CN110361442B - 一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体及其制备方法与应用,属于纳米生物材料领域。该外泌体包括能用于质谱流式检测的重金属标签化合物,重金属标签化合物分布在外泌体内腔中;制备方法包括以下步骤:1)提取外泌体:通过梯度离心、浓缩,沉淀获取外泌体;或者通过超高速离心获得外泌体;2)重金属标签导入:步骤1)获得的外泌体与重金属标签化合物通过电穿孔及孵育方式,将重金属标签化合物导入外泌体中;3)获取具有重金属标签的外泌体:利用沉淀试剂盒或者超高速离心分离,去除没有被外泌体包裹的游离重金属标签化合物,获得用于质谱流式细胞仪检测的外泌体。本申请还提供所述外泌体的应用,实现高通量单细胞追踪外泌体的摄取。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物材料领域,特别涉及一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体及其制备方法与应用。
背景技术
质谱流式是目前世界上最先进的单细胞高通量蛋白组学技术。它率先使用金属元素做为流式抗体、染料的标志物,利用质谱对标记细胞进行定量检测。这一新技术的应用,一方面使流式检测通道数量大幅提高到了上百个,提升了从单个样品获得的信息量;另一方面避免了通道间信号的干扰,大大简化了实验设计,提升了数据的可靠性。信号分子检测数量的增加意味着对细胞群内的表型进行更精准的观察和分类,意味着对细胞群的均一性有更准确的认识,也意味着对细胞内信号转导网络有更清晰的了解;同时它也为单细胞蛋白质组的发展提供了新的研究手段。它采用金属元素标记物(通常是金属元素标记的特异抗体或者染料)标记或识别细胞表面和内部的信号分子,然后用流式细胞原理分离单个细胞,再用感应耦合等离子质谱(ICP-MS)观察单个细胞的原子质量谱,最后将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据,并通过专业分析软件对获得的数据进行分析,从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察。由于检测的通道可达上百个,因此能够同时高通量地检测单细胞表型和信号,从而获得大量的单细胞数据,此外质谱流式细胞仪可以检测数量几乎无限制,可以检测百万级以上的单细胞,进而能够分辨出各种小的细胞亚群。
外泌体是直径为30-150nm的脂质双分子囊泡,可几乎由所有细胞合成并分泌至细胞外基质中,外泌体不仅参与多种疾病的发生发展,并成为多种疾病诊断和预后的标志物,且可以作为一种潜在的药物载体。虽然有很多研究通过对外泌体进行荧光标记,从而在体外和体内来检测外泌体的摄取情况,大多数研究只研究了外泌体在器官或者组织中的分布,从单细胞层面来研究外泌体的摄取较少。即使有研究利用传统的基于荧光的细胞流式细胞仪来追踪外泌体的摄取,但是由于荧光染料通道数量的限制以及常常出现的荧光溢漏和串色,使得传统的流式细胞仪无法高通量的分辨细胞类型和高通量地对外泌体摄取进行定量。虽然质谱流式细胞仪的通量很高,但是其只能检测含有75-209原子量元素,而天然提取的外泌体中是不含有这些可被质谱流式细胞仪摄取的元素,因此本发明旨在构建一种带有重金属标签化合物的的外泌体,将质谱流式用于体外体内示踪外泌体,同时建立一套高通量追踪外泌体摄取的方法。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的缺点与不足,本发明的首要目的在于提供一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体。所述外泌体的内腔中含有重金属标签化合物。
本发明的另一目的在于提供上述用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法。所述制备方法为采用电穿孔方式将重金属标签化合物导入外泌体内腔。
本发明的再一目的在于提供上述用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的应用。上述用于质谱流式细胞仪检测的外泌体,用于高通量追踪外泌体摄取的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体,包括能用于质谱流式检测的重金属标签化合物,所述重金属标签化合物分布在外泌体内腔中。
所述重金属标签化合物是指包含有原子量在75-209间所有元素的化合物,所述重金属标签化合物可与细胞内蛋白、RNA、DNA中的至少一种相结合。
优选地,所述重金属标签化合物为包含I127的IDU(碘去氧尿啶)或PI(碘化丙啶),含有Rh103或Ir191或Ir193的DNA插入剂,含有Pt194和Pt195的顺铂中的至少一种。
上述用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法,具体包括以下步骤:
1)提取外泌体:通过梯度离心、浓缩,沉淀获取外泌体;或者通过超高速离心获得外泌体;
2)重金属标签导入:步骤1)获得的外泌体与重金属标签化合物通过电穿孔及孵育方式,将重金属标签化合物导入外泌体中;
3)获取具有重金属标签的外泌体:利用沉淀试剂盒或者超高速离心分离,去除没有被外泌体包裹的游离重金属标签化合物,获得用于质谱流式细胞仪检测的外泌体。
优选地,步骤1)中所述梯度离心、浓缩,沉淀获取外泌体,其具体制备方法的步骤如下:将细胞在培养基中有血清培养2天,用PBS洗3次,后用无血清培养1-2天;收集培养基的上清液,对上清液依次采用300g×5min、2000g×5min离心去除培养液中的死细胞及细胞碎片,再用0.22um滤膜去除凋亡小体,大囊泡,进一步使用100KD超滤管以1500g转速浓缩上清,去除大部分蛋白及小分子,沉淀试剂4℃过夜沉淀外泌体,1500g×30min去除上清,再次1500g×5min去除残余上清,PBS重悬后获得外泌体。
优选地,步骤1)中所述通过超高速离心获得外泌体,其具体制备方法的步骤如下:将细胞在培养基中有血清培养2天,用PBS洗3次,后用无血清培养2天;收集培养基的上清液,对上清液依次采用300g×5min、3000g×5min、10000g×30min离心去除培养液中的死细胞及细胞碎片以及大囊泡,而后通过100000g×70-90min得到含有外泌体的沉淀,PBS重悬后获得外泌体。
步骤2)中所述电穿孔及孵育的条件设置为:250V,100ms,6次,电穿孔后37℃孵育30min。
优选地,步骤3)中所述沉淀试剂盒为ExoQuick沉淀试剂盒;具体沉淀试剂的沉淀步骤如下:利用沉淀试剂(ExoQuick沉淀试剂)对上述外泌体进行4℃过夜沉淀,1500g×30min,去除上清,再次1500g×5min,使用PBS重悬外泌体,10000g×5min离心,将可能出现蛋白、外泌体或者药物的聚集体沉淀去除,上清即为具有重金属标签化合物的外泌体。
步骤3)中所述超高速离心,具体步骤如下:外泌体进行100000g×70-90min离心得到含有外泌体的沉淀,PBS重悬后,再经过10000g×5min离心,将可能出现蛋白、外泌体或者药物的聚集体沉淀去除,上清即为具有重金属标签化合物的外泌体。
上述用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的应用,用于高通量的单细胞分析外泌体的摄取。
所述高通量的单细胞分析外泌体的摄取的方法,具体步骤为:
(1)将上述用于质谱流式细胞仪检测的外泌体加入细胞中或注射至动物体内,收集或者分离细胞;
(2)对细胞进行金属标签抗体的孵育,使抗体与细胞表面或内部的抗原结合;
(3)通过离心和PBS清洗将未结合的抗体去除,而后用质谱流式细胞仪高通量地检测单细胞中75-209原子量元素的含量,从而来判断细胞的具体类型以及其对外泌体的摄取情况。
步骤(2)中所述金属标签抗体,其对应抗原是包含有可以被质谱流式细胞仪所检测的原子量在75-209的元素;这些金属标签需要每一种标签对应标记一种抗体,不可重复;这些含有金属标签的抗体可以从商家购买,也可以通过相应试剂盒进行自主标记。
所述金属标签抗体的数量在标签不重复的情况下可以达到135种不同的抗体;这些抗体可以从商家购买;这些抗体可以是识别细胞表面蛋白抗原的抗体,也可以是识别细胞内部蛋白抗原的抗体。
所述金属标签抗体,根据检测与细胞结合的抗体可以用来分辨细胞的具体类型;分辨的类型种类与选择使用的抗体数量正相关。
可用质谱流式细胞仪高通量地检测体外或体内细胞对外泌体的摄取,以此示踪外泌体在细胞中的内化或在动物体内的分布。将质谱流式用于体外体内示踪外泌体,同时建立一套高通量追踪外泌体摄取的方法。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
本发明中所述用于质谱流式细胞仪检测的外泌体修饰方法,通过该方法的修饰,可以用质谱流式来定量细胞对外泌体摄取的情况,同时通过基于抗原抗体反应的细胞分型检测,进而从单细胞水平来定量哪些具体类型的细胞摄取外泌体的多少,从而实现高通量的单细胞追踪外泌体的摄取。对外泌体摄取的细胞类型的鉴定以及这些细胞对外泌体摄取的多少能够扩展大家对外泌体影响的细胞类型的理解以及为基于外泌体的载药研究提供新的方法和思路。
附图说明
图1为用于质谱流式细胞仪检测的外泌体制备方法及高通量的单细胞水平追踪外泌体摄取方法的流程图。
图2为对实施例1制备获得的外泌体进行定量及透射电子显微镜鉴定图。
图3为实施例1中对这些含有重金属元素化合物的外泌体进行蛋白鉴定和粒径大小的鉴定的结果图。
图4为实施例1中质谱流式检测细胞对外泌体的摄取情况的检测结果图。
图5为实施例1中细胞中Pt194含量水平的二维的viSNE图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1:
如图1所示,一种用于质谱流式细胞仪检测C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞外泌体修饰方法以及高通量的单细胞分析外泌体的摄取。包括以下步骤:将C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞在有血清培养基中培养2天,用PBS洗3次,后用无血清培养1天;收集培养基的上清液,对上清液进行300g×5min、2000g×5min的转速离心去除培养液中的死细胞及细胞碎片,再用0.22um滤膜去除凋亡小体,大囊泡,进一步使用100KD超滤管以1500g转速浓缩上清,去除大部分蛋白及小分子,沉淀试剂ExoQuick沉淀外泌体4℃过夜沉淀,1500g×30min,去除上清,再次1500g×5min去除残余上清,PBS重悬外泌体,10000g×5min离心,将可能出现蛋白、外泌体或者药物的聚集体沉淀去除,上清即为含有重金属标签化合物的外泌体,对外泌体进行定量及透射电子显微镜鉴定(图2)。
在外泌体中添加具有重金属元素标签的可以与细胞内DNA、RNA或蛋白结合的化合物,其中包括I127的IDU(碘去氧尿啶),含有Rh103或Ir191或Ir193的DNA插入剂,含有Pt194和Pt195的顺铂(DDP)等化合物,进行电穿孔并37℃孵育30min。
利用沉淀试剂对上述外泌体进行4℃过夜沉淀,1500g×30min,去除上清,再次1500g×5min,PBS重悬外泌体,使用PBS重悬外泌体,10000g×5min离心,将可能出现蛋白、外泌体或者药物的聚集体沉淀去除,上清即为含有重金属标签化合物的外泌体;
对这些含有重金属元素化合物的外泌体进行蛋白鉴定和粒径大小的鉴定(图3)。
将这些修饰的外泌体加入到目的细胞中,而后24h通过质谱流式检测细胞对外泌体的摄取情况(图4)。
将加载有DDP(含有Pt194和Pt195)的外泌体注射至小鼠体内,而后24小时后分离肝脏单细胞,同时与含有不同金属标签的13种抗体孵育,这些抗体识别小鼠细胞表面的CD11b、B220、CD19、CD45、F4/80、CD8a、CD4、CD11c、CD3e、Ly6G、Ly6C。
而后通过质谱流式细胞仪对这些细胞进行检测,而后通过viSNE分析,形成二维的viSNE图,viSNE图中细胞表面的抗原的表达情况,以及根据这些表面蛋白对这些细胞进行分群,以及这些细胞中Pt194(代表对外泌体摄取的细胞)的水平情况(图5)。通过图5可以从单细胞水平来鉴定哪些细胞摄取了含有DDP(Pt194)的外泌体以及摄取的量的多少。通过利用13种表面抗体,鉴定出了10种大的细胞类型,从而反应出这10种细胞类型在体内对外泌体摄取的情况,实现了高通量的单细胞水平来分析外泌体的摄取以及体内的示踪。
应当理解,上述实施例1仅为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让不熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体,其特征在于:包括能用于质谱流式检测的重金属标签化合物,所述重金属标签化合物分布在外泌体内腔中;所述重金属标签化合物通过电穿孔及孵育方式导入外泌体中;所述重金属标签化合物是指包含有原子量在75-209间的元素的化合物。
2.根据权利要求1所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体,其特征在于:所述重金属标签化合物可与细胞内蛋白、RNA、DNA中的至少一种相结合。
3.根据权利要求1所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体,其特征在于:所述重金属标签化合物为含有I127的碘去氧尿啶或碘化丙啶,含有Rh103或Ir191或Ir193的DNA插入剂,含有Pt194和Pt195的顺铂中的至少一种。
4.权利要求1-3任一项所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法,其特征在于:具体包括以下步骤:
1)提取外泌体:通过梯度离心、浓缩,沉淀获取外泌体;或者通过超高速离心获得外泌体;
2)重金属标签导入:步骤1)获得的外泌体与重金属标签化合物通过电穿孔及孵育方式,将重金属标签化合物导入外泌体中;
3)获取具有重金属标签的外泌体:利用沉淀试剂盒或者超高速离心分离,去除没有被外泌体包裹的游离重金属标签化合物,获得用于质谱流式细胞仪检测的外泌体。
5.根据权利要求4所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法,其特征在于:步骤1)中所述梯度离心、浓缩,沉淀获取外泌体,其具体制备方法的步骤如下:将细胞在培养基中有血清培养2天,用PBS洗3次,后用无血清培养1-2天;收集培养基的上清液,对上清液依次采用300g×5min、2000g×5min离心去除培养液中的死细胞及细胞碎片,再用0.22um滤膜去除凋亡小体,大囊泡,进一步使用100KD超滤管以1500g转速浓缩上清,去除大部分蛋白及小分子,沉淀试剂4℃过夜沉淀外泌体,1500g×30min去除上清,再次1500g×5min去除残余上清,PBS重悬后获得外泌体;
步骤1)中所述通过超高速离心获得外泌体,其具体制备方法的步骤如下:将细胞在培养基中有血清培养2天,用PBS洗3次,后用无血清培养2天;收集培养基的上清液,对上清液依次采用300g×5min、3000g×5min、10000g×30min离心去除培养液中的死细胞及细胞碎片以及大囊泡,而后通过100000g×70-90min得到含有外泌体的沉淀,PBS重悬后获得外泌体。
6.根据权利要求4所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法,其特征在于:步骤2)中所述电穿孔及孵育的条件设置为:250V,100ms,6次,电穿孔后37℃孵育30min。
7.根据权利要求4所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法,其特征在于:步骤3)中所述沉淀试剂盒为ExoQuick沉淀试剂盒;具体沉淀试剂的沉淀步骤如下:利用沉淀试剂对上述外泌体进行4℃过夜沉淀,1500g×30min,去除上清,再次1500g×5min,使用PBS重悬外泌体,10000g×5min离心,将可能出现蛋白、外泌体或者药物的聚集体沉淀去除,上清即为具有重金属标签化合物的外泌体;
步骤3)中所述超高速离心,具体步骤如下:外泌体进行100000g×70-90min离心得到含有外泌体的沉淀,PBS重悬后,再经过10000g×5min离心,将可能出现蛋白、外泌体或者药物的聚集体沉淀去除,上清即为具有重金属标签化合物的外泌体。
8.权利要求1-3任一项所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的应用,其特征在于:用于高通量的单细胞分析外泌体的摄取。
9.根据权利要求8所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的应用,其特征在于:所述高通量的单细胞分析外泌体的摄取的方法,具体步骤为:
(1)将上述用于质谱流式细胞仪检测的外泌体加入细胞中或注射至动物体内,收集或者分离细胞;
(2)对细胞进行金属标签抗体的孵育,使抗体与细胞表面或内部的抗原结合;
(3)通过离心和PBS清洗将未结合的抗体去除,而后用质谱流式细胞仪高通量地检测单细胞中75-209原子量元素的含量,从而来判断细胞的具体类型以及其对外泌体的摄取情况。
10.根据权利要求9所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的应用,其特征在于:步骤(2)中所述金属标签抗体,其对应抗原是包含有可以被质谱流式细胞仪所检测的原子量在75-209的元素;这些金属标签需要每一种标签对应标记一种抗体,不可重复。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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