是，在基底表面 上通过各种方法设计精密的纳米图案，比如等离子溅射、气相沉积、液相沉积和激光刻蚀等 不是需要严格苛刻的反应条件就是需要昂贵的原料和设备。而若想将抗体或适配体修饰到基底表面，首先得对表面进行活性处理，其次是修饰偶联剂和链霉亲和素，最后通过与亲和素 的结合才能将抗体或适配体修饰到基底表面，这一系列修饰步骤繁琐且不易。然而，这些方 法的细胞捕获效率仍然不够高，并且，对于黏附到基底表面，CTCs本身有一定的阻力，上述 两个方向的方法使得CTCs的捕获效率不高，与实际应用还有一定距离，捕获效率有待进一 步提高。
然而，基底表面对细胞的捕获实际上是细胞与基底表面相互作用的过程。因此，基底表 面的捕获能力不仅取决于基底表面，还取决于细胞。目前，大多数用于提高细胞捕获效率的 方法都是基于基板表面性质的变化。但是，改变细胞的性质也会影响细胞与底物的相互作用，即也会影响细胞的捕获效率。现有技术中缺乏通过改变细胞特性来提高细胞捕获效率的研究。 同时，本发明人在研究过程中发现，可以从改变细胞特性的角度研发一种提高细胞捕获效率 的方法。而细胞松弛素D能够破坏细胞的丝状肌动蛋白，可以通过控制细胞松弛素D的浓度来调节肿瘤细胞的机械性能，即让肿瘤细胞软化，而软化后的肿瘤细胞的变形能起主导作用 相比于黏附能，改变了细胞膜的力学性能，促进肿瘤细胞粘附于基底表面，进而提高肿瘤细 胞的检测效率。
在其中一个实施例中，所述细胞松弛素D的浓度为30-100ng/ml。
采用上述浓度范围的细胞松弛素D处理循环肿瘤细胞，能使循环肿瘤细胞保持活性的同 时，软化且获得较高的检测效率。
在其中一个实施例中，所述细胞松弛素D的浓度为40-70ng/ml。
在其中一个实施例中，所述检测方法包括以下步骤：采用细胞松弛素D处理循环肿瘤细 胞，采用基底捕获处理后的循环肿瘤细胞。
在其中一个实施例中，所述基底为粗糙的纳米结构或光滑的平面结构。
在其中一个实施例中，所述基底选自纳米柱、纳米线、纳米纤维、纳米管、纳米花或石 墨烯氧化物。
采用上述纳米形态的基底，能加大基底表面积，较好地捕获循环肿瘤细胞，进一步提高 检测效率。
在其中一个实施例中，所述基底修饰有抗体或适配体。
采用上述方式改变基底的表面化学特性，能够通过抗体或适配体与循环肿瘤细胞的细胞 表面成分之间存在增强的局部地形相互作用，进一步提高检测效率。
在其中一个实施例中，所述检测方法包括以下步骤：
软化：采用细胞松弛素D处理循环肿瘤细胞，使循环肿瘤细胞的丝状肌动蛋白破坏；
捕获：采用水热法合成TiO2纳米线阵列，将循环肿瘤细胞在TiO2纳米线阵列上培养30-50 分钟，培养温度为30-40℃；
染色：将捕获的循环肿瘤细胞染色；
结果判断：采用荧光显微镜观察捕获的循环肿瘤细胞，并用图像处理软件计算捕获的循 环肿瘤细胞的数量。
在其中一个实施例中，所述采用细胞松弛素D处理循环肿瘤细胞包括以下步骤：将细胞 松弛素D、循环肿瘤细胞加入培养基，培养时间≥30min。
本发明还提供了所述检测方法在生物样本检测中的应用，所述生物样本选自血液或淋巴 液。
在其中一个实施例中，所述血液或淋巴液取自人体。
在其中一个实施例中，所述生物样本包括白细胞。
在其中一个实施例中，所述白细胞为人白细胞。
因血液样本中的白细胞也可以被纳米结构的基底捕获，存在干扰检测结果的可能性，而细胞松弛素D处理细胞后，白细胞的捕获效率没有提高，因此当生物样本含有白细胞的情况 下，采用所述检测方法，不仅可以显著提高肿瘤细胞捕获效率，且白细胞的捕获效率没有明 显变化，不会给检测结果造成干扰。
本发明还提供了一种丝状肌动蛋白破坏剂在循环肿瘤细胞的检测方法中的应用。
在其中一个实施例中，所述丝状肌动蛋白为细胞松弛素D。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种循环肿瘤细胞的检测方法及其应用，该检测方法通过采用细胞松弛素D处 理循环肿瘤细胞，使循环肿瘤细胞软化，改变循环肿瘤细胞的细胞膜的力学性能，使软化后 的肿瘤细胞的变形能起主导作用相比于黏附能，促使肿瘤细胞粘附于基底表面，进而提高肿 瘤细胞的检测效率。与现有技术相比，该检测方法简单方便，不需要复杂的步骤，成本低， 不需要昂贵的试剂和设备。本检测方法使用的细胞松弛素D对细胞活性并不会造成伤害，这 一点已经通过活性测试实验验证。
附图说明
图1为实施例1的实验流程图；
图2为实施例1中基底上二氧化钛纳米线阵列的扫描电子显微镜图像；
图3为实施例1中用不同浓度的细胞松弛素D(0-500ng/ml)处理后，二氧化钛纳米线 (TNA)上的细胞捕获效率的结果图；
图4为实施例1中检测捕获的MCF-7细胞活力的Hoechst/PI染色图；
图5为实施例2中细胞处理和表面改性条件下的细胞捕获效率的结果图；
图6为实施例2中不同条件下由TiO2纳米线阵列捕获的细胞荧光图像；
图7为实施例3中不同条件下捕获的MCF-7细胞的扫描电子显微镜图像，其中，(a)为细 胞未经处理且基底表面未经修饰的对照组，(b)为基底表面经过修饰，但细胞未经处理的Ap 组，(c)为对细胞进行处理，但未对基底表面进行修饰的CD组，(d)为对细胞进行处理，并对 基底表面进行修饰的Ap+CD组；
图8为实施例3中细胞松弛素D浓度为0ng/ml时，处理MCF-7细胞的荧光图像；
图9为实施例3中细胞松弛素D浓度为50ng/ml时，处理MCF-7细胞的荧光图像；
图10为实施例3中细胞松弛素D浓度为500ng/ml时，处理MCF-7细胞的荧光图像；
图11为实施例4中四种情况下WBC的捕获效率的结果图；
图12为实施例4中在含有白细胞的混合样品中，MCF-7细胞的捕获效率的结果图；
图13为实施例4中捕获后MCF-7细胞(红色)和白细胞(绿色圆圈)的组合荧光图像；
图14为实施例5中细胞在纳米结构基板表面从初始状态到粘附状态的示意图；
图15为实施例5中当φ＝0.25kBT/nm2时，在不同粗糙度参数下，自由能的最小值(ΔEmin) 随膜的拉伸模量(λ)的变化而变化的示意图；
图16为实施例5中当φ＝5kBT/nm2时，在不同粗糙度参数下，膜的粘附能密度(γ)的 函数变化的示意图；
图17为实施例5中φ＝2时，λ-γ平面空间内细胞粘附能力的相图，其中不同深浅颜色条 表示的值和低值对应于强细胞粘附和捕获能力。箭头线是拉伸模量和粘附能密度随细胞松弛 素D增加而变化的示线；
图18为添加不同浓度细胞松弛素D后细胞粘附变化的生物学机制示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了 本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的 实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人 员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施 例的目的，不是旨在于限制本发明。
定义：
细胞松弛素D：属于细胞松弛素中的一种，是具有细胞膜渗透性的真菌毒素。
纳米柱、纳米线、纳米纤维、纳米管、纳米花：指纳米材料构成的不同形状的纳米级结 构。
适配体：指一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行 高亲和力和强特异性的结合。
来源：
细胞松弛素D：美国MCE生物科技公司，目录号：HY-N6682。
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明， 均为本领域的常规实验方法。
实施例1
一种循环肿瘤细胞的检测方法。
1、软化：采用细胞松弛素D处理循环肿瘤细胞，将细胞松弛素D添加到细胞浓度为105MCF-7细胞/毫升的培养基中，使细胞松弛素D在后续捕获步骤中进入循环肿瘤细胞内以破 坏丝状肌动蛋白，从而软化循环肿瘤细胞。
2、捕获：采用水热法合成TiO2纳米线阵列，将添加了细胞松弛素D的细胞培养基加入 到放置有TiO2纳米线阵列的培养皿中，使得循环肿瘤细胞在TiO2纳米线阵列的基底表面上培 养40分钟，培养温度为37℃，循环肿瘤细胞的丝状肌动蛋白在此过程中被细胞松弛素D破 坏，细胞得到软化，而软化后的循环肿瘤细胞被TiO2纳米线阵列捕获。
实施例1的实验流程如图1所示，图2为通过扫描电子显微镜(SEM)显示了通过水热法合成的TiO2纳米线阵列的基底表面。可见，在衬底表面存在致密的TiO2纳米线，平均直径为100nm。
3、染色：对捕获的细胞进行染色，然后取出带有捕获细胞的纳米结构基底，并使用荧光 显微镜观察捕获细胞的数量，以计算细胞捕获效率，结果如图3所示。
结果显示：与未经细胞松弛素D处理的情况相比，当细胞松弛素D浓度为50ng/ml时， 细胞捕获效率可从约35％提高到55％，这意味着通过细胞松弛素D处理细胞，细胞捕获效率 增加了一半以上。当细胞松弛素D的浓度超过50ng/ml时，细胞捕获效率随浓度的增加而降 低。尤其是当浓度达到500ng/ml时，细胞捕捉效率甚至低于未经细胞松弛素D处理的细胞。
图4为Hoechst/PI染色图，结果显示，在50和500ng/ml细胞松弛素D浓度下，几乎没有细胞染红(只有死细胞染红)，这表明当细胞松弛素D浓度低于500ng/ml时，处理后的细胞仍保持较高的活力。
上述结果表明，细胞松弛素D可以提高未修饰底物表面上的细胞捕获效率。
实施例2
一种循环肿瘤细胞的检测方法。
现有技术通常在纳米结构的基底表面进行化学修饰，以进一步提高细胞捕获效率。本领 域技术人员可根据需求在实施例1的基底上修饰生物分子，例如抗体、适配体。为了研究细 胞松弛素D处理是否仍然有效地提高修饰基底表面的细胞捕获效率，本发明人在本实施例中 设立了4组进行实验比较。
control组为循环肿瘤细胞未经细胞松弛素D处理，且未修饰TiO2纳米线阵列基底表面；
Ap组为循环肿瘤细胞未经细胞松弛素D处理，且生物素化适配体修饰TiO2纳米线阵列 基底表面；
CD组为循环肿瘤细胞经细胞松弛素D处理，处理方法和实施例1相同，但基底表面未 经修饰；
Ap+CD组为循环肿瘤细胞经细胞松弛素D处理，处理方法和实施例1相同，并对基底表 面进行修饰。
检测上述4组的细胞捕获效率，结果如图5所示，可以发现，与control组相比，Ap组使用生物素化适配体修饰的基底表面上的细胞捕获效率从35％提高到约60％。更重要的是， 本发明人发现如果细胞松弛素D(50ng/ml)在修饰的基底表面软化细胞，即Ap+CD组，细胞捕获效率进一步提高，达到85％左右。
上述4组捕获的细胞的荧光图像如图6所示。
实施例3
细胞松弛素D对细胞粘附影响的研究。
1、对循环肿瘤细胞粘附后的细胞形态进行表征。
在基底表面捕获细胞的能力与细胞粘附密切相关，细胞粘附力强意味着细胞捕获效率高。 为了研究细胞松弛素D处理对细胞粘附的影响，本实施例使用扫描电子显微镜(SEM)对细胞粘附后的细胞形态进行了表征。
结果如图7所示，本发明人发现当细胞未经细胞松弛素D处理时，被修饰或未修饰的基 底表面捕获的细胞显示出明显的突起形状。然而，经细胞松弛素D处理的细胞在修饰和未修 饰的基底表面均呈现扁平化。
2、研究细胞松弛素D对细胞的肌动蛋白的影响。
为了进一步研究细胞在基底表面的粘附，本发明人用肌动蛋白跟踪器RED-555荧光标记 细胞的肌动蛋白。结果如下：
(细胞松弛素D浓度为零)时，丝状肌动蛋白均匀分布在没有细胞松弛素D的细胞中， 如图8所示；
然而，当细胞松弛素D浓度为50ng/ml时，检测到肌动蛋白细胞骨架的可见变化，其中 部分丝状肌动蛋白断裂形成球状肌动蛋白。在这种情况下，球状肌动蛋白与丝状肌动蛋白共 存，如图9所示；
如果细胞松弛素D浓度提高到500ng/mL，几乎所有丝状肌动蛋白都被破坏，并被球状肌 动蛋白取代，如图10所示；
结果表明，细胞松弛素D的加入会破坏丝状肌动蛋白在细胞粘附过程中的分布。
实施例4
1、细胞松弛素D对白细胞捕获效率的影响。
通过纳米结构捕获癌细胞通常用于检测血液样本中CTC的数量。血液样本中的白细胞 (WBC)也可以被纳米结构的基底捕获。为了探讨细胞松弛素D对白细胞捕获效率的影响， 本发明人在本实施例中设立了4组进行实验比较。
control组为白细胞未经细胞松弛素D处理，且未修饰TiO2纳米线阵列基底表面；
Ap组为白细胞未经细胞松弛素D处理，且生物素化适配体修饰TiO2纳米线阵列基底表 面；
CD组为白细胞经细胞松弛素D处理，处理方法和实施例1相同，但基底表面未经修饰；
Ap+CD组为白细胞经细胞松弛素D处理，处理方法和实施例1相同，并对基底表面进行 修饰。
检测上述4组的细胞捕获效率，结果如图11所示，control组的WBC捕获效率约为5％。 细胞松弛素D处理细胞后，白细胞捕获效率没有提高。同样，当适配体在基底表面修饰时， 由于没有与白细胞特异性结合，白细胞捕获效率没有明显变化。在改性基底表面，处理后的 WBC的捕获效率仍然较低。
结果表明，细胞松弛素D处理对白细胞捕获几乎没有影响。
2、白细胞对本检测方法的循环肿瘤细胞检测效率的影响。
本发明人将癌细胞(MCF-7，Dil预染色)和白细胞以1:1的比例混合，并在捕获前用细 胞松弛素D处理混合细胞，处理方法和实施例1相同。结果如图12所示，捕获的MCF-7细胞和白细胞的组合荧光图像如图13所示。
结果显示，MCF-7细胞在修饰后的基底表面上仍达到约80％的细胞捕获效率，是对照组 的两倍多。实验结果表明，改变细胞膜的力学性能可以显著提高细胞捕获效率，但白细胞没 有明显变化。
实施例5
一种热力学理论模型。
本发明人在研究过程中发现基底的细胞捕获效率取决于细胞在其表面的粘附能力。细胞 粘附能力强意味着细胞容易粘附在基底表面，即基底表面具有较高的细胞捕获效率。相反， 细胞粘附能力弱表示细胞捕获效率低。
细胞在基底表面的粘附能力取决于细胞膜的粘附能和变形能之间的平衡。粘附能通过化 学能释放驱动细胞粘附，但细胞膜的变形能抵抗细胞粘附。能量学证明，如果粘附能大于变 形能，则细胞粘附在基底表面。由于变形能随着细胞粘附而逐渐增加，如果变形能大于粘附能，则进一步的粘附变得不利。存在一个自由能最小的平衡阶段。因此，本发明人通过计算 细胞粘附过程中的总自由能变化来确定细胞粘附能力，即基底的细胞捕获效率。总自由能变 化可以写成：
关系式(1)中γ为细胞的粘附能密度，即细胞膜与基质表面之间单位面积的粘附能，κ 为膜的弯曲模量，c1和c2为弯曲膜表面的两个主曲率，λ为膜的拉伸模量，表示粘附过程中 膜的总面积，S是初始膜的面积。第一项是细胞粘附释放的化学能，第二项根据Helfrich模型表示细胞膜的弯曲能，第三项是拉伸能，最后一项是初始阶段的自由能。
在本模型中，假设细胞具有二维平面形状，细胞膜为无厚度的弹性层，如图14所示。在 这种情况下，细胞膜的总自由能变化可以写为从顶视图看细胞投影面积的函数，即S⊥。
关系式(2)中和χ为粘附系数，由基底表面粗糙度和细胞粘附阶段确定，代表细胞粘 附面积，/>代表细胞底部变形膜的面积，χS⊥是底膜的平均曲率，(χ+1)S⊥代表粘附过程中 细胞的总面积。前三项表示粘着过程中的总自由能，后一项表示初始阶段的自由能。应该注 意的是，关系式(1)和(2)中的自由能变化。与初始阶段有关。换言之，自由能变化是指 粘着过程中的自由能与初始阶段的自由能之差。通常，在三维模型中，单元被视为球形。因 此，在初始阶段没有粘附在基底上，初始阶段的自由能为零。然而，由于目前的二维模型中 细胞的二维平面形状，在初始阶段，较低部分的膜可以直接与基底表面接触，接触面积为/>因此，初始阶段的自由能等于化学能释放，即关系式(2)中的最后一项。
本发明人认识到，当自由能达到最小值时，细胞在稳定状态下粘附在基底表面。从关系 式(2)中，本发明人通过的变化确定ΔE的最小值。
当细胞通过纳米结构阵列粘附到基底表面时，如果细胞膜能够完全吞没纳米结构阵列并 扩散到暴露的底部基底上，则细胞粘附到纳米结构基底表面的面积将等于底部膜的面积。因 此，附着系数和χ等于基板的粗糙度参数，φ即表示为基板的实际面积与投影面积之比。 此外，为了突出主要影响并简化模型，可以忽略弯曲能量的贡献，因为它比其他能量的贡献 小得多。在这种情况下，关系式(3)变为：
从热力学角度可以理解，最小自由能值越小，细胞越容易粘附在基底表面，这意味着基 底对细胞的捕获能力越强。因此，可以通过比较不同条件下的最小自由能值来确定细胞捕获 能力。根据关系式(4)，可以发现，除了地形表面(φ)的影响外，细胞粘附能力还受到膜 拉伸模量(λ)和粘附能密度(γ)的影响。图15显示了自由能变化(ΔEmin)的最小值，图15中的曲线由左至右，依次为φ＝3、φ＝2、φ＝1，该值是当γ＝0.25kBT/nm2时，膜拉伸模 量(λ)的函数，在不同的基底粗糙度参数(φ＝1,2,3)下。可以发现，随着拉伸模量(λ)的降低，ΔEmin值也随之降低，这意味着降低膜的拉伸模量有利于细胞粘附和捕获。从图15中，还可以得出，较大的表面粗糙度参数对应较小的ΔEmin值，这与实验观察结果一致，即表面粗糙度越大，细胞捕获效率越高。除了拉伸模量的影响外，粘附能密度(γ)也影响细胞粘附到基底表面。如图16所示，图16中的曲线由左至右，依次为φ＝1、φ＝2、φ＝3，降低 粘附能密度将导致细胞粘附力的增加，这意味着粘附能密度的降低不利于细胞粘附。为了更好地说明拉伸模量和粘附能量密度的影响，图17显示了当拉伸时，当基底粗糙度参数φ＝2时， 细胞粘附能力(ΔEmin)在λ-γ平面空间的相图，图17中不同深浅颜色条表示的值和低值对 应于强细胞粘附和捕获能力。箭头线是拉伸模量和粘附能密度随细胞松弛素D增加而变化的 示线。结果清楚地表明，拉伸模量小、粘附能密度大的细胞具有较强的粘附能力，易于被基 底表面捕获。
结合实施例1-5，可以得到以下结论：
从生物学角度来看，细胞膜的力学性质，包括拉伸模量，主要由丝状肌动蛋白细胞骨架 的性质决定。丝状肌动蛋白的破坏可降低细胞膜的拉伸模量。根据实施例5中的理论模型， 拉伸模量的降低意味着粘附过程中阻力的降低，即有利于细胞粘附。此外，丝状肌动蛋白可以将活性整合素运输到细胞膜表面，这决定了粘附能量密度。因此，丝状肌动蛋白的破坏将 导致粘附能量密度的降低，从而降低细胞粘附的驱动力，即不利于细胞粘附。在实验中，可 发现随着细胞松弛素D浓度的增加，细胞捕获效率先增加后降低，如图3所示。这一结果可以用添加细胞松弛素D引起的拉伸模量和粘附能密度的变化来解释。细胞松弛素D可以破坏 细胞的丝状肌动蛋白。如图18b所示，当在一定浓度下添加细胞松弛素D时，细胞松弛素D 可以在短时间内破坏丝状肌动蛋白，导致细胞拉伸模量迅速降低。同时，仍有一些未受损的 丝状肌动蛋白能将活性整合素转运到膜表面，导致粘附能密度缓慢降低。在这种情况下，拉伸模量的降低比粘附能量密度的降低更为重要，这意味着细胞的粘附能力比没有细胞松弛素 D的情况下更强。根据图17中的建模结果，拉伸模量的快速降低和粘附能量密度的缓慢降低 将导致拉伸模量的降低，如图17中箭头线的第一段(I)所示，这意味着细胞的粘附能力和 细胞捕获效率将变得更强。当添加高于一定浓度的细胞松弛素D时，如图18c所示，更多的 丝状肌动蛋白被破坏。此时，尽管细胞膜变得柔软，但粘附能密度也变得更小，因为几乎没 有丝状肌动蛋白将活性整合素运输到膜表面。在这种情况下，粘附能量密度的降低比拉伸模 量的降低起着关键作用，这意味着细胞的粘附能力变弱，如图17中箭头线的第二段(II)所 示。因此，存在细胞松弛素D的最佳浓度，其对应于最大捕获效率和的最小值，如图17中 的五角星点(箭头线第一段和第二段的分界点)所示。如果细胞松弛素D的浓度进一步增加， 粘附能密度将变得非常小。在这种情况下，细胞捕获效率甚至会低于不含细胞松弛素D的情 况。图17中的理论结果也得到了这一结果，其中当粘附能密度极低时，将高于初始情况，如第三段(III)所示图17中的箭头线，其中的平方点表示的值等于未经处理的细胞的初始值。 总结上述讨论，图3中关于使用细胞松弛素D软化细胞后细胞捕获效率变化的实验结果可以通过添加细胞松弛素D导致丝状肌动蛋白破坏而引起的拉伸模量和粘附能密度的变化来解 释。当细胞松弛素D低于一定值时在一定浓度下，拉伸模量的降低比粘附能密度的降低更为 重要，从而导致细胞捕获效率的提高。然而，当细胞松弛素D的浓度过高时，粘附能密度变 得极低，导致细胞捕获效率降低。
图18为添加不同浓度细胞松弛素D后细胞粘附变化的生物学机制示意图，其中，(a)在 不添加细胞松弛素D的情况下，由于细胞膜张力的作用，细胞膜保持弯曲形状，活性整合素 通过丝状肌动蛋白的运输紧密分布在细胞膜表面；(b)当添加适当浓度的细胞松弛素D时，软 化的细胞膜在底物表面扩散更好，由于未受损的丝状肌动蛋白的转运，仍有许多活性整合素 均匀分布在细胞膜表面；(c)软化后的细胞膜仍保持一定的弯曲形状，活性整合素稀疏分布在 细胞膜上，因为当添加较高浓度的细胞松弛素D时，几乎没有丝状肌动蛋白来运输活性整合 素。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中 的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾， 都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不 脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种非治疗和/或诊断目的的循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：采用细胞松弛素D处理循环肿瘤细胞，使循环肿瘤细胞的丝状肌动蛋白破坏，降低细胞膜的拉伸模量，采用基底捕获处理后的循环肿瘤细胞，所述细胞松弛素D的浓度为30-100ng/ml；
所述基底为粗糙的纳米结构，所述基底选自纳米柱、纳米线、纳米纤维、纳米管、纳米花或石墨烯氧化物；
所述采用细胞松弛素D处理循环肿瘤细胞包括以下步骤：将细胞松弛素D、循环肿瘤细胞加入培养基，培养时间≥30min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述基底修饰有抗体或适配体。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
软化：采用细胞松弛素D处理循环肿瘤细胞，使循环肿瘤细胞的丝状肌动蛋白破坏；
捕获：采用水热法合成TiO2纳米线阵列，将循环肿瘤细胞在TiO2纳米线阵列上培养30-50分钟，培养温度为30-40℃；
染色：将捕获的循环肿瘤细胞染色；
结果判断：采用荧光显微镜观察捕获的循环肿瘤细胞，并用图像处理软件计算捕获的循环肿瘤细胞的数量。
4.权利要求1-3中任一项所述检测方法在生物样本检测中的应用，所述生物样本选自血液或淋巴液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物样本包括白细胞。
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