CN111424013B - 基于聚苯乙烯纳米球的ctc捕获和分离基底及制备方法 - Google Patents

基于聚苯乙烯纳米球的ctc捕获和分离基底及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底及制备方法。所述基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底包括聚苯乙烯纳米球，连接于聚苯乙烯纳米球表面的聚多巴胺，与聚多巴胺连接的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTC亲和捕获分子。所述制备方法包括：选择细胞相容性良好的聚苯乙烯球构筑三维纳米结构“软”基底，在基底上引入聚多巴胺，为后续反应提供活性位点；引入抗粘附分子，例如牛血清白蛋白分子降低细胞在界面上的非特异粘附，利用CTC亲和捕获分子，例如叶酸实现对CTC细胞的高特异捕获和分离。本发明的CTC捕获和分离基底具备良好的细胞相容性，且制备工艺简单便捷，成本低廉，还易于规模化实施。

Description

基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底及制备方法
技术领域
本发明涉及一种CTC捕获和分离基底，具体的涉及一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底及其制备方法，以及该CTC捕获和分离基底在CTC捕获和分离中的应用，属于医学临床CTC分离技术领域。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)，是指从源发肿瘤病灶脱落，然后进入人体外周血循环的游离肿瘤细胞。循环肿瘤细胞脱离原始病灶进入外周血后，随血液循环迁移到身体的其他部位或组织形成新的病灶，从而造成肿瘤的转移。CTC与癌症的转移、复发、治疗效果评估、用药指导及预后等密切相关，因而被作为癌症转移的早期诊断和治疗效果评估的重要生物标志物。对CTC的研究可以实现癌症的早期诊断，从而提高病人治愈率，降低死亡率，还有望阐明癌症转移、药物敏感性及耐药性产生的内在机理，从而实现对癌症病人的个体化有效治疗。为了得到高纯度及生物活性良好的样本，发展CTC的高效捕获和分离技术具有极其重要的意义。
目前基于CTC分离的纳米结构基底的研究已经成为一个热点领域和方向。经过近几年的研究发展，已将二氧化钛纳米柱、碳纳米管、纳米粒子、纳米纤维以及氧化石墨烯等纳米结构材料应用于CTC捕获基底的研究中。然而目前的研究结果表明硬质性三维纳米结构在提高CTC捕获效率的同时，也增加了对CTC的损伤性，这实际上降低CTC的存活率。而CTC的分子鉴定和功能分析需要高活性的CTC样品。所以要求基底界面的组成具有更好的细胞相容性和柔软性。经聚多巴胺包裹的聚苯乙烯球三微纳米结构“软”基底对捕获在界面上的CTC能更好的保持其生物活性，目前它们还没有应用于基于纳米粒子界面上CTC捕获的研究。
另外，大分子亲和分子如上皮细胞黏附分子(EpCAM)抗体、CD44抗体、CD47抗体、适配体等并不能完全识别循环肿瘤细胞，如EpCAM抗体对发生上皮间充质(EMT)转化的CTC并不能发挥识别功能，包括对EpCAM表达低的CTC和循环肿瘤干细胞(CTSC)都会漏检，从而造成假阴性检测的结果；而且这些抗体价格昂贵。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种生物相容性良好的基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底，该基底在纳米界面上对分子识别作用进行设计，将抗粘附分子与亲和捕获分子的作用进行有机结合，能够有效抑制细胞的非特异性捕获且同时提高靶细胞的特异性识别，进而实现CTC的高效捕获和分离。
本发明的另一目的在于提供一种制备所述基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底的方法，该方法工艺简单便捷，成本低，并且对不同性质的材料具有普适性。
本发明的又一目的在于提供所述基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底的用途。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底，其包括粒径为100～1000nm的聚苯乙烯纳米球，连接于聚苯乙烯纳米球表面的聚多巴胺，与聚多巴胺连接的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTC亲和捕获分子。
在一较佳实施方案之中，所述的基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底包括主要由分布在基材表面的聚苯乙烯纳米球组成的三维纳米结构和自聚合形成于所述聚苯乙烯纳米球表面的聚多巴胺膜结构或聚多巴胺三维纳米颗粒结构。
进一步地，所述CTC亲和捕获分子包括叶酸和/或功能基团修饰的叶酸复合物。
本发明实施例还提供了一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底的制备方法，其包括：
(1)以液面自组装的方法，使粒径为100～1000nm的聚苯乙烯纳米球自组装形成单层密排的聚苯乙烯纳米球三维纳米结构，之后煅烧；
(2)在所述聚苯乙烯纳米球表面枝接聚多巴胺，使聚多巴胺在聚苯乙烯纳米球表面形成纳米厚度的聚多巴胺膜结构或聚多巴胺三维纳米颗粒结构；
(3)将抗粘附分子与连接在所述聚苯乙烯纳米球表面的聚多巴胺偶联；
(4)将CTC亲和捕获分子与所述抗粘附分子偶联，获得基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底。
本发明实施例还提供了前述基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底在CTC捕获和分离中的应用。
例如，其中的一种应用方案可以是：一种装置，其包含前述的任一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底。
又例如，其中的一种应用方案可以是：一种CTC分离方法，其包括：将被捕获的CTC在所述CTC捕获和分离基底上进行释放或原位培养。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
1)基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底可以提供细胞相容性良好的“软”三维纳米界面，能够更好的与细胞纳米结构匹配和作用；
2)该CTC捕获和分离基底在修饰特异捕获分子的基础上，引入抗粘附分子能够保证高效捕获靶细胞的前提下降低非靶细胞的非特异粘附；
3)该CTC捕获和分离基底对所捕获CTC具有良好生物活性，良好的细胞相容性，能保持表面附着细胞的活性，能在界面进行细胞的原位培养实现CTC的进一步纯化。原位培养可以大量扩增CTC，提高CTC的数量，这对CTC的分子鉴定和药物敏感性筛选等研究非常有帮助；
4)利用本发明的制备方法，可以制备单层或多层不同粒径的均一纳米粒子表面，其简单便捷，成本低廉，实用性强，还易于规模化实施；
5)本发明的液面自组装的制备方法对不同性质的材料有普适性；
6)本发明所述制备方法可在不同基材上制备，包括玻璃片(含导电玻璃)、单晶硅片、金属铝片、金属表面等。
附图说明
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的阐述。
图1是本发明一实施方案之中利用一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底的构造原理和表面修饰的过程示意图。
图2是本发明一实施方案之中利用一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底进行CTC捕获和分离的原理图。
图3a-图3d分别是本发明实施例2中利用一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底在不同煅烧温度、时间条件下的优化结果示意图。
图4a和图4b是本发明实施例1中以液面自组装的方法制备的聚苯乙烯纳米球基底和聚苯乙烯纳米球-聚多巴胺纳米颗粒基底表面的SEM照片。
图5是本发明实施例1中对聚苯乙烯纳米球基底进行界面化学修饰的原理图。
图6a-图6c分别是本发明实施例3中利用基底a、b、c三种不同界面捕获细胞的荧光照片。
图7a是本发明实施例4中聚苯乙烯纳米球基底在不同孵育时间条件下，分别对阴性和阳性两种细胞捕获行为的考察结果图。
图7b是本发明实施例5中三种不同修饰界面分别对两种阳性靶细胞的捕获效率对比图。
图7c是本发明实施例5中聚苯乙烯纳米球基底对不同细胞株捕获特异性的考察结果图。
图8是本发明实施例6中聚苯乙烯纳米球基底在1×PBS中和人体血液中对少量靶细胞的灵敏度捕获检测结果图。
具体实施方式
鉴于现有技术的不足，本案发明人经长期研究和实践，提出了本发明的技术方案，即，提供了一种基于聚苯乙烯纳米球的循环肿瘤细胞(CTC)捕获和分离基底及其制备方法与应用。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
具体而言，本发明的一个方面包括：通过选择细胞相容性良好的聚苯乙烯纳米球-聚多巴胺三维纳米结构“软”基底，并引入抗粘附分子降低细胞在界面上的非特异粘附，以及利用CTC亲和捕获分子实现对CTC细胞的高特异捕获和分离(其原理可参阅图1和2)。
作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的系一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底，其包括粒径为100～1000nm的聚苯乙烯纳米球，连接于聚苯乙烯纳米球表面的聚多巴胺，与聚多巴胺连接的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTC亲和捕获分子。
在一较佳实施方案之中，所述的基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底包括主要由分布在基材表面的聚苯乙烯纳米球组成的三维纳米结构和自聚合形成于所述聚苯乙烯纳米球表面的聚多巴胺膜结构或聚多巴胺三维纳米颗粒结构。
进一步地，所述CTC捕获和分离基底包括主要由分布在基材表面的聚苯乙烯纳米球组成的三维纳米结构和自聚合于聚苯乙烯纳米球表面的聚多巴胺纳米颗粒或薄膜。
其中，采用的聚苯乙烯纳米球和聚多巴胺纳米颗粒或薄膜表面具有良好的细胞相容性和微结构匹配性。
进一步地，形成所述聚多巴胺的单体具有功能基团邻苯二酚和/或醌基，还可以是其他带有邻苯二酚功能基团的物质，但不限于此。
进一步地，所述连接于PLGA纳米纤维表面的抗粘附分子旨在降低细胞在界面上的非特异性粘附，使用的是牛血清白蛋白大分子(BSA)，但不限于此。
进一步地，所述与抗粘附分子连接的CTCs亲和捕获分子用以实现CTC细胞的高特异捕获，其可以包括叶酸、或各种功能基团修饰的叶酸，或其他功能基团修饰的聚乙二醇与能基团修饰的叶酸的复合物，例如：叶酸-聚乙二醇复合物，叠氮或炔基化叶酸等，尤其优选为FA-PEG-NH2，且不限于此。
进一步地，所述功能基团包括巯基、氨基、羧基、叠氮和炔基等中的一种或两种以上组合，但不限于此。
进一步地，所述复合物包括所述功能基团修饰的聚乙二醇与所述功能基团修饰的叶酸的复合物。
叶酸小分子价格低廉，其受体在肿瘤细胞表面高表达，在正常细胞中表达量极低，且叶酸与叶酸受体结合性强，所以本发明选择小分子叶酸来作为捕获其阳性循环肿瘤细胞的亲和分子。
作为本发明技术方案的另一个方面，其所涉及的系包括：利用液面自组装的方法构筑单层密排的三维纳米结构界面，然后将多巴胺聚合到聚苯乙烯纳米球上形成二级结构纳米颗粒或薄膜，再将抗粘附分子，例如牛血清白蛋白(BSA)分子，通过化学反应连接在聚多巴胺表面，而后将亲和捕获分子，例如叶酸-聚乙二醇复合物，通过戊二醛交联剂与抗粘附分子结合，获得所述基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底。
具体的讲，所述基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底的制备方法，其包括以下步骤：
(1)以液面自组装的方法，使粒径为100～1000nm的聚苯乙烯纳米球自组装形成单层密排的聚苯乙烯纳米球三维纳米结构，之后煅烧；
(2)在所述聚苯乙烯纳米球表面枝接聚多巴胺，使聚多巴胺在聚苯乙烯纳米球表面形成纳米厚度的聚多巴胺膜结构或聚多巴胺三维纳米颗粒结构；
(3)将抗粘附分子与连接在所述聚苯乙烯纳米球表面的聚多巴胺偶联；
(4)将CTC亲和捕获分子与所述抗粘附分子偶联，获得基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底。
在一些优选实施例之中，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1.1)将粒径为100～1000nm的聚苯乙烯纳米球溶液分散在洁净的玻璃片表面，在空气中使其干燥；
(2.1)将步骤(1.1)的玻片垂直缓慢放入水中，使玻璃片上的聚苯乙烯纳米球在液面上自组装形成单层密排的三维纳米结构薄膜；
(3.1)用洗净的导电玻璃将液面上的单层密排的聚苯乙烯纳米球三维结构膜从液面上引入到其导电面上，空气中晾干，然后于100～150℃下煅烧3min～1h，使其固定；
(4.1)将多巴胺在聚苯乙烯纳米球表面聚合形成聚多巴胺纳米颗粒或薄膜，然后在其表面枝接抗粘附分子；
(5.1)将CTC亲和捕获分子与连接在所述聚多巴胺纳米球或薄膜表面的抗粘附分子偶联，获得所述CTC捕获和分离基底。
在一些优选实施例之中，步骤(1)的具体操作为：
将粒径为100～1000nm的聚苯乙烯纳米球溶液分散在一基材表面，在空气中干燥，之后将载有所述聚苯乙烯纳米球的基材垂直缓慢浸置于选定液相体系中，使聚苯乙烯纳米球在所述选定液相体系表面自组装形成单层密排的聚苯乙烯纳米球三维纳米结构；以及，
将所述聚苯乙烯纳米球三维纳米结构引入到一导电基体的导电面上，于空气中晾干，再于100～150℃下煅烧3min～1h，之后冷却.
在一较为优选的实施方案之中，步骤(1)还包括：用食人鱼溶液清洗玻璃片，然后用大量超纯水将玻璃片上残余的酸冲洗干净，然后在烘箱中烘干，待冷却后将聚苯乙烯纳米球溶液均匀的涂抹在玻璃片上，并在空气中干燥。
在一较为优选的实施方案之中，步骤(1)包括：将清洗所获玻璃片垂直且缓慢的放入水中，使聚苯乙烯球在液面上形成一层均匀单层密排三微纳米结构薄膜。
其中，所述玻璃片可以用单晶硅片、金属铝片、金属表面等替换，且不限于此。
进一步地，所述制备方法更具体包括：将聚苯乙烯纳米球溶液均匀涂覆在洁净的载玻片上，然后晾干，再将涂有聚苯乙烯纳米球的载玻片竖直缓慢放入水中，聚苯乙烯纳米球会在液面上自组装形成单层密排的纳米薄膜，将薄膜引入到洁净导电玻璃的导电面上，再取出晾干，然后，于100～150℃下煅烧3min～1h后，使其冷却，固定聚苯乙烯纳米球在导电玻璃上，从而获得单层紧密排列、具有光子效应的聚苯乙烯纳米球三维纳米结构基底，包括利用此方法重复操作得到包含多层聚苯乙烯纳米球三维纳米结构的导电基体。
其中所述导电玻璃是指在玻璃表面镀上一层ITO或FTO导电膜的玻璃，但不限于此。
在一些优选实施例之中，步骤(2)的具体操作为：在温度为25～50℃、pH为大于8的碱性溶液中，使单体多巴胺自聚合反应1～24h，从而接枝聚合到所述聚苯乙烯纳米球表面，形成纳米厚度的聚多巴胺膜结构或聚多巴胺三维纳米颗粒结构。
进一步地，所述碱性溶液包括磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或氢氧化钠溶液，但不限于此。
进一步地，所述多巴胺的形貌为薄膜或纳米颗粒。
进一步地，所述多巴胺具有功能基团邻苯二酚和/或醌基，但不限于此。
在一些优选实施例之中，步骤(3)的具体操作为：将步骤(2)所获表面枝接聚多巴胺的聚苯乙烯纳米球置于浓度为0.1～2m/v％的牛血清白蛋白溶液中反应1～24h，然后浸入0.25～25v/v％的戊二醛溶液中避光反应2～8h。
进一步地，在所述聚多巴胺纳米颗粒或薄膜表面可以枝接抗粘附分子牛血清白蛋白和其他带有氨基或巯基功能基团的物质，在碱性条件下反应1～24h。
在一些优选实施例之中，步骤(4)的具体操作为：
在磷酸盐缓冲液(PBS溶液)中，使CTC亲和捕获分子在具有醛基的偶联试剂的作用下，与表面接枝有抗粘附分子的聚多巴胺膜结构或聚多巴胺三维纳米颗粒结构于室温下反应2～8h，获得基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底。
进一步地，在一较为优选的实施方案之中，步骤(4)包括：在中性条件下，使CTC亲和捕获分子通过交联试剂戊二醛的作用，与表面接枝有牛血清白蛋白分子的聚多巴胺纳米颗粒或薄膜进行偶联。
进一步地，在磷酸盐缓冲液中，室温避光反应2～8h条件下，用0.25～25v/v％交联剂戊二醛，将亲和捕获分子偶联到抗粘附分子上；
以及，将所述聚苯乙烯纳米球基底置于浓度为0.1～1M的乙醇胺溶液中反应10～60min，以封闭未完全反应的醛基基团，获得所述CTC捕获和分离基底。
进一步地，所述制备方法还包括：将质均分子量为2000～5000Da的带有功能基团的聚乙二醇以点击反应的方式与带有功能基团的的叶酸结合形成聚乙二醇-叶酸复合物，获得CTC亲和捕获分子；所述功能基团包括炔基或叠氮基团，但不限于此。
进一步地，将分子量为Mw 2000～5000Da的带有叠氮基功能基团的聚乙二醇以点击反应的方式与带有炔基功能化叶酸结合形成可溶于水的稳定的复合物。
更进一步地，聚乙二醇其中一端的功能基团为炔基或叠氮，叶酸带有功能基团叠氮或炔基，聚乙二醇-叶酸复合物溶液的颜色随其浓度的增加从无色变成淡黄色最后变成褐色或棕色。
其中，在一更为具体的实施案例中，一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底的制备方法，可以包括如下步骤：
a)采用统一粒径大小的聚苯乙烯纳米球溶液，于室温下均匀涂覆到洁净的玻璃表面，并将其置于空气中自然晾干或吹干；
b)将步骤a)中得到的干燥后的玻璃片竖直缓慢放入平静的水中，聚苯乙烯纳米球会在液面上自组装形成一层密排的三维纳米结构薄膜，然后用洗净的导电玻璃将薄膜从水面上捞出，其导电面与薄膜接触，然后在室温下晾干或吹干，再将其放在烘箱中，在100～150℃条件下煅烧3min～1h，使其固定在导电玻璃表面；
c)将步骤b)所获的聚苯乙烯纳米球基材表面置于pH>8的多巴胺Tris-HCl溶液中，25～50℃条件下反应1～24h，然后去离子水清洗至中性；
d)将步骤c中的聚苯乙烯纳米球-聚多巴胺表面置于浓度为0.1～2m/v％的牛血清白蛋白溶液中反应1～24h，然后浸入0.25～25v/v％的戊二醛溶液中避光反应2～8h；
e)在中性条件下，使浓度为10～1000mM的叶酸-聚乙二醇复合物与抗粘附分子接枝的戊二醛进行偶联，室温下反应2～8h；
f)将步骤e中的获得聚苯乙烯纳米球表面置于浓度为0.1～1M的乙醇胺溶液中反应10～60min，以封闭未完全反应的醛基基团，即制得所述基底。
综上，本发明提供的CTC捕获和分离基底具备良好的细胞相容性，能保持表面附着细胞的活性，且制备简单经济。
作为本发明技术方案的另一个方面，其所涉及的系前述基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底在CTC捕获和分离中的应用。
例如，其中的一种应用方案可以是：一种装置，其包含前述的任一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底。
又例如，其中的一种应用方案可以是：一种CTC分离方法，其包括：将被捕获的CTC在所述CTC捕获和分离基底上进行释放或原位培养。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
本实施例中基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底的制备方法的具体步骤如下：
a)采用统一粒径大小750nm的聚苯乙烯纳米球溶液，于室温下均匀涂覆到洁净的玻璃表面，并将其置于空气中自然晾干或吹干；
b)将步骤a)中得到的干燥后的玻片竖直缓慢放入平静的水中，聚苯乙烯纳米球会在液面上自组装形成一层密排的三维纳米结构薄膜，然后用洗净的导电玻璃将薄膜从水面上捞出，其导电面与薄膜接触，然后在室温下晾干或吹干，在将其放在烘箱中，在110℃条件下煅烧15min，使其固定在导电玻璃上，其过程示意图如图1所示；
c)将步骤b所获的聚苯乙烯纳米球基材表面置于pH＝8.5的多巴胺Tris-HCl溶液中，50℃条件下反应24h,去离子水清洗至中性；本实施例制备的聚苯乙烯纳米球基底和聚苯乙烯纳米球-聚多巴胺纳米颗粒基底表面的SEM照片如图4a和图4b所示；
d)将步骤c中的聚苯乙烯纳米球-聚多巴胺表面置于浓度为1m/v％的牛血清白蛋白的PBS溶液中反应12h，然后浸入2.5v/v％的戊二醛溶液中避光反应4h；
e)在中性条件下，使浓度为10mM的叶酸-聚乙二醇复合物与抗粘附分子接枝的戊二醛进行偶联；
f)将步骤e中的获得聚苯乙烯纳米球表面置于浓度为0.1M的乙醇胺溶液中反应60min，以封闭未完全反应的醛基基团，即制得所述基底，其修饰流程图如图5所示。
实施例2本实施例中基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底的制备方法中煅烧温度和时间的选择：
将组装好的单层有序密排的聚苯乙烯纳米球基地放入烘箱中煅烧，分别选择了不同温度和不同时间进行煅烧，结果如图3a-图3d所示，其中，图3a是在100℃下煅烧15min，图3b是在110℃下煅烧10min，图3c是在110℃下煅烧15min，图3d是在110℃下煅烧30min；结果显示在110℃15min条件下煅烧的结果最好，此条件下的聚苯乙烯球基本没有发生变形且相互连接在一起，而且与玻璃片上的纳米结构紧密结合，从而使聚苯乙烯膜牢固的连接在玻璃片上。
实施例3以叶酸受体阳性的宫颈癌细胞株HeLa为模型细胞，考察了不同修饰纳米结构表面对癌细胞的捕获行为。图6a-图6c分别为3种不同修饰界面对HeLa细胞的不同捕获行为的荧光照片。经BSA-PEG-FA修饰的表面(图6c)细胞捕获量最大，同时BSA修饰的表面(图6b)细胞粘附量最小，图6a是聚苯乙烯纳米球界面对HeLa的捕获效果。
实施例4以叶酸受体阳性的宫颈癌细胞株HeLa和阴性细胞株293T为模型细胞，系统地考察了不同孵育时间，基底表面对癌细胞的捕获效率和特异性。将已培养两天而且生长状态良好的HeLa和293T细胞同时利用0.25％的胰酶消化剥离，而后弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液将细胞吹打均匀，计数细胞，均调整细胞悬液至0.5×105/ml。将已修饰完成的纳米基底分成A、B两组分别置于24孔板中，向A组的每个孔中注入1ml已配置的HeLa细胞悬液，向B组的每个孔中注入1ml已配置的293T细胞悬液，同时在细胞培养箱中孵育10-60min后，利用PBS清洗3-5次，利用荧光显微镜观察捕获到的细胞，并计数。实验结果表明，基底表面上的阴性细胞293T的粘附量虽略有增加但是明显被抑制，即BSA的引入能够有效的减少细胞的非特异性粘附(图7a)。基底表面对阳性靶细胞的捕获量在孵育40min时达到最优捕获效果。
实施例5测试适配体的特异性
选择了另外一种叶酸受体阳性细胞株KB和一种阴性细胞株293T细胞进行了细胞捕获实验。叶酸的捕获特异性的评估结果汇总见图7b和7c。实验结果表明，叶酸修饰的聚苯乙烯纳米球表面对叶酸受体阳性细胞株均具有较高的捕获效率而对叶酸受体阴性细胞株的捕获率均较低。
实施例6所述基底在PBS缓冲液中对少量细胞株的捕获特异性考察
将1cm×2cm的已经修饰好的聚苯乙烯纳米球基底放入4孔腔室中，以PBS为缓冲液，每孔分别加入含有10,20,50,100,200个已预先用DiI染色的HeLa细胞制备成的细胞悬液1mL。置于37℃，5％CO2条件下培养40min后，用PBS清洗2～5次。利用荧光显微镜观察捕获到的细胞，并计数。
聚苯乙烯纳米球表面对不同比例靶细胞样本的捕获行为的结果显示叶酸修饰的聚苯乙烯纳米球米粒子表面对靶细胞的捕获具有极高的特异性。尤其当靶细胞含量极低时，该表面对HeLa细胞的捕获率高达90％，实验结果见图8中的灰色线。
实施例7所述基底在血液中对少量细胞株的捕获特异性考察
将1cm×2cm的已经修饰好的聚苯乙烯纳米球基底放入4孔腔室中，以健康人的新鲜血液为缓冲液，每孔分别加入含有10,20,50,100,200个已预先用DiI染色的HeLa细胞制备成的混合细胞血液样1mL。置于37℃，5％CO2条件下培养40min后，用PBS清洗2～5次。利用荧光显微镜观察捕获到的细胞，并计数。
聚苯乙烯纳米球表面对不同比例靶细胞样本的捕获行为结果显示叶酸修饰的壳聚糖纳米粒子表面对靶细胞的捕获具有较高的特异性。尤其当靶细胞含量极低时，该表面对HeLa细胞的捕获率高达86.9％，实验结果见图8中的黑色线。
实施例8
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤b)的煅烧温度为100℃，煅烧时间为1h，c)将步骤b所获的聚苯乙烯纳米球基材表面置于pH＝8.5的多巴胺Tris-HCl溶液中，25℃条件下反应20h，
d)将步骤c中的聚苯乙烯纳米球-聚多巴胺表面置于浓度为0.1m/v％的牛血清白蛋白的PBS溶液中反应24h，然后浸入0.25v/v％的戊二醛溶液中避光反应8h；
f)将步骤e中的获得聚苯乙烯纳米球表面置于浓度为0.5M的乙醇胺溶液中反应30min。
实施例9
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤b)的煅烧温度为150℃，煅烧时间为3min，c)将步骤b所获的聚苯乙烯纳米球基材表面置于pH＝8.5的多巴胺Tris-HCl溶液中，50℃条件下反应1h，
d)将步骤c中的聚苯乙烯纳米球-聚多巴胺表面置于浓度为2m/v％的牛血清白蛋白的PBS溶液中反应1h，然后浸入25v/v％的戊二醛溶液中避光反应2h；
f)将步骤e中的获得聚苯乙烯纳米球表面置于浓度为1M的乙醇胺溶液中反应10min。
经测试，本发明其他条件的实施例所获基底与实施例1的产品性能基本一致。
综述之，本发明构筑了具有良好细胞相容性的聚苯乙烯纳米球表面(亦即前述的三维纳米结构)，该表面具有较高的细胞捕获特异性和灵敏度。
应当理解，以上所述实例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底，其特征在于包括主要由分布在基材表面的粒径为100 ~ 1000nm的聚苯乙烯纳米球组成的三维纳米结构和自聚合形成于所述聚苯乙烯纳米球表面的聚多巴胺膜结构或聚多巴胺三维纳米颗粒结构，与聚多巴胺连接的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTC亲和捕获分子，形成所述聚多巴胺的单体具有功能基团邻苯二酚和/或醌基，所述抗粘附分子为牛血清白蛋白，所述CTC亲和捕获分子选自叶酸、功能基团修饰的叶酸及叶酸复合物中的任意一种或两种以上的组合，所述功能基团选自巯基、氨基、羧基、叠氮和炔基中的一种或两种以上组合。
2.根据权利要求1所述的基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底，其特征在于：所述复合物为所述功能基团修饰的聚乙二醇与所述功能基团修饰的叶酸的复合物。
3.如权利要求1或2所述基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底的制备方法，其特征在于包括：
（1）以液面自组装的方法，使粒径为100~1000nm的聚苯乙烯纳米球自组装形成单层密排的聚苯乙烯纳米球三维纳米结构，之后煅烧；
（2）在所述聚苯乙烯纳米球表面枝接聚多巴胺，使聚多巴胺在聚苯乙烯纳米球表面形成纳米厚度的聚多巴胺膜结构或聚多巴胺三维纳米颗粒结构；
（3）将抗粘附分子与连接在所述聚苯乙烯纳米球表面的聚多巴胺偶联；
（4）将CTC亲和捕获分子与所述抗粘附分子偶联，获得基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤（1）具体包括：将粒径为100~1000nm的聚苯乙烯纳米球溶液分散在一基材表面，在空气中干燥，之后将载有所述聚苯乙烯纳米球的基材垂直缓慢浸置于选定液相体系中，使聚苯乙烯纳米球在所述选定液相体系表面自组装形成单层密排的聚苯乙烯纳米球三维纳米结构；以及，
将所述聚苯乙烯纳米球三维纳米结构引入到一导电基体的导电面上，于空气中晾干，再于100~150℃下煅烧3min~1h，之后冷却。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于还包括：重复步骤（1）的操作一次以上，得到包含多层聚苯乙烯纳米球三维纳米结构的导电基体。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述基材选自玻璃片、单晶硅片、金属铝片或金属表面。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述导电基体选自包含有ITO或FTO导电膜的玻璃。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤（2）具体包括：在温度为25~50℃、pH大于8的碱性溶液中，使单体多巴胺自聚合反应1~24h，从而接枝聚合到所述聚苯乙烯纳米球表面，形成纳米厚度的聚多巴胺膜结构或聚多巴胺三维纳米颗粒结构。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述碱性溶液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或氢氧化钠溶液。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述多巴胺的形貌为薄膜或纳米颗粒，所述多巴胺具有功能基团邻苯二酚和/或醌基。
11. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤（3）具体包括：将步骤（2）所获表面枝接聚多巴胺的聚苯乙烯纳米球置于浓度为0.1~2m/v%的牛血清白蛋白溶液中反应1~24h，然后浸入0.25~25v/v%的戊二醛溶液中避光反应2~8 h。
12.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤（4）具体包括：
在磷酸盐缓冲液中，使CTC亲和捕获分子在具有醛基的偶联试剂的作用下，与表面接枝有抗粘附分子的聚多巴胺膜结构或聚多巴胺三维纳米颗粒结构于室温下反应2~8 h，获得基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于还包括：将质均分子量为2000~5000Da的带有功能基团的聚乙二醇以点击反应的方式与带有功能基团的叶酸结合形成聚乙二醇-叶酸复合物，获得CTC亲和捕获分子；所述功能基团为炔基或叠氮基团。
14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于：所述偶联试剂为0.25~25v/v%的戊二醛溶液。
15. 根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于还包括：将步骤（4）所获基底置于浓度为0.1~1 mol/L的乙醇胺溶液中反应10~60 min，以封闭未完全反应的醛基基团。
16.如权利要求1-2中任一项所述的基于聚苯乙烯纳米球的CTC捕获和分离基底在CTC捕获和分离中的应用。
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