CN114441489A - 一种基于荧光微球和碳点的比率型荧光生物探针制备方法及在刀豆球蛋白a检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物传感领域，提供一种基于功能化荧光微球(Fluorescent microsphere，FM)和硼酸修饰碳点(Boric acid modified carbon dots，BCDs)的比率型荧光生物传感方法。所述荧光传感方法是基于FMs和BCDs实现对刀豆球蛋白A(Con A)的低成本、高灵敏的比率型荧光检测，包括BCDs的制备及表征、FMs@PEI@Dextran的制备及表征、实验条件的优化、Con A的测定与特异性分析、血清样本中Con A的检测。所述方法检测限为0.089μg/mL，进一步将该传感体系用于血清中Con A的回收率测定，结果令人满意。此外，该方法增强传感方法的稳定性与准确性的同时，逐步提升传感方法的灵敏性与便捷性，旨在实现疾病标志物快速、便捷的即时检测，对早期疾病的发现、疾病预后的复发监控都具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物光传感技术领域和纳米材料应用领域，具体涉及一种荧光微球和碳点的制备，并设计成用于刀豆球蛋白A检测的比率型荧光生物探针。
背景技术
刀豆球蛋白A(Con A)是研究最为广泛的凝集素之一，在pH 5.5以下作为调光体存在，在pH 5.8和pH 7.0之间以四聚体形式存在，与糖类结合的能力较强，可以使多糖沉淀。四聚体Con A具有四个结合位点，可以与不同的膜受体如asd-葡萄糖、d-甘露糖残基和一些乙二醇蛋白结合，导致细胞有丝分裂和增殖。基于糖类与凝集素的生物特异性相互作用，Con A被选择为深入研究分子识别或生物过程的蛋白质模型，这对临床诊断和药物开发具有重要意义，如检测癌细胞。有资料显示，通过使用Con A来活化病态(或老年)时的抑制性T细胞这一途径，或许可望用于改善一些自身免疫性疾病、移植物排斥反应及恶性肿瘤的防治。
目前为止，报道的检测方法主要有电化学发光、紫外可见光谱、荧光光谱、电化学分析和表面等离子体共振等。Con A与糖类的特异性结合使得这些传感系统具有良好的选择性。然而，这些方法的灵敏度有待进一步加强，探索一种背景信号低、反应简单可控、重现性好、成本低廉、响应范围宽且灵敏的Con A检测系统具有重要意义。
碳点(Carbon dots)是由10nm以下的无定形或晶体碳纳米颗粒组成的一类纳米碳材料。碳点以其简单、快速和廉价的合成路线、优异的水溶性、优良的光学性能和低毒性等优点在生物医学领域受到广泛应用。此外，它们具有内在的光致发光特性，可用于生物成像、生物传感和治疗等领域。根据报道，硼酸修饰碳点(Boric acid modified carbondots，BCDs)是一种以苯基硼酸为单一前体，通过一步水热法合成的表面修饰有大量硼酸基团的荧光纳米碳基聚合物。由于硼酸基团能够和葡萄糖分子中的顺式二醇通过共价结合，使得BCDs对含有顺式二醇结构的糖类具有特殊的识别功能。
荧光微球(FMs)是指将荧光物质通过物理法(吸附法、包埋法、自组装法) 或化学法(接枝法、共聚法)吸附或包埋到载体粒子表面或内部而形成的直径在纳米至微米级(0.01-10μm)范围内，受激发光源激发能发出荧光的固相球体。它是一种新型的功能性微球，具有比表面积大、吸附性强、凝集作用大和表面反应能力强等特性，并且以其稳定的形态结构及高效的发光效率，在标记、示踪、检测、免疫医学、高通量药物筛选等领域显示出巨大的应用潜力。
基于荧光微球技术的生物传感属于光学生物传感，是一种通过微球的荧光信号来进行实验数据采集和分析的传感方法。荧光属于光激发的冷发光，发光原理为当某种材料受到一定波长的光(紫外光、X射线等)照射时，其分子内部电子吸收光能后从基态跃迁至激发态，激发态的电子在回到基态的途中以光的形式释放能量，这种性质的发射光称为荧光。
与传统的检测方法相比，荧光分析法因具有灵敏度高，操作简单，不需要借助大型仪器设备的优点而备受关注。基于荧光发展出来的荧光分析法最早出现于 19世纪60年代，是利用荧光物质在特定波长激发光下产生的荧光，进行定性或定量的一种技术，常见的荧光物质包括FMs、金属纳米团簇、碳点、上转换稀土纳米材料等等。其中FMs以其优异的光学性质和易修饰性在荧光分析中受到广泛应用，商业化程度很高。基于FMs构建的生物传感方法能够实现多重生物反应的快速分析，具有高灵敏度和特异性，可用于抗原抗体、核酸以及病毒/细菌检测等领域的研究。
发明内容
本发明为解决检测生物标志物Con A的现有检测方法的局限性，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)、血液细胞分析仪等，都存在操作过程繁琐，耗时久，需要专业的技术人员，并且检测设备昂贵，检测成本高，无法实现快速便捷的即时检测等缺点。设计了一种基于荧光微球的生物传感方法，将功能化FMs与BCDs 相结合，增强传感方法的稳定性与准确性的同时，逐步提升传感方法的灵敏性与便捷性，旨在实现快速便捷的即时检测。
本发明的技术方案是：设计了一种成本低廉、灵敏度高、选择性好的基于功能化FMs和BCDs的比率型荧光探针，并将其成功应用于Con A的检测。该方法巧妙地利用了硼酸基团和Con A都能特异性结合Dextran的性质，引入了具有良好荧光性质的BCDs和FMs，BCDs在作为FMs@PEI@Dextran沉淀剂的同时，也作为内参提升了传感系统对环境的抗干扰能力，实现了对Con A高灵敏、高选择检测，检测限为0.089μg/mL。将该传感体系用于血清中Con A的回收率测定，结果令人满意。操作步骤如下：
(1)将称量好的1,4-苯二硼酸加入到超纯水中搅拌，随后转移至聚四氟乙烯内衬中制备BCDs；
(2)将步骤(1)中的聚四氟乙烯内衬放置于水热反应釜中，将反应釜放置于烘箱中加热，加热后自然冷却至室温，把反应后的溶液取出；
(3)将步骤(2)中的溶液进行离心处理，除去大颗粒沉淀；
(4)将步骤(3)得到的溶液转移到透析袋中透析进行纯化；
(5)将步骤(4)得到的BCDs进行保存以备后续使用；
(6)荧光微球的功能化。具体方法如下:首先对FMs进行表面氨基化,然后将得到的NH2-FMs进一步与NHS-Dextran进行偶联，最后将经超声、离心等步骤得到的FMs@PEI@Dextran放置于4℃保存以备后续使用；
(7)将步骤(5)得到的BCDs和步骤(6)中制得的功能化的FMs结合，用于比率型荧光检测Con A；
(8)将步骤(7)得到的反应溶液离心，取上层溶液用荧光分光光度计记录荧光光谱；
所述步骤(1)中1，4-苯二硼酸为0.2g，超纯水20mL，氢氧化钠溶液浓度为 0.1mol/L，溶液pH＝9.0。
所述步骤(2)中的加热温度为180℃，加热反应时间为8h。
所述步骤(3)中离心机转速为10000rpm，离心时间30min。
所述步骤(4)中透析袋规格为1kDa，纯化时间为24h。
所述步骤(5)中保存温度为4℃。
所述步骤(6)中所用缓冲液为10mM HEPES溶液(含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，PEI水溶500μL，体积浓度为5％，NHS-Dextran为10μL，质量浓度为10mg/mL。
所述步骤(7)中加入纯化的BCDs 40μL，FMs@PEI@Dextran 1μL，反应温度为25℃，反应时间为30min。
所述步骤(8)中离心机转速3000rpm，离心时间5min。记录荧光光谱时上层溶液用量200μL。
所述制备的功能化FMs和BCDs在检测Con A时的步骤如下：
1.Con A的测定。取350μL 10mM HEPES溶液(pH＝6.0，含1mM Ca2+， 1mM Mn2+)和1μL FMs@PEI@Dextran加入600μL灭菌离心管中。向离心管中加入不同浓度的Con A溶液(0-125μg/mL)，混匀后室温震荡反应60min，再分别加入40μL纯化的BCDs，混匀后室温(25℃)震荡反应30min。反应完成后以3000rpm离心5min，取200μL上层溶液用荧光分光光度计记录荧光光谱，每个样本设置3个平行。
2.特异性分析。在HEPES-FMs@PEI@Dextran检测溶液中分别加入1 mmol/L葡萄糖(Glucose)、蔗糖(Sucrose)，10μg/mL Fe3+、Na+、K+、组氨酸 (Histidine)、L-脯氨酸(L-Proline)、辣根过氧化酶(HRP)、牛血清白蛋白(BSA) 和Con A，用本研究建立的最优条件进行检测，以此评估传感方法的特异性。
3.血清样本中Con A的检测。
本发明的有益效果为：
1.本发明提出的比率型荧光检测方法成本低廉、灵敏度高、选择性好；
2.检测过程中BCDs作为内参提升了传感系统对于环境的抗干扰能力；
3.探针用于血清中Con A的回收率测定，结果令人满意。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明结合FMs和BCDs的构建的比率型荧光生物探针用于Con A 检测的原理图。
图2为实施例1所制备的BCDs的表征图。
图3为实施例1所制备的FMs@PEI@Dextran的表征图。
图4为实施例1所制备的FMs、FMs@PEI和FMs@PEI@Dextran的Zeta电位图。
图5为实施例1比率型荧光传感体系的可行性验证。
图6为实施例1Con A荧光传感的性能分析。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于荧光微球和碳点的比率型荧光生物探针用于Con A的检测，其检测原理如图1所示：使用NHS-Dextran与表面包裹PEI(含-NH2)的FMs相偶联，得到了FMs@PEI@Dextran，以1，4-苯二硼酸为单一前驱体，采用合成修饰一体化的一步水热法制备了BCDs。在330nm的激发光下，BCDs和FMs@PEI@Dextran的荧光发射峰值分别出现在410nm和620nm处。BCDs和 Con A都能与Ms@PEI@Dextran上的Dextran特异性结合，但是结合产物状态不一样。结合该特性对产物进行短时间低速离心处理，上层溶液中FMs输出的荧光信号减弱，但是过量的BCDs的荧光信号并不会受到太大影响，因此可以内参，根据此过程中荧光信号的比值变化实现对Con A的检测。实验步骤如下：
采用改进的水热碳化法制备BCDs。称取0.2g 1，4-苯二硼酸，将其加入20 mL超纯水中，超声使其完全分散，搅拌下逐滴滴加0.1mol/L的氢氧化钠溶液，调节溶液pH＝9.0，往准备好的溶液中通1h氮气除去溶解的氧气，最后将其转移至高压反应釜中，180℃加热8h。冷却至室温后，将反应后的溶液以10000rpm 离心30min，除去大颗粒沉淀，再将所得溶液转移到1kDa的透析袋中透析24h。进一步纯化，最终得到的BCDs放在4℃进行保存以备后续使用。表征数据图2 可证实BCDs的成功合成。(A)和(B)为不同放大倍数下BCDs的TEM结果图；(C)用动态光散射(DLS)对BCDs进行的粒径分析图；(D)BCDs(红色线)及其前体(蓝色线)的紫外吸收图；(E)BCDs在λex＝330nm下的荧光发射光谱图，以及日光灯和紫外灯下的照片对比图；(F)BCDs(红色线)及其前体 (蓝色线)的傅立叶转换红外线光谱(FT-IR)图。
FMs@PEI@Dextran的制备。首先要对羧基化FMs进行表面氨基化。取50μL 10mg/mL200nm的羧基化FMs，将其加入到450μL超纯水中，超声10min使 FMs完全分散，以12000rpm离心30min，除去上层溶液，向下层沉淀中加入 485μLMES溶液(pH＝5.0，10mM)，超声10min后混匀，使其完全分散，再加入15μL 10mM EDC溶液，室温反应30min后以12000rpm离心30min，除去上层溶液，将下层沉淀重新溶于水中，超声混匀后以12000rpm离心30min，除去上层溶液，在得到的沉淀中加入500μL 5％体积浓度的聚乙烯亚胺(PEI) 水溶液，混匀后超声30min，在振荡器上室温震荡1h。反应结束后以12000rpm 离心30min，除去上层溶液，重新溶于500μL超纯水中，洗涤三次，最后将所得沉淀溶于400μL超纯水中，放在4℃进行保存以备后续使用。
NH2-FMs与NHS-Dextran的偶联。取200μLNH2-FMs，12000rpm离心30min，除去上层清液，往沉淀中加入200μL碳酸氢钠溶液中(pH＝8.43，0.1M)，混匀后超声10min，向其中加入10μL 10mg/mLNHS-Dextran溶液，混匀后室温震荡 4h。反应完成后以12000rpm离心30min，除去上层溶液，将沉淀溶于200μL 碳酸氢钠溶液中(pH＝8.43，0.1M)，得到的FMs@PEI@Dextran放置于4℃保存以备后续使用。接着对合成的FMs@PEI@Dextran进行了表征。由图3A和B 可知，200nm FMs的平均水合直径为220nm，略大于SEM结果中的直径。由图3C可知，相比于图3A中的FMs,FMs@PEI表面有明显的包裹物，并且平均水合粒径有所增大为255nm(图3D)。由图3E可知，相比于图3C中的FMs@PEI， FMs@PEI@Dextran表面被进一步修饰，平均水合粒径进一步增大为295nm(图 3F)。由此可初步判定成功合成了FMs@PEI@Dextran。由图4，Zeta电位的测定进一步证明了FMs@PEI@Dextran的成功制备。对检测的可行性进行探究，如图5A所示，410nm处为上层溶液中BCDs的荧光发射峰(绿色曲线)，由于反应体系中BCDs远远过量，其强度几乎不受反应和环境影响，因此可作为内参，减少环境因素造成的影响。620nm处为上层溶液中FMs@PEI@Dextran的荧光发射峰(红色曲线)，其强度在FMs@PEI@Dextran与BCDs反应后明显降低(蓝色曲线)。当FMs@PEI@Dextran首先与Con A(60μg/mL)后，再加入BCDs， FMs@PEI@Dextran的荧光只略微降低(橙色曲线)，这是由于Dextran上的位点被ConA占据，影响了Dextran与BCDs结合。图5B说明了BCDs能够特异性的与FMs@PEI@Dextran结合，不与FMs和FMs@PEI发生非特异性的相互作用。实验现象与检测机理相符合，证明该传感体系具有可行性。
实施效果:
本申请实施例1的荧光微球和碳点检测Con A的应用，步骤如下：
首先对实施例1中的实验条件进行了优化。
第一步考察了不存在Con A的情况下，不同体积纯化的BCDs对 FMs@PEI@Dextran的猝灭情况。当BCDs的加入量为0-40μL时， FMs@PEI@Dextran的荧光逐渐下降，当BCDs的加入量超过40μL后， FMs@PEI@Dextran的荧光趋于稳定，不再随BCDs的增加而下降。因此选择40 μL纯化的BCDs作为最佳使用量。
接下来考察温度对荧光传感体系的影响。分别记录了4℃、25℃、37℃和 60℃下反应后的荧光数据，其中BCDs的荧光在有目标蛋白质和无目标蛋白质的情况下不变化，作为内参能够很好地减少环境因素带来的误差，但是会随着温度的升高略微减弱；FMs@PEI@Dextran的荧光信号受目标蛋白影响，当不存在 Con A时，不同反应温度下FMs@PEI@Dextran的荧光呈明显猝灭状态，说明 BCDs与FMs@PEI@Dextran的反应受温度影响不大；当存在Con A时，不同反应温度下FMs@PEI@Dextran的荧光强度有差别，这是由于蛋白质的活性受温度影响较大，温度过高或过低都会导致蛋白质失活。
使用存在Con A时FMs@PEI@Dextran的荧光峰值(FM)作为分子，内参 BCDs的荧光峰值(FB)作为分母，对数据进行处理，25℃和37℃时FM/FB的值较高且数值接近，说明反应在这两个温度下均能较好地进行，又由于25℃为普遍情况下的室温，较易达到，因此选择25℃作为最佳反应温度。随后考察了 pH对检测体系的影响。BCDs的荧光作为内参在有目标蛋白质和无目标蛋白质的情况下几乎不变化，作为内参能够很好地减少环境因素带来的误差，但是会随着pH的升高逐渐减弱，有研究表明，这是由于pH可以调节碳点电性，在较高的pH下，静电斥力增加，影响了碳点的聚合状态，使碳点的荧光减弱。当不存在Con A时，不同pH下FMs@PEI@Dextran的荧光都呈明显的猝灭状态；当存在Con A时，不同pH下FMs@PEI@Dextran的荧光强度有差别，这是由于蛋白质的活性受pH影响较大，pH过高或过低都会导致蛋白质失活。因此选择pH＝6.0 作为最佳反应pH。
进一步考察了不存在Con A时BCDs与FMs@PEI@Dextran的反应时间， BCDs的荧光在反应过程中几乎不随时间变化而变化，作为内参能够很好地减少环境因素带来的误差；FMs@PEI@Dextran的荧光则随时间的变化逐渐降低最后趋于平稳，FM/FB的值在0-30min内逐渐下降，30min后趋于平稳，表明BCDs 与FMs@PEI@Dextran的反应已经达到平衡，因此选择30min作为BCDs与 FMs@PEI@Dextran的最佳反应时间。
最后，考察了Con A与FMs@PEI@Dextran的反应时间。BCDs的荧光在有目标蛋白质和无目标蛋白质的情况下几乎不变化；当不存在Con A时， FMs@PEI@Dextran的荧光呈猝灭状态(反应时间为30min)；当存在Con A时， FMs@PEI@Dextran的荧光随时间的变化先逐渐升高后趋于平稳。FM/FB的值在前60min内逐渐上升，60min后趋于平稳，表明Con A与FMs@PEI@Dextran 的反应已经达到平衡，因此选择60min作为Con A与FMs@PEI@Dextran的最佳反应时间。
在上述优化条件下，测量了传感系统的线性响应范围。具体操作为：取350 μL10mM HEPES溶液(pH＝6.0，含1mM Ca2+，1mM Mn2+)和1μL FMs@PEI@Dextran加入600μL灭菌离心管中，然后加入不同浓度的Con A溶液 (0-125μg/mL)，混匀后室温震荡反应60min，再分别加入40μL纯化的BCDs，混匀后室温(25℃)震荡反应30min，反应完成后以3000rpm离心5min，取 200μL上层溶液用荧光分光光度计记录荧光光谱，每个样本设置3个平行。如图6A所示，BCDs在410nm处的荧光强度作为内参始终保持稳定， FMs@PEI@Dextran在620nm的荧光强度随着Con A浓度的增加而升高。图6B 为反应完成后的照片，可以清晰地看出，随着Con A浓度的增加(从左至右)，离心管底部的沉淀逐渐减少，上层溶液的荧光逐渐增强。FM/FB的值也随着Con A 浓度的增加而升高(图6C)，并且在0.125-12.5μg/mL范围内(图6D)，Con A 浓度与FM/FB呈良好的线性关系(R2＝0.9977)，回归方程y＝0.052+0.012x，检测限为0.089μg/mL。由此可说明该方法的线性范围和检测极限是良好的。
在HEPES-FMs@PEI@Dextran检测溶液中分别加入1mmol/L葡萄糖 (Glucose)、蔗糖(Sucrose)，10μg/mL Fe3+、Na+、K+、组氨酸(Histidine)、 L-脯氨酸(L-Proline)、辣根过氧化酶(HRP)、牛血清白蛋白(BSA)和Con A，用本研究建立的最优条件检测，评估传感方法的特异性，每个样本设置3个平行样。这些干扰物质的荧光响应远低于Con A。因此可说明该生物传感方法对于 Con A具有良好的选择性。
为了进一步研究该方法的实际应用潜力，使用加标回收法对胎牛血清中的 Con A进行了检测。首先用10mM HEPES溶液(含1mM Ca2+，1mM Mn2+)配制10％的胎牛血清溶液。然后取350μL配置好的10％的胎牛血清溶液，向其中加入不同浓度的Con A溶液(0，4，8，12μg/mL)，混匀，加入1μL FMs@PEI@Dextran，混匀，室温震荡反应60min，再分别加入40μL纯化的BCDs，混匀后室温震荡反应30min，反应完成后以3000rpm离心5min，取200μL上层溶液用荧光分光光度计记录荧光光谱。结果如表1所示，当分别向10％的胎牛血清中加入了4、8、12μg/mL的Con A时，其回收率(Recovery，RE)分别为 107.5％、108.8％、104.2％，相对标准偏差(n＝3)分别为4.4％、4.3％、3.6％。因此，基于Dextran功能化FMs和BCDs的比率型荧光生物传感方法有定量分析临床血清样品中Con A的潜力。
表1 Con A荧光传感的血清样本分析
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种结合FMs和BCDs的比率型荧光生物探针用于ConA检测的方法，其特征在于：ConA浓度与FM/FB呈良好的线性关系(R2＝0.9977)，回归方程y＝0.052+0.012x，检测限为0.089μg/mL。
2.权利要求1所述的比率型荧光生物探针的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)将称量好的1，4-苯二硼酸加入到超纯水中搅拌后转移至聚四氟乙烯的内衬中，随后将内衬放置于水热反应釜中，将水热反应釜放置于烘箱中加热，加热后自然冷却至室温，把反应后的溶液取出；
(2)将步骤(1)中的溶液进行离心处理除去大颗粒沉淀后，得到的溶液转移到透析袋中透析进一步纯化，随后将得到的BCDs进行保存以备后续使用；
(3)荧光微球的功能化。具体方法如下:首先对FMs进行表面氨基化,然后将得到的NH2-FMs进一步与NHS-Dextran进行偶联，最后将经超声、离心等步骤得到的FMs@PEI@Dextran放置于4℃保存以备后续使用。
(4)将步骤(2)得到的BCDs和步骤(3)中制得的功能化的NH2-FMs混合,用于检测ConA。
3.根据权利要求1所述的将FMs和BCDs的比率型荧光生物探针用于ConA检测的方法，其特征在于：所述步骤(1)中1，4-苯二硼酸0.2g，超纯水20mL，氢氧化钠溶液浓度为0.1mol/L，溶液pH＝9.0，加热温度180℃，反应时间为8h。
4.根据权利要求1所述的将FMs和BCDs的比率型荧光生物探针用于ConA检测的方法，其特征在于：所述步骤(2)中离心机转速10000rpm，离心时间30min，透析袋规格为1kDa，透析时间为24h，保存温度为4℃。
5.根据权利要求1所述的将FMs和BCDs的比率型荧光生物探针用于ConA检测的方法，其特征在于：所述步骤(3)中所用缓冲液为10mM HEPES溶液(含1mM Ca2+，1mM Mn2+)，PEI水溶液为500μL，5％体积浓度，NHS-Dextran为10μL，浓度为10mg/mL。
6.根据权利要求1所述的将FMs和BCDs的比率型荧光生物探针用于ConA检测的方法，其特征在于：所述步骤(4)中纯化的40μL BCDs加入1μLFMs@PEI@Dextran，反应温度为25℃，反应时间为30min，随后离心时转速3000rpm，离心时间5min，并取上层溶液用量200μL记录荧光光谱。
7.权利要求1-6任一项所述的FMs@PEI@Dextran和BCDs在比率型荧光检测ConA中的应用，其特征在于：拟使用葡聚糖(Dextran)对FMs进行表面修饰得到FMs@PEI@Dextran，并引入BCDs。BCDs和Con A都能与FMs@PEI@Dextran上的Dextran特异性结合，但是结合机理不同使得产物状态不一样。结合该特性和离心后上清中剩余的两种荧光信号的变化，实现对ConA的高灵敏比率型荧光检测，建立ConA的浓度与比率型荧光信号强度之间的定量关系，最后对血清中ConA的含量进行测定。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述选取胎牛血清中ConA的浓度为0，4，8，12μg/mL。向上述浓度的胎牛血清中加入不同浓度的ConA溶液，混匀，加入1μLFMs@PEI@Dextran，混匀，室温震荡反应60min，再分别加入40μL纯化的BCDs，混匀后室温震荡反应30min，反应完成后以3000rpm离心5min，取200μL上层溶液用荧光分光光度计记录荧光光谱。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述方法检测限为0.089μg/mL，进一步将该传感体系用于血清中ConA的回收率测定，结果令人满意。
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