CN111157501A - 一种细胞内纳米银和银离子定量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，所述测定方法方法简单便捷，通过建立银离子的质量与银离子的荧光强度的回归方程，进一步对纳米银和银离子的各自的荧光强度的检测，结合回归方程计算得到银离子的浓度；再进行纳米银和银离子总浓度的确定，进而计算得到纳米银的浓度。该方法可实现在不破坏细胞的条件下，采用不同的荧光探针有效地将纳米银的信号与银离子的信号进行区分，同时通过建立银离子的回归方程，进而对细胞内的纳米银以及银离子进行定量测定，该方法检测速度快、检测灵敏度高，选择性强，对细胞菌体没有破坏，可实现对细胞的无损分析。

Description

一种细胞内纳米银和银离子定量的测定方法
技术领域
本发明涉及纳米银和银离子定量测定领域，尤其涉及一种细胞内纳米银和银离子定量的测定方法。
背景技术
随着纳米科技的飞速发展，纳米产品在日常生活中日益增多，其中纳米银(silvernanoparticles,AgNPs)因其优越的抗菌杀菌特性而成为目前应用最为广泛的纳米材料之一，广泛应用于医疗产品，纺织业以及水质净化等各个领域。然而，在纳米材料被广泛应用的同时，其不可避免的被释放到环境水体中，被水生生物摄入，从而对水生生物产生毒性。
纳米材料因其纳米级别尺寸效应，很可能生物体的自然防御系统，进入细胞并破坏细胞的功能。而细胞作为所有生物最基本的结构和功能的单位，细胞在纳米材料毒理学研究中有着非常重要的地位。更为复杂的是，纳米材料进入到细胞后，会因为其特殊的性质，例如尺寸，表面电荷等，在细胞内分布于不同的细胞器内，对特定的细胞器产生毒性效应，最终影响到生物体的生命活动。同时，细胞内的纳米银会经历一系列不同的环境体系，不可避免的会释放出一定浓度的银离子，而释放出的银离子会与一些功能性蛋白质，氨基酸等结合，会对细胞产生毒性，因此纳米银在细胞内的迁移转化，溶解释放过程会增加对纳米银的毒性机制的判断的难度。因此有必要建立适当的分析方法，对细胞内纳米银和银离子的浓度进行测定，以便于对纳米银的毒性机制进行深入研究。
细胞内纳米银和银离子的浓度的测定对于纳米银的毒性机制研究有着重要意义，尤其是对细胞内纳米银和银离子进行无损地定量分析是纳米毒理学研究的热点。目前只有少量研究实现了细胞内纳米银和银离子的种类以及各组分浓度定量测定。例如Liu等利用浊点萃取技术(Cloud point extraction，CPE)实现对细胞内纳米银和银离子的测定，他们首先将细胞进行破碎处理，依次加入1mol/L的Na2S2O3以及10％(w/v)表面活性剂Triton X-114(TX-114)，在一定的温度和pH条件下，纳米银被萃取到表面活性剂层，而银离子被遗留在水溶液层，最后用微波消解对细胞裂解液整体溶液中银浓度的测定以及表面活性剂层中银浓度的测定，基于此技术，可以测定细胞内总的银的浓度以及纳米银的浓度。然而，此技术首先需要对细胞进行裂解处理，并不能保留细胞的完整信息，并不能实现细胞内纳米银和银离子信息的原位分析。另外，将细胞裂解处理过程中，需要加入表面活性剂等试剂以实现纳米银和银离子的分离，但是在操作过程中可能导致纳米银的进一步溶解。Veronesi等利用同步辐射基纳米束X射线荧光显微镜实现了对细胞内纳米银的溶解动力学过程的可视化实时追踪。首先利用同步加速器纳米探针可实现内细胞内银的分布信息的监测同时也可实现对银浓度的测定，通过与电镜技术的联用，可以进一步区分纳米银和银离子。另外通过x射线吸收光谱法可实现细胞内纳米银的浓度动力学过程的监测。然而此方法存在一些问题，首先通过同步辐射技术并不能很好的区分纳米银和银离子，而电镜技术虽然可以区分纳米银和银离子，但是细胞内的银离子在一定条件下也可以被还原成纳米银，因此对于细胞内纳米银的来源并不能得到确切的信息。最重要的是同步辐射技术价格昂贵，适用性不高。相比于其他技术，Pompa等利用银离子荧光探针，实现了对细胞内银离子的测定，以及纳米银释放银离子动力学过程的研究。然而，银离子探针的生物相容性、选择性以及灵敏度对细胞内银离子检测起着决定性作用。另外，此方法只可能用于半定量测定，即利用荧光信号强度进行相对定量分析，并不能定量测定细胞内纳米银以及银离子的浓度。Yan等利用具有特异性识别银离子的荧光探针(TEZ-TPE-1)对实现对溶液银离子的测定，同时可实现对不同粒径以及不同形态的纳米银材料溶解释放银离子动力学过程进行监测，并且此技术被进一步应用于水生生物肠道内纳米银溶解动力学过程的检测。
目前的测定方法仍存在以下缺陷：在不破坏细胞的条件下，无法有效地将纳米银的信号与银离子的信号进行区分，无法同时对细胞内的纳米银以及银离子进行定量测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，旨在解决现有测定方法中，在不破坏细胞的条件下，无法有效地将纳米银的信号与银离子的信号进行区分，无法同时对细胞内的纳米银以及银离子进行定量测定的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：
提供N组含有不同浓度银离子的第一细胞培养基，且N大于等于5；采用所述第一细胞培养基分别对细胞进行培养，收集胞内含有不同浓度银离子的细胞；采用银离子探针分别与所述含有不同浓度银离子的细胞进行孵化得到第一细胞，分别检测各所述第一细胞中银离子的荧光强度，并分别计算各所述第一细胞中银离子的质量；根据所述第一细胞中银离子的荧光强度与所述第一细胞中银离子的质量绘制标准曲线，获取回归方程；
提供含有纳米银和银离子的第二细胞培养基，其中，所述纳米银为表面结合荧光探针的纳米银；采用所述第二细胞培养基培养待测细胞，收集培养得到的待测细胞，采用银离子探针与所述培养得到的待测细胞进行孵化得到第二细胞；分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度；测定所述第二细胞中纳米银和银离子的总浓度；
根据所述回归方程和所述第二细胞中银离子的荧光强度，分析得到所述第二细胞中银离子的质量并计算所述第二细胞中银离子的浓度；根据所述第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度和所述第二细胞中银离子的浓度计算得到所述第二细胞中纳米银的浓度。
与现有技术相比，本发明所述的细胞内纳米银和银离子定量的测定方法中，首先采用N组含有不同浓度银离子的细胞培养基分别对细胞进行培养，且N大于等于5；本发明选择使用含有不同浓度银离子的细胞培养基进行培养，并采用银离子探针进行孵化，使细胞具有可检测的荧光强度，且N大于等于5，确保有一定数量不同浓度的样品能够绘制标准曲线进行后续的实验分析。
其次，对采用含有银离子的培养基培养及采用银离子探针进行孵化得到的细胞直接进行检测，得到该细胞的荧光强度，即细胞内银离子的荧光强度；同时，测定细胞中银离子的质量，由于在不同细胞密度下，细胞中银离子的浓度不能较准确地反映银离子的量，故通过换算得到银离子的质量，根据所述细胞的荧光强度与所述细胞中银离子的质量绘制标准曲线，获取回归方程。
再提供待测细胞，将待测细胞采用含有纳米银和银离子的细胞培养基进行培养，其中，所述纳米银和银离子分别采用不同的纳米银荧光探针和银离子荧光探针进行标记，一方面使培养后得到的细胞可直接进行检测，另一方面使纳米银的信号与银离子的信号有效得形成区分，即可分别直接得到纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度。
同时直接测定细胞中纳米银和银离子的总浓度；再根据上述回归方程，即可计算得到待测细胞中银离子的浓度；进一步根据细胞中纳米银和银离子的总浓度和银离子的浓度可直接计算得到待测细胞中纳米银的浓度。
综上所述，该方法简单便捷，通过建立银离子的质量与银离子的荧光强度的回归方程，进一步对纳米银和银离子的各自的荧光强度的检测，结合回归方程计算得到银离子的浓度；再进行纳米银和银离子总浓度的确定，进而计算得到纳米银的浓度。该方法可实现在不破坏细胞的条件下，采用不同的荧光探针有效地将纳米银的信号与银离子的信号进行区分，同时通过建立银离子的回归方程，进而对细胞内的纳米银以及银离子进行定量测定，该方法检测速度快、检测灵敏度高，选择性强，对细胞菌体没有破坏，可实现对细胞的无损分析。
附图说明
图1是本发明实施例提供的不同浓度的TZE-TPE-1对ZF4细胞系的毒性。
图2是本发明实施例提供的银离子的浓度和荧光强度的关系。
图3是本发明实施例提供的不同银离子浓度下，流式细胞仪检测得到的银离子的荧光强度。
图4是本发明实施例提供的银离子浓度与银离子荧光强度的标准曲线图。
图5是本发明实施例提供的细胞内纳米银和银离子定量的测定的流程图。
图6是本发明实施例提供的AIE-纳米银的表征图；图6a是TEM对AIEgens包裹的纳米银的表征图；图6b是EDS对AIEgens包裹的纳米银的表征图。
图7是本发明实施例提供的AIE-纳米银的荧光强度图。
图8是本发明实施例提供的流式细胞对银离子、纳米银、银离子和纳米银的混合物的荧光强度检测结果；图8a是流式细胞仪检测单独银离子的信号结果，图8b是流式细胞仪检测单独纳米银的信号结果，图8c是流式细胞仪检测检测银离子和纳米银的混合物的信号结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实例提供一种细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：
S01.提供N组含有不同浓度银离子的第一细胞培养基，且N大于等于5；采用所述第一细胞培养基分别对细胞进行培养，收集胞内含有不同浓度银离子的细胞；采用银离子探针分别与所述含有不同浓度银离子的细胞进行孵化得到第一细胞，分别检测各所述第一细胞中银离子的荧光强度，并分别计算各所述第一细胞中银离子的质量；根据所述第一细胞中银离子的荧光强度与所述第一细胞中银离子的质量绘制标准曲线，获取回归方程；
S02.提供含有纳米银和银离子的第二细胞培养基，其中，所述纳米银为表面结合荧光探针的纳米银；采用所述第二细胞培养基培养待测细胞，收集培养得到的待测细胞，采用银离子探针与所述培养得到的待测细胞进行孵化得到第二细胞；分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度；测定所述第二细胞中纳米银和银离子的总浓度；
S03.根据所述回归方程和所述第二细胞中银离子的荧光强度，分析得到所述第二细胞中银离子的质量并计算所述第二细胞中银离子的浓度；根据所述第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度和所述第二细胞中银离子的浓度计算得到所述第二细胞中纳米银的浓度。
具体的，在上述步骤S01中，提供N组含有不同浓度银离子的第一细胞培养基，且N大于等于5；采用细胞培养基分别对细胞进行培养，收集含有不同浓度银离子的细胞；采用银离子探针与所述含有不同浓度银离子的细胞进行孵化得到第一细胞，检测所述第一细胞的荧光强度。
在一些实施例中，所述细胞选自各类鱼的细胞，本发明实施例可对各类鱼的细胞内纳米银和银离子的浓度进行检测。优选的，将选取的细胞先进行传代培养，选择对数期的细胞进行后续试验。在本发明优选实施例中，所述细胞选自年龄为一天的斑马鱼幼体细胞；进一步地，以添加有10％的胎牛血清的DMEM培养基作为培养液，将斑马鱼幼体细胞放置于所述培养液中在28℃的条件下进行培养。
具体的，提供N组含有不同浓度银离子的第一细胞培养基，且N大于等于5；当选择大于等于5组含有不同浓度银离子的细胞培养基进行细胞培养，确保有一定数量不同浓度的样品能够绘制标准曲线进行后续的实验分析。优选的，提供5组含有不同浓度银离子的细胞培养基。在本发明优选实施例中，所述提供的5组含有不同浓度银离子的培养基，所述不同浓度分别为200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、5000μg/L。具体的，采用所述第一细胞培养基分别对细胞进行培养，收集胞内含有不同浓度银离子的细胞，所述培养的时间为24～26小时；若培养时间过长，则银离子对细胞会有一定的毒性影响；若培养时间过短，则银离子在细胞中的累积量过少，不利于后续试验。在本发明优选实施例中，所述培养的时间为24小时。优选的，待培养结束，去除所述细胞培养基，并采用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3～5次，目的是将未进入细胞内的银离子进行清洗，收集胞内含有不同浓度银离子的细胞。
具体的，采用银离子探针分别与所述含有不同浓度银离子的细胞进行孵化得到第一细胞，分别检测各所述第一细胞中银离子的荧光强度。优选的，所述银离子探针选自TEZ-TPE-1，选择TEZ-TPE-1作为银离子探针，能够使银离子具有荧光强度，进而方便对银离子进行检测。优选的，所述TEZ-TPE-1的浓度为5μmol/L～10μmol/L，选择浓度为5μmol/L～10μmol/L的银离子探针TEZ-TPE-1与所述含有不同浓度银离子的细胞进行孵化，保证在上述浓度条件下，所述银离子探针TEZ-TPE-1对细胞没有明显毒性效应，不会对细胞造成损害。在本发明优选实施例中，所述TEZ-TPE-1的浓度为10μmol/L。
进一步优选的，采用银离子探针分别与所述含有不同浓度银离子的细胞进行孵化得到第一细胞的步骤中，所述孵化的时间为2～4小时；若孵化时间过长，则银离子探针对细胞会有一定的毒性影响；若孵化时间过短，则银离子探针在细胞中的累积量过少，不利于后续试验。在本发明优选实施例中，所述孵化的时间为2小时。
优选的，待孵化结束，去除所述培养基，并采用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3～5次，目的是将未进入细胞内的银离子探针进行清洗，收集第一细胞。进一步优选的，还包括对所述第一细胞进行消化处理，所述消化处理的步骤为：添加胰蛋白酶对贴壁细胞进行消化得到第一细胞混合液，将所述第一细胞混合液在3000rpm的条件下离心处理1分钟，去除上清，在第一细胞沉淀中加入PBS溶液，混匀得到待检测的第一细胞。
优选的，分别检测各所述第一细胞中银离子的荧光强度的步骤中，采用流式细胞仪进行检测。优选的，在测定荧光强度之前，选取商业BDTMCS&T荧光颗粒，对流式细胞仪的电压、荧光干扰、阈值/触发信号，圈门和设门进行优化。自动优化完成后，对第一细胞进行分析。根据流式细胞仪分析结果中的前向角散射光，侧向角散射光可以反映细胞的大小以及内部结构的复杂程度。同时，测定得到第一细胞中银离子的荧光强度。
进一步，分别计算各所述第一细胞中银离子的质量，由于在不同细胞密度下，细胞中银离子的浓度不能较准确地反映银离子的量，故通过换算得到银离子的质量。
优选的，计算各所述第一细胞中银离子的质量之前，还包括测定所述第一细胞中银离子的浓度；测定所述第一细胞中银离子的浓度的步骤之前，还包括将所述第一细胞进行第一预处理得到第一细胞液，其中，所述第一预处理包括如下步骤：将所述第一细胞进行破碎处理，再加入酸液进行消解处理得到第一细胞沉淀，在所述第一细胞沉淀加入溶液，混合得到第一细胞液。
优选的，所述加入的酸液选自盐酸、硫酸、硝酸的任意一种。在本发明优选实施例中，所述酸液选自68％HNO3溶液。进一步优选的，进行消解处理的步骤中，先在常温条件下进行消化处理2小时；再在80℃的条件下消化处理12小时。优选的，在所述第一细胞沉淀加入溶液的步骤中，所述溶液选自PBS溶液。优选的，所述第一细胞液中，第一细胞的浓度为10000cell/mL，若细胞含量过多或过少，则会影响浓度测定，使浓度测定数据不准确。在本发明优选实施例中，收集所述第一细胞的数目为100000，在所述第一细胞沉淀加入溶液，定容得到10mL第一细胞液。
优选的，测定所述第一细胞中银离子的浓度的步骤中，采用电感耦合等离子体质谱仪进行测定。进一步的，根据测定得到的银离子浓度计算所述第一细胞中银离子的质量，优选的，所述细胞内银离子的质量＝银离子的浓度×溶液体积×细胞浓度，根据上述计算公式，可计算得到所述第一细胞中银离子的质量，计算公式中将不同细胞密度进行计算，故通过计算可准备得到银离子的质量。
进一步的，根据所述第一细胞中银离子的荧光强度与所述第一细胞中银离子的质量绘制标准曲线，获取回归方程；由于选择的含有不同浓度银离子的细胞培养基的组数大于等于5，且每组采用三个平行样品进行测定。因此，制备得到的线性方程可信度高。
具体的，在上述步骤S02中，提供含有纳米银和银离子的第二细胞培养基，其中，所述纳米银为表面结合荧光探针的纳米银；采用所述第二细胞培养基培养待测细胞，收集培养得到的待测细胞，采用银离子探针与所述培养得到的待测细胞进行孵化得到第二细胞；分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度；测定所述第二细胞中纳米银和银离子的总浓度。
具体的，所述纳米银为表面结合荧光探针的纳米银，优选的，所述表面结合荧光探针的纳米银中，所述荧光探针选自AIE荧光探针，其中，所述AIE荧光探针为聚集诱导发光荧光探针，具有聚集诱导发光特性的荧光材料是指其内部分子聚集在一起时，彼此的牵制作用限制了分子内部的运动，因而经由运动形式耗散的能力比例降低，光输出形式的能量比例增加，从而表现了较强的荧光强度，利用具有聚集诱导发光特性的荧光材料包裹在纳米银的表面，有利于对纳米银进行分析。
进一步优选的，所述AIE荧光探针的浓度为0.8mg/L～1.0mg/L。选择浓度为0.8mg/L～1.0mg/L的AIE荧光探针包裹纳米银，保证在上述浓度条件下，所述AIE荧光探针对细胞没有明显毒性效应，不会对细胞造成损害。在本发明优选实施例中，所述AIE荧光探针的浓度为1.0mg/L。
具体的，提供含有纳米银和银离子的第二细胞培养基，采用所述第二细胞培养基培养待测细胞，收集培养得到的待测细胞，优选的，采用所述第二细胞培养基培养待测细胞的步骤中，所述培养的时间为24～26小时；若培养时间过长，则纳米银和银离子对细胞会有一定的毒性影响；若培养时间过短，则纳米银和银离子在细胞中的累积量过少，不利于后续试验。在本发明优选实施例中，所述培养的时间为24小时。优选的，待培养结束，去除所述细胞培养基，并采用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3～5次，目的是将未进入细胞内的纳米银和银离子进行清洗，收集含有纳米银和银离子的细胞。
具体的，采用银离子探针与所述培养得到的待测细胞进行孵化得到第二细胞；所述纳米银和银离子分别采用不同的纳米银荧光探针和银离子荧光探针进行标记，一方面使培养后得到的细胞可直接进行检测，另一方面使纳米银的信号与银离子的信号有效得形成区分，即可分别直接得到纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度。
优选的，所述银离子探针选自TEZ-TPE-1，选择TEZ-TPE-1作为银离子探针，能够使银离子具有荧光强度，进而方便对银离子进行检测。优选的，所述TEZ-TPE-1的浓度为5μmol/L～10μmol/L，选择浓度为5μmol/L～10μmol/L的银离子探针TEZ-TPE-1与所述含有不同浓度银离子的细胞进行孵化，保证在上述浓度条件下，所述银离子探针TEZ-TPE-1对细胞没有明显毒性效应，不会对细胞造成损害。在本发明优选实施例中，所述TEZ-TPE-1的浓度为10μmol/L。
优选的，采用银离子探针与所述培养得到的待测细胞进行孵化得到第二细胞的步骤中，所述孵化的时间为2～4小时；若孵化时间过长，则银离子探针对细胞会有一定的毒性影响；若孵化时间过短，则银离子探针在细胞中的累积量过少，不利于后续试验。在本发明优选实施例中，所述孵化的时间为2小时。
优选的，待孵化结束，去除所述培养基，并采用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3～5次，目的是将未进入细胞内的银离子探针进行清洗，收集第二细胞。进一步优选的，还包括对所述第二细胞进行消化处理，所述消化处理的步骤为：添加胰蛋白酶对贴壁细胞进行消化得到第二细胞混合液，将所述第二细胞混合液在3000rpm的条件下离心处理1分钟，去除上清，在第二细胞沉淀中加入PBS溶液，混匀得到待检测的第二细胞。
具体的，分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度。优选的，分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度的步骤中，采用流式细胞仪分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度。进一步优选的，采用流式细胞仪分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度的步骤中，所述第二细胞中纳米银的荧光强度采用PE作为检测的滤色镜，所述第二细胞中银离子的荧光强度采用Amcyan作为检测的滤色镜。采用不同的滤光片可以快速有效地区分不同的荧光信号。
优选的，在测定荧光强度之前，选取商业BDTMCS&T荧光颗粒，对流式细胞仪的电压、荧光干扰、阈值/触发信号，圈门和设门进行优化。自动优化完成后，对第一细胞进行分析。根据流式细胞仪分析结果中的前向角散射光，侧向角散射光可以反映细胞的大小以及内部结构的复杂程度。同时，测定得到第二细胞中纳米银和银离子的荧光强度。
进一步的，测定所述第二细胞中纳米银和银离子的总浓度；优选的，测定所述第二细胞中纳米银和银离子的总浓度的步骤之前，还包括将所述第二细胞进行第二预处理得到第二细胞液，其中，所述第二预处理包括如下步骤：将所述第二细胞进行破碎处理，再加入酸液进行消解处理得到第二细胞沉淀，在所述第二细胞沉淀加入溶液，混合得到第二细胞液。
优选的，所述加入的酸液选自盐酸、硫酸、硝酸的任意一种。在本发明优选实施例中，所述酸液选自68％HNO3溶液。进一步优选的，进行消解处理的步骤中，先在常温条件下进行消化处理2小时；再在80℃的条件下消化处理12小时。优选的，在所述第二细胞沉淀加入溶液的步骤中，所述溶液选自PBS溶液。优选的，所述第二细胞液中，细胞的浓度为10000cell/mL，若细胞含量过多或过少，则会影响浓度测定，使浓度测定数据不准确。在本发明优选实施例中，收集所述第二细胞的数目为100000，在所述第二细胞沉淀加入溶液，定容得到10mL第二细胞液。
具体的，测定所述第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度，优选的，测定所述第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度的步骤中，采用电感耦合等离子体质谱仪进行测定。
具体的，在上述步骤S03中，根据所述回归方程和所述第二细胞中银离子的荧光强度，分析得到所述第二细胞中银离子的质量并计算所述第二细胞中银离子的浓度；优选的，根据所述回归方程和所述第二细胞中银离子的荧光强度，分析得到所述第二细胞中银离子的质量，并通过“细胞内银离子的质量＝银离子的浓度×溶液体积×细胞浓度”上述公式，计算所述第二细胞中银离子的浓度。
进一步的，根据所述第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度和所述第二细胞中银离子的浓度计算得到所述第二细胞中纳米银的浓度。采用“第二细胞中纳米银的浓度＝第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度-第二细胞中银离子的浓度”的公式进行计算，即可得到所述第二细胞中纳米银的浓度。
在一些实施例中，当所述第二细胞中银离子的浓度为零，即所述第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度即为所述第二细胞中纳米银的浓度。
在一些实施例中，当所述第二细胞中银离子的浓度不为零，即第二细胞中纳米银的浓度＝第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度-第二细胞中银离子的浓度。
该方法简单便捷，通过建立银离子的质量与银离子的荧光强度的回归方程，进一步对纳米银和银离子的各自的荧光强度的检测，结合回归方程计算得到银离子的浓度；再进行纳米银和银离子总浓度的确定，进而计算得到纳米银的浓度。该方法可实现在不破坏细胞的条件下，采用不同的荧光探针有效地将纳米银的信号与银离子的信号进行区分，同时通过建立银离子的回归方程，进而对细胞内的纳米银以及银离子进行定量测定，该方法检测速度快、检测灵敏度高，选择性强，对细胞菌体没有破坏，可实现对细胞的无损分析。
进一步地，以年龄为一天的斑马鱼幼体细胞为待测细胞，利用上述方法建立细胞内纳米银和银离子定量的测定方法。
实施例一
细胞的培养
以来源于年龄为一天的斑马鱼幼体细胞作为待测细胞，在28℃的条件下，以添加有10％的胎牛血清的DMEM培养基作为培养液对待测细胞进行培养，传代培养至对数生长期的细胞再进行后续试验。
实施例二
AIE荧光探针浓度的确定
利用噻唑蓝比色法(MTT法)考察AIE荧光探针的毒性
收集处于对数生长期的待测细胞，按照5000细胞/孔的密度将待测细胞转移到96孔板中，于28℃条件下过夜培养；去掉旧的培养基，收集细胞沉淀。在所述细胞沉淀中，分别加入包含不同浓度的AIE荧光探针的新的培养基，于28℃条件下培养6小时；再在每个孔中加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，于37℃条件下培养4小时；再在每个孔中加入100μL由10％的十二烷基硫酸钠和0.01mol/L的盐酸组成的混合溶液，于37℃条件下培养6小时，测定其在595nm处的吸光度，其中，调零样品为培养基、MTT、二甲基亚砜的混合液；对照样品为细胞、超纯水、培养液、MTT以及二甲基亚砜的混合液。基于此，可得到不同浓度的AIE荧光探针测试条件下595nm波长处的吸光度，与空白对照组进行比较就可得到在每个浓度的AIE荧光探针暴露条件下细胞的存活率。
结果如下：
由试验结果分析可知，选择浓度为1.0mg/L作为银离子探针的添加浓度。
实施例三
银离子荧光探针TEZ-TPE-1浓度的确定
利用噻唑蓝比色法(MTT法)考察银离子荧光探针TEZ-TPE-1的毒性
收集处于对数生长期的待测细胞，按照5000细胞/孔的密度将待测细胞转移到96孔板中，于28℃条件下过夜培养；去掉旧的培养基，收集细胞沉淀。在所述细胞沉淀中，分别加入包含不同浓度(0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、70μmol/L、100μmol/L)的银离子荧光探针TEZ-TPE-1的新的培养基，于28℃条件下培养6小时；再在每个孔中加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，于37℃条件下培养4小时；再在每个孔中加入100μL由10％的十二烷基硫酸钠和0.01mol/L的盐酸组成的混合溶液，于37℃条件下培养6小时，测定其在595nm处的吸光度，其中，调零样品为培养基、MTT、二甲基亚砜的混合液；对照样品为细胞、超纯水、培养液、MTT以及二甲基亚砜的混合液。基于此，可得到不同浓度的银离子荧光探针TEZ-TPE-1测试条件下595nm波长处的吸光度，与空白对照组进行比较就可得到在每个浓度的银离子荧光探针TEZ-TPE-1暴露条件下细胞的存活率。
结果如下：
由图1可知，不同浓度的银离子荧光探针TEZ-TPE-1对ZF4细胞系的毒性效果如图，在浓度范围为0μmol/L～10μmol/L范围内，银离子荧光探针TEZ-TPE-1对ZF4细胞没有明显毒性效应。在本实验优选实施例中，选择浓度为10μmol/L作为银离子探针的添加浓度。
实施例四
回归方程的获取
提供5组含有不同浓度银离子的细胞培养基，其中，所述银离子的浓度分别为200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、5000μg/L；采用所述5组含有不同浓度银离子的细胞培养基分别对细胞进行培养24小时，收集含有不同浓度银离子的细胞；采用10μmol/L银离子探针TEZ-TPE-1与所述含有不同浓度银离子的细胞进行孵化2小时得到第一细胞，检测所述第一细胞中银离子的荧光强度；
将所述第一细胞进行破碎处理，再加入68％HNO3酸液，在常温条件下消解处理2小时，再在80℃条件下消解处理12小时得到第一细胞沉淀；再添加PBS溶液定容至10mL得到第一细胞液，利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定所述第一细胞中的银离子的浓度，并根据“细胞内银离子的质量＝银离子的质量浓度x溶液体积x细胞浓度”计算所述第一细胞中的银离子的质量；
根据所述第一细胞中银离子的荧光强度与所述第一细胞中的银离子的质量绘制标准曲线，获取回归方程。
结果如下：
由图2a可知，将不同浓度的银离子分别与银离子的探针混合，可实现不同浓度的银离子的检测，且最大发射波长为501nm。由图2b可知，银离子探针相应荧光强度与银离子暴露浓度直接呈线性关系，线性范围为3-200μg/L，线性关系为I501nm＝4.13[Ag+]+14.54,R2＝0.992，检出限为1.08μg/L。在溶液体系下做的标准曲线主要是为了考察银离子探针能够特异性识别银离子，以及荧光强度与银离子浓度之间具有相互关系。
由图3可知，其中，图3a～图3e分别为流式细胞仪对暴露于不同浓度(200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、5000μg/L)的第一细胞中银离子的荧光强度的分析，深色曲线的为空白信号，浅色曲线的为银离子的的信号；
根据所述第一细胞中银离子的荧光强度与所述第一细胞液的银离子的质量绘制标准曲线，如图4，获得质量浓度与荧光强度之间相关关系y＝646.073x+45.87,R2＝0.986，x为细胞内银离子的质量，y为流式细胞仪分析荧光强度。
实施例五
定量测定细胞内纳米银和银离子
如图5所示，提供含有AIEgens包裹的纳米银和银离子的细胞培养基，采用所述含有纳米银和银离子的细胞培养基培养待测细胞24小时，去掉细胞培养液并且用磷酸盐缓冲清洗细胞3次，去掉未进入细胞的纳米银以及银离子，收集培养得到的待测细胞；采用10μmol/L的银离子探针(TZE-TPE-1)与所述培养得到的待测细胞进行孵化2小时得到第二细胞；去掉细胞培养液并且用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次，然后用胰蛋白酶消化贴壁细胞，在3000rpm转速下离心1分钟，去掉上清液，并且加入PBS，转移到5mL的流式细胞仪配套试管中以便用于流式细胞仪分析处理。所述第二细胞中纳米银的荧光强度采用PE作为检测的滤色镜，所述第二细胞中银离子的荧光强度采用Amcyan作为检测的滤色镜，分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度；
将所述第二细胞进行进行破碎处理，并向其中加入3mL的68％HNO3，经过2小时常温消解后，在80℃条件下消解12h，然后定容到10mL得到第二细胞中，利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定所述第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度；
根据所述回归方程y＝646.073x+45.87,R2＝0.986和所述第二细胞中银离子的荧光强度，分析得到所述第二细胞中银离子的质量并计算所述第二细胞中银离子的浓度；根据所述第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度和所述第二细胞中银离子的浓度计算得到所述第二细胞中纳米银的浓度。
结果如下：
由图6所示，由图6a中可以得出，采用TEM对AIEgens包裹的纳米银进行表征，根据TEM-EDS，可以纳米银材料的粒径和形貌进行表征，由图6b中可以得出，能谱仪EDS可以对纳米银的元素组成进行表征，能谱仪检测到有C元素和Si元素，表明纳米银材料的存在一层有机物涂层。
分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度，由图7所示，是AIE-AgNPs的荧光检测光谱，其中，AIE-AgNPs发射谱线，入射波长为450nm，在450nm激发光下，其最大发射波长为625nm。如图8所示，通过这种荧光标记的方法可以特异性的识别细胞内银离子和纳米银的信号，如图8a所示，若单独的暴露给银离子，流式细胞仪可以检测单独银离子的信号；如图8b所示,若单独暴露给纳米银而没有暴露给银离子的探针，流式细胞仪可以单独检测到纳米银的信号；如图8c所示,若暴露给纳米银和银离子探针，流式细胞仪可以识别两种信号。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤：
提供N组含有不同浓度银离子的第一细胞培养基，且N大于等于5；采用所述第一细胞培养基分别对细胞进行培养，收集胞内含有不同浓度银离子的细胞；采用银离子探针分别与所述含有不同浓度银离子的细胞进行孵化得到第一细胞，分别检测各所述第一细胞中银离子的荧光强度，并分别计算各所述第一细胞中银离子的质量；根据所述第一细胞中银离子的荧光强度与所述第一细胞中银离子的质量绘制标准曲线，获取回归方程；
提供含有纳米银和银离子的第二细胞培养基，其中，所述纳米银为表面结合荧光探针的纳米银；采用所述第二细胞培养基培养待测细胞，收集培养得到的待测细胞，采用银离子探针与所述培养得到的待测细胞进行孵化得到第二细胞；分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度；测定所述第二细胞中纳米银和银离子的总浓度；
根据所述回归方程和所述第二细胞中银离子的荧光强度，分析得到所述第二细胞中银离子的质量并计算所述第二细胞中银离子的浓度；根据所述第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度和所述第二细胞中银离子的浓度计算得到所述第二细胞中纳米银的浓度。
2.根据权利要求1所述的细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，其特征在于，采用所述第一细胞培养基分别对细胞进行培养的步骤中，所述培养的时间为24～26小时；和/或，
采用银离子探针分别与所述含有不同浓度银离子的细胞进行孵化得到第一细胞的步骤中，所述孵化的时间为2～4小时；和/或，
采用所述第二细胞培养基培养待测细胞的步骤中，所述培养的时间为24～26小时；和/或，
采用银离子探针与所述培养得到的待测细胞进行孵化得到第二细胞的步骤中，所述孵化的时间为2～4小时。
3.根据权利要求1所述的细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，其特征在于，计算各所述第一细胞中银离子的质量的步骤之前，还包括将所述第一细胞进行第一预处理得到第一细胞液，其中，所述第一预处理包括如下步骤：将所述第一细胞进行破碎处理，再加入酸液进行消解处理得到第一细胞沉淀，在所述第一细胞沉淀加入溶液，混合得到第一细胞液；和/或，
测定所述第二细胞中纳米银和银离子的总浓度的步骤之前，还包括将所述第二细胞进行第二预处理得到第二细胞液，其中，所述第二预处理包括如下步骤：将所述第二细胞进行破碎处理，再加入酸液进行消解处理得到第二细胞沉淀，在所述第二细胞沉淀加入溶液，混合得到第二细胞液。
4.根据权利要求3所述的细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，其特征在于，
所述第一细胞液中，第一细胞的浓度为10000cell/mL；和/或，
所述第二细胞液中，第二细胞的浓度为10000cell/mL。
5.根据权利要求1～4任一所述的细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，其特征在于，所述表面结合荧光探针的纳米银中，所述荧光探针选自AIE荧光探针。
6.根据权利要求5所述的细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，其特征在于，所述AIE荧光探针的浓度为0.8mg/L～1.0mg/L。
7.根据权利要求1～4任一所述的细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，其特征在于，所述银离子探针选自TEZ-TPE-1。
8.根据权利要求7所述的细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，其特征在于，所述TEZ-TPE-1的浓度为5μmol/L～10μmol/L。
9.根据权利要求1～4任一所述的细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，其特征在于，分别检测各所述第一细胞中银离子的荧光强度的步骤中，采用流式细胞仪进行检测；和/或，
分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度的步骤中，采用流式细胞仪分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度；和/或，
测定所述第二细胞中的纳米银和银离子的总浓度的步骤中，采用电感耦合等离子体质谱仪进行测定。
10.根据权利要求9所述的细胞内纳米银和银离子定量的测定方法，其特征在于，采用流式细胞仪分别检测所述第二细胞中纳米银的荧光强度和银离子的荧光强度的步骤中，所述第二细胞中纳米银的荧光强度采用PE作为检测的滤色镜，所述第二细胞中银离子的荧光强度采用Amcyan作为检测的滤色镜。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111896735A (zh) * 2020-07-08 2020-11-06 熊玲红 病毒的检测杀伤方法
CN111982789A (zh) * 2020-08-21 2020-11-24 中国科学院生态环境研究中心 基于单细胞富集和单细胞质谱的金属离子及金属纳米颗粒的高通量检测方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0682459A (ja) * 1991-11-20 1994-03-22 Hamamatsu Photonics Kk 蛍光性プローブ試薬を用いた細胞内イオン濃度測定法
US20080268493A1 (en) * 2007-04-30 2008-10-30 Yeditepe Universitesi Identification Method Based On Surface-Enhanced Raman Scattering
CN102093270A (zh) * 2010-12-20 2011-06-15 韶关学院 细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针
US20110306082A1 (en) * 2008-12-29 2011-12-15 Life Technologies Corporation "benzoxazole-based fluorescent metal ion indicators"
US20120219985A1 (en) * 2011-01-20 2012-08-30 Tae-Hyun Yoon Method for the toxicity assessments of nano-materials
CN102998291A (zh) * 2012-11-28 2013-03-27 武汉市疾病预防控制中心 基于量子点对细胞中重金属离子原位实时检测的方法
CN103163095A (zh) * 2013-03-25 2013-06-19 江南大学 基于纳米银的可视化多功能检测方法
KR20140049486A (ko) * 2012-10-17 2014-04-25 인하대학교 산학협력단 다이펩타이드 유도체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 화학센서 및 이를 이용한 은 이온(Ａｇ＋), 수은 이온(Ｈｇ２＋), 구리 이온(Ｉ)(Ｃｕ＋) 및 은나노 입자를 검출하는 방법
CN105572018A (zh) * 2015-12-08 2016-05-11 康敏 以荧光指示剂结合流式细胞技术测量红细胞内游离镁离子浓度的方法
CN106018688A (zh) * 2016-05-17 2016-10-12 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法
CN108863961A (zh) * 2018-08-01 2018-11-23 河南师范大学 一种三氮唑类蒽醌衍生物银离子荧光探针及其制备方法和应用
CN110499153A (zh) * 2019-07-15 2019-11-26 郑州大学 一种线粒体定位的碳点、制备方法及其在银离子检测中的应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0682459A (ja) * 1991-11-20 1994-03-22 Hamamatsu Photonics Kk 蛍光性プローブ試薬を用いた細胞内イオン濃度測定法
US20080268493A1 (en) * 2007-04-30 2008-10-30 Yeditepe Universitesi Identification Method Based On Surface-Enhanced Raman Scattering
US20110306082A1 (en) * 2008-12-29 2011-12-15 Life Technologies Corporation "benzoxazole-based fluorescent metal ion indicators"
CN102093270A (zh) * 2010-12-20 2011-06-15 韶关学院 细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针
US20120219985A1 (en) * 2011-01-20 2012-08-30 Tae-Hyun Yoon Method for the toxicity assessments of nano-materials
KR20140049486A (ko) * 2012-10-17 2014-04-25 인하대학교 산학협력단 다이펩타이드 유도체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 화학센서 및 이를 이용한 은 이온(Ａｇ＋), 수은 이온(Ｈｇ２＋), 구리 이온(Ｉ)(Ｃｕ＋) 및 은나노 입자를 검출하는 방법
CN102998291A (zh) * 2012-11-28 2013-03-27 武汉市疾病预防控制中心 基于量子点对细胞中重金属离子原位实时检测的方法
CN103163095A (zh) * 2013-03-25 2013-06-19 江南大学 基于纳米银的可视化多功能检测方法
CN105572018A (zh) * 2015-12-08 2016-05-11 康敏 以荧光指示剂结合流式细胞技术测量红细胞内游离镁离子浓度的方法
CN106018688A (zh) * 2016-05-17 2016-10-12 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法
CN108863961A (zh) * 2018-08-01 2018-11-23 河南师范大学 一种三氮唑类蒽醌衍生物银离子荧光探针及其制备方法和应用
CN110499153A (zh) * 2019-07-15 2019-11-26 郑州大学 一种线粒体定位的碳点、制备方法及其在银离子检测中的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINGBO CHAO ET AL.: "Speciation Analysis of Silver Nanoparticles and Silver Ions in Antibacterial Products and Environmental Waters via Cloud Point Extraction-Based Separation", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
LUQING ZHANG ET AL.: "Dominant Role of Silver Ions in Silver Nanoparticle Toxicity to a Unicellular Alga: Evidence from Luminogen Imaging", 《ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY 》 *
YAN NENG ET AL.: "Differentiating Silver Nanoparticles and Ions in Medaka Larvae by Coupling Two Aggregation-Induced Emission Fluorophores", 《ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY》 *
YAN NENG ET AL.: "Real-time monitoring of the dissolution kinetics of silver nanoparticles and nanowires in aquatic environments using an aggregation-induced emission fluorogen", 《CHEM.COMM.》 *
孙晋都等: "纳米银的银离子释放及其对细胞的毒性作用", 《环境与职业医学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111896735A (zh) * 2020-07-08 2020-11-06 熊玲红 病毒的检测杀伤方法
CN111982789A (zh) * 2020-08-21 2020-11-24 中国科学院生态环境研究中心 基于单细胞富集和单细胞质谱的金属离子及金属纳米颗粒的高通量检测方法
CN111982789B (zh) * 2020-08-21 2022-02-08 中国科学院生态环境研究中心 基于单细胞富集和单细胞质谱的金属离子及金属纳米颗粒的高通量检测方法

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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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