KR101146263B1

KR101146263B1 - 특이적 결합분자?나노섬유 복합체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101146263B1
Application number: KR1020100013872A
Authority: KR
Inventors: 이경미; 김중배; 김광희; 전승현; 안효진; 손정희
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-02-16
Filing date: 2010-02-16
Publication date: 2012-05-15
Also published as: KR20110094475A

Abstract

본 발명은 특이적 결합분자-나노섬유 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항체, 항원결합부위를 포함하는 이의 단편, 또는 앱타머가 결합된 나노섬유는 알코올을 처리한 분산된 나노섬유를 사용하여 제조함으로써 섬유 사이의 공간이 증가하여 결합하는 항체의 함량이 향상되었고, 상기와 같이 제조한 CD4 항체가 결합된 나노섬유와 면역세포를 결합시킨 경우에 CD4+ 세포의 약 94%가 상기 나노섬유에 결합된 것으로 나타났을 뿐만 아니라 이러한 결합이 항체와 세포 사이에 결합 특이성을 갖는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 특이적 결합분자가 결합된 나노섬유는 높은 함량의 결합분자가 결합된 나노섬유 복합체의 제조, 및 간편하고 신속한 세포 분리 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

특이적 결합분자?나노섬유 복합체 및 이의 제조방법{The specific binding molecules-nanofibers complex and method for preparing the same}

본 발명은 특이적 결합분자-나노섬유 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

세포의 분리는 질병의 진단이나 치료에 있어서 생물학적 또는 생의학적인 적용 등의 다양한 분야에 매우 중요한 기술 중 하나로서, 다양한 세포의 혼합으로부터 원하는 특정 세포를 분리하기 위해 사용이 증가하고있다(McCloskey KE, et al., Anal Chem, 2003, Dec 15;75(24):6868-6874; McCloskey KE, et al., Biotechnol Prog, 2003, May-Jun;19(3):899-907). 따라서 이러한 중요성 때문에 현재 많은 연구 그룹에서 세포 분리의 기술과 관련한 많은 연구를 진행 중에 있다.

비중이 서로 다른 세포를 분리하는 경우에는 속도침강법에 의해 분리할 수 있다. 한편, 감작(感作)한 세포와 미감작의 세포를 분별하는 것과 같이, 세포의 차이가 거의 없는 경우에는 형광항체로 염색한 정보 또는 직접 현미경 관찰을 통한 정보로 세포를 분리할 필요가 있다. 예를 들어, 형광색소로 표지하여 표지의 강약에 따라 세포를 분획하여 특정의 세포집단을 분리하여 채취하는 세포분별장치(cell sorter)(Kamarck, M.E., Methods Enzymol. Vol. 151, p150~165, 1987)가 이용되고, 최근에는 마이크로 가공기술을 이용해서 만든 미세한 유로에 생긴 층류(層流)중을 흐르는 미립자를 직접 현미경 관찰하면서 분리하는 세포분별장치(Micro Total Analysis, 98, pp.77~80, Kluwer Academic Publishers, 1998; Analytical Chemistry, 70, pp.1909~1915, 1998)가 개발되어 있다.

현재 많이 사용되고 있는 세포 분리 방법 중 하나인 형광활성세포분류기(fluorescence activated cell sorter, FACS)는 레이저 광선을 사용하여 림프구 등 유리세포의 표면 항원을 해석하거나 표면 항원의 유무 등에 의해 세포를 분리하는 장치로서, 유액 상태의 입자나 세포가 일정 감지 지역을 통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여, 각각의 세포가 갖는 형광의 세기를 측정하고, 수치화된 형광의 세기를 이용하여, 특정 세포를 선택적으로 분리할 수 있다. 형광 염료(fluorescent dye) 또는 단일클론 항체(monoclonal antibodies)를 사용하여 세포의 표면 및 내부가 갖는 면역상태를 파악하여 세포를 분리할 수 있다. 그러나, 장치의 복잡한 조작 기술, 고도로 숙련된 기술자, 많은 시간의 소요, 및 고가의 기계가 필요하다는 단점이 있다(Lancioni CL, et al., J Immunol Methods, 2009, May 15;344(1):15-25).

또한, 현재 사용되고 있는 또 다른 방법 중 하나인 자기활성세포분류기(magnetic activated cell sorter)는 자기 입자(magnetic particle)가 붙어있는 항체나 또는 그에 상응하는 물질을 이용하여 자기장의 힘으로 원하는 특정 세포를 분리하는 것으로, 이때, 세포 분리시 필요한 비드(bead)가 세포와 결합하여 세포 내로 들어감으로써 세포의 상태에 변화가 발생한다는 단점이 있다.

한편, 항체(antibody)는 항원에 대한 특이성(specificity) 때문에 세포 표면 항원에 대해 특이적인 항체를 사용하여 생물학적 물질의 검출, 분리 및 측정에 널리 이용되고 있다. 세포 치료를 위한 특정 세포의 분리 또는 특정 세포의 검출을 위해서는 동일한 세포 특성을 갖는, 보다 간편하고 용이하게 안정적인 고순도 세포를 분리하는 방법의 확립이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 보다 간편하고 효과적인 세포 분리 시스템을 구축하고자 연구한 결과, 나노섬유에 알코올을 처리하여 제조한 분산된 나노섬유는 섬유 사이의 공간이 증가하여 결합하는 항체의 함량이 향상되었고, 항체가 결합된 분산된 나노섬유는 항체에 대한 표적세포가 효과적이며 특이적으로 결합할 뿐만 아니라 사용이 간편하고 신속함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 특이적 결합분자-나노섬유 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 고분자 용액을 전기방사하여 나노섬유를 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 나노섬유에 20 내지 100%(v/v) 농도의 알코올을 처리하여, 분산된 나노섬유를 제조하는 단계; 및

3) 단계 2)의 분산된 나노섬유에 특이적 결합분자를 혼합하여 결합시키는 단계를 포함하는, 세포분리용 특이적 결합분자-나노섬유 복합체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된, 특이적 결합분자-나노섬유 복합체를 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 상기 특이적 결합분자-나노섬유 복합체에 세포를 혼합하여 배양하는 단계; 및

2) 단계 1)의 혼합물로부터 복합체에 결합된 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 특이적 결합분자가 결합된 나노섬유를 이용한 세포 분리 방법을 제공한다.

본 발명의 특이적 결합분자가 결합된 나노섬유는 항체와 이에 대한 표적 세포의 결합 및 분리가 신속하고 사용방법이 간단하여 간편하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라 표적 세포를 특이적이고 효율적으로 분리할 수 있고, 특히 세포수의 소실 없이 나이브(naive)한 상태의 세포를 약 95% 이상 수득할 수 있으므로 본 발명의 특이적 결합분자가 결합된 나노섬유는 기존의 비드를 사용한 세포분리 방법의 단점(약 50%의 세포 손실)을 보완할 수 있는, 높은 함량의 항체 또는 앱타머가 결합된 나노섬유의 제조, 및 간편하고 신속하며 효과적인 세포 분리에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1의 A는 알코올 용액의 농도 변화에 따른 나노섬유의 형태를 나타낸 그림이고, B는 본 발명에 사용된 나노섬유를 전자현미경을 통해 확인한 그림이다.
도 2는 알코올의 농도 변화에 따른 나노섬유에 고정된 리파아제의 초기활성 및 단백질 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 다양한 농도(2 ~ 10 ㎍)의 항체 처리에 따른 알코올 처리된 나노섬유 또는 as-spun 나노섬유에 결합된 항체의 양을 나타낸 그래프이다.
도 4의 A는 유세포분석기를 이용하여 림프절 세포의 CD4+ 또는 CD8+ 개체군의 비율을 나타낸 그림이고, B는 CD4 항체가 고정된 나노섬유에 림프절 세포를 처리하는 과정을 나타낸 그림이다.
도 5의 A 및 B는 유세포분석기를 이용하여 시간이 지남에 따라, CD4 항체가 고정된 나노섬유에 결합하지 않고 남아있는 CD4+ 세포의 비율을 나타낸 그래프이고, C는 상기 나노섬유에 결합한 CD4+ 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 나노섬유가 없는 실험군(no NF), 알코올 처리된 항체 고정 나노섬유(Alcohol/NF-Ab), 항체 고정 나노섬유(NF-Ab), 알코올 처리된 나노섬유(Alcohol/NF) 또는 나노섬유(NF)에 결합하지 않고 남아있는 세포의 개체군을 나타낸 그래프이고, B는 상기 섬유세포에 결합하지 않고 남아있는 총 세포수를 나타낸 그래프이며, C는 상기 섬유세포에 결합하지 않고 남아있는 CD4+ 세포수를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세포분리용 특이적 결합분자-나노섬유 복합체의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 제조방법은

1) 고분자 용액을 전기방사하여 나노섬유를 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 나노섬유를 20 내지 100%(v/v) 농도의 알코올에 분산시켜, 분산된 나노섬유를 제조하는 단계; 및

3) 단계 2)의 분산된 나노섬유에 특이적 결합분자를 혼합하여 결합시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 고분자 용액은 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran) 및 아세톤에 용해한 폴리스티렌(polystyrene) 및 스티렌말레익 안하이드라이드 공중합체{poly(styrene-co-maleic anhydride)}의 혼합물인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 폴리스티렌(polystyrene, PS) 및 스티렌말레익 안하이드라이드 공중합체{poly(styrene-co-maleic anhydride), PSMA}의 혼합물은 PS : PSMA = 2 : 1인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

삭제

상기 특이적 결합분자는 항체, 상기 항체의 항원결합부위를 포함하는 항체 단편, 및 앱타머(aptamer)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 항체는 단일클론항체, 키메라항체 및 이들을 조합한 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 항체는 면역세포의 세포표면마커인 CD4, CD2, CD3, CD8, CD28, B7, ICAM-1, LFA-1 및 CTLA4Ig 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 줄기세포 세포표면마커인 CD9, CD10, CD13, CD44, CD54, CD55, CD59, CD73, CD90, CD105, CD117, CD146, CD166 및 STRO-1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, CD4인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 전기방사는 전압이 5 ~ 10 ㎸, 유속이 0.01 ~ 0.2 ㎖/hour로 조절된 전기방사 장치에서 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 알코올은 알코올/물의 혼합용매일 수 있고, 상기 알코올은 에탄올, 메탄올, 프로판올 등의 저급 알코올을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 알코올/물의 혼합용매의 혼합비율은 알코올:물 = 20:80 ~ 100:0인 것이 바람직하고, 70:30인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기와 같이 70%의 에탄올은 상기 나노섬유를 멸균작용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 혼합물을 4℃에서 하룻밤 배양하여 나노섬유와 특이적 결합분자를 결합시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 상기 복합체를 50 mM Tris-HCl(pH 7.4)에서 30분간 배양하여 특이적 결합분자가 결합되지 않은 자유알데하이드기를 캡핑(capping)하는 단계를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 폴리스티렌(polystyrene, PS) : 스티렌말레익 안하이드라이드 공중합체{poly(styrene-co-maleic anhydride), PSMA} = 2 : 1의 비율로 혼합한 고분자 용액을 7 ㎸의 전압 및 0.1 ㎖/hour의 유속으로 전기방사하여 나노섬유를 제조하였고, 상기 나노섬유를 에탄올에 담가 볼텍싱하여 혼합한 뒤 알코올이 완전히 제거될 때까지 이를 세척하였다. 상기 제조한 분산된 나노섬유에 항체를 결합시키기 위하여 나노섬유와 항체를 하룻밤 동안 4℃의 로커(rocker)(50 rpm) 위에서 반응시켰다. 반응결합 후, 반응하지 않은 나노섬유 상의 알데하이드기를 캡핑(capping)하기 위하여, 상기 나노섬유를 50 mM의 Tris-HCl(pH 7.4)에 30분간 반응시켰고, 최종적으로 상기 나노섬유를 인산염충식염수로 세척하여 항체가 고정된 나노섬유를 제조하였다.

본 발명자들은 전기방사하여 제조한 나노섬유의 분산을 위한 최적의 알코올 농도를 확인하기 위하여, 상기 나노섬유를 물을 혼합한 다양한 농도{0, 10, 20, 30, 50, 및 100% (v/v)}의 에탄올 수용액에 담가 변화를 관찰하였다. 그 결과, 20%(v/v)보다 낮은 농도의 에탄올에서는 육안으로 나노섬유의 변화가 확인되지 않았고, 30%(v/v) 이상의 농도에서는 에탄올 농도에 의존적으로 나노섬유가 분산되는 것으로 나타났다. 분산 효과를 극대화하기 위하여 핸드쉐이크(Hand shake) 과정을 수행한 경우에는 20%(v/v) 이상부터 분산되기 시작하는 것으로 나타났다(도 1의 A 참조).

본 발명자들은 알코올의 농도에 따른, 분산된 나노섬유에 고정된 단백질의 함량 및 활성을 확인하기 위하여, 나노섬유에 리파아제(lipase)를 고정한 뒤 BCA 단백질 분석 시약 키트를 사용하여 리파아제의 함량을 측정하였고, 4-니트로페닐 부틸레이트(4-nitrophenyl butyrate, 4-NB)의 가수분해를 통하여 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 나노섬유에 처리한 에탄올의 농도가 증가할수록 섬유 사이의 공간이 증가하여 리파아제 함량이 증가하였고, 알코올 농도 20%(v/v) 이상부터 포화되는 것으로 나타났다. 4-NB를 이용한 효소 활성 결과 역시 이와 비슷한 결과를 보이는 것을 확인하였다. 이는 나노섬유에 처리하는 알코올의 농도가 증가함에 따라 나노섬유가 잘 분산되어 세포 사이의 공간이 증가하므로 수용액 내에 노출되어 있는 나노섬유의 말레익 안하이드라이드기(maleic anhydride groups)가 증가하게 되어 많은 양의 효소가 결합하게 되는 것으로 여겨진다(도 2 참조).

본 발명자들은 항체가 고정된 나노섬유에서 나노섬유에 처리한 항체의 농도에 따른 결합된 항체의 함량을 확인하기 위하여, BCA 단백질 분석 시약 키트를 사용하여 항체 함량을 측정하였다. 그 결과, 알코올을 처리하지 않은 나노섬유 경우에는 단백질이 결합할 수 있는 공간이 제한적이므로 항체의 농도를 증가시키더라도 결합된 항체가 거의 증가하지 않는 반면에, 분산된 나노섬유의 경우에는 항체의 농도를 증가시킴에 따라 결합된 항체의 함량도 이에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다. 이는 상기 리파아제를 고정화시킨 경우와 마찬가지로 알코올 처리를 통해 섬유 사이의 공간이 증가된, 분산된 나노섬유는 항체가 결합할 수 있는 말레익 안하이드라이드기(maleic anhydride groups)가 증가하게 되어 항체의 양이 많아질수록 많은 양의 항체가 결합하게 되는 것으로 나타났다(도 3 참조).

본 발명자들은 항체가 고정된 나노섬유가 항체에 대한 표적세포를 얼마나 효과적으로 결합시키는지 확인하기 위하여, 70%(v/v) 알코올 용액으로 처리한 분산된 나노섬유에 CD4 항체를 결합시킨 후, 마우스의 림프절의 혼합된 단일세포(T, B 또는 NK 세포)를 상기 항체가 고정된 나노섬유에 결합시켜 결합되지 않고 남아있는 세포에 대해 유세포분석을 실시하였다. 그 결과, 상기 나노섬유의 직경은 약 800 ㎚로 측정되었다(도 1의 B 참조). 또한, 림프절로부터 수득한 상기 혼합된 단일 세포 중 CD4+ 세포가 약 38%, CD8+ 세포가 약 23%로 나타났다(도 4 참조). 나노섬유에 상기 세포를 반응시키면 반응 10분 뒤부터 현저하게 CD4+ 세포의 감소가 나타났고 시간이 지남에 따라 CD4+ 세포의 개체군이 더욱 감소하였으며, 상기 나노섬유의 항체에 결합된 CD4+ 세포의 비율(0분; 0%, 10분; 75%, 20분; 88%, 30분; 91%, 및 60분; 94%)은 증가하는 것으로 나타났다(도 5의 C 참조).

본 발명자들은 항체가 고정된 나노섬유가 항체에 대한 표적세포를 얼마나 특이적으로 결합시키는지 확인하기 위하여, 나노섬유가 없는 실험군(no NF), 알코올 처리된 항체 고정 나노섬유(Alcohol/NF-Ab), 항체 고정 나노섬유(NF-Ab), 알코올 처리된 나노섬유(Alcohol/NF) 또는 나노섬유(NF)에 각각 림프절 세포를 반응시킨 후, 결합하지 않고 남아있는 세포를 FACS 및 트립판블루배제법(trypan blue exclusion method)을 수행하여 세포의 개체군 및 세포수를 확인하였다. 그 결과, Alcohol/NF-Ab의 경우 CD4+ 세포가 거의 남아있지 않았다. NF-Ab, Alcohol/NF 또는 NF의 경우에는 no NF와 비교하였을 때, CD4+ T 세포 및 B 세포 비율에서 유의적인 변화가 없었다(도 6의 A 참조). 총 세포수 역시 Alcohol/NF-Ab군에서만 감소되는 것으로 나타났고, CD4+ 세포수의 경우도 Alcohol/NF-Ab에서는 관찰할 수 없었으며 NF-Ab의 경우에도 약간의 감소가 있었으나 이것은 NF-Ab에 결합된 미량의 CD4+ 항체와 반응하여 감소가 이루어진 것으로 여겨진다. 나머지 군의 경우에는 유의적인 변화를 관찰할 수 없었다(도 6의 B 참조).

따라서, 알코올 처리로 인하여 분산된 나노섬유는 항체가 높은 함량으로 결합되고 항체의 표적세포에 효과적이고 특이적으로 결합하였으므로, 높은 함량의 항체, 항원결합부위를 포함하는 이의 단편, 또는 앱타머가 결합된 특이적 결합분자-나노섬유 복합체의 제조에 유용하게 이용할 수 있다.

상기 복합체는 직경이 10 ㎚ 내지 1000 ㎚인 나노섬유에, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 결합분자가 결합된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 세포는 면역세포 또는 줄기세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 항체의 항원결합부위를 포함하는 항체 단편이 결합된 나노섬유는 알코올을 처리에 의해 분산된 나노섬유를 사용하여 제조함으로써 섬유 사이의 공간이 증가하여 이에 결합하는 항체의 함량이 증가하였고, 상기와 같이 제조한 CD4 항체가 결합된 나노섬유와 면역세포를 결합시킨 경우에 CD4+ 세포의 약 94%가 상기 나노섬유에 결합된 것으로 나타났을 뿐만 아니라 이러한 결합이 항체와 세포 사이에 결합 특이성을 갖는 것을 확인하였으므로 높은 함량의 항체, 항원결합부위를 포함하는 이의 단편, 또는 앱타머가 결합된 특이적 결합분자-나노섬유 복합체를 포함하는 세포분리용 조성물로서 유용하게 이용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 특이적 결합분자가 결합된 나노섬유를 이용한 세포 분리 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 세포 분리 방법은

2) 단계 1)의 혼합물로부터 복합체에 결합된 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 나노섬유는 폴리스티렌, 스티렌말레익 안하이드라이드 공중합체, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐알코올, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리젖산, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌비닐알코올 공중합체, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리에스테르계 공중합체, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐카바졸, 콜라겐, 폴리아닐린, 폴리우레탄, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리에틸렌-비닐아세테이트 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 실크, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리카프로락톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 구성되는 것이 바람직하고, 폴리스티렌 및 스티렌말레익 안하이드라이드 공중합체{poly(styrene-co-maleic anhydride)}로 구성되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 나노섬유의 재질은 탄소섬유, 유리섬유, 실리카섬유, 세라믹섬유, 붕소섬유 및 알루미나섬유로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 나노섬유는 폴리스티렌을 포함하는 수불용성 고분자, 또는 실리카를 포함하는 무기물을 사용할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 항체는 세포표면마커(cell surface marker)의 항체일 수 있고, 단계 3)의 복합체에 결합된 세포는 세포표면마커를 가지고 있는 세포이면 무엇이든 가능하다.

상기 방법에 있어서, 상기 특이적 결합분자는 항체, 상기 항체의 항원결합부위를 포함하는 항체 단편, 및 앱타머(aptamer)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 항체는 CD4, CD2, CD3, CD8, CD28, B7, ICAM-1, LFA-1 및 CTLA4Ig 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 CD4인 것이 더욱 바람직하며, 이때, 상기 복합체에 결합된 세포는 림프절, 비장, 골수 등의 면역기관으로부터 분리한 면역세포인 것이 바람직하고 CD4+ T세포인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 항체는 CD9, CD10, CD13, CD44, CD54, CD55, CD59, CD73, CD90, CD105, CD117, CD146, CD166 및 STRO-1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 이때, 상기 복합체에 결합된 세포는 줄기세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 복합체는 나노섬유와 특이적 결합분자를 함께 배양하여 제조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 복합체와 세포를 함께 배양하여 결합시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 복합체에 결합된 세포는 볼텍싱(vortexing)하여 분리하거나, 10% 이상의 알코올 또는 열을 가하여 상기 특이적 결합분자를 변성하여 이로부터 분리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 의해 분리된 세포의 수율은 75% 이상인 것이 바람직하고, 85% 이상인 것이 더욱 바람직하며 90% 이상인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 의해 분리된 세포는 나이브(naive) 상태를 유지하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 항체의 항원결합부위를 포함하는 이의 단편이 결합된 나노섬유는 알코올을 처리에 의해 분산된 나노섬유를 사용하여 제조함으로써 섬유 사이의 공간이 증가하여 이에 결합하는 항체의 함량이 증가하였고, 상기와 같이 제조한 CD4 항체가 결합된 나노섬유와 면역세포를 결합시킨 경우에 CD4+ 세포의 약 94%가 상기 나노섬유에 결합된 것으로 나타났을 뿐만 아니라 이러한 결합이 항체와 세포 사이에 결합 특이성을 갖는 것을 확인하였으므로, 항체, 항원결합부위를 포함하는 항체 단편, 또는 앱타머가 결합된 나노섬유를 이용하여 상기 결합물질에 특이적으로 결합하는 세포표면마커를 가진 세포의 분리에 유용하게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

재료의 준비

리파아제, 4-니트로페닐 부틸레이트(4-nitrophenyl butyrate, 4-NPB), N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide, DMF)는 Sigma(ST Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 폴리스티렌(polystyrene, PS, MW=950,400) 및 스티렌말레익 안하이드라이드 공중합체{poly(styrene-co-maleic anhydride), PSMA, MW=224,000}, 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF)은 Aldrich(Milwaukee, WI, USA)로부터 구입하였으며, 에탄올은 Deajung(Siheung, Korea)으로부터 구입하였다. 7주령 C57BL/6 마우스는 Narabiotech(Seoul, Korea)로부터 구입하여 고려대학교 동물실에서 사육하였다. 실험에 사용된 모든 마우스는 7 ~ 10주령이었다. 모든 과정은 고려대학교 실험동물운영위원회(KUIACUC-2009-105)의 승인하에 실시하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)가 결합 또는 결합되지 않은 항-마우스 CD3(145-2C11), CD4(GK1.5, RM4-4) 및 NK1.1(PK136) 단일클론 항체(mAbs), 피코에리트린(phycoerythrin, PE), 또는 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)은 eBioscience(San Diego, CA)로부터 구입하였다. 페리디닌 클로로필 단백질 복합체(Peridinin Chlorophyll Protein Complex, PerCP)가 결합된 항-마우스 CD19(6D5) mAb는 BioLegend(San Diego, CA)로부터 구입하였다. 모든 다른 시약들은 상업적으로 구입가능한 가장 높은 등급으로 Sigma and Aldrich로부터 구입하였다.

전기방사법( electrospinning )을 이용한 폴리머 나노섬유의 제조

폴리머 용액은 상온에서 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)에 PS : PSMA 혼합물을 2:1 중량비로 넣고 용해를 위해 유기 용매인 테트라하이드로퓨란을 이용하여 용해함으로써 제조하였다. 혼합된 용액을 자석교반기를 사용하여 3시간 동안 PS 및 PSMA 혼합물을 완전히 녹였다. 그런 다음, 폴리머 용액의 점성을 감소시키기 위하여 상기 폴리머 용액에 아세톤 용액을 넣었다. 상기 폴리머 용액을 30 게이지 스테인리스강 주사 바늘이 장착된 5 ㎖의 플라스틱 주사기에 채워 넣었다. 고전압 공급기를 사용한 전압의 작동 조건은 7 ㎸이었고, 상기 용액은 주사기 펌프(PHD-2000 Infusion, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)를 사용하여 0.1 ㎖/시간으로 공급하였다. 전기방사된 나노섬유를 바늘끝으로부터 적절한 거리(7 ~ 10 ㎝)에 놓인 깨끗한 알루미늄박 위(바닥에 연결된)에 모아놓았다.

알코올을 이용한 분산된 나노섬유의 제조

알코올을 이용한 분산된 나노섬유를 제조하기 위하여, 상기 실시예 2에서 제조한 전기방사된 나노섬유를 물로 혼합한 다양한 %(v/v)(0, 10, 20, 30, 70, 100% v/v)의 에탄올에 담갔다. 알코올 용액 및 나노섬유가 담긴 병은 5분간 볼텍싱(vortexing) 하였고 200 rpm에서 10분간 혼합(shaking)한 뒤 30초간 손으로 흔들어 주었다. 상기와 같이 PS-PSMA 나노섬유를 수용성 에탄올 용액에서 분산시킨 후, 알코올이 상기 용액에서 완전히 제거될 때까지 건조되지 않게 수회 세척하였다. 상기 분산된 나노섬유를 실험에 사용하기 전까지 완충용액에 보관하였다.

나노섬유를 다양한 농도의 에탄올 용액(0 ~ 100% v/v)으로 처리한 결과, 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 1 ㎖의 나노섬유와 알코올 용액이 들어있는 유리병을 5분간 볼텍싱 및 10분간 혼합하였을 때, 알코올 농도 20%(v/v) 이하에서는 혼합 후 나노섬유의 구조에 큰 차이가 없었다. 반면에 알코올의 농도가 높아질수록 나노섬유는 쉽게 분산되는 것을 볼 수 있었으며, 알코올 농도 30%(v/v) 이상에서는 나노섬유가 분산되는 것을 확인할 수 있었다. 분산 효과를 극대화하기 위해 30초간 손으로 흔들어 혼합(hand-shaking)한 경우, 0%(v/v)의 알코올에서는 나노섬유의 구조에 변화가 없었고, 10%(v/v)에서는 약간 분산되었고, 20%(v/v)부터 분산되기 시작하는 것으로 나타났다. 손으로 흔들어 혼합한 시간을 증가시켜도 나노섬유의 구조는 더 이상 변화가 없는 것을 볼 수 있었다(도 1의 A).

나노섬유에 고정된 단백질의 함량 및 활성 측정

분산된 나노섬유의 섬유 사이의 공간(inter-fiber space)을 알아보기 위하여, 리파아제(lipase)를 고정화하여 효소 담지량(loading)과 활성의 차이를 비교해보았다.

<4-1> 분산된 나노섬유에 리파아제의 고정

상기 실시예 3과 같이 다양한 농도의 알코올이 처리된 나노섬유 1 ㎎을 4 ㎎의 리파아제가 포함된 20 mM의 나트륨인산염완충용액(pH 7.0) 2 ㎖에 배양하였다. 나노섬유 및 리파아제 용액이 포함된 유리병을 200 rpm에서 30분간 혼합한 다음, 나노섬유에 리파아제를 공유적으로 결합시키기 위하여 4시간 동안 4℃ 냉장고 안에 로커(rocker)(50 rpm) 위에서 혼합시켰다. 반응 후, 생체촉매 나노섬유를 100 mM의 Tris-HCl(pH 7.0)로 세척하였다. 반응하지 않은 자유알데하이드기를 캡핑시켜주기 위하여, 생체촉매 나노섬유를 100 mM의 Tris-HCl(pH 7.0)에 30분간 반응시켰다. 최종적으로, 상기 생체촉매 나노섬유를 10 mM의 나트륨인산염완충용액(pH 7.0)으로 세척하였고, 사용하기 전까지 동일한 완충용액에서 4℃에 보관하였다.

<4-2> 나노섬유에 고정된 리파아제의 함량 및 활성 측정

리파아제 활성은 20 mM의 나트륨인산염완충용액(pH 7.0)에서 4-니트로페닐 부틸레이트(4-nitrophenyl butyrate, 4-NB)의 가수분해로서 측정하였다. 생촉매 나노섬유에 의해 가수분해되는 4-NB 용액을 제조하기 위하여, 100 ㎕의 20 mM 4-NB를 9.9 ㎖의 20 mM 인산염완충용액(pH 7.0)이 포함된 20 ㎖ 짜리 유리병에 넣었다. 생체촉매 나노섬유를 10 ㎖의 4-NB 용액이 포함된 병에 옮기고 나서, 상기 병을 200 rpm에서 혼합하였고, 반응 혼합물로부터 시간에 따른 분액을 만들었다. 효소 반응 산물의 농도를 분광광도계를 사용하여 410 ㎚(A410)에서의 흡광도로부터 산출하였다. 상기 단백질의 농도는 BCA 단백질 분석 시약 키트를 사용하여 측정하였고 분광광도계를 사용하여 562 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 나노섬유에 처리한 에탄올의 %(v/v)가 증가할수록 섬유 사이의 공간이 증가하여 리파아제 함량이 증가하였고, 알코올 농도 20%(v/v) 이상부터 포화되는 것으로 나타났다. 4-NB를 이용한 효소 활성 결과 역시 이와 비슷한 결과를 보이는 것을 확인하였다(도 2).

항체-나노섬유 복합체의 제조

<5-1> 폴리머 나노섬유에 항체의 고정

폴리머 나노섬유에 항체를 결합시키기 위하여, 상기 실시예 2에서 제조한 전기방사된 나노섬유를 상기 실시예 3과 같이 수용성 에탄올 용액(70% v/v)을 15분간 처리하여 분산된 나노섬유를 제조함과 동시에 멸균 상태를 유지하도록 하였다. 상기 나노섬유를 전자현미경을 통해 평균 직경이 약 800 ㎚ 정도인 것을 확인하였다(도 1의 B). 폴리머 나노섬유에 항체의 결합은 상기 실시예 <4-1>의 폴리머 나노섬유에 리파아제의 고정과 동일한 방법을 사용하였다. 모든 실험은 세포 오염을 방지하기 위해 멸균 상태에서 진행하였다. 알코올 처리된 나노섬유 1 ㎎을 다양한 농도(2 ~ 10 ㎍/㎖)의 항체 용액이 포함된 2 ㎖의 인산염완충식염수에 배양하였다. 나노섬유 및 항체 용액이 포함된 유리병을 150 rpm에서 30분간 혼합한 다음, 나노섬유에 항체를 결합시키기 위하여 하룻밤 동안 4℃ 냉장고 안에 로커(rocker)(50 rpm) 위에 혼합시켰다. 혼합 후, 생촉매 나노섬유를 PBS 및 50 mM의 Tris-HCl(pH 7.4)로 세척하였다. 반응하지 않은 자유알데하이드기를 캡핑시켜주기 위하여, 상기 나노섬유를 50 mM의 Tris-HCl(pH 7.4)에 30분간 반응시켰다. 최종적으로, 상기 생체촉매 나노섬유를 인산염완충식염수로 세척하였고, 사용하기 전까지 동일한 완충용액에서 4℃에 보관하였다.

<5-2> 나노섬유에 고정된 항체의 함량 측정

상기 실시예 <5-1>에서 제조된, 항체가 고정된 폴리머 나노섬유의 항체의 함량은 BCA 단백질 분석 시약 키트를 사용하여 측정하였고 분광광도계를 사용하여 562 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 방사직후(As-spun) 나노섬유의 경우에는 생체분자가 붙을 수 있는 결합능이 제한적이므로 항체의 농도를 증가시키더라도 결합된 항체가 2 ㎍ 정도에서 포화되었다. 반면에, 분산된 나노섬유의 경우에는 항체의 농도를 증가시킴에 따라 결합된 항체의 함량도 이에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다(도 3).

나노섬유에 고정된 항체의 효율 확인

<6-1> 세포의 준비 및 분리

말초{이하(Submental), 아래턱(Mandibular), 얕은목(Superficial Cervical), 겨드랑이(Axillary), 외측 겨드랑이(Lateral Axillary), 서혜부(Inguinal), 오금(Popliteal)} 림프절을 C57BL/6 마우스로부터 적출하였다. 단일 세포 현탁액을 70 ㎛ 나일론망(BD biosciences)을 통해 걸렀고 5% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)(Lonza Walkersville, MD USA)이 포함된 인산염완충식염수로 세포를 세척하였다.

<6-2> 나노섬유에 고정된 항체의 효율 확인

나노섬유에 결합한 항-마우스 CD4 항체가 CD4+ T세포에 얼마나 효율적으로 결합할 수 있는가를 확인하기 위하여, 70%(v/v) 알코올 용액으로 처리한 분산된 나노섬유 또는 as-spun 나노섬유에 10 ㎍의 CD4+ T세포만이 특이적으로 결합할 수 있는 항-마우스 CD4 항체를 결합시킨 후, 상기 실시예 <6-1>에서와 같이, 마우스의 림프절을 균질하게 하여 수득한 혼합된 단일 세포(T, B 또는 NK 세포)를 항체가 고정된 나노섬유에 결합시키고, 결합되지 않고 남아있는 세포를 형광활성세포분류기(fluorescence activated cell sorter, FACS)를 이용하여 분석하였다. 즉, 상기와 같이 준비된 세포를 알코올 처리하여 CD4 항체를 고정한 나노섬유(Alcohol/NF-CD4 Ab)와 함께 4℃에서 조심스럽게 혼합하였다. 상기 시료로부터 0, 10, 20, 30 및 60분에 각각 시료를 취하여 Alcohol/NF-CD4 Ab에 결합하지 않은 세포를 FACS 염색(staining)을 실시하였다(도 4의 B).

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 림프절로부터 수득한 상기 혼합된 단일 세포들을 FACS 염색(staining)하여 CD4+ 및 CD8+ 세포의 개체군을 확인한 결과, CD4+가 약 38%, CD8+가 약 23%로 나타났다(도 4의 A). 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 항체를 처리한 10분 뒤, 많은 양의 CD4+ 세포의 감소가 있었고, 시간이 증가함에 따라 CD4+ 세포의 개체군(0분; 32%, 10분; 8%, 20분; 4%, 30분; 3%, 및 60분; 2%)이 더욱 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 5의 A 및 B). 이러한 결과를 바탕으로 전체 CD4+ 세포 중 Alcohol/NF-CD4 Ab에 결합된 CD4+ 세포의 비율을 하기의 식 (총 CD4+ 세포 % - 남아있는 CD4+ 세포 %) / 총 CD4+ 세포 % × 100)에 따라 계산한 결과, 시간이 지남에 따라 Alcohol/NF-CD4 Ab에 결합된 CD4+ 세포의 비율이 증가하는 것을 확인하였다(0분; 0%, 10분; 75%, 20분; 88%, 30분; 91%, 및 60분; 94%)(도 5의 C).

<6-3> 나노섬유에 고정된 항체의 특이적 결합능 확인

Alcohol/NF-Ab에 CD4+ 세포만 특이적으로 결합하는지를 확인하기 위하여, no NF, Alcohol/NF-Ab, NF-Ab, 및 Alcohol/NF, NF에 림프절 세포를 1시간 동안 반응시킨 후 결합하지 않고 남아있는 세포를 FACS 염색 및 트립판블루배제법(trypan blue exclusion method)을 수행하여 세포의 개체군 및 세포수를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Alcohol/NF-Ab의 경우 CD4+ 세포가 존재하지 않았으며 no NF와 비교하였을 때, B 세포의 비율이 약 1.5배 증가하였다. 그러나, NF-Ab, Alcohol/NF 또는 NF의 경우에는 no NF와 비교하였을 때, CD4+ T 세포 및 B 세포 비율에서 유의적인 변화가 없었으며, NK 세포의 경우 림프절에서 매우 적은 양이 존재하므로 모든 군에서 변화를 관찰할 수 없었다(도 6의 A). 총 세포수 역시 Alcohol/NF-Ab에서만 그 감소를 확인할 수 있었고, CD4+ 세포수의 경우도 Alcohol/NF-Ab에서는 관찰할 수 없었으며 NF-Ab의 경우에도 약간의 감소가 있었으나 이것은 NF-Ab에 결합된 미량의 CD4+ 항체와 반응하여 감소가 이루어진 것으로 보였고, 나머지 실험군의 경우에는 유의적인 변화를 관찰할 수 없었다(도 6의 B).

상기와 같이, 본 발명의 특이적 결합분자가 결합된 나노섬유는 기존의 세포분리 방법에 비해 신속하고 사용방법이 간단하여 간편하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라 표적 세포를 특이적이고 효율적으로 분리할 수 있으므로, 혼합된 세포로부터 원하는 특정 세포를 분리하기 위한 세포 분리 장치 및 분리법의 개발 또는 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

1) 고분자 용액을 전기방사하여 나노섬유를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 나노섬유를 20 내지 100%(v/v) 농도의 알코올에 분산시켜, 분산된 나노섬유를 제조하는 단계; 및
3) 단계 2)의 분산된 나노섬유에 항체, 상기 항체의 항원결합부위를 포함하는 항체 단편, 및 앱타머(aptamer)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 특이적 결합분자를 혼합하여 결합시키는 단계를 포함하는, 세포분리용 특이적 결합분자-나노섬유 복합체의 제조방법.

삭제

제 1항에 있어서, 단계 1)의 고분자 용액은 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran) 및 아세톤에 용해한 폴리스티렌(polystyrene) 및 스티렌말레익 안하이드라이드 공중합체{poly(styrene-co-maleic anhydride)}의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 1)의 전기방사는 전압이 5 ~ 10 ㎸, 유속이 0.01 ~ 0.2 ㎖/hour로 조절된 전기방사 장치에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 항체는 단일클론항체, 키메라항체 및 이들을 조합한 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 항체는 CD4, CD2, CD3, CD8, CD28, B7, ICAM-1, LFA-1, CTLA4Ig, CD9, CD10, CD13, CD44, CD54, CD55, CD59, CD73, CD90, CD105, CD117, CD146, CD166, STRO-1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항의 방법에 따라 제조된 특이적 결합분자-나노섬유 복합체.

제 9항에 있어서, 상기 복합체는 직경이 10 ㎚ 내지 1000 ㎚인 나노섬유에, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 결합분자가 결합된 것을 특징으로 하는 특이적 결합분자-나노섬유 복합체.

1) 제 9항의 특이적 결합분자-나노섬유 복합체에 세포를 혼합하여 배양하는 단계; 및
2) 단계 1)의 혼합물로부터 복합체에 결합된 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 특이적 결합분자가 결합된 나노섬유를 이용한 세포 분리 방법.

제 11항에 있어서, 단계 1)의 복합체와 세포를 함께 배양하여 결합시키는 것을 특징으로 하는 세포 분리 방법.

제 11항에 있어서, 단계 2)의 복합체에 결합된 세포는 면역세포 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포 분리 방법.

제 11항에 있어서, 단계 2)의 복합체에 결합된 세포는 10%(v/v) 이상의 알코올 또는 열을 가하여 특이적 결합분자를 변성하여 분리하는 것을 특징으로 하는 세포 분리 방법.