CN107966425B - 一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针 - Google Patents

一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针 Download PDF

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Abstract

本发明属于荧光纳米材料和可视化探针的制备技术领域，具体涉及一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备方法，该方法主要包括以下步骤：1)采用水热法制备牛血清白蛋白稳定的红荧光发射铜纳米簇；2)通过羧胺偶联法制备铜纳米簇/荧光素纳米复合物；3)加入吗啉胍分子与牛血清白蛋白结合引起铜纳米簇红荧光淬灭，而未对荧光素绿荧光造成显著影响；4)构建铜纳米簇与荧光素的荧光发射峰强度比率与吗啉胍摩尔浓度之间的线性关系，以及吗啉胍摩尔浓度与其荧光颜色的对应关系，制备出检测吗啉胍的比率荧光可视化探针；该探针的工艺简单，制备成本低，产品灵敏度高，适用于生物样品中吗啉胍的比率荧光可视化检测。

Description

一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针
技术领域：
本发明属于荧光纳米材料和可视化探针的制备技术领域，具体涉及一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备方法，其制备的探针可用于吗啉胍的比率荧光可视化检测。
背景技术：
胍类化合物存在于生理体液和组织中，对生物体功能起着重要的调节作用，也可作为药物成分广泛用于制药工业中。作为重要的胍类化合物之一，吗啉胍(或病毒灵)对RNA和DNA病毒具有多种抗病毒功效。吗啉胍已被证实在丙型肝炎、流感症状、水痘带状疱疹、麻疹、腮腺炎、烟草花叶病毒等疾病的治疗中功效显著。常规用于检测吗啉胍的方法主要包括紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法，极谱法，流动注射化学发光法等。这些常规检测方法往往需要昂贵的仪器设备、复杂而耗时的操作、较高的检测成本等，削弱了在实际样品中检测吗啉胍的效率。当前，发展一种操作简单、快速和高效检测吗啉胍的方法备受关注，已成为一项亟待解决的关键技术问题。
荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法，具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点。由于单一荧光信号易受样品体系自体和背景荧光干扰，采用双荧光强度比值处理的比率荧光具备自校准功能，可消除了自体和背景荧光带来的干扰，提高目标物检测的准确性和可靠性。比率荧光探针方法已有文献报道，例如Y.H.Wang等基于碳点-量子点杂化物构建了铜离子比率荧光纸传感器(Y.H.Wang,C.Zhang,X.C.Chen,B.Yang,L.Yang,C.L.Jiang,Z.P.Zhang,Ratiometric fluorescentpaper sensor utilizing hybrid carbon dots-quantum dots for the visualdetermination ofcopper ions,Nanoscale,2016,8:5977-5984)；C.X.Wang等采用蓝荧光碳点与红荧光金纳米团簇发展了比率荧光温度探针(C.X.Wang，H.H.Lin，Z.Z Xu，Y.J.Huang，M.G.Humphrey,C.Zhang,Tunable carbon-dot-based dual-emissionfluorescent nanohybrids for ratiometric optical thermometry in living cells,ACS Appl.Mater.Interfaces,2016,8:6621-6628)。
贵金属纳米团簇由于其独特的光学、电学和物理学性能，受到广泛关注。铜纳米团簇(CuNCs)作为一种重要的贵金属纳米团簇，与金、银、铂、钯等纳米团簇相比，其价格更低廉，易于制备，在生物分析中获得广泛应用。CuNCs尺寸小，呈现蓝-紫至近红外光谱区较强紫外-可见吸收带、宽激发带、窄发射带、高量子产率，以及可调光致发光(即荧光)性质等。此外，CuNCs具备生物相容性好、毒性低、荧光稳定性高、发射光谱可调等诸多优点，在生物检测、光电转换、药物控释、光催化、复合/杂化材料等诸多领域具有广阔的应用前景。迄今，尚未有采用比率荧光方法检测吗啉胍，基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备方法，以及对吗啉胍执行比率荧光可视化检测的国内外相关文献和专利报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，设计一种方法简单、成本低廉、灵敏度高的基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备方法。
为了实现上述目的，本发明涉及的一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备工艺包括以下步骤：
(1)制备CuNCs：配制摩尔浓度为0.1摩尔/升的氯化铜水溶液50毫升，加入0.25克牛血清白蛋白，在磁力搅拌下配制备成均质溶液，然后逐滴加入1毫升50wt％水合肼，在室温下反应6小时，然后用丙酮萃取，吸取悬浊液离心，用乙醇洗涤，真空干燥，制得CuNCs；
(2)制备CuNCs/荧光素复合物：配制质量浓度为1毫克/毫升的CuNCs水溶液50毫升，加入5毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和10毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温和磁力搅拌下，逐滴加入摩尔浓度为0.1摩尔/升的荧光素水溶液10毫升，反应1小时后产物用孔径为0.2微米的微滤膜过滤，滤液用截流分子量为1000道尔顿的透析袋透析，清除未反应的原料，袋中溶液用旋转蒸发去除90％溶剂，离心分离，乙醇洗涤，干燥得到CuNCs/荧光素复合物；
(3)配制1毫克/毫升的CuNCs/荧光素复合物水溶液10毫升，逐滴加入摩尔浓度为10毫摩尔/毫升的吗啉胍溶液，在室温和磁力搅拌下形成一系列均质混合溶液，采用荧光光谱仪测定不同吗啉胍共存浓度下均质溶液的荧光发射光谱，拟合CuNCs与荧光素荧光发射峰强度的比率I荧光素/ICuNCs与待测物质中吗啉胍的浓度之间的线性关系，进而构建出可定量检测吗啉胍摩尔浓度的比率荧光探针；
(4)将一系列均质溶液转入玻璃小瓶，放置于暗箱式紫外灯箱中，在365纳米紫外灯照射下，用数码相机拍摄记录小瓶中溶液的荧光颜色，依据小瓶中吗啉胍的浓度与其荧光颜色的对应关系，实现对吗啉胍摩尔浓度的比率荧光颜色可视化检测。
本发明涉及的步骤(1)中所述的CuNCs尺寸为1～5纳米；步骤(2)中所述的CuNCs/荧光素复合物尺寸为1～10纳米；步骤(3)中所述的待测物质中吗啉胍的浓度范围为0.1～10毫摩尔/升，吗啉胍的检测极限为0.01～0.1毫摩尔/升；步骤(4)中所述的荧光颜色变化范围是红色至绿色之间。
本发明采用化学偶联法构建了CuNCs/荧光素复合物，吗啉胍分子作为电子受体与CuNCs表面牛血清白蛋白特异性结合，引起CuNCs红荧光淬灭，而未对荧光素绿荧光造成明显影响，将荧光素荧光作为参比，构建I荧光素/ICuNCs与吗啉胍摩尔浓度之间的线性关系，且荧光颜色发生从红色向绿色迁移，实现对吗啉胍摩尔浓度的比率荧光可视化检测；与现有技术相比，本发明制备的吗啉胍比率荧光探针，其制备工艺简单，制备成本低，产品灵敏度高，可发展成为一种新颖的吗啉胍比率荧光探针，适用于生物样品中吗啉胍的比率荧光可视化检测。
附图说明：
图1为本发明涉及的一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的工作原理示意图。
图2.(a)吗啉胍摩尔浓度增大对铜纳米簇/荧光素复合物荧光发射峰强度的响应，(b)荧光峰强度比率与吗啉胍摩尔浓度间的线性关系，插图为吗啉胍摩尔浓度与其比率荧光颜色可视化检测的照片。
具体实施方式：
下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
本实施例涉及的一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备工艺与吗啉胍比率荧光检测的原理示意图参见图1所示，具体工艺步骤为：
制备CuNCs：配制摩尔浓度为0.1摩尔/升的氯化铜水溶液50毫升，加入0.25克牛血清白蛋白，在磁力搅拌下配制成均质溶液，然后逐滴加入1毫升50wt％水合肼，在室温下反应6小时，反应结束后用丙酮萃取，吸取悬浊液离心，用乙醇洗涤，真空干燥，制得CuNCs；
制备CuNCs/荧光素复合物：配制质量浓度为1毫克/毫升CuNCs水溶液50毫升，加入5毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和10毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温和磁力搅拌下，逐滴加入摩尔浓度为0.1摩尔/升的荧光素水溶液10毫升，反应1小时后产物用孔径为0.2微米的微滤膜过滤，滤液用截流分子量1000道尔顿透析袋透析，清除未反应的实验原料，袋中溶液用旋转蒸发去除90％溶剂，离心分离，乙醇洗涤，干燥得到CuNCs/荧光素复合物；
配制1毫克/毫升的CuNCs/荧光素复合物水溶液10毫升，逐滴加入摩尔浓度为10毫摩尔/毫升的吗啉胍溶液，在室温和磁力搅拌下形成一系列均质混合溶液，采用荧光光谱仪测定不同吗啉胍摩尔浓度下均质溶液的荧光发射光谱(参见图2(a))，拟合CuNCs与荧光素荧光发射峰强度比率I荧光素/ICuNCs与待测物质中吗啉胍的浓度之间的线性关系，即I荧光素/I荧光素＝1.334C吗啉胍+0.7718(R2＝0.9976)(参见图2(b))，构建出可定量检测吗啉胍的比率荧光探针，该探针检测待测物质中吗啉胍的浓度范围为0.1～10毫摩尔/升，吗啉胍的检测极限为0.01毫摩尔/升；
将一系列上述均质溶液转入玻璃小瓶，放置于紫外灯箱中，在365纳米紫外灯照射下，用数码相机拍摄记录小瓶中溶液的荧光颜色，依据小瓶中吗啉胍浓度与其荧光颜色的对应关系，实现针对吗啉胍摩尔浓度的比率荧光颜色可视化检测(参见图2(b)中插图)。
实施例2：
本实施例中CuNCs与CuNCs/荧光素复合物制备的具体工艺步骤同实施例1，配制1毫克/毫升的CuNCs/荧光素复合物水溶液20毫升，逐滴加入摩尔浓度为20毫摩尔/毫升的吗啉胍溶液，在室温和磁力搅拌下形成一系列均质混合溶液，采用荧光光谱仪测定不同吗啉胍共存摩尔浓度下均质溶液的荧光发射光谱，拟合CuNCs与荧光素的荧光发射峰强度比率I荧光素/ICuNCs与待测物质中吗啉胍的浓度之间的线性关系，构建出可定量检测吗啉胍的比率荧光探针，该探针检测待测物质中吗啉胍的浓度范围为0.1～1毫摩尔/升，吗啉胍的检测极限为0.05毫摩尔/升；将一系列上述均质溶液转入玻璃小瓶，放置于暗箱式紫外灯箱中，在365纳米紫外灯照射下，用数码相机拍摄记录小瓶中溶液的荧光颜色，依据小瓶中吗啉胍摩尔浓度与其荧光颜色的对应关系，实现针对吗啉胍摩尔浓度的比率荧光颜色可视化检测。
实施例3：
本实施例中CuNCs与CuNCs/荧光素复合物制备的具体工艺步骤同实施例1，配制1毫克/毫升的CuNCs/荧光素复合物水溶液50毫升，逐滴加入摩尔浓度为50毫摩尔/毫升的吗啉胍溶液，在室温和磁力搅拌下混合形成一系列均质混合溶液，采用荧光光谱仪测定不同吗啉胍共存摩尔浓度下均质溶液的荧光发射光谱，拟合CuNCs与荧光素的荧光发射峰强度比率I荧光素/ICuNCs与待测物质中吗啉胍的浓度之间的线性关系，进而构建出可定量检测吗啉胍的比率荧光探针，该探针检测待测物质中吗啉胍的浓度范围为1～10毫摩尔/升，吗啉胍的检测极限为0.1毫摩尔/升；将一系列上述均质溶液转入玻璃小瓶，放置于暗箱式紫外灯箱中，在365纳米紫外灯照射下，用数码相机拍摄记录小瓶中溶液的荧光颜色，依据小瓶中吗啉胍摩尔浓度与其荧光颜色的对应关系，实现针对吗啉胍摩尔浓度的比率荧光颜色可视化检测。

Claims (5)

1.一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)制备CuNCs：配制摩尔浓度为0.1摩尔/升的氯化铜水溶液50毫升，加入0.25克牛血清白蛋白，在磁力搅拌下配制备成均质溶液，然后逐滴加入1毫升50wt％水合肼，在室温下反应6小时，然后用丙酮萃取，吸取悬浊液离心，用乙醇洗涤，真空干燥，制得CuNCs；
(2)制备CuNCs/荧光素复合物：配制质量浓度为1毫克/毫升的CuNCs水溶液50毫升，加入5毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和10毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温和磁力搅拌下，逐滴加入摩尔浓度为0.1摩尔/升的荧光素水溶液10毫升，反应1小时后产物用孔径为0.2微米的微滤膜过滤，滤液用截流分子量为1000道尔顿的透析袋透析，清除未反应的原料，袋中溶液用旋转蒸发去除90％溶剂，离心分离，乙醇洗涤，干燥得到CuNCs/荧光素复合物；
(3)配制1毫克/毫升的CuNCs/荧光素复合物水溶液10毫升，逐滴加入摩尔浓度为10毫摩尔/毫升的吗啉胍溶液，在室温和磁力搅拌下形成一系列均质混合溶液，采用荧光光谱仪测定不同吗啉胍共存浓度下均质溶液的荧光发射光谱，拟合CuNCs与荧光素荧光发射峰强度的比率I荧光素/ICuNCs与待测物质中吗啉胍的浓度之间的线性关系，进而构建出可定量检测吗啉胍摩尔浓度的比率荧光探针；
(4)将一系列均质溶液转入玻璃小瓶，放置于暗箱式紫外灯箱中，在365纳米紫外灯照射下，用数码相机拍摄记录小瓶中溶液的荧光颜色，依据小瓶中吗啉胍的浓度与其荧光颜色的对应关系，实现对吗啉胍摩尔浓度的比率荧光颜色可视化检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的CuNCs尺寸为1～5纳米。
3.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的CuNCs/荧光素复合物尺寸为1～10纳米。
4.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的待测物质中吗啉胍的浓度范围为0.1～10毫摩尔/升，吗啉胍的检测极限为0.01～0.1毫摩尔/升。
5.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米簇/荧光素复合物的吗啉胍比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的荧光颜色变化范围是红色至绿色之间。
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