CN109312293A - 用于进行磁浮分离的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于磁分离在生物样品中不同生物分子(例如，细胞，细胞器等)的磁分离的方法和组合物，以及用于进行这些方法的组合物和试剂盒。还提供了含有分离的生物分子的组合物，以及将其用于体外和体内生物医学应用的方法。本发明的磁浮方法采用靶向磁性颗粒，优选靶向纳米磁性颗粒和靶向的浮颗粒，例如浮微粒和微泡。本发明的益处之一是能够将靶向磁性颗粒与差异靶向浮颗粒组合，以实现在同一工作流程期间两种或更多种特异性细胞靶向群体的分离。

Description

用于进行磁浮分离的组合物和方法
磁分离背景技术
在过去的几十年中，已经建立和改进用于分离和隔离细胞、核酸、蛋白质和其他生物分子的基于磁性颗粒的技术。磁性颗粒通常与特定的靶向部分(例如抗体或核酸)偶联，使得颗粒与复杂混合物(例如细胞群体或蛋白质和核酸混合物)中发现的靶分子结合。然后可以使用磁场设备将与靶生物材料结合的磁性颗粒与混合物分离，从而为靶提供纯化或富集方法。这种基于磁性颗粒的生物靶分离方法已被用于分离或富集携带靶抗原的真核细胞、细菌物种、核酸和蛋白质，用于研究和治疗用途。它们还用于临床试验应用，例如用作免疫测定或放射免疫测定(RIA)的固体支持物。
制备用于这种应用的磁性颗粒的方法通常是两种通用类型。一种通用方法包括在制备聚合物颗粒期间将磁性颗粒均匀地分散在聚合物基质中，在聚合物颗粒核心周围构建磁性材料壳，或将磁性材料引入聚合物颗粒内的预先存在的孔中。前一种方法的例子可以在例如美国专利No.4,358,388中找到，第二种方法的例子可以在美国专利No.5,320,944和5,091,206。。后一种方法在例如美国专利No.5,648,124和4,654,267中例示。所有这些方法都产生大于0.3μm(微米)尺寸的磁性颗粒。
制备用于生物材料应用的磁性颗粒的第二种通用方法涉及首先产生用作较大颗粒的核心的裸磁性材料颗粒，所述较大颗粒通过在第一磁性材料核周围构造壳而产生。一种形式的初级涂层是硅烷涂层，但也描述了其他涂层。例如，美国专利No.3,933,997描述了使用包被磁性颗粒并直接与特异性抗体结合的硅烷偶联剂。据报道，该材料旨在用于RIA方法。美国专利No.4,554,088描述了被聚合硅烷包覆的金属或氧化铁颗粒核的构建，生物亲和分子如抗体直接与聚合硅烷结合。美国专利No.4695392，上述“088专利的一个分案，还限定了与生物亲和性分子直接连接硅烷涂层具有两个离散的官能团-第一个官能团吸附地或共价地连接到该金属氧化物核颗粒，第二个官能团共价连接到生物亲和有机分子。在两个专利中，颗粒的尺寸限定为0.1μm至1.5μm。现已放弃的美国专利申请公开No.2007/0026435公开了磁性颗粒核上的主要涂层，羟基硅烷，优选羟烷基三烷氧基硅烷。在该申请中，粒度范围为0.1μm至100μm，并且指定颗粒用于从混合物中分离特定核酸。当严格地秉承专利'392和公开文本2007/0026435中包含的引用的实施例时，其公开的磁性颗粒产生直径高达1um的高度聚集的磁性颗粒。美国专利No.7,169,618公开了制备尺寸范围为0.07μm至0.45μm的磁性颗粒，首先用有机硅烷包被，然后通过有机硅烷上的侧链官能团与多糖材料偶联。美国专利申请公开No.2010/0012880公开了一种磁性颗粒，其具有带有初级疏水性保护层的磁性材料核，在该初级疏水性保护层上层叠有亲水性烷基硅烷涂层。公开了这种颗粒的直径为0.2μm至0.4μm。
与也用作生物亲和分子的偶联剂的硅烷涂层不同，还报道了核心磁性颗粒上的非硅烷初级涂层。这些包括聚戊二醛(参见，例如，美国专利No.4,267,234)、丙烯酰胺、丙烯酸正丁酯、或N，N'-亚甲基双丙烯酰胺(参见，例如，美国专利No.4,454,234)、聚丙烯醛(参见，例如，美国专利No.4,783,336)、聚乙烯醇(参见，例如，美国专利No.6,204,033)、天然聚合物如葡萄聚糖(参见，例如，美国专利No.4,452,773)和牛血清白蛋白(参见，例如，美国专利No.4,795,698)。据报道，所有这些磁性颗粒初级涂层都用作基底，可以与另外的生物分子如抗体或核酸偶联。采用所有这些方法，所得生物亲和磁性颗粒产品的形状和尺寸不易控制，颗粒产品的尺寸范围相对较宽，直径通常大于0.5μm，产品颗粒易于粘附彼此形成颗粒团块。
最近，已经有材料可用于使用所需细胞的浮动成功分开和分离细胞。这在概念上类似于与磁性颗粒偶联的靶向部分的使用，不同的是在这种情况下颗粒在生物相容性分离缓冲液中是漂浮的。浮颗粒可以将靶细胞或生物分子升高到分离容器的表面远离不需要的组分，在该表面可以收获浮颗粒和细胞或生物分子。
对于细胞和生物分子富集和分离，所有可用的基于颗粒的系统限于单方向和单个群体的富集和/或分离。例如，对于包括磁性纳米颗粒的磁性颗粒，如果足够的磁性纳米颗粒已经通过靶向部分与细胞结合，则通过将所需细胞移向磁极来发生细胞群体的正选择。磁性颗粒可以与一种或多种靶向载体偶联，或者颗粒群可以包含与不同靶向部分偶联的许多颗粒亚集。在后一种情况下，磁性颗粒混合物用于将几种不同的细胞或生物分子类型移向磁极。在许多情况下，基于单一方向的移动富集和分离细胞或颗粒足以分离所需群体。然而，在许多情况下，能够快速且容易地在不同方向上移动至少两个不同群体以使得两个或更多个不同细胞或生物分子群体可以从起始复杂混合物中富集和分离是非常有利的，或者通过快速去除困难的污染群体，可以提高单个群体的净化。因此，需要允许在单个工作流程内在至少两个方向上快速、简单和可负担的移动包含在复杂混合物中的细胞和生物分子的方法、材料和试剂盒。
本发明满足使用与特定靶向部分偶联的稳定磁性颗粒(优选磁性纳米颗粒)和与另外的靶向部分偶联的几种形式的浮微粒(例如，微泡)中的任何一种从复杂混合物中简单且快速地双向分离两种或更多种细胞或生物分子群体的需要。
发明内容
本发明的目的是使用与特定靶向部分和几种形式的浮颗粒中的任何一种偶联的稳定磁性颗粒(优选磁性纳米颗粒)，从复杂混合物中简单快速地双向分离两种或多种细胞或生物分子群(例如，微泡)与另外的靶向部分偶联。
因此，本发明的一个方面涉及从生物样品中分离至少一种靶生物分子物种的方法。这种磁浮分离方法包括形成反应混合物并使已知或怀疑含有目标第一生物分子物种和目标第二生物分子物种的生物样品与靶向磁颗粒物种接触，任选地靶向纳米磁颗粒物种和靶向浮颗粒物种，任选地靶向浮颗粒物种，任选地微泡物种接触，所述磁颗粒物种靶向目标第一生物分子物种以形成第一靶生物分子/磁性颗粒复合物，所述靶向浮颗粒物种靶向目标第二生物分子物种以形成第二靶生物分子/浮颗粒复合物。使用从反应混合物中分离第一生物分子/磁性颗粒复合物的磁场和漂浮/浮选性质将第二靶生物分子/浮颗粒复合物与反应混合物分离。磁性、浮力分离/浮选分离可以串联或并联进行，并且分离的顺序可以变化。在一些优选的实施方案中，靶向磁性颗粒和/或靶向浮颗粒各自独立地进一步包含可检测标记。在一些优选的实施方案中，靶向磁性颗粒物种的靶向部分和靶向浮颗粒物种的靶向部分是不同的，并且各自独立地选自由抗体、抗原结合抗体片段、重组抗体、细胞表面受体、细胞表面受体的配体结合细胞外结构域、适体、核酸、抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素组成的组。在一些优选的实施方案中，靶向浮颗粒物种包含靶向微粒，任选靶向微泡。在一些优选的实施方案中，第一生物分子物种是可用于细胞治疗，任选地人细胞疗法的细胞类型的细胞表面抗原。
在该方面的优选实施方案中，靶向磁性颗粒物种是靶向纳米磁性颗粒物种，其包含磁核颗粒、包封磁核颗粒的玻璃层，结合到玻璃层的蛋白质/聚合物复合物层和靶向部分，该靶向部分靶向目标第一生物分子物种并且包含与蛋白质/聚合物复合物层结合的生物亲和配体对的一个成员。在一些优选的实施方案中，靶向纳米磁性颗粒物种的分子具有约5nm至约500nm，优选约30nm至约300nm的直径。在一些优选的实施方案中，靶向纳米磁性颗粒物种的磁核颗粒包含磁铁矿(Fe3O4)晶体，任选地其中磁铁矿晶体具有范围为约5nm至约300nm的直径。在一些优选的实施方案中，靶向纳米磁性颗粒物种的玻璃层是由有机官能烷氧基硅烷分子形成的硅烷层，任选地包含可连接端基，任选地选自氨基、巯基、羧基和端羟基组成的组的可连接端基的有机官能烷氧基硅烷分子。在一些优选的实施方案中，靶向纳米磁性颗粒物种的蛋白质/聚合物复合物层与玻璃层共价结合，任选地其中蛋白质/聚合物复合物层由血清白蛋白，任选地牛或人血清白蛋白，葡萄聚糖或酪蛋白组成，其中任选地蛋白质/聚合物复合物层通过将组合物加热到约45℃至约85℃而被永久地结合。在一些优选的实施方案中，靶向纳米磁性颗粒物种的靶向部分选自由抗体、抗原结合抗体片段、重组抗体、细胞表面受体、细胞表面受体的配体结合的细胞外结构域、适体、核酸、抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素组成的组。在一些优选的实施方案中，靶向纳米磁性颗粒物种的磁核颗粒包含氧化亚铁，任选地Fe3O4或Fe2O3；氧化铬，任选地CrO3；或包含选自由Mn、Co、Ni、Zn、Gd和Dy组成的组的取代金属离子的稳定金属氧化物。
如此产生的纳米磁性颗粒具有围绕纳米尺寸核心磁性颗粒的三层涂层，即硅烷或玻璃层、蛋白质/聚合物层，并且最后由靶向部分组成的最外层，所述靶向部分是生物亲和配体对中一个成员，例如用于靶向目标抗原的抗体、细胞表面受体或受体片段等。靶向部分或生物亲和配体(可以是例如抗体或抗原结合抗体片段、链霉亲和素、肽，核酸聚合物或其他目标受体或配体)优选地与蛋白质/聚合物层上存在的丰富的官能团共价偶联。在优选的实施方案中，玻璃层是由有机官能烷氧基硅烷分子形成的硅烷层，任选地有机官能烷氧基硅烷分子包含可连接端基或反应基团，任选地可连接端基选自由氨基、巯基、羧基和羟端基组成的组。端基可能受到保护或不受保护；如果受到保护，优选在偶联蛋白质/聚合物复合物层之前使用脱保护步骤。在优选的实施方案中，蛋白质/聚合物复合物层与玻璃层共价结合。优选地，蛋白质/聚合物复合物层由血清白蛋白例如牛或人血清白蛋白、葡萄聚糖或酪蛋白组成。在一些实施方案中，蛋白质/聚合物复合物层通过将组合物从约45℃加热至约85℃而被永久地结合。然后将靶向部分或生物亲和配体(即，高亲和力结合对的一个成员)偶联，优选共价偶联至蛋白质/聚合物层。优选的靶向部分包括抗体(优选单克隆抗体)、抗原结合抗体片段(例如Fab片段)、细胞表面受体、细胞表面受体的配体结合的细胞外结构域、核酸(包括基于核酸的适体)、抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素和用于靶向药物递送的药物化合物。
当本发明的靶向纳米磁性颗粒与复合液体(例如哺乳动物全血或哺乳动物全血的一部分)在反应混合物中结合时，其表现为稳定的胶体。此外，本发明的靶向纳米磁性颗粒优选在长期储存(例如1年至5年)期间不显示磁性、生物亲和性和/或粒度和靶向性质的显著或有害变化。优选的生物样品来源是从哺乳动物(包括人类)以及伴侣动物(例如猫和狗)或具有商业意义的动物(例如，牛；家禽，如鸡、火鸡和鸭子；山羊；马、猪、绵羊等)中获得的那些。
包含本发明的靶向磁性(纳米)颗粒和靶向浮微粒的组合物可以以任何合适的方式配制，包括干燥、易分散的制剂(例如冻干制剂)或液体组合物。在制备之后，通常将所需的量(例如，以适于进行单次或者任选地多次分离磁分离的量)分配到合适的容器中，然后经常将容器包装成试剂盒用于随后的分配和使用。根据本发明的试剂盒优选包括使用试剂盒中试剂的说明书，包括使用本发明的靶向(纳米)磁性颗粒和靶向浮微粒进行一种或多种所需的磁分离。在一些实施方案中，此类试剂盒可包括多种靶向磁性颗粒物种(其中全部或者一些包括纳米磁性颗粒或者不包括纳米磁性颗粒)和靶向浮微粒(其中全部或者一些包括靶向微泡或者不包括靶向微泡)，其中每个靶向(纳米)磁性颗粒物种和靶向浮微粒物种包含不同的靶向部分物种。优选地，在包含多种不同的靶向磁性颗粒物种和靶向浮颗粒物种的试剂盒中，每种物种优选包装在试剂盒中的单独容器中。此类试剂盒还可包括从由生物样品制备的反应混合物中进行磁浮分离一种或多种特定生物分子物种所需的其他试剂、设备和供应品。
因此，本发明涉及磁分离和浮力分离的组合使用，以富集和分离待从复杂混合物如生物样品中分离的靶生物分子，例如，细胞、细胞器、外来体、癌小体和其他生物材料。
本发明的另一方面涉及使用本发明的磁浮分离方法制备富集细胞群体，其中富集细胞群体的细胞表达第一生物分子物种作为细胞表面抗原。
相关方面涉及使用根据本发明的磁浮分离方法产生的分离的富集细胞群体。
另一个相关方面涉及向受试者例如人施用富集细胞群体的方法。此类方法包括向受试者施用本发明的分离的富集细胞群体，例如富含表达第一生物分子物种作为细胞表面抗原的干细胞的细胞群体。
本发明的另一方面涉及用于进行根据本发明的磁浮分离的试剂盒。此类试剂盒通常包括，包含靶向目标第一生物分子物种的靶向磁性颗粒物种，任选地靶向纳米磁性颗粒物种的至少一种组合物；包含靶向目标第二生物分子物种的靶向浮颗粒物种，任选地靶向浮微粒物种，任选地靶向浮微泡物种的至少一种组合物，该组合物靶向与由包含靶向磁性颗粒物种的组合物靶向的生物分子物种相比不同的生物分子物种；以及使用所述靶向磁性颗粒物种和靶向浮颗粒物种进行磁浮分离的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多种靶向磁性颗粒物种，其中每种靶向磁性颗粒物种靶向的目标生物分子物种不同于试剂盒中其他靶向磁性颗粒物种和靶向浮颗粒物种靶向的其他目标生物分子物种，其中，不同的靶向磁性颗粒物种在试剂盒中的相同或不同组合物中。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多种靶向浮颗粒物种，其中每种靶向浮颗粒物种靶向的目标生物分子物种不同于试剂盒中其他靶向磁性颗粒物种和靶向浮颗粒物种靶向的其他目标生物分子物种，其中不同的靶向浮颗粒物种在试剂盒中的相同或不同组合物中。在其他实施方案中，试剂盒包括多种靶向浮颗粒物种和多种靶向磁性颗粒物种。
本发明的其他方面涉及用于所需或靶生物分子(例如细胞、细胞器等)的磁浮分离、分开、浓缩和纯化的方法。根据这些方面的各种实施方案，此类方法包括以下步骤：提供溶液中的靶向磁性颗粒，特别是靶向纳米磁性颗粒和靶向浮颗粒，特别是靶向浮微粒(尤其是微泡)，每个靶向磁性颗粒包被有不同的靶向部分物种；使靶向磁性颗粒和靶向浮颗粒与多种生物分子物种(例如，不同类型的细胞)接触，多种生物分子物种是例如可以存在于生物样品中的多种生物分子物种，该多种生物分子物种与与溶液中的它们的靶向部分相互作用以形成第一生物分子/磁性颗粒复合物和第二生物分子/浮颗粒复合物，并从溶液中分离如此形成的复合物。在优选的实施方案中，第一生物分子/磁性颗粒复合物从溶液磁分离，并且第二生物分子/浮颗粒复合物被允许上升或漂浮至溶液的顶部，然后被除去，从而从溶液中分离第二生物分子/浮颗粒复合物。以这种方式，可以磁浮地分离、分开、浓缩或纯化所有形式的生物分子物种。生物分子物种的代表性实例包括细胞、细胞组分(脂质体、内质网等)、亚细胞器(线粒体等)、亚细胞器的组分、以及其复合物、以及蛋白质(抗原、抗体、配体、受体、激素)、核酸(RNA、DNA核苷酸类似物、其混合物等)、脂蛋白、脂肪、甘油三酯、糖和碳水化合物。分离、分开、浓缩和纯化可以通过富集、消耗、或富集或消耗步骤的组合来进行。而且，磁性分离、浮分离可以顺序地或并行地进行。当顺序进行时，在一些实施方案中，磁分离可在浮力分离之前进行，而在其他实施方案中，浮力分离在磁分离之前进行。
如将理解的，本发明的靶向浮颗粒(例如，靶向微泡)借助于与浮颗粒偶联的靶向部分物种结合到所需靶生物分子物种，例如细胞、病毒、分析物或其他生物分子，然后上升到溶液表面，从而将它们与反应混合物中的非靶物种分离。在某些实施方案中，在分离时间很重要的情况下，含有靶分子/浮颗粒复合物的反应混合物可以被离心或经受气泡捕集以进一步更快地进行分离。本发明的磁浮分离方法的靶向浮颗粒组分还提供了另外的优点，即重力的法向力和浮颗粒的浮力在不同的方向上，因此导致在分离过程中通常会向反应容器底部下沉的生物分子的非特异性结合和捕获显著减少。在对靶向浮颗粒不产生不利影响的条件下，在低离心场中迫使未结合的生物分子离开靶向浮颗粒，如同使用适度的离心速度，可以增强分离。
在利用基于蛋白质(例如，基于白蛋白的)靶向微泡的本发明的实施方案中，这种微泡具有能够被容易地破坏或分裂并且通过向溶液施加压力或真空或加入少量洗涤剂或表面活性剂而在视觉上消失的有用特性。当需要分离没有捕获微泡的靶向生物分子物种时，这会特别有用。例如，对表征浮力分离的细胞的表型或释放分离的细胞用于进一步分析或繁殖这可能是需要的。这些方法可以避免潜在的破坏性试剂，例如酶、刺激性化学品和极端pH值。在其他实施方案中，如果需要，可通过酶促或化学方法从微泡释放目标靶生物分子物种。
本发明的这些和其他方面、目的和实施方案，不限于发明内容中的信息或不由发明内容中的信息所限定，其被提供如下，包括在权利要求中。
附图说明
图1显示了在超声处理之前和在超声处理之后对本发明的非硅烷化硅烷化和硅烷化纳米磁性颗粒进行的酸溶解研究的结果。该图显示暴露于4M HCl 15分钟后溶解的铁的百分比。
图2显示了根据本发明制备的各种纳米磁性颗粒的磁性分离效率。
图3显示了抗体偶联的市售磁性纳米颗粒产品的磁性分离效率。
图4显示了使用链霉亲和素偶联的纳米磁性颗粒和适当的生物素化抗体阴性选择的CD4阳性细胞的纯度，所述链霉亲和素偶联的纳米磁性颗粒和适当的生物素化抗体在不同温度下储存然后在两个月的时间内测试细胞分离性能。
图5显示了链霉亲和素偶联的纳米磁性颗粒的CD4阳性细胞产量，所述链霉亲和素偶联的纳米磁性颗粒在不同温度下储存并在两个月的过程中测试细胞分离性能，如图4所示。
图6显示了大鼠抗小鼠CD19抗体-偶联的纳米磁性颗粒的纯度，所述大鼠抗小鼠CD19抗体-偶联的纳米磁性颗粒在不同温度下储存并在两个月的时间内测试CD19阳性细胞分离性能。
图7显示了大鼠抗小鼠CD19抗体-偶联的纳米磁性颗粒的产量，所述大鼠抗小鼠CD19抗体-偶联的纳米磁性颗粒在不同温度下储存并在两个月的时间内测试CD19阳性细胞分离性能。
图8是显示各种常规市售磁性颗粒与根据下面实施例1制备的本发明的磁性颗粒相比的粒度分布的图。使用动态光散射进行测量，并且将各种“尺寸-直方”中的颗粒百分比绘制为实际粒度的函数。
图9具有两个图，图A和图B，每个图包含3个透射电子显微照片。图A中的显微照片显示了使用商业HGMS兼容的磁性颗粒通过HGMS磁选的细胞，而图B中的显微照片显示了使用本发明的靶向纳米磁性颗粒通过HGMS磁选的细胞。
图10显示了相对荧光单位(RFU)相对于用于包覆微孔以驱动细胞增殖的抗小鼠CD3抗体浓度的图。RFU是每种条件下相对细胞数的指标。
图11说明了本发明的“磁浮”分离方法的一般方案，用于从复杂混合物(标记为“A”、“B”、“C”和“D”的细胞群体)中快速富集和分离两个单独的细胞群体(标记为“A”和“B”的细胞群体)。细胞群体A的细胞通过用靶向微泡(一种浮颗粒)浮力分离，而细胞B通过靶向磁性颗粒分离。N和S代表磁性分离器设备的北极和南极。
图12说明了本发明的“磁浮”分离方法的一般方案，用于从复杂混合物(标记为“A”、“B”、“C”和“D”的细胞群体)中快速富集和分离三个独立的细胞群体(标记为“A”、细胞“B”和细胞“C”的细胞群体)。如图11，分离细胞群体A和细胞B，同时在从同一管中去除细胞群体A后沉淀并分离细胞群体C+D。N和S代表磁性分离器设备的北极和南极。
图13说明了使用靶向浮颗粒(例如靶向微泡)从复杂细胞混合物(小鼠脾细胞)中富集或分离所需细胞群体(CD19+淋巴细胞)的原理。将CD19抗体偶联的微泡与含有细胞如类型“A”、“B”和“C”的复杂混合物混合(a)。CD19+细胞(A)通过微泡偶联的抗CD19抗体漂浮到表面(b)。从表面收获CD19+细胞并转移到另一个容器(c)中以供进一步使用。
图14说明了使用靶向浮颗粒(如靶向微泡)从大多数不需要的细胞(小鼠骨髓细胞类型(标记为“A”“D”))的复杂混合物中富集或分离所需细胞群体(造血干细胞(标记为“D”))的原理。在该实施例中，“C”型细胞是富集群体的可接受污染物。将复杂细胞混合物与微泡偶联的抗体一起孵育，所述抗体识别漂浮到表面(b)的大部分不需要的细胞(a)，留下所需的细胞(“D”)和可接受的污染细胞(“C”)。从表面除去不需要的细胞(A和B)以留下所需的(D)和可接受的污染细胞(C)以供进一步使用。下图显示了流式细胞术分析数据(参见下文实施例13)，其说明了所需造血干细胞从起始频率0.52％(左，Q2)到3.77％(右，Q2)的富集。
图15说明了同时应用本发明的“磁浮”方法以快速富集和分离两个离散的细胞群体的一个实施例。图15A描绘了复杂混合物(小鼠脾单核细胞)同时暴露于抗CD4抗体-偶联的微泡(一种靶向浮颗粒)和抗CD19抗体-偶联的磁性纳米颗粒(一种靶向磁性颗粒)(a))。CD4 +细胞(B)漂浮到表面，而CD19+细胞(A)被吸引到容器壁处的磁性设备。不需要的CD4-/CD19-细胞(C)沉淀(b)。分别收获两个所需的细胞群体(A和B)并转移到各个容器中以供进一步使用(c)。丢弃不需要的CD4-/CD19-细胞(C)。N和S代表磁性分离器设备的北极和南极。下图(图15B)显示了流式细胞术分析数据(参见下文实施例14)，其说明CD19+/CD4-细胞(A)从起始频率50.5％(对照，Q3)至98.3％(分离后PF，Q3)的富集和残留的不需要的细胞混合物的CD4/CD19表型(C，分离后(NF))。
图16说明了本发明的“磁浮”方法的顺序应用用于改进和快速富集和分离离散的细胞群体的一个实施例。将复杂混合物(人PBMC)同时暴露于抗CD14抗体-偶联的微泡和抗CD4抗体-偶联的磁性纳米颗粒(a)。CD14+细胞(B)首先被漂浮到表面，收获并丢弃(b)。然后将CD4+细胞(A)吸引到容器壁处的磁性设备上(c)。不需要的CD14-/CD4-细胞(C)沉淀并被丢弃(c)。收获所需的、高度富集的CD4+细胞群体(A)并转移到单独的容器中以供进一步使用(d)。N和S代表磁性分离器设备的北极和南极。
图17说明了如图16中所述的从复杂人PBMC获得的高度富集的CD4+/CD14-的流式细胞术分析(参见下文实施例15)。所有细胞像轴显示CD4(横坐标)与CD14(纵坐标)。顶行，对 照：新制备的PBMC，没有经过纯化步骤。顶行，CD14耗尽后：在如图16的步骤(b)中所述使用微泡去除CD14+细胞后剩余的PBMC群体。在没有CD14耗尽行的情况下，CD4阳性级分：使用磁性颗粒在没有预先去除CD14的情况下获得的CD4阳性选择的极性。在没有CD14耗尽行的情 况下，CD4阴性：在没有预先除去CD14情况下使用磁性颗粒的CD4阳性选择步骤后剩余的阴性级分。在CD14耗尽行的情况下，CD4阳性级分：预先除去CD14+细胞后获得的CD4阳性选择级分。在CD14耗尽行的情况下，CD4阴性级分：在CD4+细胞的阳性选择去除之后和CD14预去除步骤之后剩余的阴性级分。
具体实施方式
如本领域技术人员将理解的，以下详细的说明描述了本发明的某些优选实施方案，因此仅是代表性的，并未描述本发明的实际范围。在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定方面和实施方案，因为它们可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制由所附权利要求限定的本发明的范围。
已知许多方法用于分析和分选细胞群体和其他生物分子，包括基于细胞大小、密度或粒度的方法，其中通过沉降，单独或与密度梯度和离心或洗脱组合实现分离。其他方法包括基于细胞对渗透性裂解的差异抗性的方法，例如可用于从全血中分离白细胞。此外，使用与细胞表面标志物反应的特异性抗体从更复杂的生物样品中消耗(即减少数量)不需要的细胞(或其他生物分子)的方法可用于去除或减少表达该标记物的细胞数量。其他细胞分离方法包括流式细胞术和磁性细胞分选(例如，使用磁性颗粒偶联的抗体)，以及使用对特定生物分子(包括细胞表面蛋白)的抗体亲和力(或其他高亲和力结合对)的其他方法。使用这些技术，可以实现与标记的检测/分离试剂偶联的特别需要的即“靶向”或“靶”细胞群体(即，表达可被高亲和力结合部分(例如，抗体、Fab片段、受体等)靶向的标记物的那些细胞群体)的正富集或消耗。
因此，本发明涉及从更复杂的生物样品如细胞混合物(例如，全血，均质活检或组织样品等)中分离一种或多种所需或靶生物分子物种，特别是一种或多种靶细胞群体。“靶生物材料”或“靶生物分子”是指任何生物基质，例如细胞、细胞器和其他生物材料，使用者希望分离、富集、消耗或靶向，并且可以制备针对其的特异结合部分(配偶体)，以便特异性标记或结合材料。合适的靶生物分子列表是广泛的，包括微生物，如原生动物、细菌、酵母和其他真菌、来自多细胞生物(包括哺乳动物和其他脊椎动物细胞、病毒、细胞的和病毒的碎片)的培养细胞、表达一种或多种可靶向细胞表面抗原的真核细胞群体、以及包含可靶向蛋白质或其他生物分子(例如，碳水化合物、脂质等)的细胞器或其他亚细胞结构(例如，外来体、蛋白酶体、核糖体等)。实际上，可以被靶向部分靶向的任何生物材料(即生物分子)，其或者为单个分子(例如，蛋白质)或者为一个或多个分子(由不同分子物种的相同分子组成的)的有组织或无定形聚集体可以使用本发明的纳米磁性颗粒和方法分离或纯化。
本方法基于使用可获得专利的新一类的磁浮分离技术，其可用于通过磁性细胞分离技术将靶生物分子(直至并包括完整的活细胞)与反应混合物中的其他组分分离。如果需要，还可以进行其他分离以富集或消耗反应混合物中(由于存在于待分析的原始样品中)存在的一种或多种其他生物分子物种(例如，细胞群体)。实际上，在根据本发明的优选的磁浮分离中，基于使用靶向浮微粒(例如，微泡等)的分离与磁性分离结合使用用于平行或连续处理生物样品以富集两个或更多所需的细胞群体(或其他生物分子物种)或富集至少一种靶细胞群体(或其他生物分子物种)并耗尽另一种。
为了进行根据本发明的磁分离，同时(并行)或一个接一个地(串联地；在这些实施方案的一些中，可以在浮力分离之前进行磁性分离，而在其他实施方案中，浮力分离程序在磁性分离程序之前进行)。本发明设想组合使用在特定应用中兼容的任何合适的磁性分离和浮力分离过程(适当时进行改动))。在优选的实施方案中，磁性分离方法利用靶向磁性颗粒，特别是靶向纳米磁性颗粒，浮力分离方法使用靶向浮颗粒，优选靶向浮微粒，例如浮微泡。优选地，靶向磁性颗粒的靶向部分靶向的生物分子物种与靶向浮颗粒的靶向部分靶向的那些生物分子物种不同。
在实践中，磁性分离利用由磁源例如由永磁体或电磁体产生的磁场梯度。可以使用任何类型和形式的磁体。通过将磁梯度应用于含有生物或细胞样品的等分试样的反应混合物，基本上所有的(即50-99％或更多)被靶向磁性颗粒结合(通过靶向目标生物分子的包含的靶向部分，例如，在靶细胞类型的表面上表达的蛋白质)的细胞可以与反应混合物的其他组分分离，而基本上由靶向浮颗粒结合的所有细胞(即50-99％或更多)仍然存在于反应混合物中(除非已经使用适合于所使用的特定靶向浮颗粒物种的浮力分离方法从反应混合物中除去了这些细胞)。
通过将磁性颗粒或浮颗粒偶联到一个或多个靶向部分来提供靶向。对于本发明的给定的靶向磁性颗粒物种或靶向浮颗粒物种，特定靶向部分物种的一种或多种靶向部分分子可以(直接或间接)偶联到磁性颗粒或浮颗粒，视情况而定。这种靶向部分分子提供了特异性结合一种或多种被靶向的生物分子物种的分子的能力。在一些实施方案中，靶向部分分子具有结合两种或更多种不同的所需(即，靶)生物分子物种的能力。这种多元特异性或多特异性靶向部分的实例包括工程化以靶向不同抗原(或同一抗原上的不同表位)的抗体、树枝状大分子等。在其他实施方案中，给定的靶向浮颗粒或磁性颗粒物种具有与其偶联的两种或更多种(例如，2-20种)不同的靶向部分物种，优选各自靶向不同抗原(或相同抗原上的不同表位)。可由本发明的靶向浮颗粒和/或磁性颗粒物种靶向的生物分子的代表性实例包括细胞表面标志物，例如CD1c、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD23、CD25、CD27、CD34、CD36、CD38、CD43、CD45、CD45RO、CD45RA、CD56、CD61、CD123、CD127、CD133、CD193、CD235a、CD335、CD304、抗-Fc-epsilon、抗-T细胞受体α/β、抗T细胞受体γ/δ、抗生物素、抗IgE、抗HLA-DR及其组合。可以(例如通过与其特异性反应的单克隆抗体)被靶向以将靶细胞群体与生物样品分离的特别优选的蛋白质包括以下细胞表面蛋白：
在本发明的上下文中，通过使用与可分离颗粒(例如，本发明的纳米磁性颗粒、常规磁性颗粒、浮颗粒(例如，微泡)等)偶联的靶向部分来实现靶向分离(用于富集或消耗)。靶向部分通常是可以通过合适的化学方法(优选地涉及共价键的方法，其不破坏高亲和力结合试剂和靶向生物分子优选在靶细胞群体的表面上表达的蛋白质、细胞器或其他生物分子之间的结合)与可分离的颗粒偶联的高亲和力结合试剂。这种高亲和力结合试剂的实例包括高亲和力结合对的成员。这些成员包括抗体(特别是单克隆抗体)、抗原结合抗体片段(例如，Fab片段)或高亲和力结合对的另一成员(其中一个与可分离颗粒偶联，另一个是存在于被靶向的生物分子或结构上的“靶”)。在一些实施方案中，与其偶联的高亲和力结合试剂和/或可分离颗粒用适于细胞分离(例如FACS)的可检测试剂例如荧光染料标记。
与可分离的(例如，通过磁场或电场、浮力等)颗粒偶联的高亲和力结合试剂可用于在允许结合试剂特异性结合其相应的靶标(例如，在抗体、抗原结合抗体片段等情况下的抗原)的条件下使所需生物分子(例如，表达特定细胞表面抗原的细胞群体)与其他反应混合物组分分离。
本发明分离方法的实施包括以下步骤：在反应混合物中，固定存在于已知或怀疑含有靶生物分子的生物样品中的靶生物分子，例如，表达特定细胞表面标志物的靶细胞群体，该生物分子通过使用磁场在铁磁性基质中被本发明的纳米磁性颗粒的靶向部分特异性结合；洗涤基质以除去反应混合物中未结合的组分；以及去除磁场以从基质中洗脱靶生物分子。结果，富集了靶生物分子(例如，靶细胞群体)；另外或可替代地，生物样品耗尽了靶生物分子(假设从基质洗涤的材料被保留用于进一步使用)。可以使用重力流、离心、真空过滤或压力梯度来进行从铁磁基质中洗脱材料。
术语“磁性分离”是指复杂样品(例如生物样品)的组成成分的分离程序。此类程序包括由靶向部分介导的磁性分离，所述靶向部分包含与根据本发明的纳米磁性颗粒偶联或以其他方式连接的高亲和力结合对的一个成员(例如，特异性结合靶细胞表面抗原的单克隆抗体)。磁性分离可以与其他分离程序组合，其他分离程序包括使用靶向浮颗粒的那些和/或本领域已知的还依赖于高亲和力结合对(例如，抗体及其同源抗原)的分离技术，例如亲和层析、“淘选”(其中高亲和力结合对的一个成员附着至固体基质(例如微量滴定板的孔))。如果荧光标签包含在靶向可分离颗粒中，也可以使用荧光激活细胞分选(FACS)。实际上，任何现在已知或以后开发的配体依赖性分离技术可以与依赖于靶生物分子的物理性质而不是亲和力的阳性和/或阴性分离技术(包括过滤、尺寸排阻色谱和密度梯度离心)结合使用。
本发明还包括用于单独或与其他分离方法一起进行本文所述磁性分离方法的试剂盒。此类试剂盒包括靶向所需生物分子例如在特定细胞类型的表面上表达的细胞表面抗原的本发明的靶向纳米磁性颗粒。靶纳米磁性颗粒通常包装在容器中，所述容器包括进行一次或多次磁性分离程序所需的量的颗粒。用于靶向纳米磁性颗粒(和任何其他被包含的试剂，例如靶向浮微泡)的说明书(或包含此类说明的链接或网站地址)通常也包括在任意此类试剂盒中。
磁性分离
已知用于分离生物材料或样品的组分的技术是利用磁性分离技术的技术。磁性分离方法通常选择性地将磁性材料保持在设置在磁场中的腔室或柱中。此类方法通常包括使生物材料或样品通过一个或多个分离柱。简而言之，通过使用与颗粒偶联的靶向部分，通过附着于本发明的靶向纳米磁性颗粒来磁性标记生物材料或样品，该靶向部分靶向已知或怀疑存在于样品中的所需(或“靶”)生物分子，例如在已知或怀疑存在于样品中的某些细胞的表面上显示的所需生物分子。然后将标记的靶样品的悬浮液施加到分离室或柱上。为了将靶生物分子物种与反应混合物的其余部分分离，在磁场存在下将靶生物材料保留在室中。然后可以通过改变磁场的强度或通过消除磁场来洗脱保留的靶生物材料。
在一些实施方案中，使用高梯度磁性分离(HGMS)(Miltenyi等，Cytometry，11,231(1990))。在HGMS中，将适当磁化率的材料基质(例如铁毛或钢珠)放置在腔室或柱中，使得当施加磁场时，在基质表面附近局部诱导高磁场梯度，允许保留磁化颗粒和靶向生物材料的复合物，所述复合物通过混合物中存在的高亲和力结合对的成员的结合形成。
本发明的靶向磁性颗粒和方法可用于磁性分离或磁性标记，并且如果需要，可分离任何所需的靶物种或分析物(例如，细胞、细胞器等)。特别感兴趣的是将一种或多种特异性生物分子与复杂的生物混合物分离。本发明具有很大的实用性，因为一旦可获得该物质的特异结合成员，几乎任何靶物种都可以被分离。靶向部分可以是特异性高亲和力结合对的任何成员，或与特异性高亲和力结合对的成员结合的物质。例如，细胞表面抗原-抗体结合对可用于分离抗原本身、表达抗原的细胞、参与抗原加工的特定细胞器等。本发明的设备和方法也有利地应用涉及受体和配体结合的诊断技术，例如免疫测定等。
靶向磁性颗粒
两类磁性氧化物，铁氧体和非铁氧体，可用于生产本发明的靶向磁性颗粒，特别是靶向纳米磁性颗粒(参见2016年4月30日提交共同拥有的、共同未决的USSN 15/143,552、美国专利申请公开号20160320376和WO 2016/179053)。铁氧体或含铁过渡金属氧化物通常可表示为XO.Fe2O3，其中“X”可以是Fe、Ni、Cr、Co、Mn、Mg、Mo、Gd、Cu、V、Dy、Ey、Tm或者Yb。因此，在合成磁铁矿超级团簇的过程中，可以用上述二价金属离子盐之一代替含有Fe2+的铁盐。在这类铁氧体中最优选的是FeO·Fe2O3，其被更广泛地称为磁铁矿或Fe3O4。非铁氧体类磁性氧化物没有铁原子，而是被这些过渡金属的两种或多种离子的组合取代：Cr；Co；Mn；Ni；Mo；Gd；Dy；Ey；Tm；和Yb。这种基于非铁氧体的磁性氧化物通常产生一系列有色纳米磁性颗粒，但磁性响应性低于铁氧体类磁性氧化物。
几乎在一个世纪前首次合成磁铁矿晶体。磁铁矿晶体的后续加工和稳定化催生了具有不同的表面涂层并用于不同的应用的许多不同类型的不同尺寸的磁性颗粒。在优选的实施方案中，磁铁矿(Fe3O4)晶体首先使用任何合适的方法合成，包括众所周知的水基共沉淀方法[Massart 1982，Schwertmann 1991]。在惰性气氛下用强碱滴定亚铁(Fe2+)的铁盐和铁(Fe3+)的铁盐的化学计量混合物，得到1μm-3μm直径的磁铁矿晶体。为了生产出最高品质的“裸”磁铁矿晶体，优化变量如铁盐的摩尔比(例如1.0M Fe2+：2.0MFe3+至2.0M Fe2+：1.0MFe3+)、反应温度(例如，40℃至95℃)、使用的碱反离子(例如铵、钠、钾)的类型和碱添加速率(例如，2mL/分钟至200mL/分钟)。接着在高功率下对这些磁铁矿晶体进行超声处理，以产生准稳定态的90nm-110nm(纳米)尺寸的纳米磁性颗粒，其使用含水酸性硅烷化程序立即硅烷化，伴随高温脱水，以获得硅烷化的纳米磁性颗粒。
可以使用任何合适的方法完成硅烷化。例如，在使用0.5英寸钛探头端在高功率(750W)下超声处理25分钟后，将纳米磁性颗粒转移到保持在氮气下含有50v％甘油的具有顶置式搅拌器的三颈圆底玻璃反应容器中。然后以0.5ml/分钟加入10wt％(相对于铁质量)的硅酸钠溶液，然后立即以1mL/分钟加入0.5M冰醋酸直至达到pH6。然后将温度升至180℃并使混合物脱水至少2小时，然后冷却并用水洗涤。
在各种优选的实施方案中，首先使用强金属离子螯合剂如EGTA使“裸”磁铁矿晶体胶溶化，以便提供用于与硅烷化试剂缩合的额外的种子羟基。通过在螯合剂(例如EGTA)存在下对2μm大小的磁铁矿超级团簇进行超声处理来实现胶溶作用，以便在磁铁矿颗粒上引入额外的羟基并提供更大的胶体稳定性。在另一个优选的实施方案中，依次使用两种硅烷化试剂，以便通过二级硅烷化试剂中存在的固有官能团来增强包封以及提供额外的可偶联基团。例如，可以通过首先使用如上所述的硅酸钠硅烷化超声的磁铁矿颗粒，然后在180℃脱水之前立即添加氨基硅烷如氨丙基-三甲氧基硅烷(APTS)来实现依次硅烷化(参见实施例2，下面)。
进行第二轮高功率超声处理(尽管是短暂的)以减小粒度，优选至95nm-105nm。接下来，将这些硅烷化的纳米磁性颗粒与含有蛋白质/聚合物混合物例如BSA(牛血清白蛋白)和多糖葡萄聚糖(99wt％BSA：1wt％葡萄聚糖至50wt％BSA：50wt％葡萄聚糖)的加热的溶液混合。例如，这可以通过将含有BSA和葡萄聚糖的混合物的溶液加热到700℃然后在含氮气氛下在密封的三颈反应容器中将其与超声处理的磁铁矿颗粒混合来实现。使包被过程进行30分钟。然后将悬浮液冷却并使用例如高磁场磁偶极分离器洗涤。
已知将浓缩的BSA溶液加热至超过58℃的温度会产生由各个BSA分子之间形成的二硫键和β折叠的氢键介导的不可逆的BSA聚集体[Wetzel，1980]。在一个优选的实施方案中，在与超声处理的硅烷化颗粒混合之前，将马来酰亚胺基团引入BSA蛋白质中，以进一步促进二硫键的形成。然后借助于强偶极/四极型磁性分离器洗涤BSA/葡萄聚糖包被的纳米磁性颗粒以除去多余的涂层材料以及使颗粒的尺寸分布变窄至约110nm的最终尺寸。来自该磁性分级步骤的初始洗涤上清液含有显著量(约50％铁质量)的30nm-80nm尺寸的BSA/葡萄聚糖包被的纳米磁性颗粒。这种较小尺寸的纳米磁性颗粒也可以有效地用于磁性捕获/纯化细胞内和/或细胞外靶标，例如但不限于分别为核内体和外来体。如此产生的BSA/葡萄聚糖包被的纳米磁性颗粒通常具有≤0.1的PDI。该PDI数是粒度分布宽度的量度，并且是在基于DLS的尺寸测量期间自动获得的。通常，小于0.1的多分散指数通常称为“单分散”颗粒悬浮液。更确切地说，PDI＝(标准偏差除以平均直径)的平方，并且是无量纲数。然后使用标准的异/同-双功能偶联化学将生物亲和配体，即“靶向部分”，例如抗体和/或链霉亲和素，与110nm直径的BSA/葡萄聚糖包覆的纳米磁性颗粒偶联。如此制备的链霉亲和素包覆的纳米磁性颗粒用高离子强度盐溶液(1M至5M NaCl)进一步热处理，以稳定颗粒上的表面涂层。
在一些实施方案中，与本发明的靶向纳米磁性颗粒相连的靶向部分用可检测的标记物例如放射性同位素或荧光分子标记，以使得颗粒或颗粒/靶向细胞复合物(或其他生物分子结构)通过使用互补标签检测仪器或系统可检测。这种标记可以包含在磁核颗粒中和/或本发明的纳米磁性颗粒的一个或多个外层中。在需要颗粒/细胞检测的其他实施方案中，可以采用用于检测颗粒的磁信号的技术，代表性实例是SQUID技术，可以用于通过它们产生的磁场来检测磁性标记[Clarke and Braginski,SQUID Handbook,vol.1,(2004)]。
基于浮力的分离
本发明组合使用靶向磁性颗粒和靶向浮颗粒以从生物样品、细胞培养物等中亲和分离或分开所需生物分子，特别是特定细胞类型。与靶向磁性颗粒类似，靶向浮颗粒(例如，微泡)使用靶向部分靶向所需生物分子，例如靶细胞类型表面上存在的抗原。靶向部分通常是高亲和力结合试剂，其可以通过合适的化学方法(优选地，不破坏高亲和力结合试剂和靶生物分子优选在靶细胞群体的表面上表达的蛋白质、细胞器或其他生物分子之间的结合的涉及共价键的方法)与浮颗粒偶联。
本发明的浮微粒，例如微泡，与用于生物分子分离的固体颗粒相比具有优势，因为重力的法向力和浮微粒的浮力在不同的方向上，因此导致在分离过程中通常向反应容器底部下沉的物种的非特异性结合和截留显著减少。例如，在不对微泡(或其他浮微粒)产生不利影响的条件下，在低离心场中(如同以适当的离心速度)未结合的细胞被迫离开微泡可以增强分离。
如本领域技术人员所理解的，任何合适的浮微粒都可以适用于实施本发明。示例性浮微粒物种包括蛋白质微泡，例如白蛋白微泡。在本发明的一些实施方案中，微泡是蛋白质微泡，其可以包含任何肽、多肽，蛋白质或其组合。在一些实施方案中，蛋白质是白蛋白。本发明考虑了合成的和天然存在的肽、多肽、蛋白质和组合。在一些实施方案中，通过引入气体，例如，通过超声、加热或其他合适的方法将气体引入含蛋白质的溶液中蛋白质微泡可以被容易地形成微泡。
在其他实施方案中，微泡是玻璃微泡，优选具有约0.6g/cc的密度和约30微米的平均直径的玻璃微泡。在使用玻璃微泡的一些实施方案中，处理玻璃微泡以产生反应性表面残基，反应性表面残基继而与3-氨基丙基三乙氧基硅烷反应以产生胺官能团。在其他实施方案中，玻璃微泡可以是顺式-二醇包被的，并且靶向部分可以通过顺式-二醇涂层直接偶联到玻璃上。顺式二醇涂层可以通过以下产生：例如处理玻璃微泡以产生反应性表面羟基残基，使这些残基与3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷反应生成环氧官能残基，然后用酸处理环氧官能残基以将环氧官能团转化成顺式二醇官能团。
这里，“气泡”是指小的、中空的和轻质的小球，通常是包封在薄膜内的小球形体积的气体。气泡可以填充任何气体，包括但不限于氧气、氮气、二氧化碳、氦气、碳氟化合物气体及其各种组合，例如空气。薄膜可以是能够包封少量气体的任何材料，例如不溶性蛋白质或脂质；聚合物或非聚合物材料；金属等固体；实心玻璃、陶瓷或类似材料；或塑料，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、尼龙等。在一些优选的实施方案中，薄膜是白蛋白。在其他优选的实施方案中，薄膜是硼硅酸盐玻璃。在一些实施方案中，薄膜在其暴露的条件和溶液下是稳定的。在其他实施方案中，气泡可以选择性地破裂、压碎或溶解。“微泡”是小气泡，直径的范围通常为0.1至100微米，通常1至50微米，通常2至20微米或2至30微米。
在使用中，本发明涉及以下步骤：提供溶液中的靶向磁性纳米颗粒和靶向微泡，使靶向磁性纳米颗粒和靶向微泡与在溶液中的已知或怀疑含有目标生物分子物种的生物样品在允许靶向部分和靶向生物分子相互作用的条件下接触，从而产生生物分子：靶向磁性颗粒和/或靶向微泡复合物，并允许生物分子：靶向微泡复合物漂浮到溶液顶部，从而将与靶向微泡复合的靶生物分子与溶液中的其他组分分离。然后可以分离生物分子：靶向微泡复合物。在分离后，生物分子：靶向微泡复合物可以用任何合适的方法例如去污剂、压力或真空处理，以从微泡：生物分子复合物中释放出靶生物分子物种。生物分子：靶向磁性颗粒复合物可以用磁场设备单独分离或同时作为生物分子：微泡复合物被分离。
磁性颗粒和浮微粒的靶向部分
根据本发明，靶向部分是高亲和力结合对的一个成员，其实例包括受体、受体配体、适体、四聚体和抗体以及抗原结合抗体片段。其他合适的靶向部分包括生物素、抗生物素蛋白和链霉亲和素。
在其他实施方案中，靶向部分可以例如通过至少一种其他分子的相互作用间接偶联至磁性纳米颗粒或浮微粒(例如微泡)。作为间接偶联的实例，磁性纳米颗粒或微泡可以直接与链霉亲和素偶联，并且靶向部分是生物素化的。特别的靶向磁性纳米颗粒或微泡物种通过使链霉亲和素和生物素相互作用以将靶向部分偶联至磁性纳米颗粒或微泡从而形成靶向磁性纳米颗粒物种或靶向微泡物种，视情况而定。
靶向部分可以直接偶联至磁性纳米颗粒或浮微粒，例如，通过使用异双功能试剂，例如磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、环氧涂层或在磁性纳米颗粒或浮微粒上的胺官能团。
如本文所用的术语“靶向部分”是指能够特异性结合另一分子的任何分子。在一些实施方案中，靶向部分是抗体。在其他实施方案中，靶向部分是抗原。在其他实施方案中，靶向部分可包括但不限于：核酸(DNA、RNA、PNA和其混合物的核酸或包括核苷酸衍生物或类似物的核酸)；细胞表面受体分子；细胞表面受体的配体；和对另一种分子具有亲和力的生物、化学或其他分子，如生物素和抗生物素蛋白。本发明的靶向部分不需要包含完整的天然存在的分子，而是可以仅由天然或非天然存在的分子的一部分、片段或亚基例如抗体的Fab片段组成。靶向部分可以进一步包含可以检测的标志物或标记。
靶向部分可以通过任何合适的方法产生。例如，抗体可以在由杂交瘤组织培养上清液或腹水液制备的抗血清中发现，或者可以衍生自重组表达系统，如本领域所熟知的。例如，抗体、受体或其他分子的片段、部分或亚基可以通过化学、酶促或例如产生众所周知的分子(例如，Fab，Fab')或新分子的其他技术产生。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明还预期靶向部分可包括重组、嵌合和杂合的分子，例如人源化和灵长类化抗体，以及其他非天然存在的抗体形式。本领域技术人员将认识到，上文给出的描述各种形式的抗体的非限制性实施例也可以扩展至其他靶向部分，使得非抗体靶分子的重组、嵌合、杂合、截短等形式可以是用于本发明的方法中。
术语“特异性地结合”、“特异的结合”等意指抗体或其他分子尤其是本发明的靶向部分以与在本发明的特定条件下以比与其他分子结合更大的亲和力与靶例如抗原、配体或其他分析物结合。另外，特异性结合可以由用于增加结合事件的特异性和亲合力的相对高亲合力分子，例如四聚体、五聚体和Dextamer引导。如本领域已知的，抗体或抗体片段是含有可以结合其他分子例如抗原的区域的多肽分子。在本发明的各种实施方案中，“特异性结合”可意指抗体或其他靶向部分以比其结合与靶分子无关的分子大至少约106倍的亲和力，优选至少约107倍的亲和力，更优选至少约108的亲和力，最优选至少约109倍的亲和力与靶分析物分子(生物分子)结合。通常，特异性结合是指在比非特异性结合大约106倍至约109倍的范围内的亲和力。在一些实施方案中，特异性结合的特征在于亲和力大于非特异性结合的109倍。当在此出现范围时，如“1-10或1至10”，该范围不受限制地指给定范围内的每个整数或度量单位。因此，1-10表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和其间的任何亚单位中的每一个。
可以通过已知技术产生识别特异性表位的抗体片段，例如Fab和F(ab')2片段、单链抗体等。
“抗原”是能够在动物中产生抗体反应并被所得抗体识别的大分子。抗原通常包含至少一种抗原决定簇或“表位”，其是抗体结合的抗原的区域。
“受体”或“生物受体”通常是指细胞内或表面上的分子结构，其特征在于选择性结合特定物质(例如“配体”)，导致伴随结合的特定生理效应。受体的实例包括针对生物分子的细胞表面受体，例如肽激素、神经递质、抗原、补体片段和免疫球蛋白、以及类固醇激素的细胞质受体。然而，如本文所用，受体通常被分离和纯化，并且除了靶向其所属的高亲和力结合对的另一成员之外，不需要引起或不能够引起生理学或其他生物学效应。
术语“配体”通常是指与受体结合的分子。通常，配体是小的可溶性生物分子，例如肽、激素或神经递质。
可以理解，含有靶向部分的磁性纳米颗粒和浮微粒的包被可以通过本领域已知的任何方法完成。有利地，蛋白质含有可以作为许多修饰和偶联反应例如与醛的反应的基础的胺官能团。此外，构成可用于实施本发明的磁性纳米颗粒和浮微粒的材料，例如蛋白质、玻璃、磷脂等，可以化学衍生化或官能化以与各类型的靶向部分共价相互作用。实际上，用于将蛋白质和其他靶向部分分子偶联到本发明的磁性纳米颗粒和浮微粒上的各种商业试剂、产品和试剂盒是本领域已知的。
在本发明的其他实施方案中，靶向部分可以间接偶联至磁性纳米颗粒和浮微粒，例如通过至少一种其他分子的相互作用。例如，磁性纳米颗粒和/或浮微粒可以直接与链霉亲和素偶联，并且靶向部分是生物素化的，使得链霉亲和素和生物素相互作用以将靶向部分偶联至颗粒。参见例如，Avidin-Biotin Chemistry:A Handbook(Savage,et.al.,eds.Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.,1992)。
体内应用
本发明的磁分离方法可适用于许多体内诊断和治疗用途，包括成像、细胞疗法和向细胞递送治疗剂。将使用靶向磁性颗粒与基于靶浮力技术相结合提供了甚至更大的优点，例如提高分离的生物分子的纯度、减少样品处理时间以及从单个复杂样品中产生一种或多种特定的富集细胞群体。如将理解的，在一些实施方案中，细胞虽然不存在于组织中，但存在于细胞群体中。如本文所用，“细胞的群体”或“细胞群体”是指一组至少两个细胞，例如2-10个细胞、2-100个细胞、2-1000个细胞、2-10,000个细胞、2-100,000个细胞、2-106个、2-107个、2-108个或其间的任何值，或更多个细胞。任选地，细胞群体可以是具有共同起源的细胞，例如，起源于相同亲本细胞的细胞、分离自或起源于从相同组织分离的细胞的细胞、或分离自或起源于从相同组织样品分离的细胞的细胞。细胞群体可包含一种或多种细胞类型，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种细胞类型或更多细胞类型。细胞群体也可以是异质的或同质的。如果细胞群体包含至少约90％的相同细胞类型，例如，群体中90％、92％、95％、98％、99％或更多的细胞具有相同的细胞类型，则细胞群体可以是基本上同质的。如果群体中存在的细胞小于约90％具有相同的细胞类型，则细胞群体可以是异质的。
根据本发明的方法分离的细胞或细胞群体可以通过任何合适的途径施用于患者或受试者，以治疗多种病症、疾病和障碍。优选地，用本发明分离的细胞治疗的受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人之外的哺乳动物可以有利地用作受试者，其代表与给定细胞、组织或器官的缺陷、功能障碍和/或衰竭或干细胞区室的缺陷、功能障碍或衰竭相关的疾病的动物模型。此外，本文描述的方法可用于治疗驯养动物和/或宠物。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是先前已被诊断患有或被鉴定为患有或具有细胞类型、组织、器官或干细胞区室的缺陷、功能障碍和/或衰竭的或与这种病症相关的一种或多种疾病或病症并且任选地，不必已经经历过针对这种病症的治疗的受试者。受试者还可以是已经被诊断患有或被鉴定为患有包括细胞类型或组织或干细胞区室的缺陷、功能障碍和/或衰竭的病症，但是由于接受针对这种病症的一种或多种治疗而已经显示出已知风险因素的改善的受试者。或者，受试者也可以是先前未被诊断为患有这种病症的受试者。例如，受试者可以是表现出这种病症的一种或多种风险因素的受试者或没有表现出这种病症的风险因素的受试者。
细胞疗法
今天，不能用标准药物令人满意地治疗许多人类疾病。对于这些疾病中的一些，细胞疗法提供了有吸引力的替代方案。基于细胞的疗法通常需要对细胞产品进行大量操作和处理。目前的细胞治疗方法需要大量的基础设施和设备来满足制造和监管要求，包括良好的生产规范，其涉及使用合适的洁净室和人员在确保不污染样品以保持无菌条件下维护房间、设备、生产、质量控制和质量保证程序。基于细胞的产品通常使用不同设备和一次性用品的组合进行处理。在这些过程中转移产品和试剂可以是手动的和/或自动化的。
磁性细胞分离可包括富集和消耗程序。如果可以使用细胞表面蛋白(或其他细胞表面生物分子)鉴定靶细胞，则可以通过一轮或多轮富集和/或消耗将它们富集至高纯度。在其他情况下，可以从所得的细胞产物中鉴定和除去靶细胞，所述细胞产物可以是不同所需细胞的异质混合物，其中移除的靶细胞数量已经减少。当然，可以使用富集和消耗的组合。
使用本发明的靶向(纳米)磁性颗粒和靶向浮颗粒(例如，微泡)对细胞进行磁浮标记包括针对每种磁性颗粒物种和每种浮颗粒物种的至少一种合适的靶向部分，通常是高亲和力结合对的特异性结合成员，其中不同颗粒类型的靶向部分靶向不同的生物分子(例如，细胞表面受体)。然后可以使用磁性分离设备优选还结合使用靶向浮颗粒分离靶细胞/颗粒复合物，以进一步富集所需的细胞群体。尽管本发明可以应用于广泛的细胞类型或其他生物材料或样品，多能细胞(例如造血干细胞或祖细胞)的分离是特别令人感兴趣的。
根据本发明生产的细胞产品可立即用于治疗或储存以供以后使用已知方法使用。制剂化步骤包括将分离的含有细胞的制剂调节至所需的体积或细胞浓度，用可注射溶液交换处理液，加入稳定剂(例如，自体血浆或血清，血清白蛋白，其他蛋白质或合成聚合物等)或佐剂，补充冷冻保护剂如DMSO用于随后的储存，抽取保留等分试样用于质量控制，递送到用于输注的袋子或注射器的组合等。可以使用根据本发明富集细胞群体实施的示例性细胞疗法包括用于组织再生的干细胞移植，包括治疗心肌梗塞、肝损伤或神经退行性疾病；治疗难治性自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、系统性硬皮病、1型糖尿病或多发性硬化症；治疗癌症，例如白血病(包括急性髓性白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)；治疗癌症、病毒和细菌感染的免疫疗法等。
可根据本发明富集的优选细胞类型包括干细胞。干细胞是非特化细胞，具有自我更新和分化成特化细胞类型例如神经元、肝脏或肌肉细胞的能力。胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)是多能干细胞(PSC)，其具有分化并成为人(或其他动物物种)体内发现的任何细胞类型的潜能。成体干细胞如神经干细胞(NSCs)、间充质干细胞(MSCs)和造血干细胞(HSC)是专能干细胞，其分化仅限于原始组织中发现的细胞类型。对于这些类型的干细胞，广泛的标记物，特别是细胞表面标记物是已知的，该标记物(无论是现在已知的还是后来发现的)可以用作用于实施本发明的靶向部分的靶标。类似地，已知用于基于细胞的疗法的细胞中不存在的标志物可用于在给予待治疗的受试者(例如人)之前从细胞群体中耗尽表达此类标志物的细胞。
重要的是，本发明的靶向磁性和微泡浮颗粒可以使用任何合适的方法，包括过滤灭菌(由于颗粒的小尺寸)进行灭菌，以用于强制或必须的无菌处理的治疗和/或体内/体外程序。
如上所述，通过使用本发明的磁分离方法和组合物分离的细胞可以是任何类型的细胞，例如成体细胞、胚胎细胞、分化细胞、干细胞、祖细胞和/或体细胞。分离的细胞可以从受试者获得，例如从获自患者的生物样品、细胞培养物或任何其他合适的来源获得。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在一些实施方案中，细胞是成体细胞。在其他实施方案中，细胞是新生儿细胞、胎儿细胞、羊膜细胞或脐带血细胞。细胞可以是自体的或同种异体的，并且它们可以经遗传修饰或以其他方式工程化或可以不经遗传修饰或以其他方式工程化。
术语“体细胞”是指生殖细胞以外的任何细胞，存在于植入前胚胎中或从植入前胚胎获得的细胞，或由这种细胞体外增殖产生的细胞。换句话说，体细胞是指形成生物体的任何细胞，与生殖细胞相反。在哺乳动物中，生殖细胞(也称为“配子”)是精子和卵子，它们在受精过程中融合产生称为受精卵的细胞，整个哺乳动物胚胎从受精卵发育。哺乳动物体内的每一种其他细胞类型-除了精子和卵子、制造它们的细胞(配子体)和未分化的干细胞-都是体细胞；内脏器官、皮肤、骨骼、血液和结缔组织都是由体细胞组成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚胎体细胞”，其意指不存在于胚胎中或不是从胚胎获得并且不是由这种细胞体外增殖产生的体细胞。在一些实施方案中，体细胞是“成体体细胞”，其是指存在于胚胎或胎儿以外的生物体中或从其获得的细胞，或者是这种细胞的体外增殖产生的细胞。在本文中，“成体”是指在出生后的任何时间从动物受试者或在动物受试者中衍生的组织和细胞，“胚胎”是指在出生之前的任何时间从动物受试者或在动物受试者中衍生的组织和细胞。应注意，成体和新生儿或胚胎细胞可通过结构差异例如表观遗传组织诸如甲基化模式来区分。在一些实施方案中，体细胞是哺乳动物体细胞。在一些实施方案中，体细胞是人体细胞。在一些实施方案中，体细胞是成体体细胞。在一些实施方案中，体细胞是新生儿体细胞。
“分化细胞”是指其命运或功能比其发育中的先前点更特化的细胞，并且包括终末分化的细胞和尽管不是终末分化但比他们发育中的先前点更特化的细胞。从未定型细胞(例如，干细胞)到越来越高程度向特定分化细胞类型定型、最后到终末分化细胞的细胞发展，被称为渐进分化或渐进定型。在细胞个体发育的背景下，形容词“分化的”或“分化”是相对术语。“分化细胞”是比与其进行比较的细胞在发育途径中向下进一步发展的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制的前体细胞(例如中胚层干细胞)，其进而可以分化成进一步沿着途径向下的其他类型的前体细胞(例如心肌细胞前体)，然后到达在某种组织类型中起特征性作用并且可能保持或可能不保持进一步增殖的能力的末期分化细胞。
术语“干细胞”是指处于未分化或部分分化状态的细胞，具有自我更新的特性并且具有天然分化成更分化的细胞类型的发育潜能，且没有关于发育潜能的特定隐含意义(即，全能的、多能的、专能的等)。“自我更新”是指干细胞能够增殖并产生更多这样的干细胞，同时保持其发育潜能。因此，术语“干细胞”是指这样的细胞的任何子集：在特定情况下具有分化为更特化或分化的表型的发育潜能，并且在某些情况下保持增殖能力而基本上不分化。术语“成体干细胞”在本文中用于指衍生自非胚胎组织，包括胎儿、幼年和成人组织的任何干细胞。已从多种成体组织，包括血液、骨髓、脑、嗅上皮、皮肤、胰腺、骨骼肌和心肌中分离出天然体细胞干细胞。示例性的天然存在的成体干细胞包括但不限于间充质干细胞和造血干细胞。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞可以是胚胎干细胞。如本文所用，“胚胎干细胞”是指源自受精后但在妊娠结束前形成的组织的干细胞，包括胚胎前组织(例如胚泡)、胚胎组织或妊娠期间任何时间通常但不一定在妊娠约10-12周之前取得的胎儿组织。最常见的是，胚胎干细胞是来源于早期胚胎或胚泡的全能细胞。胚胎干细胞可以直接从合适的组织，包括但不限于人组织或从已建立的胚胎细胞系获得。
示例性干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、多能干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉干细胞、肌肉前体干细胞、内皮祖细胞、骨髓干细胞、软骨形成干细胞、淋巴干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、中枢神经系统干细胞、外周神经系统干细胞等。
如本文所用，“祖细胞”是指处于未分化或部分分化状态的细胞，并且具有分化成至少一种更分化的表型的发育潜能，且没有关于发育潜能的特定隐含意义(即，全能、多能、专能等)并且没有自我更新的属性。因此，术语“祖细胞”是指在特定情况下具有发育潜能以分化成更特化或分化的表型的任何细胞亚群。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞是多能干细胞。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞是全能干细胞。
术语“全能”是指可以在体内产生任何组织或细胞类型的干细胞。“多能”干细胞可以在体内产生除了生殖细胞外的任何类型的细胞。可以产生较小或有限数量的不同细胞类型的干细胞通常被称为“专能的”。因此，全能细胞分化成可以产生胎儿发育所必需的大多数但不是全部组织的多能细胞。多能细胞经历进一步分化成致力于产生具有特定功能的细胞的专能细胞。例如，专能造血干细胞产生血液中的红细胞、白细胞和血小板。
术语“多能”是指在不同条件下具有分化为所有三个生殖细胞层(即内胚层(例如，肠组织)、中胚层(例如，血液、肌肉和血管)和外胚层(例如，皮肤和神经细胞))特征的细胞类型的细胞的能力。多能细胞的特征主要在于使用例如裸鼠畸胎瘤形成测定法测定的它们分化成所有三个胚层的能力。多能性也通过胚胎干(ES)细胞标记物的表达证明，但是多能性的优选测定是证明分化成三个胚层中每一层的细胞的能力。
当用于提及“专能细胞”时，术语“专能”是指能够分化成来自所有三个胚层的一些细胞但不是所有细胞的细胞。因此，专能细胞是部分分化的细胞。专能细胞是本领域公知的，并且专能细胞的非限制性实例可包括成体干细胞，例如造血干细胞和神经干细胞。“专能”是指干细胞可以形成给定谱系中的许多类型的细胞，但不能形成其他谱系的细胞。例如，专能血液干细胞可以形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但它不能形成神经元。术语“专能性”是指具有小于全能和多能性的发育多样性程度的细胞。
术语“全能性”是指具有这样分化程度的细胞，其描述了制备成体体内所有细胞以及胚胎外组织(包括胎盘)的能力。众所周知，受精卵(受精卵)是全能的，早期裂解细胞(卵裂球)也是如此。
本文描述的方法中使用的细胞可以是不存在于组织中的细胞。如本文所用，“组织”是指在执行至少一种特定功能时联合的相似特化细胞的有组织的生物材料(例如，组、层或聚集体)。当细胞从有组织的超结构中移除，或以其他方式与体内存在的有组织的超结构分离时，它们不再存在于组织中。例如，当将血液样品分成两个或更多个不相同的部分，或者将脾脏切碎并用巴斯德吸管机械解离时，应理解细胞不再存在于组织中。在一些实施方案中，不存在于组织中的细胞是分离的细胞。当提及细胞时本文所用的术语“分离的”是指与在体内通常相连的另一组细胞机械或物理分离的细胞。任选地，可以在体外例如在其他细胞存在下培养分离的细胞。
可根据本发明实施的细胞疗法包括移植工程，例如，结合例如干细胞或器官移植；对细菌或病毒感染或癌症的免疫疗法，例如通过给予T细胞以通过细胞介导的免疫来治疗实体瘤(例如，肾细胞癌、乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌等)以及治疗白血病(如急性髓性白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病等)；治疗难治性自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮或系统性硬皮病、1型糖尿病、多发性硬化症；治疗传染病；组织再生(例如，治疗心肌梗塞、肝损伤或神经退行性疾病)；和诱导耐受(例如，与组织或器官移植联合使用，治疗自身免疫疾病等)。本发明的免疫治疗方法包括过继性细胞疗法(ACT)，其使用已经基因修饰(或工程化)在其细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞以允许T细胞识别折磨受试者的肿瘤细胞上的特定蛋白质细胞表面抗原，或者在其他实施方案中，允许T细胞识别对细菌或病毒感染特异性的细胞表面抗原。通常，在被设计成靶向在患病细胞上表达的细胞表面抗原(例如，通过特定癌细胞类型或被特定细菌或病毒感染的细胞)之后，CAR-T细胞在培养物中扩增直至它们总数达十亿(或更多)，之后可以将它们给予受试者。
磁浮细胞分离方法可包括富集和消耗程序。如果可以基于表面蛋白鉴定靶细胞，则可以将靶细胞富集至高纯度。在一些情况下，可以基于特定临床环境中的不需要的功能特征来鉴定非靶细胞。可以从细胞产物中除去这些非靶细胞，产生不同靶细胞的异质混合物。例如，通过本发明处理的用于移植工程的细胞产物可富集CD34和/或CD133或耗尽CD3、CD3和CD19、CD6、CD4和CD8、T细胞受体α/β(TCRα/β)或CD3/CD19/CD16/CD14，产生补充有其他免疫细胞例如自然杀伤(NK)细胞和树突细胞的富集干细胞制剂或干细胞。
在其他实施方案中，根据本发明制备的用于细胞治疗的细胞产物可以富集，例如CD14(单核细胞)、CD56(天然杀伤细胞)、CD335(NKp46、天然杀伤细胞)、CD4(T辅助细胞)、CD8(细胞毒性T细胞)、CD1c(BDCA-1、血液树突细胞亚群)、CD303(BDCA-2)、CD304(BDCA-4、血液树突细胞亚群)、NKp80(自然杀伤细胞、γ/ΔT细胞、效应/记忆T细胞)、“6B11”(Va24/Vb11；不变的自然杀伤T细胞)、CD137(活化的T细胞)、CD25(调节性T细胞)、或耗尽CD138(浆细胞)、CD4、CD8、CD19、CD25、CD45RA、CD45RO。在其他实施方案中，细胞群体如天然杀伤细胞、T细胞等可用作供体淋巴细胞输注方法中的效应细胞以耗尽病毒或细菌感染的细胞、肿瘤细胞等。细胞培养中由单核细胞产生或直接分离的树突细胞可用于例如“接种”患者以促进针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞、细菌和/或真菌的抗原特异性和天然免疫。
有利地，本发明允许制造通过可以在单一反应中针对两种或更多种不同的生物分子物种进行的磁性分离和浮力分离技术分选的细胞产物，从而避免对所需的细胞产物的潜在危害(例如，感染、污染、升高的温度)。代表性的两个参数分选应用包括产生高度富集的调节性T细胞(例如，细胞产物可首先耗尽CD8和/或CD19和/或CD49d并富集CD25)，高度富集的天然杀伤细胞(例如，CD3耗尽，CD56富集)和高度富集的血液树突细胞亚群(例如，CD19耗尽，CD1c富集)。
体外应用
除了治疗用途(如上文和本文其他地方所述)之外，本发明的磁浮方法和组合物还可以适用于许多体外诊断用途。过去已使用磁性颗粒来分离或富集真核细胞、细菌菌种、核酸和蛋白质。除了颗粒分离或细胞分离之外，磁性颗粒还被用于通过在颗粒表面上包被细胞活化配体来刺激或激活细胞，使得与溶液相激活方案相比更准确地再现靶参与的完整三维方面(通常在生物系统中很重要)。近年来，已经研究了磁性颗粒用于较新的体外试验。在磁性纳米颗粒的背景下，这种诊断用途的实例包括评估纳米磁性颗粒的潜在健康影响(Kevin,等人,Biosensors and Bioelectronics,43,88(2013))和用于递送si-RNA的基于纳米技术的系统潜在健康影响(Dim,等人,J.Nanobiotechnology,13,61(2015))。纳米颗粒还在用于应用的研究和开发测试中用作靶向加热组分，其可以开发用于治疗癌症的局部磁热疗条件(Makridis,et al.,Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.,63,663(2016))。
试剂盒
本发明的另一个目的是提供用于从生物或细胞样品(例如外周血、脐带血和/或骨髓)中分离、富集、回收和/或分开治疗上、诊断上或科学上有价值的细胞的组合物。此类组合物包括至少一种靶向磁性颗粒物种和至少一种靶向浮颗粒物种。这些组合物可以分开的或组合的。此类组合物可以是液体(例如，制备成溶液或悬浮液)或干燥(例如，作为冻干粉末，在使用前在合适的缓冲液中复原)形式。通常，这种组合物以试剂盒形式提供，每个试剂盒优选含有根据本文所述方法从含有细胞的样品中磁浮分离所需生物分子(例如特定细胞物种或类型)所必需的组分。
举例来说，根据本发明的“试剂盒”可以包括设置在其中的含有靶向目标第一生物分子物种的靶向纳米磁性颗粒物种的至少一个容器，和设置在其中的含有靶向目标第二生物分子物种的靶向浮微粒物种的另一个容器(第一生物分子物种和第二生物分子物种不同)。在一些实施方案中，靶向纳米磁性颗粒物种和靶向浮微粒物种设置在同一容器中。在其他实施方案中，试剂盒包含含有一种或多种不同靶向纳米磁性颗粒物种和/或靶向浮微粒物种的容器。根据本发明的试剂盒可以进一步包括包含以下中的一种或多种的其他容器：进行磁分离所必需的缓冲液、溶液或其他试剂和材料；和用于进行磁分离的容器(例如，离心管、柱等)。优选地，本发明的试剂盒还包括用于进行磁分离的说明书。如果用于诊断或治疗用途，此类试剂盒还可包括FDA批准的用途的通知及其说明书。
实施例
提供以下实施例以说明本发明的某些方面并帮助本领域技术人员实践。这些实施例决不以任何方式被认为是限制本发明的范围，并且本领域普通或更高技术人员将容易理解，本说明书彻底描述了本发明并且可以容易地应用以实施对象并获得所提到的目的和优点，以及其中固有的优点。
尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。此外，除非另有说明，否则实施例中描述的实验使用例如以下中的标准程序进行：Sambrook等人的分子克隆实验室手册(第三版)(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2001))；Davis等人的分子生物学的基本方法(Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1995))；细胞生物学实验室指南(CPCB)(Juan S.Bonifacino,et.al.ed.,John Wiley and Sons,Inc.)和动物细胞培养：R.Ian Freshney的基本技术手册(Publisher:Wiley-Liss)；动物细胞培养方法第五版(2005)(Methods in Cell Biology,Vol.57,Jennie P.Mather and DavidBarnes editors,Academic Press,1st edition,1998)，它们全部通过引用整体并入本文。
1.硅烷化BSA/葡萄聚糖包覆的纳米磁性颗粒的合成
该实施例描述了合成用于本发明的硅烷化BSA/葡萄聚糖包被的纳米磁性颗粒的优选方法。该合成分三个阶段进行，首先包括裸(未包被的)磁铁矿超级团簇的合成，然后对这些超级团簇进行硅烷化，最后使用BSA/葡萄聚糖的混合物进行蛋白质/聚合物包被步骤。
简而言之，将5.02g硫酸亚铁和7.22g硫酸铁(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)分别溶解在25mL脱气去离子水中，然后加入到含有250mL70℃脱气去离子水的反应容器中，持续搅拌。接下来，将35mL的10M氢氧化铵(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)以9mL/分钟的速率添加到反应烧瓶中，并使磁铁矿超级团簇的形成进行30分钟。然后使用内置陶瓷低梯度磁力分离器(LGMS)用去离子水彻底洗涤沉淀物，最后在氮气盖中在脱气的去离子水中储存。这些磁铁矿超级团簇通常具有通过动态光散射(Malvern Nano-S ZetaSizer；Westborough，MA)测量的2至3μm的流体动力学直径。
接下来，借助于VCX750超声波处理器(Sonics&amp；Materials Inc，Newtown，CT)，使用冷却的夹套反应烧杯，在100mL体积的低离子强度磷酸盐缓冲液(ACS级磷酸二氢钠，分子量为137.99g/mol)中超声处理1.65g磁铁矿超级团簇至～110nm的最终尺寸，然后立即转移到包含于硅油浴中的反应烧瓶中。接下来，将2.5mL的66mg/mL的硅酸钠(SiO2-)溶液(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)以0.5mL/分钟的速率添加到反应烧瓶中，然后用～8mL的0.5M乙酸酸化，以1mL/分钟添加至最终pH值为6.0。然后将油浴的温度升至170℃并使颗粒悬浮液脱水约3小时，以促进纳米磁性颗粒的表面硅烷化。冷却至室温后，将颗粒悬浮液置于LGMS磁力分离器中30分钟，回收磁性球状颗粒，并用低离子强度HEPES缓冲液(VWR，Visalia，CA)彻底洗涤。这些硅烷化或SiO2衍生的磁铁矿簇通常具有约200nm的流体动力学尺寸，并且在强酸中比其非硅烷化形式溶解得慢得多(参见下表1)。
为了制备BSA/葡萄聚糖包被的纳米磁性颗粒，借助于VCX750超声波处理器(Sonics&amp；Materials Inc.；Newtown，CT)，使用冷却的夹套反应烧杯，在135mL体积的低离子强度磷酸盐缓冲液中超声处理1.4g硅烷化磁铁矿簇至最终尺寸～100nm，然后立即转移至恒温70℃的1L夹套反应瓶中，该夹套反应瓶中含有400mL的20mg/mL BSA(LampireBiologicals；Pipersville，PA)和0.2mg/mL葡萄聚糖(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)的混合物。使该包被反应在70℃进行30分钟。然后将包被的纳米磁性颗粒冷却至室温并在4℃静置过夜。
接下来，借助于保持在容器底部的低场陶瓷磁体将颗粒从容器中缓慢倾析，以沉淀掉大尺寸(～300nm)的颗粒聚集体。然后收集的上清液(直径约100nm)在低离子强度HEPES缓冲液(VWR；Visalia，CA)中经受7个循环的高场磁性洗涤。除去除过量的反应物之外，这些高场洗涤还用于将粒度分布显著缩小至≤0.1PDI的值。最终的流体动力学粒度通常为约115nm。从1.65g磁铁矿超级团簇开始的总收率通常为至少50％。第一高场磁性洗涤上清液，通常具有约70nm的流体动力学粒度并占总颗粒产率的约35％，作为副产物被收集并且可用于产生用作体内/体外跟踪/捕获标记以及用于与HGMS柱配合的磁性细胞分离的更小尺寸(<100nm)的纳米磁性颗粒产品(参见下文实施例3)。
最后，可以使用对于本领域技术人员来说熟悉的标准的异/双功能偶联化学品将生物亲和配体对的成员如链霉亲和素、抗体或其他所需的配体与这些BSA/葡萄聚糖包覆的纳米磁性颗粒上存在的足够的BSA衍生的官能团共价偶联。
2.通过胶溶作用和其他类型的硅烷化剂合成纳米磁性颗粒
电解质例如更常见地被称为螯合剂的EDTA、EGTA以及弱碱和酸在它们有助于将沉淀物分散到胶体溶胶中的情况下被称为胶溶剂。在该实施例中，在如上述实施例1中那样形成磁铁矿超级团簇之后，立即加入(以0.25摩尔EGTA/摩尔铁)作为强铁螯合剂的EGTA(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)。在如上述实施例1那样洗涤磁铁矿超级团簇之前，使该螯合步骤在70℃进行1小时。与～2.5μm尺寸的起始磁性超级团簇不同，这些EGTA胶溶磁铁矿簇通常具有约1μm的流体动力学直径，这种尺寸减小表示磁铁矿超级团簇的成功分散。
在另一个实施方案中，使用顺序硅烷化方法，其中EGTA胶溶磁铁矿超级团簇如上述实施例1中所述进行超声处理和硅烷化，并且在加入硅酸钠溶液后立即添加等摩尔量的氨基官能化硅烷化剂氨丙基三甲氧基硅烷或APS(SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)并在酸化至pH6.0后使颗粒在160℃下脱水90分钟。仅使用APS代替如上述实施例1中的硅酸钠也实现了硅烷化，并且脱水步骤允许在160℃进行75分钟。
另一种硅烷化试剂羟甲基三乙氧基硅烷(Gelest，Morrisville，PA)是非常亲水的，并且还已成功地用于生产可用于本发明背景的硅烷化纳米磁性颗粒。在这种特殊情况下，使用15wt％的该硅烷化剂(相对于铁含量)并使脱水在160℃进行2小时。
如上述实施例1中所述，所有上述硅烷化磁性颗粒已成功地用BSA/葡萄聚糖混合物包被。这些类型的硅烷化纳米磁性颗粒，当用BSA/葡萄聚糖混合物包封时，在暴露于4MHCL 15分钟后，通常在实施例1中显示。简而言之，为了进行溶解，将100uL 0.1mg/mL(以铁含量计)的颗粒悬浮液与200uL的6M盐酸一起温育，并以不同的时间间隔取出该混合物的等分试样并通过与硫氰酸钾络合作为比色终点读数测定元素(或溶解的)铁的存在。下表1显示了所有这些上述硅烷化磁铁矿簇的酸溶解行为。
表1：氧化铁的溶解百分比随各种硅烷化磁铁矿簇的酸暴露时间的变化
上表1中的数据表明，本文所述的硅烷化方法确实提供了防止酸溶解的保护，并且还用于在磁性颗粒的表面上提供高度交联的硅烷分子。例如，在15分钟的时间点，与硅烷化磁铁矿簇只有50％至70％相比，90％的(裸)磁铁矿超级团簇被酸溶解。
图1显示了在超声波处理之前和超声波处理之后对硅烷化纳米磁性颗粒进行的酸溶解研究的结果。该研究表明，在第二轮如上述实施例1中所述高功率超声处理之后，硅烷(玻璃)涂层在纳米磁性颗粒表面上保持完整。
在没有初级玻璃涂层的情况下产生的纳米磁性颗粒通常在诸如血浆和全血的生物流体中不稳定，而且，即使在低离子强度的溶液中它们也易于聚集。与其他磁性纳米颗粒相比，由本文所述的硅烷化方法提供的这种保护功能(例如，稳定性、降低的聚集)显著地有助于本专利中要求保护的靶向纳米磁性颗粒在生物研究工作中的实际应用。
3. 70nm BSA/葡萄聚糖包被的硅烷化纳米磁性颗粒副产物的衍生、处理和细胞标 记功效
首先使用填充有小的铁磁珠以除去过量的包被试剂的市售HGMS'XS'柱(目录#130-041-202；Miltenyi Biotec，San Diego，CA)对上述来自实施例1的第一高场磁洗涤上清液进行HGMS纯化，第一高场磁洗涤上清液中磁性颗粒具有约70nm的流体动力学尺寸。将'XS'柱定位在通过将2英寸×1英寸×0.25英寸厚的“北”面和相同尺寸的“南”面磁体彼此相对放置而形成的均匀磁场中。'XS'柱/磁性组件连接到蠕动泵以促进纳米磁性颗粒的快速自动化处理。
将30mL(12.5mg铁)的第一高场磁洗涤上清液HGMS纯化至低离子强度HEPES pH7.5缓冲液中。在从均匀磁场中除去'XS'柱并用3mL HEPES pH7.5缓冲液重悬后，基于铁含量回收约90％的颗粒。这些HGMS纯化的纳米磁性颗粒具有73nm的流体动力学直径，然后使用异双功能偶联化学品将其与大鼠抗小鼠CD4抗体(目录号100506；BioLegend Inc.，SanDiego，CA)偶联。简言之，用SMCC交联剂(目录号S1534；ThermoFisher Scientific，SanDiego，CA)活化HGMS纯化的73nm BSA/葡萄聚糖包覆的纳米磁性颗粒，并将其与已经使用2-亚氨基硫烷(目录#26101；ThermoFisher Scientific，San Diego，CA)硫醇化的大鼠抗小鼠CD4抗体偶联。测得这些抗体-偶联的纳米磁性颗粒的最终流体动力学尺寸为83nm。虽然没有彻底优化，当该偶联颗粒与'MS'型HGMS柱(目录号130-042-201；Miltenyi Biotec Inc.，Auburn，CA)一起用于靶向来自脾细胞悬浮液的小鼠CD4+细胞时，获得通过流式细胞术使用适当的荧光标记的抗体(FACSCalibur with CellQuest software；BD Biosciences，SanDiego，CA)测量的超过90％的纯度和产率。
这些结果表明，与本文其他地方描述的较大颗粒相比，这些较小颗粒也可以被有效地偶联并用于分离生物材料。
4.链霉亲和素偶联的纳米磁性颗粒的胶体稳定性
根据以上实施例1制备的115nm直径的BSA/葡萄聚糖包覆的纳米磁性颗粒按照上述实施例3中所述的方法共价偶联至链霉亲和素，以产生135nm直径的链霉亲和素偶联的纳米磁性颗粒。在将纳米颗粒重悬浮并在室温储存在高离子强度溶液(1M NaCl)中后，在不同时间点进行粒度测量。对正常储存缓冲液中的相同纳米颗粒进行对照尺寸测量，所述缓冲液是补充有BSA和叠氮化钠的低离子强度缓冲液。下表2显示了该研究的结果。该研究表明本发明的纳米磁性颗粒具有显著的抗聚集性和增强的胶体稳定性。
表2：1M氯化钠中的粒度稳定性
存储溶液 粒度@0小时 粒度@1小时 粒度@72小时
正常存储缓冲液 135nm 137nm 137nm
1M氯化钠 139nm 139nm 140nm
5.纳米磁性颗粒的磁性分离效率
图2显示了各种纳米磁性颗粒的磁性分离效率，该颗粒包括113nm直径的BSA/葡萄聚糖包被的颗粒，127nm抗体-偶联颗粒和130nm链霉亲和素-偶联颗粒，后两种使用以上实施例3中描述的方法偶联。该研究使用如美国专利No.5,186,827中制造并设计符合标准12mm×75mm一次性实验室试管的四极磁分离器进行，试管具有含有生理缓冲液如等渗磷酸盐缓冲盐水溶液中的25ug/mL铁的稀释的纳米磁性颗粒悬浮液。用于与试管一起使用的类似强磁分离器可从StemCell Technologies(Part#18000；Vancouver，British Columbia，Canada)获得。图2显示所有这些上述纳米磁性颗粒在短短几分钟内快速且定量地分离。
还测试了具有测量的流体动力学直径为82nm的抗体偶联的市售微珠(目录号130-049-201；Miltenyi Biotec Inc.，Auburn，CA)在四极磁分离器中的磁性分离效率，结果显示于图3。如图3所示，这些82nm微珠在本实施例中的上述四极磁分离器中根本没有定量分离。反而，在30分钟之后，只有约40％的磁性颗粒可以分离。这些结果表明，这些类型的微珠仅适用于基于HGMS柱的磁性分离方法。然而，纳米磁性颗粒适用于基于外场(偶极、三极、四极、六极型)以及内场(HGMS)的磁性分离器中的定量磁性颗粒分离。
就纳米磁性颗粒的实际应用而言，该性质代表了显著的区别，因为对本发明人来说，目前还不知道其他磁性颗粒在内部类型的磁性分离器和外部类型的磁分离器中起作用。
6.纳米磁性颗粒与哺乳动物细胞的非特异性结合
下表3显示了根据以上实施例1在6个月时间内合成的不同批次的BSA/葡萄聚糖包覆的纳米磁性颗粒的非特异性结合(NSB)。在该研究中，将小鼠脾细胞(每管1×107个总细胞)在4℃下与相对大量的纳米磁性颗粒(约2000个颗粒/细胞或每个样品2×1010个颗粒总数)一起温育20分钟。然后借助四极磁力分离器使用仅5分钟的磁性分离时间将细胞/纳米磁性颗粒反应混合物磁力洗涤两次。
洗涤步骤如下进行：用等渗PBS/BSA/EDTA缓冲液(5×磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.2，2.5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和10mM EDTA)将细胞悬浮液稀释至总体积4mL并将管置于四极磁性分离器中5分钟。然后通过轻微倒置磁力分离器或借助巴斯德吸管吸出上清液。然后取出管，再用4mL等渗缓冲液重新悬浮其内容物，放回磁力分离器中再分离5分钟。第二次吸出后，将细胞离心，用少量等渗缓冲液重悬细胞沉淀，然后分析非特异性收集的细胞的存在。然后将磁性收集的细胞离心一次(以300×g离心5分钟)以除去过量或游离的纳米磁性颗粒。然后使用自动细胞计数器(Cellometered using an Nexcelom Bioscience,Lawrence,MA)计数磁性收集的细胞的数量，与起始细胞数一起，使得能够计算被磁性选择的细胞的百分比(称为非特异性结合)。注意，2×1010个颗粒相当于约40μg铁的质量。更典型地，为了以高纯度和高产率有效分离细胞，对于含有1×107个总细胞的样品，仅需要添加约10μg至20μg的纳米磁性颗粒(依据铁重量)。
也使用高梯度磁性分离(HGMS)柱(Part#130-042-201；MS-Columns；MiltenyiBiotec Inc.，Auburn，CA)代替试管四极磁性分离器重复这些非特异性结合实验(见下表3)。由于在这种HGMS柱分离器中产生非常高的磁场梯度，纳米磁性颗粒与细胞的比率急剧减少到每个细胞约20个颗粒，或每个样品约2×108个颗粒。发现10：1至50：1的颗粒与细胞比率提供了最佳的靶细胞产量和纯度(参见下表5和6)。
用常用的标准细胞相容缓冲液(PBS)进行这些研究，所述缓冲液补充有0.5wt％BSA、2mM EDTA和0.1wt％酪蛋白并调节至pH 7.2。
表3
上述表3中的结果表明，这种纳米磁性颗粒的非特异性结合(NSB)极低，使得可以达到高达约99％的靶细胞纯度。大多数(如果不是全部)目前可用的商业磁性颗粒不能达到如此低水平的NSB。
7.与HGMS分离器相比，使用四极磁性分离器的哺乳动物细胞的特异性结合和捕获
下表4显示了127nm直径的大鼠抗小鼠CD4抗体(克隆RM4-5；目录号100506；BioLegend Inc.，San Diego，CA)偶联的纳米磁性颗粒(如上实施例3中所述制备的)与小鼠脾细胞的滴定结果。使用500：1至1500：1的颗粒与细胞比率进行该滴定。使用的方案基本上与上述实施例6中所述的方案相同，不同之处在于在除去过量的纳米磁性颗粒后，进行与适当的荧光染料偶联的抗体的额外孵育(用于表型检测目的)并且在流式细胞仪上分析细胞(FACSCalibur with CellQuest software；BD Biosciences，San Diego，CA)以测定磁选细胞的纯度百分比。
表4
颗粒与细胞比率 ％纯度 ％产量
500：1 93.0 91.2
750：1 91.6 90.2
1000：1 92.6 92.9
1200：1 92.1 95.1
1500：1 89.3 90.7
该研究清楚地说明了本发明的纳米磁性颗粒用于以高产率和高纯度分离目标靶细胞以供进一步问诊的生物医学用途。
下表5显示了使用相同的127nm直径大鼠抗小鼠CD4抗体偶联的纳米磁性颗粒与小鼠脾细胞进行的类似滴定研究的结果。然而，在该研究中，HGMS柱用于执行磁洗步骤。如前所述(在上述实施例6中)，在该基于HGMS的研究中使用较低的颗粒与细胞比率，5：1至50：1。
下表6显示了使用HGMS柱但使用129nm直径的大鼠抗小鼠CD19抗体(克隆6D5；目录号115502；BioLegend Inc.，San Diego，CA92121)偶联纳米磁性颗粒(如上述实施例3中所述制备的)进行的类似滴定研究的结果，以证明本发明的纳米磁性颗粒在基于HGMS的细胞分离方案中的多功能性。
对于在相对较宽的颗粒与细胞比率范围内磁性(纯化的)捕获的靶细胞的纯度和产率，这两项研究均产生了极好的结果。
市售磁性颗粒被测量具有170nm的流体动力学直径，并如本实施例中所述的被滴定，结果如下表7所示。
表7
这种市售的磁性颗粒没有表现出足够宽的颗粒与细胞使用比以便可以获得可靠和可重复的结果，因此表明这种常规磁性颗粒与使用HGMS型磁性分离方法不兼容。用这些磁性颗粒滴定后产率的快速损失很可能是由于相对大尺寸的磁性颗粒被截留在HGMS柱中的金属(或铁磁)基质中，导致保留在去磁化HGMS柱上的磁性标记细胞的低效回收。如本领域技术人员所理解的，这种常规磁性颗粒实际上只能与强外磁场磁性分离器例如上述研究中使用的四极型磁性分离器一起使用。
8.根据上述实施例1和实施例3制备的纳米磁性颗粒的稳定性
为了评估上述纳米磁性颗粒的长期稳定性，根据上述实施例1和实施例3制备链霉亲和素偶联的颗粒和大鼠抗小鼠CD19抗体偶联的颗粒。然后将这些颗粒的多个小等分试样在三个不同温度(40℃、25℃和37℃)储存，并在两个月的过程中在不同时间点进行磁性细胞分离试验，以监测这些纳米磁性颗粒的总体生物稳定性。Biolegend公司MojoSortTM小鼠CD4T细胞分离试剂盒(目录号480005)是一种阴性选择试验，它使用链霉亲和素纳米磁性颗粒与生物素化抗体混合物，以磁性选择所有CD4阴性细胞。另外，BioLegend MojoSortTMBuffer和MojoSortTMMagnet用于执行本实施例中描述的细胞选择方案。来自磁性分离步骤的“未接触”细胞或上清液含有所需的CD4阳性细胞。然后在流式细胞仪(FACSCalibur withCellQuest software；BD Biosciences，San Diego，CA)上分析这些“未接触”的细胞，以确定靶向CD4阳性细胞的纯度和产率。还使用BioLegend DieMojoSortTM小鼠CD19纳米珠(BioLegend，目录号480001)进行类似的分析，该小鼠CD19纳米珠是用于正选择CD19阳性细胞的大鼠抗小鼠CD19抗体偶联的纳米磁性颗粒。
图4和图5分别显示了使用在不同温度储存并在两个月的时间内测试细胞分离性能的链霉亲和素纳米磁性颗粒和适当的生物素化抗体负选择的CD4阳性细胞的纯度和产率。
类似地，图6和图7分别显示了在不同温度储存并在两个月的时间内测试细胞分离性能的大鼠抗小鼠CD19抗体偶联的纳米磁性颗粒的纯度和产率。注意，使用称为CD45R/B220(目录号103223；BioLegend Inc.，San Diego，CA)的非交叉反应荧光标记的B细胞特异性抗体来鉴定磁性选择的B细胞。
这些稳定性研究的结果清楚地证明了这种纳米磁性颗粒的优异生物稳定性。这些研究中使用的两组纳米磁性颗粒在37℃的高温具有至少30天或更长的生物稳定性，这可以外推为在40℃超过4年的生物稳定性，该事实可归因于纳米磁性颗粒组成和合成设计。相反，据报道，尺寸为80nm至1000nm的常规磁性颗粒即使在4℃冷藏时也具有几个月至约20个月的保质期或生物稳定性。因此，传统的磁性颗粒不太优选，但仍可用于本文所述的磁浮分离的各种实施方案中。
9.粒度分布的比较
测量在靶细胞分离市场中高度利用的各种常规市售磁性颗粒的粒度分布，并与使用上述实施例1制备的那些磁性颗粒进行比较。这些测量使用动态光散射(Malvern Nano-SZetaSizer；Westborough，MA)进行，并且将各种“尺寸直方”中的颗粒百分比绘制为实际粒度的函数，如图8所示。在Malvern Nano-S ZetaSizer仪器上测量流体动力学直径，该仪器使用“动态光散射”原理，从而用激光照射颗粒并分析散射光的强度波动。纳米磁性颗粒(图8中标记为“BioLegend”)具有约130nm的流体动力学直径和相对不显著数量的直径大于约300nm的颗粒(以使磁性颗粒在基于外场的磁性分离器和基于内场的磁性分离器中均表现良好的一个重要标准)。注意，图8中标记为“常规颗粒A'”的颗粒具有约82nm的流体动力学直径，因此仅适用于“内场”产生或HGMS柱(还参见上述图3)。
10.使用HGMS选择的细胞的透射电子显微镜检查
在该研究中，使用商业HGMS兼容的磁性颗粒(图9A)和本发明的靶向纳米磁性颗粒(图9B)，通过HGMS磁性选择细胞。使用磁选细胞的55nm冷冻切片并在透射电子显微镜上成像产生图9中所示的代表性电子显微照片。使用MojoSortred light anaNanobeads(BioLegend，CA)和商业小鼠CD19MicroBeads(Miltenyi，Germany)，然后使用BioLegend和Miltenyi推荐的方案，制备来自C57BL/6小鼠脾的单细胞悬浮液以分离CD19+B细胞。通过用CD45R/B220(克隆RA3-6B2)PE染色所得细胞并通过流式细胞术分析来鉴定分离的CD19细胞纯度(BioLegend，97％；Miltenyi，94.9％)。然后将细胞离心，将细胞沉淀重悬于改良的Karnovsky's固定剂(0.15M二甲胂酸钠缓冲液中2.5％戊二醛和2％多聚甲醛，pH7.4)中4小时。然后，制剂在0.15％二甲胂酸盐缓冲液中的1％四氧化锇中后固定1小时，并在2％乙酸双氧铀中整体染色1小时。然后将样品在乙醇中脱水，包埋在Durcupan环氧树脂(Sigma-Aldrich)中，在Leica UCT超薄切片机上以50-60nm切片，并在聚醋酸甲基乙烯脂和碳包被的铜网上拾取。切片用2％乙酸铀酰染色5分钟，佐藤铅染色1分钟。然后在JEOL 1200EX II(JEOL，Peabody，MA)透射电子显微镜上观察网格，并使用Gatan数码相机(Gatan，Pleasanton，CA)拍摄，或使用配备有Eagle 4k HS数码相机(FEI，Hilsboro，OR)的TecnaiG2Spirit BioTWIN透射电子显微镜观察。
类似地，在来自每种样品类型的40个图像中观察到与常规标记的磁性颗粒相比较少量的靶向纳米磁性颗粒。这些电子显微照片清楚地表明，与显示由常规标记的磁性颗粒结合的细胞的显微照片相比，靶向纳米磁性颗粒与靶细胞结合的数量要少得多。这些显微照片中的箭头标记了可视化磁性颗粒在这些细胞表面上的位置。这(用每个细胞非常少的纳米磁性颗粒介导磁性分离的能力)是靶向纳米磁性颗粒的一个非常重要的属性，因为这种磁性选择的细胞基本上处于“原生”或“未改变的”状态，如果有的话，很少细胞的扰动。这允许细胞以生物学上完整并响应的状态被捕获(参见实施例12)。
11.纳米磁颗粒冻干研究
分别根据以上实施例3和4制备的小鼠抗CD19偶联纳米珠(2×108个总颗粒)和SAv偶联纳米珠(2×108个总颗粒)悬浮在各种补充的溶液中，并经受Genesis Pilot冷冻干燥机(SP Scientific)上的3天的冻干(Lyo)循环。具体地，将包含在硅烷化玻璃小瓶中的颗粒悬浮液冷冻至-46℃，然后冷却至-80℃3小时，回到-46℃并在密封的真空室中保持3天。此后，将温度升至22℃。然后用PBS重构冻干的纳米磁性颗粒，并使用MojoSort TM小鼠CD19Nanobeads(BioLegend Inc.，San Diego，CA；目录号480001)和MojoSort TM小鼠CD4 T细胞分离试剂盒(BioLegend Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥；目录#480005)测试性能。结果分别如下表8和表9所示。
表8：通过使用重构的冻干(lyo)CD19纳米珠的小鼠CD19阳性选择纯度和产量
颗粒 纯度(％) 产量(％)
非冻干6D5颗粒(对照) 97.7 82
储存缓冲液(Lyo)中的6D5纳米珠 97.1 72
在1％BSA(Lyo)中 96.9 88
在1％右旋糖酐(Lyo)中 96.9 88.2
在2％蔗糖(Lyo)中 97 89.2
在1％葡萄聚糖+1％蔗糖(Lyo)中 96.7 90.8
表9：通过使用重构的冻干(lyo)SAv颗粒的小鼠CD4阴性选择纯度和产量
颗粒 纯度(％) 产量(％)
非冻干SAv(对照) 95.4 90.0
在1％BSA(Lyo) 92.8 92.9
1％右旋糖酐(Lyo) 96 88.1
在2％蔗糖(Lyo) 96 87.0
在1％葡萄聚糖+1％蔗糖(Lyo) 96.2 87.6
这些冻干和重构的纳米磁珠显示出优异的生物活性保留，表明冻干有助于延长靶向纳米磁珠的储存/稳定性很长一段时间。
12.磁选细胞的功能研究
磁选细胞通常用于下游加工，例如基因/蛋白质/RNA分析；然而，许多(如果不是大多数)商业上可获得的磁性颗粒对细胞具有毒性作用。因此，获得具有附着的磁性颗粒的活细胞或有生活力的细胞进行进一步研究/探测是非常具有挑战性的。在本研究中，在靶CD4+细胞被磁性分离后，并行测试与抗小鼠CD4抗原的抗体偶联的靶向纳米磁性颗粒物种和广泛使用的市售磁性颗粒物种的细胞功能性。
简而言之，使用HGMS柱(目录号130-042-201；Miltenyi Biotec Inc.，Auburn，CA)测试大鼠抗小鼠CD4抗体(克隆RM4-5；目录号100506；BioLegend Inc.，San Diego，CA)偶联的纳米磁性颗粒(如上述实施例3中所述制备)以及抗CD4偶联微珠一起(克隆L3T4，目录号130-049-201；Miltenyi Biotec Inc.，Auburn，CA)。本发明的抗CD4-偶联纳米磁性颗粒的流体动力学直径为127nm，而L3T4-偶联微珠的流体动力学直径为82nm。下表10显示了当用于根据制造商的说明书从小鼠脾脏中分离CD4+细胞时，来自两种类型的这些磁性颗粒的分离的CD4+细胞的纯度和产率。
表10
使用的纳米磁性颗粒的类型 ％纯度 ％产量
BioLegend抗CD4纳米珠 92.4 65
MACS抗CD4微珠 91.5 67
在磁性分离CD4+细胞后，将来自两种分离方法的等量CD4+细胞(1×106个细胞)以不同浓度接种到包被有小鼠抗CD3(克隆17A2；目录#100201；BioLegend Inc.，San Diego，CA)抗体并补充有1μg/mL可溶性小鼠抗CD28(克隆37.51；目录号102101；BioLegend Inc.，San Diego，CA)的96孔微量培养板中，并在37℃培养3天。接下来，以10％体积比向孔中加入测量活细胞的代谢活性的荧光氧化还原标记刃天青(目录#TOX8-1KT；SIGMA-ALDRICH；St.Louis，MO)的溶液，并且在孵育7小时后使用SPECTRAmax Gemini XPS荧光酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测量相对荧光强度。图10中显示了相对荧光单位(RFU)相对于用于包覆微孔的抗小鼠CD3抗体浓度的图。注意，在图10中，荧光强度越高，活细胞数越高。
该功能细胞测定的结果清楚地证明纳米磁性颗粒对磁选细胞没有显著的毒理学作用，即使这种纳米磁性颗粒大于测试的商业磁性微珠。
13.微泡与纳米磁珠结合用于细胞分离
微尺寸漂浮气泡是可商购获得的中空的(或空气或特定气体填充的)微米尺寸的球体，其具有用于靶向目标部分的官能化表面或包被的配体。可与细胞特异性配体(例如，细胞抗原特异性抗体)偶联并用于分离特定细胞群体的市售实例包括以前可从Targeson(San Diego，CA)获得的充气磷脂微泡和来自Akadeum的玻璃浮微泡。研究文献中描述的实例包括Shi等人，Methods,64,102(2013)的全氟化碳微泡、Hsu等人，Technology(SingaporeWorld Science)，3,38(2014)的玻璃微泡、Liou等人，PLoS One,20,10(2015)的白蛋白微泡和Shi等人，PLoS One,8,1(2013)的气体填充的免疫微泡。描述使用基于微泡的系统分离分析物或细胞的专利文献的实例包括美国专利和公开的专利申请号5,116,724、5,246,829、8,835,186、US 20030104359、US 20070036722和US 20110236884。这些例子说明了使用基于浮力的系统来特异性分离靶细胞和分析物的价值。然而，在本发明之前，没有人将基于浮力的系统与磁性颗粒组合以提供所需的生物分子靶标(例如，特定细胞类型)或多个靶标的更快、更有效、实际地的富集和分离。
在该实施例中，描述了一种独特的方法，其中任何组合物的靶向微泡和任何组合物的靶向纳米磁性颗粒可以顺序和/或同时使用以比单独使用磁性颗粒或微泡技术更快地和/或高纯度地获得一个、两个或三个目标细胞群体。磁性分离和浮力分离或“磁浮”程序的组合将允许非常有效地实现困难的分离。这种细胞分离的“磁浮”方法显著减少了分离不同目标细胞所需的时间和资源，并且可以以非常高的纯度获得群体。靶向磁性纳米颗粒，由于它们在各种流体中具有高稳定性、小尺寸、更高的磁响应性能、与其他磁性颗粒相比以更低的颗粒与细胞比率分离细胞的能力以及与其他磁性颗粒相比更快且更完全地响应磁场的能力，特别适合于这种应用。这些优点以前没有实现和/或商业化。图11说明了分离两个不同群体的一般原理，图12说明了分离三个不同群体的相同的一般原理。
考虑图11，如果含有两个(A和B)所需或想要的亚群的不同细胞类型(A、B、C、D)的混合物在反应混合物中与靶向一种所需细胞类型的微泡(A)并且与靶向第二所需类型(B)的磁性颗粒组合，然后允许第一组细胞(A)漂浮到表面，而第二组细胞(B)被吸引到强磁场(例如上述实施例5中所述的四极磁分离器)，这使得被磁化的靶细胞以与微泡靶细胞的悬浮方向成直角的角度被分离。以这种方式，两个细胞群体可以从相同的初始反应混合物中在单个分离步骤后被分离，并且可以被单独收获以进一步使用。在该简单实例中，可能需要两种不同的细胞群体(A和B)以供进一步使用，并且可以容易地收获它们。或者，一个群体可以是被丢弃的不需要的细胞，例如，意图将它们作为第二分离群体的潜在污染物去除。
考虑图12，如果需要，也可以收获第三个“剩余”群体(在该实施例中，细胞类型C和D)，即那些不被微泡或磁性颗粒靶向的群体，以供进一步使用，因为当收获两个靶群体(A和B)时，该群体也可以单独保留。例如，在组合的浮微泡标记、磁性纳米颗粒标记和沉降步骤之后，可以通过移液、倾倒或抽吸收获漂浮的细胞，接着去除剩余的细胞缓冲液并收获沉淀的群体(C和D)，接着在新鲜细胞缓冲液中从管壁释放和收获磁性群体(B)。在单个标记和制备步骤后，该程序将产生三个富集群体。
作为显示微泡可以有效富集和分离细胞群体的背景信息，提供了两个实例来说明微泡如何能够单独从不同来源的复杂混合物中飘浮细胞群体。图13说明了仅使用与抗小鼠CD19抗体偶联的微泡漂浮并阳性分离所需细胞群体小鼠CD19+细胞的一般原理。在该实施例中，将与链霉亲和素磷脂微泡偶联的生物素化大鼠抗小鼠CD19(克隆6D5；目录号115503；BioLegend Inc.，San Diego，CA)与小鼠脾细胞在4℃在旋转器上的小eppendorf管中孵育15分钟(参见图13中的(a))。然后将细胞悬浮液转移到试管中，用等渗细胞缓冲液稀释至总体积为4mL，并以300×g离心5分钟(参见图13中的(b))。将漂浮的细胞轻轻地倾倒或吸出并转移到新的试管(c)中。然后通过转移到微量注射器并通过注射器柱塞施加温和压力使通过与CD19结合的抗体附着于细胞的磷脂微泡破裂。微泡的破坏消除了漂浮特性并允许用于流式细胞术分析的随后细胞染色。然后用荧光CD45R/B220抗体偶联物(藻红蛋白偶联的大鼠抗小鼠/人CD45R/B220；目录号103207；BioLegend Inc.，San Diego，CA)染色细胞，并在流式细胞仪(FACSCalibur with CellQuest software；BD Biosciences，San Diego，CA)上分析收集的细胞。下表11显示了使用这种抗体偶联的微泡获得的小鼠CD19+靶细胞的纯度和产率。这表明在收获的漂浮群体中CD19+群体的近两倍富集，从55％的纯CD19+细胞富集到接近99％的纯CD19+细胞。
表11
预分离 分离后
纯度 55％ 98.6％
产量 100％ 92.4％
在仅使用微泡的第二个实施例中，微泡用于漂浮并从样品中消除不需要的细胞，使得剩余的非漂浮群包含所需细胞的富集部分。图14说明了在使用附着在微泡上的不同抗体的混合物漂浮大部分不需要的细胞类型(A和B)，使得也可以通过标准沉淀技术收获的所需细胞(D)被富集在非漂浮细胞群体中的情况下所使用的一般原理。根据BioLegend的“制备小鼠和大鼠组织单细胞悬液”标准操作程序，制备来自C57BL/6小鼠的骨髓悬浮液。细胞被悬浮至1×108/ml并将100μl细胞转移到1.5ml Eppendorf管中。然后将细胞与10μlMojoSortTM小鼠造血祖细胞分离混合物(BioLegend，目录号480004)在冰上孵育15分钟，以用生物素化抗体靶向大多数非造血祖细胞，然后进行两次洗涤以除去额外的生物素化抗体。小鼠造血祖细胞分离混合物含有识别小鼠骨髓细胞(不需要的细胞类型)、不是小鼠造血祖细胞(想要的细胞)上的几个靶标的抗体。用100μl PBS重悬细胞沉淀，并将管保持在45°角，将1×107链霉亲和素微泡(Akadeum Life Science，Ann Arbor，MI，目录号SA01)缓慢加入管中并轻轻研磨1分钟，然后在室温下360°旋转另外10分钟。然后将细胞-微泡混合物转移到15ml管中，加入PBS至14ml，然后以300×g离心5分钟。通过该程序，“非造血祖细胞”细胞将上升，所需的造血祖细胞将形成沉淀。吸出漂浮细胞和培养基后，将细胞沉淀用100μl PBS重悬，并与1μl的PE抗小鼠Ly-6A/E(Sca-1)(克隆D7)(BioLegend，San Diego，CA，目录号#108108)和APC抗小鼠CD117(c-Kit)(克隆2B8)(BioLegend，San Diego，CA，目录号105812)一起孵育，根据BioLegend“小鼠和大鼠白细胞的直接标准染色”标准操作程序来标记造血干细胞。然后根据BioLegend细胞采集标准操作程序通过流式细胞术(具有CellQuest软件的FACSCalibur；BD Bioscience，San Diego，CA)分析细胞，并用FlowJo分析软件(FlowJo，LLC，Ashland，OR)分析数据。典型的流式细胞术结果显示在图14的底部，其中细胞图的象限2(Q2)显示在用多抗体偶联的微泡预富集之前或之后群体中CD117+/Sca-1+细胞的频率。为了比较，还进行了使用磁性纳米颗粒(BioLegend试剂盒#480003)去除不需要的细胞的类似富集。表12中比较了两种方法的富集结果。下表12中的结果表明，通过使用与不同特异性的多种抗体偶联的微泡去除不需要的污染细胞可以使稀有的造血干细胞富集6至7倍。这类似于使用磁性纳米颗粒观察到的富集程度。
表12
14.用链霉亲和素微泡和抗小鼠CD19磁性纳米颗粒同时分离小鼠CD4+细胞和CD19+ 细胞
在生物学研究中，通常需要从例如可以含有许多不同的B细胞、T细胞、单核细胞和树突细胞亚群的复杂细胞混合物如小鼠脾中分离出两个或多个特定的细胞亚群，如CD19+B淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞。目前的工作流程要求对单独的起始混合物执行单独的程序以分离不同的亚群。能够从单个复杂起始混合物中分离一个以上的群体将在试剂、时间和组织成本方面是有利的。图15中所示的示例示出了本发明实现的这种节省。在图15中，在同一工作流程中单独分离来自同一复杂小鼠脾细胞制剂的CD4+细胞和CD19+细胞。
从C57BL/6小鼠制备小鼠脾细胞。将脾细胞以1×108/ml悬浮在合适的缓冲液中，然后将100μl脾细胞转移到1.5ml Eppendorf管中。然后将细胞与2.5μg生物素化的抗小鼠CD4(克隆RM4-5)(BioLegend，San Diego，CA，目录号100508)在冰上孵育15分钟，然后进行两次洗涤以除去未结合的生物素抗体。将细胞重悬于100μl PBS，pH 7.4(Thermo Fisher，San Diego，CA，目录号10010023)中，并与10μl磁性MojoSortTM小鼠CD19纳米珠(BioLegend，San Diego，CA，目录号480002)——与抗小鼠-CD19单克隆抗体偶联的纳米磁性颗粒，一起孵育在冰上保持14分钟。然后将管保持在45°角，缓慢加入1×107链霉亲和素微泡(链霉亲和素包覆的微泡)Akadeum Life Science，Ann Arbor，MI，目录号SA01)并研磨1分钟。链霉亲和素偶联的微泡附着于先前结合的生物素化的抗小鼠-CD4抗体。然后加入PBS至总体积3ml，将管置于MojoSortTM磁体(BioLegend，San Diego，CA，目录号480019)中进行三次迭代分离步骤。通过该程序，附着于磁体的磁性纳米颗粒结合细胞和微泡结合的细胞上升。在每个分离步骤后，将漂浮的细胞-微泡混合物倒入另一个新管中。然后将收获的含有细胞-微泡和细胞-磁性纳米颗粒的管重悬于PBS中，并以300×g离心5分钟。通过该程序，CD4+细胞升起并且CD19+细胞形成沉淀。然后用1μl PE抗小鼠CD4(克隆RM4-4)(BioLeged，SanDiego，CA，目录号116006)和FITC抗小鼠CD19(克隆6D5)(BioLegend，San Diego，CA，目录#115506)染色富含CD19的细胞沉淀并以300×g离心5分钟。通过流式细胞术(具有CellQuest software的FACSCalibur；BD Bioscience，San Diego，CA)获得细胞。由于保留的微泡阻塞细胞计流体中的样品流动，通过常规流式细胞术不可能分析用这种形式的抗体偶联的玻璃微泡获得的富含CD4的漂浮细胞群体。相反，使用从非漂浮部分中耗尽的CD4+细胞的百分比来计算收获到漂浮部分中的细胞的百分比。
实验结果(下表13)表明，用于同时富集来自单个复杂混合物的两个群体的该方案可以快速、有效和实际地提供高纯度和高产量的两个亚群。通过同时磁浮方法分离的CD19+细胞和CD4+细胞的纯度类似于通过单独的磁性纳米颗粒方法分离的纯度。可以以稳定的库形式产生与生物素化抗体偶联的链霉亲和素微泡，使得可以在没有偶联步骤的情况下即时使用原料，并且基本上减少细胞分离时间。在替代和改进的产品形式中，可以通过多种方法从微泡中释放出所需的细胞，例如通过使用可逆的异双功能交联剂，竞争性类似物置换技术如生物素/脱硫生物碱，以及通过温和的机械方法使磷脂微泡塌陷。
表13
15.磁浮法用于以极高纯度分离人CD4+细胞
用于分离稀有细胞(即，诸如干细胞、循环肿瘤细胞、胎儿细胞、内皮细胞等的细胞)的商业上可用的方法是基于磁性颗粒的两步方案，其中首先进行阴性耗尽步骤以去除不需要的细胞接着进行多次洗涤步骤以去除非特异性结合的磁性颗粒。然后进行阳性选择步骤，再次进行多次洗涤，以捕获稀有细胞。由于固相材料(即磁性和非磁性珠子)的非特异性结合，由于多次洗涤步骤导致的损失以及与稀有细胞的靶向和结合的巨大困难，直接阳性选择仅取得了有限的成功。此外，通常用于稀有细胞的直接阳性选择的起始细胞悬浮液通常是非常复杂的混合物。起始或天然细胞悬浮液的任何显著操作，例如重复洗涤，由于在细胞样品处理的每个阶段经历的固有细胞损失，对样品中存在的任何稀有细胞的回收率或产率具有负面影响。
作为使用本发明的磁浮方法来减少样品损失和提高工作流程效率的实例，该方法用于显著改善从外周血单核细胞制备物(PBMC)分离的人CD4+淋巴细胞的纯度。在该实施例中，CD4抗原也在不需要的单核细胞上以使足以它们与所需的靶向CD4+淋巴细胞共分离的高水平共表达。用于以高纯度从PBMC分离人CD4+淋巴细胞的目前方法需要预富集步骤以用磁性颗粒或通过粘附到塑料板上去除污染的单核细胞，都使用多个耗时的程序。然后用抗CD4-偶联磁性颗粒包覆CD4+淋巴细胞，并通过另外的磁性分离步骤分离CD4+/CD14-淋巴细胞。该实施例证明了用于以高产率获得高纯度CD4+/CD14-淋巴细胞的更快、更简单的工作流程。
如图16所示，识别单核细胞标记物CD14的单核细胞特异性生物素化抗体，克隆#63D3(目录号367102；BioLegend Inc.，San Diego，CA)与链霉亲和素偶联微泡偶联，抗CD4特异性抗体例如克隆#SK3(目录#344602；BioLegend Inc.，San Diego，CA)直接与纳米磁性颗粒偶联。然后用两种抗体制剂包覆PBMC，并首先进行漂浮去除CD14+细胞，包括不需要的CD4+/CD14+单核细胞。然后磁分离CD4+/CD14-淋巴细胞群体。通过磁浮细胞分离，将漂浮的CD14+/CD4+双阳性单核细胞从CD4+淋巴细胞中提升出来，然后用磁力以比首先没有CD14耗尽的情况下高的纯度将CD4+淋巴细胞捕获到管壁上。这导致处理时间的显著减少，从而可以实现增加的总产率。在连续工作流程中使用微泡预先除去污染的CD4+/CD14+单核细胞群体之前和之后的PBMC复杂混合物的流式细胞术分析显示在图17中，结果的总结显示在下表14中。结果表明，使用这种简单快速的方法，CD4+/CD14-淋巴细胞群体的纯度提高到接近100％的纯度。所需群体中细胞的产量等于在没有预除去步骤的情况下的细胞产量。这些结果显示本发明可用于容易地获得越来越纯的以第二标记物也存在于不需要的细胞上但不存在于所需的细胞群体上为特征的所需细胞群体。
在上面所示的两个磁分离实例中，生物素化的靶抗体用于偶联链霉亲和素包覆的微泡，从而可以改善的分离的原理得到证明。抗体与微泡的直接偶联也是可能的，并且该步骤将简化和加速工作流程，同时保留该方法的积极属性。
表14
定义：
为方便起见，下面收集本说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。如果需要，除了这些术语之外，其他术语在本说明书的其他地方定义。除非另有说明或从上下文隐含，否则以下术语和短语包括下面(或说明书中的其他地方)提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中显而易见，否则下面的术语和短语(或在说明书中其他地方定义的术语和短语)不排除该术语或短语在本领域中已经获得的含义，提供这些定义是为了帮助描述特定实施方案并且不旨在限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。除非下文或说明书中的其它地方另有明确定义，否则本说明书中使用的术语将具有其领域公认的含义。
除非上下文另有明确说明，如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“方法”包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤和/或在阅读本公开之后对于本领域技术人员而言变得显而易见的方法和/或步骤等。除非上下文另有明确说明，类似地，单词“或”意图包括“和”。
术语“约”是指与所述值的差异大约+/-10％。应当理解，无论是否具体提及，这种变化总是包括在本文提供的任何给定值中。
术语“施用”是指通过导致例如施用的细胞至少部分定位于所需部位的方法或途径将根据本发明的组合物置于受试者体内。药物组合物可以通过任何合适的途径给药，从而在受试者中产生有效的治疗。
“分析物”是指可能被怀疑存在于样品中(即，生物样品)的待检测的物质。分析物可以是存在天然存在的特异性结合配偶体的任何物质或可以制备特异性结合配偶体的任何物质。因此，分析物是可以与一种或多种特异性结合配偶体结合或被其结合的物质。
“抗体”是指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。该术语包括多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合抗体片段，以及由特异性结合目标抗原的免疫球蛋白基因序列改造的分子。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及种种免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其分别定义免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每条链的N-末端限定了约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链(VL)”和“可变重链(VH)”分别指这些轻链和重链。
抗体作为完整的免疫球蛋白或作为通过用各种肽酶消化产生的许多充分表征的抗原结合抗体片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中二硫键以下消化抗体产生F(ab')2、Fab的二聚体，其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。可以在温和条件下还原F(ab')2以破坏铰链区中的二硫键，从而将(Fab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有部分铰链区的Fab。尽管就完整抗体的消化而定义了各种抗原结合抗体片段，但是技术人员将理解，这些Fab'片段可以通过化学方法或通过利用重组DNA方法从头合成。因此，在本发明的上下文中，术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生或使用重组DNA方法从头合成的抗原结合抗体片段。抗体包括可变重链和可变轻链连接在一起(直接或通过肽接头)以形成连续多肽的单链抗体(作为单个多肽链存在的抗体)、单链Fv抗体(sFv或scFv)。单链Fv抗体是共价连接的VH-VL异二聚体，其可以从包括直接连接或通过肽编码接头连接的VH-编码序列和VL-编码序列的核酸表达。虽然VH和VL作为单个多肽链彼此连接，但VH和VL结构域非共价结合。本领域技术人员已知的是，scFv抗体和许多其他结构将天然聚集但化学分离的轻多肽链和重多肽链从抗体V区转变为折叠成与抗原结合位点结构基本相似的三维结构的分子。
本文的“自身免疫疾病”是由个体自身组织引起并针对个体自身组织的非恶性疾病或病症。自身免疫疾病或病症的实例包括但不限于炎性反应，例如炎性皮肤病，包括牛皮癣和皮炎(例如特应性皮炎)；系统性硬皮病和硬化症；与炎症性肠病相关的反应(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；湿疹和哮喘等过敏性疾病以及其他涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的疾病；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；多发性硬化；雷诺综合症；自身免疫性甲状腺炎；过敏性脑脊髓炎；Sjorgen综合征；青少年发病的糖尿病；通常见于结核病、结节病、多发性肌炎、肉芽肿病和血管炎中的细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫反应；恶性贫血(艾迪生病)；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎症性疾病；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或Coombs阳性贫血)；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜疾病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎；格雷夫斯病；Lambert-Eaton肌无力综合征；类天疱疮大疱；天疱疮；自身免疫性多内分泌病；瑞特氏病；僵硬综合症；白塞病；巨细胞动脉炎；免疫复合性肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等
高亲和力结合对的“结合配偶体”或“成员”是结合对的成员，即一对分子，其中一个分子与第二分子结合。特异性结合的结合配偶体被称为“特异性结合配偶体”。“高亲和力”结合对是其中成员以高亲和力结合的结合对。除了通常用于免疫测定的抗原和抗体结合配偶体之外，其他特异性结合配偶体可包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉亲和素)、碳水化合物和凝集素、具有互补核苷酸序列的核酸、配体和受体分子、辅因子和酶、酶抑制剂和酶等。此外，特异性结合配偶体可包括为原始特异性结合配偶体的类似物的配偶体，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合配偶体包括抗原、抗原片段、抗体(单克隆和多克隆)和抗原结合抗体片段。
“生物样品”是取自患者或受试者的生物材料样品以及取自组织培养物或组织培养上清液或可能含有目标分析物的任何其他来源的样品。生物样品包括取自体液和组织(例如，来自活组织检查)或组织制剂(例如组织切片、匀浆等)的样品。“体液”是从根据本发明适用的受试者获得或衍生的任何流体。这些液体包括全血、血液成分如血清和血浆、尿液、汗液、淋巴液、粪便、腹水、精液、痰液、乳头抽吸液、术后血清肿、伤口引流液、唾液、滑液、骨髓、脑脊液液体、鼻腔分泌物、羊水、支气管肺泡灌洗液、外周血单核细胞、总白细胞、淋巴结细胞、脾细胞和扁桃体细胞。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、以及各物种型的头颈癌。
术语“细胞样品”是指具有不同表型或不同量的细胞亚群的细胞例如全血、外周血、脐带血和骨髓、血沉棕黄层部分中常见的细胞以及通过例如白细胞分离术产生的细胞制剂的悬浮液或混合物。此类细胞样品可包括例如红细胞、血小板和白细胞，诸如T细胞、调节性T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞和/或造血干细胞。
术语“包含”或“包括”用于指对于制品、组合物或方法必需的制品，组合物、方法和其各自的组分，无论是否必要，视具体情况而定可以开放地包括未指明的元素。它是与“包括”，“包含”，“特征在于”或类似开放式术语或短语的同义词。
术语“基本上由......组成”指的是给定实施方案所需的那些元素。该术语允许存在一种或多种附加元素，这些附加元素不会实质上影响该(那些)实施方案的基本且新颖的或功能性的特征。
术语“由......组成”是指如本文所述的制品、组合物、方法和其各个组分不包括在该实施方案的描述中未列举的任何要素。
术语“例如”、“诸如”等术语表示“例如”，因此不限制它们解释的术语或短语，而术语“即，”等类似术语意味着“也就是”，因此限制了它解释的术语或短语。
如本文所用，术语“表位”或“抗原表位”或“目标表位”是指任何分子上的位点，其被识别并且能够结合其特异性结合配偶体上的互补位点。携带表位的分子和特异性结合配偶体是特异性结合对的一部分。例如，表位可以是多肽、蛋白质、半抗原、碳水化合物抗原(例如但不限于糖脂、糖蛋白或脂多糖)或多糖，其特异性结合配偶体可以是但不限于抗体例如，自身抗体。通常，表位包含在更大的分子框架内(例如，在蛋白质的抗原区域的背景下，表位是具有能够被与该表位反应的抗体结合的结构的蛋白质的区域或片段)，是指已知与特定结合配偶体接触的精确残基。众所周知，抗原或抗原片段可能含有一个以上的表位。
本文所用的术语“移植物”是指衍生自供体的生物材料，用于移植入受体。移植物包括多种材料，例如，分离的细胞，例如胰岛细胞；组织如新生儿的羊膜、骨髓，造血前体细胞和眼组织，如角膜组织；和器官，如皮肤、心脏、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺叶、肺、肾、管状器官(如肠、血管或食道)等。管状器官可用于替代食道受损部位、血管或胆管。皮肤移植物不仅可用于烧伤，还可用作损伤肠道的敷料或用于闭合膈疝等某些缺陷。移植物来自任何哺乳动物来源，包括人类，无论是来自尸体还是活体捐献者。优选地，移植物是骨髓或器官如心脏，针对HLA II类抗原，移植物的供体和宿主相匹配。
“本文”是指在包括可以通过引用并入的任何内容的本申请中。
如本文所用，在特异性结合对的成员(例如，抗原和特异性结合此抗原的抗体)之间的相互作用的背景下，“特异地”或“特异性”是指相互作用的选择性反应性。短语“特异性结合”和类似术语是指抗体与抗原特异性结合(例如，优先反应)而不特异性结合其他实体的能力。可以鉴定特异性结合特定抗原的抗体或抗原结合抗体片段，例如，通过诊断免疫测定(例如，放射免疫测定(“RIA”)和酶联免疫吸附测定(“ELISAs”)、表面等离子体共振、或本领域技术人员已知的其他技术。在一个实施方案中，术语“特异性结合”或“特异性反应性”表示对靶分析物的结合倾向(例如，亲和力)为相对于非特异性靶分子(例如，缺少特异性识别位点的随机产生的分子)的至少约2倍，更优选至少约5倍、10倍、100倍、1,000倍、一百万倍或更多倍。
术语“标记的”是指用可检测标记物标记的或在可使用期间用可检测标记物标记的分子(例如，抗体、纳米颗粒等)。“可检测标记”包括可检测或使得可检测的任何部分。关于标记的可分离颗粒，“直接标记”是与颗粒共价或非共价附着或相关联的可检测标记，“间接标记”是特异性结合颗粒的可检测标记。因此，间接标记包括检测剂部分的特异性结合配偶体的部分。生物素和抗生物素蛋白是这样的部分的实例，可以例如通过使生物素化的抗体与标记的抗生物素蛋白接触以产生间接标记的抗体(因此标记的纳米磁性颗粒)来使用。“标记”是指可检测的化合物或组合物，例如直接或间接与靶特异性结合成员偶联的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，拉曼标记、放射性同位素、荧光标记等)，或者在酶标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
术语“磁性颗粒”是指铁磁性、超顺磁性或顺磁性固相，例如胶体颗粒、微球、纳米颗粒或珠。颗粒可以悬浮或冻干状态使用。
“微粒”是指可通过任何合适的方法例如磁性分离、浮力分离、超速离心等回收的小颗粒，。微粒通常具有约1微米或更小的平均直径。
“微泡”是指通过任何合适的方法分离和回收的小浮颗粒，例如，不离心漂浮、离心加速漂浮、使用高漂浮/低密度缓冲液加速漂浮、通过移液去除和/或转移、通过倾倒除去、通过抽吸除去等。微泡的直径大小范围通常为约0.1至约100微米，通常约1至约50微米，通常约2至约20或30微米。微泡可以由任何合适的材料制成，例如玻璃、磷脂、加热的BSA等。微泡可以填充有环境空气，特定气体或气体混合物，或低密度/高漂浮流体。
“纳米颗粒”是指可通过任何合适的方法回收的小颗粒，例如磁性分离或缔合、超速离心等。纳米颗粒的平均直径通常为约500纳米(nm)或更小，优选约为500纳米(nm)或更小，在1nm至约500nm尺寸范围内的20nm至约300nm或任何尺寸或尺寸范围。
根据本发明的“可获得专利的”工艺、机器或制品制造意味着该主题在进行分析时满足可专利性的所有法定要求。例如，关于新颖性、非显而易见性等，如果后来的调查显示一个或多个权利要求包含将否定新颖性、非显而易见性等的一个或多个实施例，则权利要求根据定义限于“可获得专利的”实施方案，具体地排除了不可专利的实施方案。此外，所附权利要求应被解释为既提供最广泛的合理范围，又保持其有效性。此外，如果一项或多项可专利性法定要求得到修订，或者用于评估自本申请提交之日起或者作为专利公布时至一个或多个所附权利要求的有效性受到质疑的时间可专利性的特定法定要求是否被满足的标准发生变化，权利要求的解释方式是：(1)保持其有效性；(2)在这种情况下提供最广泛的合理解释。
“多个”意味着不止一个。
当用于提及细胞或细胞群体时，术语“选择”是指选择、分离、分开和/或选择性繁殖一种或多种具有所需特征的细胞。
术语“分离的”、“纯化的”、“隔离的”等意指样品或反应混合物的一种或多种组分已经与混合物中存在的一种或多种其他组分物理远离或在混合物中存在的一种或多种其他组分存在的情况下被稀释。
术语“物种”在本文中用于各种情况，例如特定的靶生物分子物种。在每个上下文中，该术语是指在特定上下文中提及的那种化学上不明显的分子群。
“受试者”(或“患者”)是指人或动物。通常动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、家畜或野生动物。例如，灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家养和野生动物包括牛，马，猪，鹿，野牛，水牛，猫科动物例如家猫，犬科动物例如狗，狐狸，狼，鸟类例如鸡、鸸、鸵鸟和鱼例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。患者或受试者包括前述的任何子集，例如，以上所有。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。
术语“移植”及其变体是指移植物插入宿主，无论移植是同源的(供体和受体在遗传上是相同的)、同种异体的(其中供体和受体具有不同的遗传起源但是相同物种)或异种(其中供体和受体来自不同物种)。因此，在典型情况下，宿主是人，并且移植物是衍生自相同或不同遗传起源的人的同种异体移植物。在另一种情况下，移植物来源于与其被移植入的物种不同的物种，例如移植到人类受体宿主中的狒狒心脏，并且包括来自系统发育上广泛分离的物种的动物，例如移植到人类宿主中的猪心脏瓣膜，或者动物β胰岛细胞或神经细胞。
当用于提及疾病、病症或医学状况时，术语“治疗”，“疗法”，“处理”或“改善”是指针对病症的治疗性治疗，其中目的是逆转、缓解、改善、抑制、减缓或停止症状或病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减轻或缓解病症的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，治疗通常是“有效的”。或者，如果病症的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括停止或至少减缓在没有治疗的情况下预期的进展或症状恶化。有益或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状，减少缺乏程度，稳定(即，不恶化)健康状态，延迟或减缓疾病进展，以及改善或减轻症状。治疗还可以包括受试者存活超过统计学上预期死亡的时间。
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根据本公开，无需过度实验即可制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物、制品、设备、系统和方法。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物、制品、设备、系统和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围情况下，变化可以应用于该组合物、制品、设备、系统和方法。无论是现在存在的还是以后开发的，对于本领域技术人员显而易见的所有这些变化和等同物，都被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内。
本说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物表示本发明所属领域普通技术人员的水平。所有专利、专利申请和出版物通过引用整体并入本文中用于所有目的，并且程度如同每个单独的出版物被特别和单独地指出通过引用整体并入用于任何和所有目的。
本文说明性描述的发明可适当地在不存在本文未具体公开的任何要素的情况下实施。因此，例如，在本文的每种情况下，任何术语“包括”，“基本上由......组成”和“由...组成”可以用其他两个术语中的任一个替换。已经使用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且无意在使用这些术语和表达来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，而是认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以诉诸于本文公开的概念的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在由还可以包含本发明的其他实施方案的所附权利要求限定的发明的范围内。

Claims (17)

1.一种从生物样品中分离至少一种靶生物分子物种的方法，包括：
(a)在反应混合物中，使已知或怀疑含有目标第一生物分子物种和目标第二生物分子物种的生物样品与靶向磁性颗粒物种，任选地靶向纳米磁性颗粒物种，以及靶向浮颗粒物种，任选地靶向浮微粒物种，任选地微泡物种接触，所述靶向磁性颗粒物种靶向所述目标第一生物分子物种以形成第一靶生物分子/磁性颗粒复合物，所述靶向浮颗粒物种靶向所述目标第二生物分子物种以形成第二靶生物分子/浮颗粒复合物；
(b)使用磁场从所述反应混合物分离所述第一生物分子/磁性颗粒复合物；和/或，
(c)使用浮力/漂浮性质从所述反应混合物分离所述第二靶生物分子/浮颗粒复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶向磁性颗粒物种是靶向纳米磁性颗粒物种，其包含：
(i)磁核颗粒；
(ii)包封所述磁核颗粒的玻璃层；
(iii)与所述玻璃层结合的蛋白质/聚合物复合物层；和
(iv)靶向部分，所述靶向部分靶向所述目标第一生物分子物种并包含与所述蛋白质/聚合物复合物层结合的生物亲和配体对的一个成员。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述靶向纳米磁性颗粒物种的分子具有范围为约5nm至约500nm，优选约30nm至约300nm的直径。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述靶向纳米磁性颗粒物种的磁核颗粒包括磁铁矿(Fe3O4)晶体，任选地其中所述磁铁矿晶体具有范围为约5nm至约300nm的直径。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述靶向纳米磁性颗粒物种的玻璃层是由有机官能烷氧基硅烷分子形成的硅烷层，任选地包含可连接端基，任选地选自由氨基、巯基、羧基和端羟基组成的组的可连接端基的有机官能烷氧基硅烷分子。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述靶向纳米磁性颗粒物种的蛋白质/聚合物复合物层与所述玻璃层共价结合，任选地其中所述蛋白质/聚合物复合物层由血清白蛋白，任选地牛或人血清白蛋白，葡萄聚糖或酪蛋白组成，其中任选地所述蛋白质/聚合物复合物层通过将所述组合物加热至约45℃到约85℃而被永久地结合。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述靶向纳米磁性颗粒物种的所述靶向部分选自由抗体、抗原结合抗体片段、重组抗体、细胞表面受体、细胞表面受体的结合配体的细胞外结构域、适体、核酸、抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素组成的组。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶向磁性颗粒和/或所述靶向浮颗粒各自独立地还包含可检测标记物。
9.根据权利要求2所述的方法，其中，所述靶向纳米磁性颗粒物种的磁核颗粒包括氧化亚铁，任选地Fe3O4或Fe2O3；氧化铬，任选地CrO3；或包含选自由Mn、Co、Ni、Zn、Gd和Dy组成的组的取代金属离子的稳定金属氧化物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶向浮颗粒物种包括靶向浮微粒，任选地靶向微泡，以及选自由抗体、抗原结合抗体片段、重组抗体、细胞表面受体、细胞表面受体的结合配体的细胞外结构域、适体、核酸、抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素组成的组的靶向部分。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一生物分子物种是用于细胞疗法，任选地人细胞疗法的细胞类型的细胞表面抗原。
12.根据权利要求1所述的方法，用于制备富集细胞群体，其中，所述富集细胞群体的细胞将所述第一生物分子物种表达为细胞表面抗原。
13.一种分离的富集细胞群体，其中，所述富集细胞群体使用根据权利要求11所述的方法产生。
14.一种向受试者施用富集细胞群体的方法，包括向受试者施用根据权利要求12所述的分离的富集细胞群体，其中，所述富集细胞群体富含表达作为细胞表面抗原的所述第一生物分子物种的干细胞。
15.一种用于进行根据权利要求1所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含靶向目标第一生物分子物种的靶向磁性颗粒物种，任选地靶向纳米磁性颗粒物种的组合物；
(b)包含靶向目标第二生物分子物种的靶向浮颗粒物种，任选地靶向浮微粒物种，任选地靶向浮微泡物种的组合物，所述组合物靶向与由包含所述靶向磁性颗粒物种的组合物靶向的生物分子物种相比不同的生物分子物种；和
(c)使用所述靶向磁性颗粒物种和所述靶向浮颗粒物种进行根据权利要求1所述的方法的说明书。
16.根据权利要求14所述的试剂盒，包含多种靶向磁性颗粒物种，其中由每种靶向磁性颗粒物种靶向的目标生物分子物种与由所述试剂盒中的其他靶向磁性颗粒物种和所述靶向浮微粒物种靶向的其他目标生物分子物种不同，其中不同的靶向磁性颗粒物种在试剂盒中的相同或不同组合物中。
17.根据权利要求14所述的试剂盒，包含多种靶向浮颗粒物种，其中由每种靶向浮颗粒物种靶向的目标生物分子物种与由所述试剂盒中的其他靶向磁性颗粒物种和靶向浮颗粒物种靶向的其他目标生物分子物种不同，其中不同的靶向浮颗粒物种在试剂盒中的相同或不同组合物中。
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