CN104964942B

CN104964942B - 一种可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法

Info

Publication number: CN104964942B
Application number: CN201510373724.5A
Authority: CN
Inventors: 付凤富; 张红艳; 阮雅娟
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2015-07-01
Publication date: 2017-09-22
Anticipated expiration: 2035-07-01
Also published as: CN104964942A

Abstract

本发明属于水环境中痕量离子的检测领域，具体涉及一种可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法。该方法主要为：将对UO₂ ²⁺具有特异性识别的DNAzyme固定在磁珠表面，在纳米金表面预组装辣根过氧化物酶；然后利用UO₂ ²⁺对DNAzyme的切割作用和DNA的杂交反应实现磁珠与纳米金的连接，经过外磁场的分离收集后，辣根过氧化物酶高效催化H₂O₂氧化四甲基联苯胺使溶液由无色变为蓝色，从而实现对UO₂ ²⁺离子的灵敏、特异可视化快速检测。该方法因具有灵敏度高、特异性强、抗基体干扰强、简单快速和低成本等优点，可用于各种水样品中痕量UO₂ ²⁺离子的现场快速可视化检测。

Description

一种可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法

技术领域

本发明属于水环境中痕量离子的检测领域，具体涉及一种可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法。

背景技术

铀是一种天然放射性元素，含有三种放射性同位素铀-234、铀-235和铀-238，各同位素的自然丰度分别为²³⁴U（0.0050-0.0059%）、²³⁵U（0.7198-0.7202%）、²³⁸U（99.2739-99.2752%）。铀的放射性大约48%来自于²³⁴U，2.2%来自于²³⁵U，48.9%来自于²³⁸U。铀的放射性同位素半衰期特别长，分别为²³⁴U （24.4万年）、²³⁵U（7.1亿年）、²³⁸U（45亿年）。随着经济和科学技术的发展，工业化进程随之加快，铀作为一种重要的战略能源，因其密度高、韧性好等优势在军事以及工商业领域的应用也越来越广泛。例如铀不仅是核武器和核电反应堆的重要原料，还可用于制作飞机上的平衡物和压舱物、放射性治疗用的医疗设备上的辐射盾牌、运输放射性材料的容器等。随着时代和经济发展的需要，越来越多的铀矿被开采利用。在铀的转运、加工等过程中，人类暴露于铀污染的机会越来越多，受到伤害的可能性也与日俱增。个体暴露于含铀的环境中，常常是通过日常接触的土壤、呼吸的空气、食用被铀污染的水和食物等方式受到铀的伤害。铀对人体的危害主要来自于其潜在的化学毒性和放射毒性。据文献报道，铀的化学基因毒性类似于六价铬，而铀的放射毒性与受到的辐射强度密切相关。高剂量的放射性损害主要造成肾损伤、肺癌和泌尿系统疾病。而长期低剂量放射常会造成遗传方面的损害。因为铀的半衰期很长，对人体和环境造成的污染和伤害往往是长期的。因此，对于环境中痕量铀污染的检测和预警有着非常重要的意义，是避免人类遭受铀辐射伤害的最有效方法之一。

铀酰离子(UO₂ ²⁺)是铀在水环境中的主要存在形式。目前用于水环境中痕量铀酰离子(UO₂ ²⁺)检测的主要方法有射线检测法、X射线荧光法、原子光谱法和ICP-MS法等。这些方法需要价格昂贵的精密仪器和复杂费时的前处理过程，无法满足现场快速检测的需要。近年来，一些简便易行的铀酰离子(UO₂ ²⁺)传感方法被开发，以满足铀酰离子(UO₂ ²⁺)现场快速检测的需求。但是已有的传感检测方法或因灵敏度较低、选择性差，或因抗基质干扰能力较低，无法用于实际环境水样中痕量铀酰离子(UO₂ ²⁺)的现场快速检测。

发明内容

本发明的目的在于针对环境水样中痕量铀酰离子高灵敏、高选择性现场快速检测的技术难题，提供一种可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法。该方法通过裸眼观测混合溶液颜色变化或应用紫外分光光度计测试溶液的吸光度即可实现对UO₂ ²⁺进行半定量及定量快速检测，具有灵敏度高、特异性强、抗基体干扰强、简单快速和低成本等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法，将对UO₂ ²⁺具有特异性识别的DNAzyme固定在磁珠表面，在纳米金表面预组装辣根过氧化物酶；然后利用UO₂ ²⁺对DNAzyme的切割作用和DNA的杂交反应实现磁珠与纳米金的连接，经过外磁场的分离收集后，辣根过氧化物酶高效催化H₂O₂氧化四甲基联苯胺使溶液由无色变为蓝色，从而实现对UO₂ ²⁺离子的灵敏、特异可视化快速检测。

所述的可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）DNAzyme功能化磁珠储备液的制备；

（2）固定有连接探针的纳米金悬浮溶液的制备；

（3）辣根过氧化物酶修饰的信号探针溶液的制备；

（4）实际水样中痕量UO₂ ²⁺的可视化检测：取10 μL的实际水样与步骤（1）制备的50μL DNAzyme功能化磁珠储备液混匀，室温下振荡1 h；在磁铁作用下分离磁珠后，用100 μLPBS缓冲液洗涤3次，随后加入50 μL步骤（2）制备的固定有连接探针的纳米金悬浮溶液，混匀后，在37 ℃下恒温振荡1 h，得到连接有纳米金的磁珠悬浮液；在磁铁作用下分离磁珠后，用100 μL的PBS缓冲液洗涤3次，加入30 μL步骤（3）制备的辣根过氧化物酶修饰的信号探针溶液，混匀后，在37 ℃下恒温振荡30 min；在磁铁作用下，用100 μL的PBS缓冲液清洗5次后，加入300 μL 四甲基联苯胺/H₂O₂溶液，振摇20 min后通过裸眼观测混合溶液颜色变化（随着UO₂ ²⁺浓度的增大，颜色由无色逐渐变为蓝色，由浅至深变化）或应用紫外分光光度计测试溶液的吸光度对UO₂ ²⁺进行半定量及定量快速检测。

步骤（1）具体为：

DNAzyme溶液的制备方法为：取 2.0 μL 0.18 μM 的底物链DNA，序列为：5’-biotin-ATATAT TGT CCG TGC TAG AAG GAA CTC ACT AT rA GGA AGA GAT GGA CGT G-3’和2.0 μL 0.36 μM 酶链DNA，序列为：5’-CAC GTC CAT CTC TGC AGT CGG GTA GTT AAACCG ACC TTC AGA CAT AGT GAG T-3’，混合于46 μL的 MES杂交缓冲液中，升温至85 ℃反应2 min后，以1 ℃/min的速度冷却至室温，得到双链DNAzyme溶液；

在50 μL DNAzyme溶液中，加入10 μL 1 mg/mL磁珠分散液（表面修饰Streptavidin（链霉亲和素）；直径约为1 μm），混合均匀；混合溶液在37 ℃下恒温振荡30min使DNAzyme均匀地固定在磁珠表面；用磁铁分离固定有DNAzyme的磁珠，并用100 μL MES杂交缓冲液清洗3次后，把固定有DNAzyme的磁珠分散在50 μL MES杂交缓冲液中，0-4℃存储备用。

步骤（2）具体为：将5 μL 10 ppm金纳米粒子（表面修饰Streptavidin（链霉亲和素）；直径：15 nm）和5 μL 10 μM连接探针DNA，其序列为5’-biotin-AAA AAT AGT GAG TT-3’，加入到40 μL PBS缓冲液中，混匀后在37 ℃下恒温振荡1 h，制得连接探针修饰的纳米金悬浮溶液，0-4℃存储备用。

步骤（3）具体为：将2.5 μL 10 μM信号探针5’-biotin-ATATAT TGT CCG TGC TAGAAG GAA CTC ACT AT-3’和2.5 μL 0.02 mg/mL 辣根过氧化物酶溶液加入到25 μL PBS缓冲液中，混匀后，在37 ℃下恒温振荡30 min，制得辣根过氧化物酶修饰信号探针溶液，0-4℃存储备用。

所述的MES（2-(N-吗啡啉)乙磺酸）杂交缓冲液为：50 mM MES，300 mM NaNO₃，pH=5.5。

步骤（4）所述的PBS缓冲液为：10 mM、pH=7.4。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明利用固定在磁珠（MBs）上的对铀酰离子具有特异性识别和切割作用的DNAzyme作为UO₂ ²⁺的识别探针、辣根过氧化物酶（HRP）催化氧化TMB /H₂O₂产生颜色变化作为信号、纳米金作为信号放大工具，实现对水样中痕量UO₂ ²⁺的可视化快速检测；所建立的可视化检测方法具有灵敏度高、选择性好、抗基体干扰能力强、简单快速等优点，克服了传统UO₂ ² ⁺离子检测方法仪器昂贵、前处理操作复杂等缺点，可用于水样中痕量铀酰离子的现场快速和低成本检测；通过裸眼观测可目视检测低至0.02 ppb的UO₂ ²⁺离子，可满足实际水样中痕量UO₂ ²⁺离子的现场快速检测需要，无需借助大型昂贵的仪器；

（2）本发明的方法操作简单，检测速度快，检测整个过程在2.5小时之内完成，检测成本低，一个样品检测成本低于2.5元；

（3）本发明所建立的检测方法具有良好的选择性，其它常见离子（Mg²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、 La³⁺、Lu³⁺），不干扰UO₂ ²⁺离子的检测；

（4）本发明所建立的检测方法具有良好的抗基质干扰能力，检测水样无需复杂的前处理过程，只需要过滤去除水样中的沙土及悬浮物，便可立即检测。

附图说明

图1是利用所建立的方法检测不同浓度UO₂ ²⁺离子时溶液颜色的变化图；

图2是利用所建立的方法检测UO₂ ²⁺离子的特异性验证；相对于10种浓度高于UO₂ ²⁺离子1000倍的其它常见离子（如Mg²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、 La³⁺、Lu³⁺），只有UO₂ ²⁺离子存在时体系的颜色才发生明显变化。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

（1）DNAzyme功能化磁珠的制备：取 2.0 μL浓度为 0.18 μM 的底物链DNA（序列为：5’-biotin-ATATAT TGT CCG TGC TAG AAG GAA CTC ACT AT rA GGA AGA GAT GGA CGTG-3’）和2.0 μL浓度为 0.36 μM 的酶链DNA（序列为：5’-CAC GTC CAT CTC TGC AGT CGGGTA GTT AAA CCG ACC TTC AGA CAT AGT GAG T-3’）混合于46 μL的 MES杂交缓冲液（50mM MES，300 mM NaNO₃，pH=5.5）中，升温至85 ℃反应2 min后以1 ℃/min的速度冷却至室温，得到双链DNAzyme溶液；接着，加入10 μL浓度为1 mg/mL的磁珠分散液（表面修饰Streptavidin；直径：约1 μm），混合溶液在37 ℃下恒温振荡30 min使DNAzyme均匀地固定在磁珠表面。用磁铁分离固定有DNAzyme双链的磁珠，并用100 μL MES杂交缓冲液清洗三次后，把固定有DNAzyme双链的磁珠分散在50 μL的MES杂交缓冲液中，0-4℃存储备用；

（2）连接探针功能化纳米金(L_P-AuNPs）的制备：将5 μL浓度为 10 ppm的AuNPs（表面修饰Streptavidin；直径：15 nm）和5 μL浓度为 10 μM的连接探针DNA（L_P，5’-biotin-AAA AAT AGT GAG TT-3’）加入到40 μL的 PBS缓冲液（10 mM， pH=7.4）中，混匀后在37 ℃下恒温振荡1 h，制得连接探针修饰的AuNPs（L_P-AuNPs）溶液，0-4℃存储备用。

（3）HRP修饰信号探针（HRP-S_P）的制备：将2.5 μL 浓度为10 μM的信号探针（S_P，5’-biotin-ATATAT TGT CCG TGC TAG AAG GAA CTC ACT AT-3’）和2.5 μL浓度为0.02 mg/mL的 HRP溶液加入到25 μL的 PBS缓冲液中，混匀后，在37 ℃下恒温振荡30 min，制得HRP-S_P溶液，0-4℃存储备用；

（4）实际水样中痕量UO₂ ²⁺的可视化检测：在浓度为0.02至15 ppb范围内，取3至4个不同浓度UO₂ ²⁺标准溶液各10 μL，与50 μL步骤（1）制备的DNAzyme功能化的磁珠分散液混匀，室温下，振荡1 h；在磁铁作用下分离磁珠后，用100 μL的PBS缓冲液洗涤3次，再加入50μL步骤（2）制备的固定有连接探针的纳米金悬浮液（AuNPs-L_P），37 ℃下恒温振荡1 h；在磁铁作用下分离磁珠后，用100 μL的PBS缓冲液洗涤3次，再加入30 μL步骤（3）制备的 HRP-S_P，混匀后37 ℃下恒温振荡30 min；在磁场作用下分离磁珠后，用100 μL PBS缓冲液洗涤5次，加入300 μL TMB/H₂O₂溶液，振摇20 min后通过裸眼观测颜色变化或通过紫外分光光度计测定吸光度，用作比对标准。

实施例2

取10 μL 经0.22 μm滤膜过滤的闽江水样，按照实施例1的方法进行操作，最后观测颜色变化，对照实施例1所得的标准UO₂ ²⁺离子溶液的颜色或吸光度，对水样中的UO₂ ²⁺离子进行半定量或定量检测，检测结果如表1所示，与ICP-MS的测定结果基本相同，说明本发明的方法是一种可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法，适合于现场检测。

表1利用所建立的方法对闽江水样中UO₂ ²⁺离子的分析结果及与ICP-MS检测结果的对比

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atatattgtc cgtgctagaa ggaactcact atraggaaga gatggacgtg 50

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacgtccatc tctgcagtcg ggtagttaaa ccgaccttca gacatagtga gt 52

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

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<400> 3

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<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atatattgtc cgtgctagaa ggaactcact at 32

Claims

1.一种可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）DNAzyme功能化磁珠储备液的制备；

（2）固定有连接探针的纳米金悬浮溶液的制备：将5 μL 10 ppm金纳米粒子和5 μL 10μM连接探针DNA，其序列为5’-biotin-AAA AAT AGT GAG TT-3’，加入到40 μL PBS缓冲液中，混匀后在37 ℃下恒温振荡1 h，制得连接探针修饰的纳米金悬浮溶液，0-4℃存储备用；

（3）辣根过氧化物酶修饰的信号探针溶液的制备：将2.5 μL 10 μM信号探针5’-biotin-ATATAT TGT CCG TGC TAG AAG GAA CTC ACT AT-3’和2.5 μL 0.02 mg/mL 辣根过氧化物酶溶液加入到25 μL PBS缓冲液中，混匀后，在37 ℃下恒温振荡30 min，制得辣根过氧化物酶修饰信号探针溶液，0-4℃存储备用；

（4）实际水样中痕量UO₂ ²⁺的可视化检测：取10 μL的实际水样与步骤（1）制备的50 μLDNAzyme功能化磁珠储备液混匀，室温下振荡1 h；在磁铁作用下分离磁珠后，用100 μL PBS缓冲液洗涤3次，随后加入50 μL步骤（2）制备的固定有连接探针的纳米金悬浮溶液，混匀后，在37 ℃下恒温振荡1 h，得到连接有纳米金的磁珠悬浮液；在磁铁作用下分离磁珠后，用100 μL的PBS缓冲液洗涤3次，加入30 μL步骤（3）制备的辣根过氧化物酶修饰的信号探针溶液，混匀后，在37 ℃下恒温振荡30 min；在磁铁作用下，用100 μL的PBS缓冲液清洗5次后，加入300 μL 四甲基联苯胺/H₂O₂溶液，振摇20 min后通过裸眼观测混合溶液颜色变化或应用紫外分光光度计测试溶液的吸光度对UO₂ ²⁺进行半定量及定量快速检测。

2.根据权利要求1所述的可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法，其特征在于：步骤（1）具体为：在50 μL DNAzyme溶液中，加入10 μL 1 mg/mL磁珠分散液，混合均匀；混合溶液在37 ℃下恒温振荡30 min使DNAzyme均匀地固定在磁珠表面；用磁铁分离固定有DNAzyme的磁珠，并用100 μL MES杂交缓冲液清洗3次后，把固定有DNAzyme的磁珠分散在50μL MES杂交缓冲液中，0-4℃存储备用。

3.根据权利要求2所述的可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法，其特征在于：所述的DNAzyme溶液的制备方法为：取 2.0 μL 0.18 μM 的底物链DNA，序列为：5’-biotin-ATATAT TGT CCG TGC TAG AAG GAA CTC ACT AT rA GGA AGA GAT GGA CGT G-3’和2.0 μL0.36 μM 酶链DNA，序列为：5’-CAC GTC CAT CTC TGC AGT CGG GTA GTT AAA CCG ACC TTCAGA CAT AGT GAG T-3’，混合于46 μL的 MES杂交缓冲液中，升温至85 ℃反应2 min后，以1℃/min的速度冷却至室温，得到双链DNAzyme溶液。

4.根据权利要求3所述的可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法，其特征在于：所述的MES杂交缓冲液为：50 mM MES，300 mM NaNO₃，pH=5.5。

5.根据权利要求1所述的可视化快速检测水环境中痕量铀酰离子的方法，其特征在于：步骤（4）所述的PBS缓冲液为：10 mM、pH=7.4。