CN106970061A - 碳点/铜纳米簇复合物比率荧光多巴胺探针的制备方法 - Google Patents
碳点/铜纳米簇复合物比率荧光多巴胺探针的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于纳米材料与生化传感的交叉技术领域，涉及一种碳点/铜纳米簇复合物比率荧光多巴胺探针的制备方法：首先制备蓝色荧光发射的碳点，对其表面进行氨基苯硼酸改性，再制备红色荧光发射的牛血清白蛋白稳定铜纳米簇，将二者混合反应制备出双荧光发射的碳点/铜纳米簇复合物，然后向碳点/铜纳米簇复合物水分散液中加入多巴胺，利用荧光光谱仪测定荧光发射光谱，拟合比率荧光峰强度与多巴胺共存浓度之间的线性关系，进而构建基于碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针；该探针的制备工艺简单，制备成本低，产品具有高灵敏性和高选择性，能够发展成为一种新颖的比率荧光探针应用于多巴胺的高效检测。
Description
技术领域：
本发明属于纳米材料与荧光传感的交叉技术领域，具体涉及一种基于碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针的制备方法，其制备的探针可用于多巴胺的高效检测。
背景技术：
多巴胺是一种儿茶酚类神经递质，参与人体多项生理功能的调节，具有控制肌肉运动、影响人的情绪和记忆的作用等。多巴胺对人体健康有显著影响，其在人体内含量发生异常可能与多种疾病有关，如厌食症、帕金森氏症与精神分裂症，因此快速准确地测定多巴胺十分重要。目前检测多巴胺的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、离子色谱法、电化学分析法、化学发光法等。这些方法普遍存在操作过程复杂、检测设备昂贵、成本高等缺点。考虑到操作简单，检测限低，可视化等优点，采用荧光分析方法，尤其是比率荧光分析方法检测多巴胺具备显著的优势。
比率荧光分析法是指通过两个波长发射光强度的比值随检测物浓度变化而变化来确定检测物含量的一种方法。鉴于比率荧光探针是以两个发射波长处荧光强度的比值作为信号，可减少因探针浓度、设备及样品环境等因素引起的测量误差，进而提高了信号的选择性和灵敏度，这在一定程度上克服了传统采用单一波长信号探测分子所存在的缺陷。传统比率荧光探针使用半导体量子点(或有机染料)作为发光材料，但其中潜在的有毒离子(发光效率低)在一定程度上会限制其在生化分析中的应用。基于此，发展一种简单、快速、准确和环保的比率荧光多巴胺探针，并将其应用于实际样品的高效分析，这对多巴胺相关疾病的临床诊断和治疗具有重要的应用价值。
铜纳米簇一般由几个到约一百个铜原子组成，具有超小粒径，高生物相容性，低毒性以及其它独特的物理化学性质，已成为构建荧光传感平台的理想纳米材料之一。铜纳米簇可用于重金属离子、pH、小分子、生物分子等的荧光检测，在疾病诊断与检测、细胞成像、生物示踪、环境检测、生物传感等方面具有广阔的应用前景。碳点作为一种新型发光碳纳米材料，不但延续了碳基纳米材料原料丰富、价廉、无毒和生物相容性好等优点，还拥有发光范围可调，光稳定性好，易于功能化，易制备等优势，在光、电、催化等方面具有独特的性质，在光电转换、光催化以及复合材料等领域也展示出重要应用。
倘若将制备的蓝色荧光发射碳点与红色荧光发射铜纳米簇通过化学偶联结合形成双荧光发射的碳点/铜纳米簇复合物，依据碳点表面修饰配体氨基苯硼酸与多巴胺之间特异性结合，引起碳点的电子向多巴胺转移，导致碳点蓝色荧光被淬灭，而多巴胺对铜纳米簇的红色荧光几乎没有影响，然后拟合比率荧光峰强度与多巴胺浓度之间的线性关系，可构建出基于碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针。经文献查新，截至目前，尚未检索到有关碳点/铜纳米簇复合物，以及基于该碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针的国内外文献和专利等资料报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，设计提供一种工艺简单，成本低，高灵敏和高选择性的基于碳点/铜纳米簇复合物比率荧光多巴胺探针的制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明涉及的一种基于碳点/铜纳米簇复合物比率荧光多巴胺探针的制备方法，其具体工艺包括以下步骤：
(1)首先制备蓝色荧光发射的碳点：将0.1克柠檬酸钠与0.75克碳酸氢铵溶解于10毫升二次蒸馏水中，搅拌均匀形成均质混合水溶液，将其转移至高压反应釜中，在180℃下搅拌反应4小时，然后冷却至室温，采用分子量为1000道尔顿透析袋渗析处理24小时，透析袋中溶液采用旋转蒸发仪除水得到悬浊液，采用丙酮沉淀产物，离心分离，乙醇洗涤得到沉淀物，再干燥除水处理得到碳点；
(2)碳点表面进行氨基苯硼酸改性：称取20毫克1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠(EDC)，10毫克N-羟基琥珀酰亚胺钠(NHS)和20毫克氨基苯硼酸溶于20毫升二次蒸馏水，混合均匀形成均质水溶液，充分搅拌1小时后，加入1毫克/毫升的碳点水分散液，在室温下继续搅拌反应2小时，反应产物采用离心分离除去未偶联的氨基苯硼酸，上层悬浊液用丙酮沉淀，离心分离，用乙醇反复洗涤得到沉淀物，然后干燥处理得到氨基苯硼酸改性的碳点；
(3)制备牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇：量取0.25毫升0.1摩/升的氯化铜水溶液与20毫升5毫克/毫升的牛血清白蛋白，在室温下充分搅拌10分钟形成均质混合液，然后滴加质量分数50％的0.5毫升氨水，继续搅拌反应5小时，反应产物用丙酮沉淀，离心分离，乙醇反复洗涤，在60℃下干燥得到牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇；
(4)碳点/铜纳米簇复合物的制备：在5毫升pH＝7.4物质的量浓度为1毫摩/升的磷酸盐水缓冲液中加入15毫克EDC和9毫克NHS，充分搅拌均匀后再加入10毫克牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇，在室温下连续搅拌反应30分钟，然后滴加5毫升1毫克/毫升的碳点水分散液，保持连续搅拌反应8小时，反应产物用丙酮进行沉淀处理，沉淀物离心分离，乙醇重复洗涤，干燥处理得到碳点/铜纳米簇复合物；
(5)在50毫升pH＝7.4物质的量浓度为1毫摩/升的磷酸盐水缓冲液中加入碳点/铜纳米簇复合物，其浓度调节至0.1毫克/毫升，在缓慢搅拌下加入多巴胺形成均质的混合体系，其中的多巴胺浓度调节为0.1-100微摩/升，采用荧光光谱仪测定混合体系的荧光发射光谱，拟合比率荧光峰强度与相应多巴胺物质的量浓度之间的线性关系，进而构建出基于碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针；
本发明与现有技术相比，采用简易的化学偶联方法制备了新颖的碳点/铜纳米簇复合物，该复合物具备蓝/红双发射的荧光，且蓝色荧光可被多巴胺高选择性和高灵敏性淬灭，而红色荧光几乎不受多巴胺的影响，可依据比率荧光峰强度与多巴胺浓度之间的线性关系，发展基于该碳点/铜纳米簇复合物的新型比率荧光多巴胺探针。该探针的制备工艺简单，制备成本低，产品具有高灵敏性和高选择性，能够发展成为一种新颖的比率荧光探针应用于多巴胺的高效检测。
附图说明：
图1为本发明制备的碳点/铜纳米簇复合物在多巴胺不同共存浓度下的荧光发射光谱，插图为相应的荧光颜色照片。
图2为本发明制备的碳点/铜纳米簇复合物在多巴胺不同共存浓度下的荧光发射光谱的比率荧光峰强度的对数与多巴胺浓度CDA之间拟合的线性关系：Log(I640/I440)＝0.00457CDA—0.12576(R2＝0.990)。
具体实施方式：
下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
将0.1克柠檬酸钠与0.75克碳酸氢铵溶解于10毫升二次蒸馏水中，搅拌均匀形成均质混合水溶液，将其转移至高压反应釜中，在180℃下反应4小时，然后冷却至室温，采用分子量为1000道尔顿透析袋渗析处理24小时，透析袋中溶液采用旋转蒸发仪除水得到悬浊液，采用丙酮沉淀产物，离心分离，乙醇洗涤得到沉淀物，再干燥除水处理得到碳点。称取20毫克1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠(EDC)，10毫克N-羟基琥珀酰亚胺钠(NHS)和20毫克氨基苯硼酸溶于20毫升二次蒸馏水，混合均匀形成均质水溶液，充分搅拌1小时后，加入1毫克/毫升的碳点水分散液，在室温下继续搅拌反应2小时，反应产物采用离心分离除去未偶联的氨基苯硼酸，上层悬浊液用丙酮沉淀，离心分离，用乙醇反复洗涤得到沉淀物，然后干燥处理得到氨基苯硼酸改性的碳点。量取0.25毫升0.1摩/升的氯化铜水溶液与20毫升5毫克/毫升的牛血清白蛋白，在室温下充分搅拌10分钟形成均质混合液，然后滴加质量分数50％的0.5毫升氨水，继续搅拌反应5小时，反应产物用丙酮沉淀，离心分离，乙醇反复洗涤，在60℃下干燥得到牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇。在物质的量浓度1毫摩/升，5毫升和pH7.4的磷酸盐水缓冲液中加入15毫克EDC和9毫克NHS，充分搅拌均匀后再加入10毫克牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇，在室温下连续搅拌反应30分钟，然后滴加5毫升物质的量浓度为1毫克/毫升的碳点水分散液，保持连续搅拌反应8小时，反应产物用丙酮进行沉淀处理，沉淀物离心分离，乙醇重复洗涤，干燥处理得到碳点/铜纳米簇复合物。在50毫升pH＝7.4物质的量浓度为1毫摩/升的磷酸盐水缓冲液中加入碳点/铜纳米簇复合物，其浓度调节至0.1毫克/毫升，在缓慢搅拌下加入多巴胺形成均质的混合体系，其中的多巴胺浓度调节为0.1-100微摩/升，采用荧光光谱仪测定混合体系的荧光发射光谱(参见图1)，拟合比率荧光峰强度与相应多巴胺物质的量浓度之间的线性关系(参见图2)，构建出基于碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针。
实施例2：
蓝色荧光发射碳点的制备，碳点表面进行氨基苯硼酸改性，红色荧光发射的牛血清白蛋白稳定铜纳米簇的制备参见实施例1，首先配制2.0毫克/毫升表面氨基硼酸改性碳点的水分散液，在磁力搅拌下向其中加入20毫克牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇，以及30毫克EDC和18毫克NHS，然后加入100毫升pH＝7.4物质的量浓度为1毫摩/升的磷酸盐水缓冲液，形成均质的混合体系，在室温下搅拌反应10小时。反应产物用丙酮进行沉淀处理，沉淀物离心分离，乙醇重复洗涤，干燥处理得到碳点/铜纳米簇复合物。配制2.0毫克/毫升的碳点/铜纳米簇复合物的水分散液，向其中加入多巴胺，配制成含一定浓度梯度的含多巴胺的碳点/铜纳米簇复合物的水分散液。采用荧光光谱仪测定混合体系的荧光发射光谱，通过拟合比率荧光峰强度与相应多巴胺物质的量浓度之间的线性关系，进而构建出基于碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针。
实施例3：
蓝色荧光发射碳点的制备，碳点表面进行氨基苯硼酸改性，红色荧光发射的牛血清白蛋白稳定铜纳米簇的制备参见实施例1，首先配制3.0毫克/毫升表面氨基硼酸改性碳点的水分散液，在磁力搅拌下向其中加入30毫克牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇，以及45毫克EDC和27毫克NHS，然后加入150毫升pH＝7.4物质的量浓度为1毫摩/升的磷酸盐水缓冲液，形成均质的混合体系，在室温下搅拌反应12小时。反应产物用丙酮进行沉淀处理，沉淀物离心分离，乙醇重复洗涤，干燥处理得到碳点/铜纳米簇复合物。配制3.0毫克/毫升的碳点/铜纳米簇复合物的水分散液，向其中加入多巴胺，配制成含一定浓度梯度的含多巴胺的碳点/铜纳米簇复合物的水分散液。采用荧光光谱仪测定混合体系的荧光发射光谱，通过拟合比率荧光峰强度与相应多巴胺物质的量浓度之间的线性关系，进而构建出基于碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针。
实施例4：
蓝色荧光发射碳点的制备，碳点表面进行氨基苯硼酸改性，红色荧光发射的牛血清白蛋白稳定铜纳米簇的制备参见实施例1，首先配制5.0毫克/毫升表面氨基硼酸改性碳点的水分散液，在磁力搅拌下向其中加入50毫克牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇，以及60毫克EDC和36毫克NHS，然后加入200毫升pH＝7.4物质的量浓度为1毫摩/升的磷酸盐水缓冲液，形成均质的混合体系，在室温下搅拌反应15小时。反应产物用丙酮进行沉淀处理，沉淀物离心分离，乙醇重复洗涤，干燥处理得到碳点/铜纳米簇复合物。配制5.0毫克/毫升的碳点/铜纳米簇复合物的水分散液，向其中加入多巴胺，配制成含一定浓度梯度的含多巴胺的碳点/铜纳米簇复合物的水分散液。采用荧光光谱仪测定混合体系的荧光发射光谱，通过拟合比率荧光峰强度与相应多巴胺物质的量浓度之间的线性关系，进而构建出基于碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针。
Claims (1)
1.一种碳点/铜纳米簇复合物比率荧光多巴胺探针的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)制备蓝色荧光发射的碳点：将0.1克柠檬酸钠与0.75克碳酸氢铵溶解于10毫升二次蒸馏水中，搅拌均匀形成均质混合水溶液，将其转移至高压反应釜中，在180℃下搅拌反应4小时，然后冷却至室温，采用分子量为1000道尔顿透析袋渗析处理24小时，透析袋中溶液采用旋转蒸发仪除水得到悬浊液，采用丙酮沉淀产物，离心分离，乙醇洗涤得到沉淀物，再干燥除水处理得到碳点；
(2)碳点表面进行氨基苯硼酸改性：称取20毫克1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠(EDC)，10毫克N-羟基琥珀酰亚胺钠(NHS)和20毫克氨基苯硼酸溶于20毫升二次蒸馏水，混合均匀形成均质水溶液，充分搅拌1小时后，加入1毫克/毫升的碳点水分散液，在室温下继续搅拌反应2小时，反应产物采用离心分离除去未偶联的氨基苯硼酸，上层悬浊液用丙酮沉淀，离心分离，用乙醇反复洗涤得到沉淀物，然后干燥处理得到氨基苯硼酸改性的碳点；
(3)制备牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇：量取0.25毫升0.1摩/升的氯化铜水溶液与20毫升5毫克/毫升的牛血清白蛋白，在室温下充分搅拌10分钟形成均质混合液，然后滴加质量分数50％的0.5毫升氨水，继续搅拌反应5小时，反应产物用丙酮沉淀，离心分离，乙醇反复洗涤，在60℃下干燥得到牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇；
(4)碳点/铜纳米簇复合物的制备：在5毫升pH＝7.4物质的量浓度为1毫摩/升的磷酸盐水缓冲液中加入15毫克EDC和9毫克NHS，充分搅拌均匀后再加入10毫克牛血清白蛋白稳定的铜纳米簇，在室温下连续搅拌反应30分钟，然后滴加5毫升1毫克/毫升的碳点水分散液，保持连续搅拌反应8小时，反应产物用丙酮进行沉淀处理，沉淀物离心分离，乙醇重复洗涤，干燥处理得到碳点/铜纳米簇复合物；
(5)在50毫升pH＝7.4物质的量浓度为1毫摩/升的磷酸盐水缓冲液中加入碳点/铜纳米簇复合物，其浓度调节至0.1毫克/毫升，在缓慢搅拌下加入多巴胺形成均质的混合体系，其中的多巴胺浓度调节为0.1-100微摩/升，采用荧光光谱仪测定混合体系的荧光发射光谱，拟合比率荧光峰强度与相应多巴胺物质的量浓度之间的线性关系，进而构建出基于碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针。
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