CN111982789B - 基于单细胞富集和单细胞质谱的金属离子及金属纳米颗粒的高通量检测方法 - Google Patents
基于单细胞富集和单细胞质谱的金属离子及金属纳米颗粒的高通量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于单细胞富集和单细胞质谱的金属离子及金属纳米颗粒的高通量检测方法。本发明提供了一种检测金属离子及金属纳米颗粒的方法,包括:利用细胞或单细胞生物对金属离子及金属纳米颗粒进行吸收富集;用金属同位素A对处理后的细胞或单细胞生物进行标记;所述金属同位素A为待测金属元素外的其他金属同位素,能够同时标记存活的和死亡的细胞或单细胞生物;然后进行单细胞质谱流式检测,得到所述待测金属元素的胞内信号强度值,进而计算得到所述待测样本中所述待测金属元素的含量。本发明样品前处理简单不引入有害试剂;对样品的需求量很小;通量高;灵敏度高;可区分细胞相关金属信号。
Description
技术领域
本发明涉及金属离子和金属纳米颗粒检测领域,具体涉及一种基于单细胞富集和单细胞质谱的金属离子及金属纳米颗粒的高通量检测方法。
背景技术
原子吸收光谱分析法(AAS)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等是目前常用的元素分析方法。对于金属纳米颗粒的检测,目前常用的方法有激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法(LA-ICP-MS)、单颗粒/单细胞-电感耦合等离子体质谱法(SP/SC-ICP-MS)等。AAS分析法对不同的元素测定需要更换灯源,一次只能测定一种元素,不可以对多种元素同时进行分析,对于需要多元素分析的样品效率较低;ICP-MS和ICP-AES具有较大的元素分析范围,且能同时测定多种元素,具有灵敏度高、线性范围宽等优点,但使用ICP-MS和ICP-AES往往需要使用浓盐酸、浓硝酸甚至高氯酸、氢氟酸等高强腐蚀性酸对样品进行前处理,样品消解操作繁琐,耗时长;对于痕量金属元素则需要络合剂萃取,或固相萃取和液液萃取等实现金属富集后才能检测,这些富集方法容易对样品造成基体干扰,影响检测的准确度;而目前SP/SC-ICP-MS不能实现多个元素同时检测,LA-ICP-MS的检测通量也较低,不能实现高效的样品检测。
如,专利201910246159.4中公开了一种单细胞中银纳米颗粒含量的分析方法,方法流程如下图1。该发明先采用同位素稀释剂对含有银颗粒的单细胞阵列进行处理,获得含有同位素稀释剂的单细胞阵列;采用LA-ICP-MS对含有同位素稀释剂的单细胞阵列进行处理,剥蚀深度为15-25μm,测定单细胞阵列中单细胞109Ag/107Ag的比值,根据109Ag/107Ag的比值计算得到单细胞中银纳米颗粒的含量。
在实现本发明的过程中,申请人发现上述专利201910246159.4的设计具有如下局限性:(1)细胞样品需要制成单细胞阵列,才可以进行检测,样品前处理较复杂;(2)虽然结合了同位素稀释法,但是由于使用LA-ICP-MS作为检测器,其检测通量低;(3)对于单细胞样品,其检测限较高,在fg/细胞级别,难以实现对一些痕量或超痕量样品的检测。
再如,专利201910129284.7中公开了一种用于X射线荧光光谱检测水体重金属的藻富集装置及方法,方法流程如下图2。该方法利用单细胞绿藻对重金属进行吸附富集后,使用X射线荧光光谱检测重金属含量。实现本发明的过程中,申请人发现上述专利201910246159.4的设计具有如下局限性:(1)样品消耗量大,在实现金属吸附的过程中需要消耗几十甚至上百毫升样品,对特别珍贵的样品不适用;(2)需要的生物量大,每个样品需要消耗100mL藻溶液;(3)该方法的检测限高,且对样品的均匀程度要求高,否则样品检测的重复性差。
因此,建立一种高效、灵敏检测方法对实现痕量金属离子或金属纳米颗粒的快速准确检测具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于单细胞富集和单细胞质谱的金属离子及金属纳米颗粒的高通量检测方法。
第一方面,本发明要求保护一种检测待测样本中的待测金属元素含量的方法。
本发明所要求保护的检测待测样本中的待测金属元素含量的方法,特别适合于痕量金属离子或金属纳米颗粒的检测,可包括如下步骤:
(A)利用细胞或单细胞生物对待测样本中的待测金属元素进行吸收富集;所述待测样本为含有所述待测金属元素的金属离子或金属纳米颗粒的溶液。
(B)用金属同位素A对步骤(A)处理后的细胞或单细胞生物进行标记(如标记核酸);所述金属同位素A为所述待测金属元素外的其他金属同位素,能够同时标记存活的和死亡的所述细胞或单细胞生物。
(C)对步骤(B)处理后的细胞或单细胞生物进行单细胞质谱流式检测,得到所述待测金属元素的细胞信号强度值,进而计算得到所述待测样本中所述待测金属元素的含量。
进一步地,在步骤(C)中,根据所述待测金属元素的细胞信号强度值计算所述待测样本中所述待测金属元素的含量是通过标准曲线法实现的。
更进一步地,步骤(C)中,在根据所述待测金属元素的细胞信号强度值计算所述待测样本中所述待测金属元素的含量的过程中,采用的标准曲线可按照包括如下步骤的方法获得:
(a)利用所述细胞或单细胞生物对系列标准品溶液中的所述待测金属元素进行吸收富集;所述系列标准品溶液为系列所述待测金属元素浓度已知的金属离子或金属纳米颗粒的溶液。
在本发明的具体实施方式中,所述系列标准品溶液中所述待测金属元素(如Au)的浓度范围为100ng/L以下,具体为0、1、5、10、50和100ng/L。
相应的,所述待测样本中的所述待测金属元素(如Au)的浓度范围也可为100ng/L以下,如1-100ng/L(进一步如2.35-100ng/L),对于浓度较高的样品则可以稀释后进行检测。
(b)用所述金属同位素A对步骤(a)处理后的细胞或单细胞生物进行标记(如标记核酸)。
(c)对步骤(b)处理后的细胞或单细胞生物进行单细胞质谱流式检测,得到所述待测金属元素的细胞信号强度值和所述待测金属元素浓度之间的标准曲线。
在获得所述标准曲线的过程和检测所述待测样本的过程,除了与所述细胞或单细胞生物作用的样本不同外,其余条件保持一致。
其中,能够同时检测到所述金属同位素A(所述金属同位素A只有细胞信号无溶液中的信号)和所述待测金属元素(所述待测金属元素既有细胞信号也可能有溶液中的信号)信号的为细胞信号,反之则为溶液中的信号。
第二方面,本发明要求保护一种检测细胞或单细胞生物对待测金属元素的生理反应情况的方法。
本发明要求保护的检测细胞或单细胞生物对待测金属元素的生理反应情况的方法,为方法A或方法B。
所述方法A可包括如下步骤:
(a’)利用所述细胞或单细胞生物对供试溶液中的待测金属元素进行吸收富集;所述供试溶液为所述待测金属元素浓度已知的金属离子或金属纳米颗粒的溶液。
(b’)用金属同位素A和金属同位素B对步骤(a’)处理后的细胞或单细胞生物进行标记(如标记核酸);所述金属同位素A为所述待测金属元素外的其他金属同位素,能够同时标记存活的和死亡的所述细胞或单细胞生物;所述金属同位素B为所述待测金属元素和所述金属同位素A外的其他金属同位素,仅能够标记死亡的所述细胞或单细胞生物(存活的无法标记)。
(c’)对步骤(b’)处理后的细胞或单细胞生物进行单细胞质谱流式检测,先根据所述金属同位素A的信号分离出单细胞(这个信号是一个不确定的范围,根据样品不同范围有所波动,但是本领域技术一般技术人员可以很容易的把控,并根据单细胞质谱流式检测结果确定该范围。小于这个范围的信号是一些细胞碎片的信号,大于这个范围的可能是两个或多个细胞黏连体的信号),记为集合S;然后从集合S中分离出所述待测金属元素的细胞信号强度值大于阈值的所述细胞或单细胞生物(包括存活的和死亡的),记为集合P。另外从集合S中获得带有所述金属同位素A的信号但是不带有所述金属同位素B的信号的个体(存活个体,不含死亡个体),记为集合Q。
所述阈值满足如下条件:对照组中所述待测金属元素的信号强度值高于所述阈值的所述细胞或单细胞生物数量小于等于总数的1%。
在本发明的具体实施方式中,所选择的阈值为:对照组中所述待测金属元素的细胞信号强度值高于所述阈值的所述细胞或单细胞生物数量约为总数的0.23%。
所述对照组按照如下处理:将不含有所述待测金属元素的溶液(如水溶液)和所述细胞或单细胞生物的悬浮液或者培养有所述细胞或单细胞生物的培养液共同孵育6-48h;然后用所述金属同位素A对孵育后的所述细胞或单细胞生物进行标记(如标记核酸);然后进行单细胞质谱流式检测,得到所述待测金属元素的细胞信号强度值。
所述对照组除了与所述细胞或单细胞生物作用的样本不同外,其余条件保持一致。
在本发明的具体实施方式中,所述待测金属元素为197Au,相应的所述阈值为197Au信号强度(EIAu)为5。
其中,能够同时检测到所述金属同位素A和所述待测金属元素信号的为细胞信号,反之则为溶液中的信号。
所述方法B可包括如下步骤:
(a”)利用所述细胞或单细胞生物对供试溶液中的待测金属元素进行吸收富集;所述供试溶液为所述待测金属元素浓度已知的金属离子或金属纳米颗粒的溶液;
(b”)用两种以上所述待测金属元素外的其他金属同位素对步骤(a”)处理后的细胞或单细胞生物进行标记;不同的金属同位素用于标记所述细胞或单细胞生物的不同生理指标;
(c”)对步骤(b”)处理后的细胞或单细胞生物进行单细胞质谱流式检测,通过分析所述细胞或单细胞生物群体中所述不同金属同位素和所述待测金属元素的信号的有无和/或强弱,确定所述细胞或单细胞生物对所述待测金属元素的生理反应情况。
进一步地,在步骤(A)、(a)、(a’)和(a”)中,利用所述细胞或单细胞生物对所述待测金属元素进行吸收富集可按照包括如下步骤的方法进行:将所述待测样本或所述系列标准品溶液或所述供试溶液和所述细胞或单细胞生物共同孵育6-48h(如24h)。
进行所述共同孵育时的孵育液为所述细胞或单细胞生物能够在其中正常生存的液体。如当所述细胞或单细胞生物为四膜虫时,所述孵育液可为水或者用于培养四膜虫的培养基。
所述系列标准品溶液的溶剂可为所述细胞或单细胞生物能够在其中正常生存的液体;如当所述细胞或单细胞生物为四膜虫时,所述系列标准品溶液的溶剂可为水或者用于培养四膜虫的培养基。
所述待测样本可如水体。
所述供试溶液的溶剂可为所述细胞或单细胞生物能够在其中正常生存的液体;如当所述细胞或单细胞生物为四膜虫时,所述供试溶液的溶剂可为水或者用于培养四膜虫的培养基。
更进一步地,在所述悬浮液或所述培养液中所述细胞或单细胞生物的初始密度可为2×105~1×106个/mL,如2×105个/mL。
进一步地,在步骤(A)和(B),(a)和(b),以及(a’)和(b’)之间,还包括如下步骤:对经步骤(A)或(a)或(a’)处理后的体系进行离心(如800g离心5min)收集所述细胞或单细胞生物,并洗涤(如用无Ca2+,Mg2+的PBS洗涤三次),以去除未被所述细胞或单细胞生物吸收的所述待测金属元素(以金属离子或金属纳米颗粒的形式存在),并将每组的所述细胞或单细胞生物密度调整至1-3×106个/mL。
进一步地,在步骤(C)和(c)中,所述待测金属元素的细胞信号强度值为各组根据所述金属同位素A的信号分离出的单细胞中阳性的所述细胞或单细胞生物的所述待测金属元素的细胞信号强度值的均值;所述待测金属元素的细胞信号强度值大于阈值的所述细胞或单细胞生物为阳性,反之则为阴性。
所述阈值满足如下条件:对照组中所述待测金属元素的细胞信号强度值高于所述阈值的所述细胞或单细胞生物数量小于等于总数的1%。
在本发明的具体实施方式中,所选择的阈值为:对照组中所述待测金属元素的细胞信号强度值高于所述阈值的所述细胞或单细胞生物数量约为总数的0.23%。
所述对照组按照如下处理:将不含有所述待测元素的溶液(如水溶液)和所述细胞或单细胞生物的悬浮液或者培养有所述细胞或单细胞生物的培养液共同孵育6-48h;然后用所述金属同位素A对孵育后的所述细胞或单细胞生物进行标记(如标记核酸);然后进行单细胞质谱流式检测,得到所述待测金属元素的细胞信号强度值。
所述对照组除了与所述细胞或单细胞生物作用的样本不同外,其余条件保持一致。
在本发明的具体实施方式中,所述待测金属元素为197Au,相应的所述阈值为197Au信号强度(EIAu)为5。
所谓“各组”,对于所述待测样本而言,就一个组;对于所述系列标准品溶液而言,一个浓度对应一个组。
在上述各方面中,所述细胞或单细胞生物包括但不限于单细胞藻类、单细胞原生动物或巨噬细胞等细胞系。
所述金属同位素A包括但不限于193Ir或103Rh或镧系金属同位素。
所述金属同位素B包括但不限于195Pt。
在步骤(C)、(c)、(c’)和(c”)中,进行所述单细胞质谱流式检测后,每组样本收集5000-10000个events(Cytof收集到的信号数量)进行数据分析。收集的events数可以根据待分析的金属元素数量的增加适当增大。
在步骤(C)、(c)和(c’)中,可在质谱流式细胞术数据处理网站(www.cytobank.org)整理分析获得的数据,可以使用包括但不限于软件flowjo 10.0等替换。
在本发明的具体实施方式中,所述细胞或单细胞生物具体为四膜虫(如嗜热四膜虫B2086)。
在本发明的具体实施方式中,所述金属纳米颗粒具体为纳米金颗粒(AuNPs,直径,5nm)。
在上述各方面中,所述细胞信号可包括胞内信号(主体信号)和细胞膜上的信号(很少,对结果无影响)。
第三方面,本发明还要求保护如下任一应用:
(1)单细胞质谱流式细胞分析仪和/或四膜虫在检测金属离子或金属纳米颗粒中的应用;
(2)前文所述方法在检测细胞内特定生物分子的含量变化和/或信号通路的变化中的应用;
(3)单细胞质谱流式细胞分析仪和/或四膜虫在检测细胞内特定生物分子的含量变化和/或信号通路的变化中的应用。
(4)前文所述方法在检测细胞内特定生物分子的含量变化和/或信号通路的变化与细胞摄取的目标待测金属含量的关系的应用。
在(2)-(4)所述应用中,可对能够与一个或多个所述特定生物分子或待研究信号通路上的分子特异性结合的物质进行金属同位素标记,然后采用前文所述方法检测细胞中所述金属同位素的含量,进而反应细胞内所述特定生物分子的含量变化和/或所述信号通路的变化,及其与细胞摄取的目标待测金属含量的关系。
在本发明的具体实施方式中,前文所述的单细胞质谱流式细胞分析仪具体为单细胞电感耦合等离子体飞行时间质谱仪。
本发明的有益效果:
(1)样品前处理简单不引入有害试剂:本发明所述的细胞或单细胞生物,在实验室培养方便,在短时间内可以获得较大的生物量满足检测需求。由于本发明使用细胞悬浮液直接上样,因此避免了繁杂的样品消解过程以及有害试剂的引入。
(2)四膜虫有高度发达的离子及颗粒内化系统,可以实现对痕量金属的富集,可以检测极低金属含量的样品;由于本发明是基于单细胞水平的检测方法,因此对样品的需求量很小,减少了样品的消耗量。
(3)本发明使用单细胞电感耦合等离子体飞行时间质谱仪进行检测,其通量高,分析速度可达600个细胞每秒。
(4)灵敏度高:由于使用飞行时间质谱为检测器,可以对原子量为75至209的135余种金属同位素进行检测,在单细胞水平上可进行多金属元素同时检测,由于金属信号之间没有交叠,互不干扰,因此检测限低。
(5)可区分细胞相关金属信号:本发明使用铱(193Ir)对富集金属后的四膜虫进行核酸标记,在同时检测到193Ir的信号和目标金属信号时,目标金属的信号为细胞信号,反之则为溶液中的信号。
(6)可以在监测金属含量的同时检测金属的生物细胞效应:本发明基于生物富集在细胞或单细胞生物富集金属后,使用非目标金属的金属分子探针对细胞进行标记,可以同时检测细胞内特定生物分子的含量变化和信号通路的变化。
附图说明
图1为专利201910246159.4中公开的单细胞中银纳米颗粒含量的分析方法流程。
图2为专利201910129284.7中公开的用于X射线荧光光谱检测水体重金属的藻富集装置及方法流程。
图3为本发明提供的用于痕量金属离子或金属纳米颗粒的检测方法。
图4为由193Ir信号区分来自单个四膜虫的信号以及利用阈值定义Au阳性细胞和Au阴性细胞的圈门方法。“信号长度”指的是:CyTOF每13微秒收集一次信号。每个细胞进样后被离子化成为一团离子云,这些信号都将被收集,一个细胞的信号可能是很多个13微秒的信号加起来的,这个信号长度就是指的多少个13微秒。
图5为不同暴露浓度样品中四膜虫的197Au信号强度、AuP四膜虫占比,及AuP四膜虫的197Au平均信号强度。
图6为每106个四膜虫细胞的197Au总强度-AuNPs浓度的线性相关曲线。
图7为由193Ir信号区分来自单个四膜虫的信号及利用195Pt信号区分死活细胞的圈门方法。“信号长度”指的是:CyTOF每13微秒收集一次信号。每个细胞进样后被离子化成为一团离子云,这些信号都将被收集,一个细胞的信号可能是很多个13微秒的信号加起来的,这个信号长度就是指的多少个13微秒。
图8为实施例中20ng/L AuNPs暴露组与对照组中存活的细胞百分比。
具体实施方式
本发明提供了一种用于痕量金属离子或金属纳米颗粒的检测方法(如图3),所述方法包括步骤:
1、细胞或单细胞生物的培养
细胞或单细胞生物培养至适当密度(对于不同的细胞种类约2×105~1×106个/mL)以满足后续步骤需求。
2、待测金属离子或金属纳米颗粒的富集
将待测金属离子或金属纳米颗粒水溶液加入步骤1中的细胞或单细胞生物的悬浮液或培养皿中使金属被充分地吸收富集,根据不同的细胞类型6-48小时后收集细胞。
3、细胞或单细胞生物的核酸标记
使用铱(193Ir)对细胞或单细胞生物的核酸进行标记,同时可以使用其他非待测元素的外的金属同位素标记物对所使用的生物的其他生物分子进行标记(如顺铂(195Pt)标记死亡细胞的核酸)。
4、样本检测
将标记后的样本细胞密度调整至5-10×105个/mL,使用质谱流式细胞仪检测样本,每个样本收集5000-10000个events进行数据分析。
5、数据分析
在质谱流式细胞术数据处理网站(www.cytobank.org)整理分析获得的数据,计算金属含量。
进一步地,本领域普通技术人员可对上述对实施方法其进行简单地更改或替换,例如:
步骤1中所述的细胞和单细胞生物包括但不限于单细胞藻类、单细胞原生动物、吞噬能力较强的巨噬细胞等。
步骤3所述193Ir还可以使用包括但不限于铑(103Rh)的替代,其他非待测元素的外的金属同位素标记物包括但不限于镧系金属同位素等;
步骤4中收集的events数可以根据待分析的金属元素数量的增加适当增大;
步骤5中所述的数据处理网站可以使用包括但不限于软件flowjo 10.0等替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
嗜热四膜虫B2086:由山西大学王伟教授赠予。(可从美国康奈尔大学四膜虫库购买http://tetrahymena.vet.cornell.edu)。
纳米金:nanoComposix Inc.,(USA)。
CyTOF试剂:金属同位素标记物193Ir、195Pt、细胞染色缓冲液(CSB)、fix and permbuffer和EQTM四元素校准磁珠溶液均购自于Fluidigm(USA)公司。
四膜虫SPP培养基试剂:
酵母提取物(OXOID,Thermo Fisher Scientific,USA)。
葡萄糖(Sigma,USA),and 0.003%ferric citrate(Sigma,USA)。
双抗(HyClone,GE Healthcare Life Sciences,USA)。
柠檬酸铁(Sigma,USA)。
实施例1、本发明痕量金属离子或金属纳米颗粒的检测
1、嗜热四膜虫培养
嗜热四膜虫B2086,以3000cells/mL接入5mL SPP培养基中,在28℃,135rpm/min的摇床中培养24h,至细胞密度上升至2×105cells/mL左右。SPP培养基配方为:1L去离子水中加入20g蛋白胨、2g葡萄糖、1g酵母提取物、0.03g柠檬酸铁,在120℃20min灭菌后加入1%(v/v)双抗。
2、金属或金属纳米颗粒暴露
纳米金颗粒(AuNPs,直径,5nm),储备液1g/L,逐级稀释为100ng/L,500ng/L,1μg/L,5μg/L,10μg/L的工作液。取上述四膜虫悬浮液2mL,分别加入20μL上述工作液,使四膜虫分别暴露于1、5、10、50或100ng/L的纳米金颗粒(AuNPs,直径,5nm),另设置加入20μL灭菌水的对照组,每个暴露浓度和暴露组均设置三个独立重复样本,暴露时长为24h。在暴露过程中四膜虫将继续增殖,至暴露结束四膜虫的密度可达约6×105cells/mL。
3、收集四膜虫
800g离心5min收集暴露后的四膜虫,并用PBS(无Ca2+,Mg2+)洗涤三次,以去除未被四膜虫吸收的AuNPs,并将每个样品的细胞密度调整至1-3×106cells/mL,最终重悬于1mLPBS。
4、标记抗体
(1)每个样品使用0.5μM 195Pt孵育5min,以标记死亡的四膜虫(195Pt只能进入膜通透的细胞),孵育后使用细胞染色缓冲液(CSB)终止反应。
(2)配制193Ir工作液溶液(在fix and perm buffer中加入终浓度为125nM的193Ir)。
(3)向样品中逐滴加入1ml 193Ir工作液,室温1小时或4℃过夜。
(4)每个样品中加入1ml CSB,800g离心5min,去上清。
(5)使用去离子洗涤至少三次,使四膜虫最终悬浮于去离子水中,并调整细胞密度为6×105cells/mL,准备上样。
5、上机检测
上样前,每个样品加入体积比为10%的EQTM四元素校准磁珠溶液,使用采用Helios质谱流式细胞仪(Fluidigm,USA)检测样品,所用雾化器内径为100μm,进样流速30μL/min,采集模式为“event mode”,每个样品收集10000events(仪器收集到的信号数量)。对于“event”的定义:CyTOF每13μs进行一次数据采集,所有进入仪器的液体将被雾化器雾化成为极小的液滴,这些液滴将被离子化成为一团“离子云”,“离子云”中所有的信号都将被CyTOF采集,每团离子云可能经历多个13μs的采集成为一个信号,“event”定义为10-150个13μs范围内的信号。
6、数据处理计算浓度
用软件flowjo进行数据处理,也可在在质谱流式细胞术数据处理网站(www.cytobank.org)整理分析获得的数据。
(1)利用193Ir信号识别单个四膜虫细胞(集合S),并定义197Au信号强度(EIAu)大于5的四膜虫为Au positive(AuP,集合P)的四膜虫,小于等于5为Au negative(AuN),如图4。选择5作为界限的原因是在EIAu小于等于5条件下可保证未暴露组的AuP%≤1%(选择5作为界限时,对照组AuP占比大概只有0.23%)。
(2)根据此圈门规则,圈出所有样品的AuP群体,统计各样品中AuP群体占比和AuP群体的平均197Au信号强度(MEIAu),如图5。
(3)根据步骤(2)中AuP群体占比,检验是否与对照组有显著性差异(对暴露组和对照组进行独立样本t检验,当p<0.05时,认为有显著性差异),没有显著性差异的则认为其信号无法与对照组区分,不能用于浓度检测。该实施例中,所有暴露组AuP群体占比经检验均与对照组有显著差异,因此可以用于浓度检测和计算。
(4)根据步骤(2)结果,将各组数据进行归一化处理:计算每106个四膜虫细胞中的Au信号总强度(TCI,TCI=106×AuP%×MEIAu),拟合各组的TCI和对应纳米金颗粒暴露浓度相关曲线,如图6。所得标准曲线为C=TCI×3.13×10-5+2.35(R2=0.9906,剩余标准差SE=3.36),其中C为AuNPs的浓度(ng/L)。根据此标准曲线,该方法的准确定量检测限定义为TCI=3SE+intercept=12.43(intercept为该标准曲线的截距),即最低准确定量浓度为2.35ng/L。在此暴露浓度范围(2.35-100ng/L)内,根据样品的TCI,利用拟合的标准曲线可以计算出暴露浓度。
(5)另外,利用195Pt信号,可以圈出暴露后健康的和细胞膜通透的(死亡的)四膜虫群体(195Pt只能进入细胞膜通透的细胞),在检测样品中金属含量的同时得到四膜虫的生理信息如图7(集合Q),如20ng/L浓度暴露后的健康四膜虫百分比如图8。这样,在实际应用中,就可以在检测出水体金属含量的同时,得知该浓度的金属暴露是否会对生物造成影响(得到相应的毒性数据)。
7、对四膜虫细胞进行终浓度为20ng/L的AuNPs进行暴露,暴露方法如2中所述,并按照上述相同样品处理和检测方法进行样品检测获得其AuP与MEIAu值并计算得出TCI值(表1),根据标准曲线可以计算得出暴露浓度为18.69ng/L,与实际暴露值(20ng/L)比较,绝对误差为6.55%,可见本方法可以反应暴露浓度(水体或培养基中的金属纳米颗粒质量浓度)。
表1
注:表中数据依次为20ng/L AuNPs暴露组中四膜虫的AuP四膜虫占比,AuP四膜虫的197Au平均信号强度,每106个四膜虫细胞中197Au信号总强度以及根据标准曲线计算得出的AuNPs暴露浓度。
Claims (10)
1.一种检测待测样本中的待测金属元素含量的方法,包括如下步骤:
(A)利用细胞或单细胞生物对待测样本中的待测金属元素进行吸收富集;所述待测样本为含有所述待测金属元素的金属离子或金属纳米颗粒的溶液;
(B)用金属同位素A对步骤(A)处理后的细胞或单细胞生物进行标记;所述金属同位素A为所述待测金属元素外的其他金属同位素,能够同时标记存活的和死亡的所述细胞或单细胞生物;
(C)对步骤(B)处理后的细胞或单细胞生物进行单细胞质谱流式检测,得到所述待测金属元素的细胞信号强度值,进而计算得到所述待测样本中所述待测金属元素的含量;
其中,能够同时检测到所述金属同位素A和所述待测金属元素信号的为细胞信号,反之则为溶液中的信号;
所述待测金属元素的细胞信号强度值为各组中阳性的所述细胞或单细胞生物细胞的所述待测金属元素的细胞信号强度值的均值;所述待测金属元素的细胞信号强度值大于阈值的所述细胞或单细胞生物为阳性,反之则为阴性;
所述阈值满足如下条件:对照组中所述待测金属元素的细胞信号强度值高于所述阈值的所述细胞或单细胞生物数量小于等于总数的1%;
所述对照组按照如下处理:将不含有所述待测元素的溶液和所述细胞或单细胞生物的悬浮液或者培养有所述细胞或单细胞生物的培养液共同孵育6-48h;然后用所述金属同位素A对孵育后的所述细胞或单细胞生物进行标记;然后进行单细胞质谱流式检测,得到所述待测金属元素的细胞信号强度值;
步骤(C)中,根据所述待测金属元素的细胞信号强度值计算所述待测样本中所述待测金属元素的含量是通过标准曲线法实现的;
所述待测样本中的所述待测金属元素的浓度为100ng/L以下。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(C)中,在根据所述待测金属元素的细胞信号强度值计算所述待测样本中所述待测金属元素的含量的过程中,采用的标准曲线是按照包括如下步骤的方法获得的:
(a)利用所述细胞或单细胞生物对系列标准品溶液中的所述待测金属元素进行吸收富集;所述系列标准品溶液为系列所述待测金属元素浓度已知的金属离子或金属纳米颗粒的溶液;
(b)用所述金属同位素A对步骤(a)处理后的细胞或单细胞生物进行标记;
(c)对步骤(b)处理后的细胞或单细胞生物进行单细胞质谱流式检测,得到所述待测金属元素的细胞信号强度值和所述待测金属元素浓度之间的标准曲线。
3.一种检测细胞或单细胞生物对待测金属元素的生理反应情况的方法,包括如下步骤:
(a’)利用所述细胞或单细胞生物对供试溶液中的待测金属元素进行吸收富集;所述供试溶液为所述待测金属元素浓度已知的金属离子或金属纳米颗粒的溶液;
(b’)用金属同位素A和金属同位素B对步骤(a’)处理后的细胞或单细胞生物进行标记;所述金属同位素A为所述待测金属元素外的其他金属同位素,能够同时标记存活的和死亡的所述细胞或单细胞生物;所述金属同位素B为所述待测金属元素和所述金属同位素A外的其他金属同位素,仅能够标记死亡的所述细胞或单细胞生物;
(c’)对步骤(b’)处理后的细胞或单细胞生物进行单细胞质谱流式检测,先根据所述金属同位素A的信号分离出单细胞,记为集合S;然后从集合S中分离出所述待测金属元素的细胞信号强度值大于阈值的所述细胞或单细胞生物,记为集合P;从集合S中获得不带有所述金属同位素B的信号的个体,记为集合Q;所述集合Q中的个体数和所述集合P中的个体数的比值即反映所述细胞或单细胞生物对所述待测金属元素的生理反应;
所述阈值满足如下条件:对照组中所述待测金属元素的细胞信号强度值高于所述阈值的所述细胞或单细胞生物数量小于等于总数的1%;
所述对照组按照如下处理:将不含有所述待测元素的溶液和所述细胞或单细胞生物共同孵育6-48h;然后用所述金属同位素A对孵育后的所述细胞或单细胞生物进行标记;然后进行单细胞质谱流式检测,得到所述待测金属元素的细胞信号强度值;
所述供试溶液中的所述待测金属元素的浓度为100ng/L以下。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:在步骤(A)、(a)和(a’)中,利用所述细胞或单细胞生物对所述待测金属元素进行吸收富集是按照包括如下步骤的方法进行的:将所述待测样本或所述系列标准品溶液或所述供试溶液和所述细胞或单细胞生物的悬浮液或者培养有所述细胞或单细胞生物的培养液共同孵育6-48h。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:在所述悬浮液或所述培养液中所述细胞或单细胞生物的起始密度为2×105~1×106个/mL。
6.根据权利要求1或3所述的方法,其特征在于:所述细胞或单细胞生物为单细胞藻类、单细胞原生动物或巨噬细胞。
7.根据权利要求1或3所述的方法,其特征在于:所述金属同位素A为193Ir或103Rh或镧系金属同位素。
8.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述金属同位素B为195Pt。
9.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:在步骤(C)、(c)和(c’)中,进行所述单细胞质谱流式检测后,每组样本收集5000-10000个events进行数据分析。
10.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述细胞或单细胞生物为四膜虫。
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