CN112611868A - 一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针及其制备方法,涉及病毒检测领域。所述探针为表面功能化的磁性氧化铁纳米颗粒,其与新型冠状病毒颗粒能快速聚集使样品横向弛豫时间T2发生显著缩短。所述制备方法为:首先制备磁性氧化铁纳米颗粒,然后进行磁性氧化铁纳米颗粒表面改性,最后表面修饰可与新型冠状病毒颗粒特异结合的S蛋白抗体,即得到检测探针。本发明所提供的检测探针用于新型冠状病毒检测,具有样品前处理简单、检测速度快、操作简便、测试成本低、灵敏度高及准确性好等优点,可用于快速现场检测,有利于传染性较强的新型冠状病毒的大规模筛查及控制。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测领域,尤其涉及一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒会造成严重的肺炎而致人死亡,病人应及时得到诊治。要及时有效地遏制病毒的传播,必须对大量的疑似病例及密切接触者进行快速的病毒检测。目前新型冠状病毒检测的金标准是实时荧光RT-PCR法。但该方法在实际使用中仍存在检测时间较长、检测成本较高、前处理较复杂、检测结果受样本质量以及试剂盒性能影响较大等问题。因此急需发展新的病毒检测方法对当前方法进行补充,最终实现对新型冠状病毒的快速、低成本、准确筛查。
磁共振分析方法具有样品前处理简单、检测速度快、操作简便、测试成本低、灵敏度高及准确性好等优点,可用于快速现场检测,有利于传染性较强的新型冠状病毒的大规模筛查及控制。然而目前尚未有公开磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的专利。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题,提供一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针及其制备方法,其关键化学成分为表面功能化磁性纳米颗粒,这些纳米颗粒能通过新型冠状病毒颗粒相互聚集并造成样品的弛豫时间发生显著变化。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针,所述探针采用表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒,所述表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒与新型冠状病毒相互聚集并造成样品的横向弛豫时间T2显著缩短。
所述表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒的表面修饰一种或多种与新型冠状病毒表面S蛋白特异结合的抗体。
所述表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒的尺寸为1~100nm,形状为球形或立方体。
所述探针的制备方法,包括以下步骤:
1)制备表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒;
2)对表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒表面进行改性;
3)在改性后的磁性氧化铁纳米颗粒表面进一步修饰可与新型冠状病毒表面抗原特异结合的S蛋白抗体。
步骤1)中制备表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒的方法如下:将油酸钠溶解于乙醇和蒸馏水的混合溶液中,滴入氯化铁水溶液,在一定温度下搅拌反应,反应后取上层溶液,加入十八烯和油酸,第一次保温,然后抽真空通氮气,第二次保温,最后冷却至室温,经乙醇沉淀离心后即可得到表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒。
所述油酸钠和氯化铁的质量比为1:1.2,乙醇和蒸馏水的体积比为1:1,十八烯和油酸的体积比为(75~100):1。
所述在一定温度下搅拌反应的温度30~80℃,时间为1~6h;所述第一次保温的温度为90~110℃,时间为5~20min;第二次保温的温度为280~330℃,时间为0.5~3h。
在步骤2)中,使用两端官能团化的聚乙二醇对磁性氧化铁纳米颗粒表面进行改性,聚乙二醇的分子量为100~2000000Da;在步骤3)中,利用改性后的磁性氧化铁纳米颗粒表面的官能团进行反应以实现表面S蛋白抗体的修饰。
所述聚乙二醇两端的官能团包括羧基、胺基、羟基、巯基、马来酰亚胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺。
一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的应用,将待测样品与探针混匀后直接进行上样测试,无需分离纯化。
相对于现有技术,本发明技术方案取得的有益效果是:
本发明所提供的探针可用于快速、准确检测新型冠状病毒,与传统检测手段相比,具有样品前处理简单、检测速度快、操作简便、测试成本低、灵敏度高及准确性高等优点,可用于快速现场检测,有利于传染性较强的新型冠状病毒的大规模筛查及控制。
附图说明
图1为本发明探针的结构示意图。
图2为本发明探针检测新型冠状病毒的原理示意图。
图3为实施例1制备表面油酸包覆的球形磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜照片。
图4为实施例2制备表面油酸包覆的立方体磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜照片。
图5为本发明检测过程示意图。
图6为实施例1的探针检测结果图。
图7为实施例2的探针检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白,以下结合附图和实施例,对本发明做进一步详细说明。
如图1所示,为本发明探针的结构示意图,磁性氧化铁纳米颗粒1通过聚乙二醇链2与S蛋白抗体3连接,所述S蛋白抗体可特异性地与新型冠状病毒结合。
如图2所示,本发明的原理如下:
磁共振分析方法是利用磁共振分析仪对样本中质子的弛豫时间(包括纵向弛豫时间T1和横向弛豫时间T2)进行测量分析的方法。人的体液(如血液、唾液、痰液、尿液等)具有相对固定的横向弛豫时间T2,加入表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒可以改变样品的横向弛豫时间T2。具体地,表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒的横向弛豫效能在颗粒发生聚集后会显著增强,造成样品横向弛豫时间T2显著缩短。横向弛豫时间T2改变的多少与表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒的分散状态有关。在表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒表面修饰能特异结合新型冠状病毒的识别分子得到病毒检测探针,当体液样本中不存在新型冠状病毒时,探针均匀分散,样本的横向弛豫时间T2较长;当体液样本中存在新型冠状病毒时,探针发生聚集,样本的横向弛豫时间T2较短。加入探针后样本的横向弛豫时间T2与样本中的新型冠状病毒浓度呈数学关系,所以通过测定横向弛豫时间T2可以得知样本中新型冠状病毒的浓度。
本发明中,磁性氧化铁纳米颗粒的制备如下:1~10g油酸钠溶解于5~20mL乙醇和5~20mL蒸馏水混合溶液中,使乙醇和蒸馏水的体积比为1:1,滴入0.1~2g浓度为0.1mmol/L的氯化铁水溶液,使油酸钠和氯化铁的质量比为1:1.2,在30~80℃搅拌1~6h。反应后取上层溶液0.1~5g,加入5~15mL十八烯,50~200μL油酸,使十八烯和油酸的体积比为(75~100):1,在90~110℃保温5~20min,抽真空5~20min后通氮气5~10min,升温至280~330℃,保温0.5~3h后冷却至室温,经乙醇沉淀离心后即可得到表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒。
实施例1
一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的制备:
a)表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒按照以下步骤合成:1g油酸钠溶解于5mL乙醇和5mL蒸馏水混合溶液中,滴入0.1g浓度为0.1mmol/L的氯化铁水溶液,在30℃搅拌1h。反应后取上层溶液0.1g,加入5mL十八烯和50μL油酸,在90℃保温5min,抽真空5min后通氮气5min,升温至280℃,保温0.5h后冷却至室温,经乙醇沉淀离心后即可得到表面油酸包覆的球状磁性氧化铁纳米颗粒,产品的透射电镜照片如图3所示。
b)磁性氧化铁纳米颗粒表面改性:
要使磁性氧化铁纳米颗粒能在水中分散且可以进一步修饰抗体,需要将其表面的油酸分子替换为端基官能团化的聚乙二醇,此过程即磁性氧化铁纳米颗粒的表面改性。在本实施例中,选择一端为羧基,一端为胺基的分子量为500Da的聚乙二醇分子通过配体交换的方法进行表面改性。具体操作为:取约5mg磁性氧化铁纳米颗粒溶于50mL四氢呋喃,磁搅拌下再加入含有50mg聚乙二醇、100mg碳酸氢钠的30mL去离子水,50℃加热磁搅拌约6h,离心收集产品,产品重新溶于去离子水,再通过超滤纯化三遍。
c)表面修饰新型冠状病毒抗体:
经过步骤b),磁性氧化铁纳米颗粒表面为亲水性的聚乙二醇,且末端为胺基,通过这些胺基与识别分子的羧基反应实现表面功能化。具体操作为:0.01mmol识别分子溶于2mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),磁搅拌下先后加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)50μL、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)20mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)30mg,室温磁搅拌1h后再加入b)步骤的产品溶液,继续室温磁搅拌过夜,旋蒸除去溶剂,再重新溶于去离子水中,再通过超滤纯化三遍,得到探针储备液。
实施例2
一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的制备:
a)表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒按照以下步骤合成:10g油酸钠溶解于20mL乙醇和20mL蒸馏水混合溶液中,滴入2g浓度为0.1mmol/L的氯化铁水溶液,在80℃搅拌6h。反应后取上层溶液5g,加入15mL十八烯,200μL油酸,在110℃保温20min,抽真空20min后通氮气10min,升温至330℃,保温3h后冷却至室温,经乙醇沉淀离心后即可得到表面油酸包覆的立方体磁性氧化铁纳米颗粒,产品的透射电镜照片如图4。
b)磁性氧化铁纳米颗粒表面改性:
要使磁性氧化铁纳米颗粒能在水中分散且可以进一步修饰抗体,需要将其表面的油酸分子替换为端基官能团化的聚乙二醇,此过程即磁性氧化铁纳米颗粒的表面改性。在本实施例中,选择一端为羧基,一端为胺基的分子量为2000000Da的聚乙二醇分子通过配体交换的方法进行表面改性。具体操作为:取约5mg磁性氧化铁纳米颗粒溶于50mL四氢呋喃,磁搅拌下再加入含有50mg聚乙二醇、100mg碳酸氢钠的30mL去离子水,50℃加热磁搅拌约6h,离心收集产品,产品重新溶于去离子水,再通过超滤纯化三遍。
c)表面修饰新型冠状病毒抗体
经过步骤b),磁性氧化铁纳米颗粒表面为亲水性的聚乙二醇,且末端为胺基,通过这些胺基与识别分子的羧基反应实现表面功能化。具体操作为:0.01mmol识别分子溶于2mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),磁搅拌下先后加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)50μL、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)20mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)30mg,室温磁搅拌1h后再加入b)步骤的产品溶液,继续室温磁搅拌过夜,旋蒸除去溶剂,再重新溶于去离子水中,再通过超滤纯化三遍,得到探针储备液。
如图5为本发明检测过程示意图,先收集新冠病毒肺炎病人体液,然后加入本发明制备的纳米颗粒探针,混合均匀后获得待测样品,最后用磁共振分析仪测试所述待测样品的弛豫时间,进行数据分析后得到检测报告。
实施例3
利用实施例1的探针检测新型冠状病毒模型:
a)分别取1mL 1×PBS溶液于两个样品瓶,加入抗凝剂防止凝固;
b)向其中一管加入5μL1×PBS溶液作为对照组,另一管加入5μL新型冠状病毒模型(表面修饰S蛋白抗原的二氧化硅纳米颗粒)溶液作为实验组,混匀;
c)向实验组和对照组溶液分别加5μL实施例1的探针储备液,混匀;
d)利用弛豫分析仪分别测定实验组和对照组样品的横向弛豫时间T2,检出新型冠状病毒模型,结果如图6所示。
实施例4
利用实施例2的探针检测新型冠状病毒模型:
a)分别取1mL 1×PBS溶液于两个样品瓶,加入抗凝剂防止凝固;
b)向其中一管加入5μL 1×PBS溶液作为对照组,另一管加入5μL新型冠状病毒模型(表面修饰S蛋白抗原的二氧化硅纳米颗粒)溶液作为实验组,混匀;
c)向实验组和对照组溶液分别加5μL实施例2的探针储备液,混匀;
d)利用弛豫分析仪分别测定实验组和对照组样品的横向弛豫时间T2,检出新型冠状病毒模型,结果如图7所示。
本发明所提供的探针可用于快速、准确检测新型冠状病毒,与传统检测手段相比,具有样品前处理简单、检测速度快、操作简便、测试成本低、灵敏度高及准确性高等优点,可用于快速现场检测,有利于传染性较强的新型冠状病毒的大规模筛查及控制。
Claims (10)
1.一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针,其特征在于:所述探针采用表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒,所述表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒与新型冠状病毒相互聚集并造成样品的横向弛豫时间T2显著缩短。
2.如权利要求1所述的一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针,其特征在于:所述表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒的表面修饰一种或多种与新型冠状病毒表面S蛋白特异结合的抗体。
3.如权利要求1所述的一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针,其特征在于:所述表面功能化磁性氧化铁纳米颗粒的尺寸为1~100nm,形状为球形或立方体。
4.一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)制备表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒;
2)对表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒表面进行改性;
3)在改性后的磁性氧化铁纳米颗粒表面进一步修饰可与新型冠状病毒表面抗原特异结合的S蛋白抗体。
5.如权利要求4所述的一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的制备方法,其特征在于步骤1)中制备表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒的方法如下:将油酸钠溶解于乙醇和蒸馏水的混合溶液中,滴入氯化铁水溶液,在一定温度下搅拌反应,反应后取上层溶液,加入十八烯和油酸,第一次保温,然后抽真空通氮气,第二次保温,最后冷却至室温,经乙醇沉淀离心后即可得到表面油酸包覆的磁性氧化铁纳米颗粒。
6.如权利要求5所述的一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的制备方法,其特征在于:所述油酸钠和氯化铁的质量比为1:1.2,乙醇和蒸馏水的体积比为1:1,十八烯和油酸的体积比为(75~100):1。
7.如权利要求5所述的一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的制备方法,其特征在于:所述在一定温度下搅拌反应的温度30~80℃,时间为1~6h;所述第一次保温的温度为90~110℃,时间为5~20min;第二次保温的温度为280~330℃,时间为0.5~3h。
8.如权利要求4所述的一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的制备方法,其特征在于:在步骤2)中,使用两端官能团化的聚乙二醇对磁性氧化铁纳米颗粒表面进行改性,聚乙二醇的分子量为100~2000000Da;在步骤3)中,利用改性后的磁性氧化铁纳米颗粒表面的官能团进行反应以实现表面S蛋白抗体的修饰。
9.如权利要求8所述的一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的制备方法,其特征在于:所述聚乙二醇两端的官能团包括羧基、胺基、羟基、巯基、马来酰亚胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺。
10.一种用于磁共振分析方法检测新型冠状病毒的探针的应用,其特征在于:将待测样品与探针混匀后直接进行上样测试,无需分离纯化。
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