CN107722968B - 一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法 - Google Patents

一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米材料和荧光探针的交叉技术领域，具体涉及一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法；采用水热法制备蓝荧光发射硅量子点和红荧光发射碳量子点，通过羧‑胺偶联在羧基化硅量子点表面连接氨基功能化碳量子点和双(3‑吡啶甲基)胺，制得碳量子点/硅量子点的纳米复合物；铜离子与双(3‑吡啶甲基)胺结合引起硅量子点荧光淬灭，加入环丙沙星与铜离子竞争性结合引起硅量子点荧光恢复，碳量子点荧光几乎不变；构建硅量子点与碳量子点荧光发射峰强度比率与环丙沙星摩尔浓度之间的线性关系，制备环丙沙星比率荧光探针；该探针工艺简单，制备成本低，产品灵敏度高，适用于生物样品中环丙沙星的高效检测。

Description

一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法
技术领域：
本发明属于纳米材料和荧光探针的制备技术领域，具体涉及一种基于双发射碳量子点/硅量子点纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法，其制备的探针可用于环丙沙星的高效检测。
背景技术：
环丙沙星是第三代喹诺酮类代表性抗菌药，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药无交叉耐药性、毒副作用小等特点，被广泛用于治疗尿路感染、下呼吸道感染、皮肤感染、关节感染，以及慢性细菌感染等，检测生物流体中环丙沙星的存在浓度对人体相关疾病的临床治疗具有重要的指导意义。当前，检测环丙沙星的方法主要包括高效液相色谱法、分光光度法、流动注射化学发光法等。这些传统的检测方法普遍存在操作过程复杂、检测设备昂贵、检测成本高等缺点，发展一种简单、快速和高效的环丙沙星检测方法已成为一项当前亟待解决的关键技术问题。
荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点。文献检索表明，Chen等发展了基于蛋白质为模版的金纳米簇用于荧光OFF-ON检测环丙沙星(Protein-templated goldnanoclusters based sensor for off-on detection of ciprofloxacin with a highselectivity,Zhanguang Chen,Sihua Qian,Junhui Chen,Jie Cai,Shuyan Wu,ZipingCai,Talanta,2012,94,240–245)；Madrakian基于3-巯基丙酸修饰的CdS量子点发展了环丙沙星荧光探针(Surface decoration of cadmium-sulfide quantum dots with 3-mercaptopropionic acid as a fluorescence probe for determination ofciprofloxacin in real samples,Tayyebeh Madrakian,Somayeh Maleki,AbbasAfkhami,Sens.Actuators B,2017,243,14–21)；马岚等报道了一种基于量子点的免疫荧光检测环丙沙星的方法及其专用试剂盒(专利公开号：CN102253214A)。
尽管有关环丙沙星荧光检测的文献已有报道，但均为单一荧光信号探针，而单一荧光信号易受样品体系自体荧光和背景荧光干扰。相比之下，采用双荧光强度比值处理的比率荧光具备自校准功能，有效消除了自体荧光和背景荧光带来的干扰，提高了目标物检测结果的准确性和可靠性。碳量子点和硅量子点均属于碳族零维纳米材料，它们具备生物相容性好、毒性低、荧光稳定性高、发射光谱可调等诸多优点，在生物检测、光电转换、药物控释、光催化、复合/杂化材料等领域具有广阔的应用前景。迄今，尚未有采用比率荧光方法检测环丙沙星，以及基于碳量子点/硅量子点的双荧光发射纳米复合物来构建环丙沙星检测探针的国内外文献和专利报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，设计一种方法简单、成本低廉、灵敏度高的基于双发射碳量子点/硅量子点纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法。
为了实现上述目的，本发明涉及的基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备工艺包括以下步骤：
(1)制备硅量子点：0.5克乙二胺四乙酸二钠加入10毫升通氩气饱和的二次蒸馏水中，再加入2毫升3-氨基丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌充分混合10分钟，混合液转至反应釜中，在160℃下反应40分钟，产物冷却至室温，采用孔径为0.2微米的微滤膜过滤，滤液采用截留分子量1000道尔顿的透析袋透析处理以清除残余未反应实验原料，将透析袋中溶液倒出，旋转蒸发去除90％溶剂，然后冷冻干燥得到硅量子点干样，研磨成粉末备用；
(2)制备碳量子点：将0.1克苯二胺和1毫升质量浓度85％的磷酸加入40毫升二次蒸馏水中，混合物转至反应釜中在180℃下反应4小时，产物冷却至室温，采用孔径为0.2微米的微滤膜过滤，滤液采用截留分子量1000道尔顿的透析袋透析处理以清除残余未反应实验原料，将透析袋中溶液倒出，旋转蒸发去除90％溶剂，然后离心分离，用乙醇洗涤，真空干燥得到碳量子点备用；
(3)制备碳量子点/硅量子点纳米复合物：将步骤(1)制备的硅量子点溶于10毫升二次蒸馏水中，加入20毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和20毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温下磁力搅拌30分钟，充分混合后加入溶解了步骤(2)制备的碳量子点的水溶液10毫升，在避光处搅拌反应6小时，反应结束后再分别采用离心分离、乙醇洗涤和真空干燥处理，得到碳量子点/硅量子点纳米复合物；
(4)制备改性的纳米复合物：将步骤(3)制得的纳米复合物分散在10毫升二次蒸馏水中，加入10毫克双(3-吡啶甲基)胺，5毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和5毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温下磁力搅拌反应6小时，反应结束后再分别采用离心分离、乙醇洗涤和真空干燥处理，制得改性的纳米复合物；
(5)将步骤(4)制得的改性纳米复合物配制成水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下，在水溶液中加入氯化铜形成均质溶液，然后再加入环丙沙星，继续搅拌10分钟形成改性纳米复合物与铜离子的均质溶液；
(6)测定不同的环丙沙星摩尔浓度下，改性纳米复合物与铜离子均质溶液的荧光发射光谱，拟合硅量子点与碳量子点荧光发射峰强度比率与环丙沙星摩尔浓度之间的线性关系，构建成环丙沙星比率荧光探针。
本发明涉及的步骤(1)中所述的硅量子点尺寸为1～5纳米；步骤(2)中所述的碳量子点尺寸为1～5纳米；步骤(3)中所述的碳量子点与硅量子点的质量浓度比为1:1～1:10；步骤(5)中所述的改性纳米复合物水溶液质量浓度为1～10毫克/毫升，氯化铜摩尔浓度为0.1～150微摩/升，环丙沙星的摩尔浓度为0.1～150微摩/升；步骤(6)中所述的检测环丙沙星的浓度范围为0.1～150毫摩尔/升，环丙沙星的检测极限为0.1～1毫摩尔/升。
本发明与现有技术相比，采用化学偶联法构建了双(3-吡啶甲基)胺功能化修饰的碳量子点/硅量子点纳米复合物，铜离子与双(3-吡啶甲基)胺发生电子内滤效应，引起硅量子点荧光淬灭，环丙沙星与铜离子高特异性结合，导致硅量子点荧光恢复，此过程仅对碳量子点荧光产生微弱影响，碳量子点荧光可作为参比荧光，硅量子点荧光为响应荧光，构建硅量子点与碳量子点荧光发射峰强度比率与环丙沙星摩尔浓度之间的线性关系，制备环丙沙星比率荧光探针；其制备工艺简单，制备成本低，产品灵敏度高，能够发展成为一种新颖的环丙沙星比率荧光探针，适用于生物样品中环丙沙星的高效检测。
附图说明：
图1为本发明涉及的一种基于双发射碳量子点/硅量子点纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备与环丙沙星比率荧光信号检测的原理示意图。
图2为本发明涉及的环丙沙星比率荧光探针随环丙沙星摩尔浓度增大对碳量子点与硅量子点荧光发射峰强度信号的响应，以及荧光峰强度比率与环丙沙星摩尔浓度之间的线性关系。
具体实施方式：
下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
本实施例涉及的一种基于双发射碳量子点/硅量子点纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备工艺及其与环丙沙星比率荧光信号检测的原理示意图参见图1所示，其具体工艺步骤为：
制备硅量子点：0.5克乙二胺四乙酸二钠加入10毫升通氩气饱和的二次蒸馏水中，再加入2毫升3-氨基丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌充分混合10分钟，混合液转至反应釜中，在160℃下反应40分钟，产物冷却至室温，采用孔径为0.2微米的微滤膜过滤，滤液采用透析袋(截留分子量1000道尔顿)透析处理以清除残余未反应实验原料，取透析袋中溶液，旋转蒸发去除大部分溶剂，然后冷冻干燥得到硅量子点干样，研磨成粉末备用；
制备碳量子点：将0.1克苯二胺和1毫升质量浓度85％的磷酸加入40毫升二次蒸馏水中，混合物转至反应釜中在180℃下反应4小时，产物冷却至室温，采用孔径为0.2微米的微滤膜过滤，滤液采用透析袋(截留分子量1000道尔顿)透析处理以清除残余未反应实验原料，取透析袋中溶液，旋转蒸发去除大部分溶剂，然后离心分离，用乙醇洗涤，真空干燥得到碳量子点备用；
将制备的硅量子点溶于10毫升二次蒸馏水，加入20毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和20毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温下磁力搅拌30分钟，充分混合后加入溶解了碳量子点的水溶液10毫升，在避光处搅拌反应6小时，反应结束后采用离心分离、乙醇洗涤、真空干燥处理，得到碳量子点/硅量子点纳米复合物，其中碳量子点与硅量子点的质量浓度比为1:2；
在纳米复合物分散在10毫升二次蒸馏水中，加入10毫克双(3-吡啶甲基)胺，5毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和5毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温下磁力搅拌反应6小时，反应结束后采用离心分离、乙醇洗涤、真空干燥处理，制得改性的纳米复合物，其中双(3-吡啶甲基)胺的质量浓度为2毫克/毫升；
配制改性纳米复合物的水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下加入氯化铜形成均质溶液，然后加入环丙沙星，继续搅拌10分钟再形成均质溶液，其中改性纳米复合物质量浓度为2毫克/毫升，氯化铜摩尔浓度为0.1～100微摩尔/升，环丙沙星的摩尔浓度为0.1～100微摩尔/升；
分别测定不同的环丙沙星摩尔浓度下，改性纳米复合物与铜离子均质溶液的荧光发射光谱(参见图2a)，拟合硅量子点与碳量子点荧光发射峰强度比率ISiQDs/ICQDs与环丙沙星摩尔浓度CCIP之间的线性关系(参见图2b)即：ISiQDs/ICQDs＝0.5970+0.479Log CCIP(R2＝0.9980)，构建环丙沙星比率荧光探针，其中检测环丙沙星的浓度范围为0.1～100毫摩尔/升，环丙沙星的检测极限为0.1毫摩尔/升。
实施例2：
本实施例中的硅量子点制备与碳量子点制备的具体工艺步骤同实施例1，将制备的硅量子点溶于10毫升二次蒸馏水，加入20毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和20毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温下磁力搅拌30分钟，充分混合后加入溶解了碳量子点的水溶液10毫升，在避光处搅拌反应6小时，反应结束后采用离心分离、乙醇洗涤、真空干燥处理，得到碳量子点/硅量子点纳米复合物，其中碳量子点与硅量子点的质量浓度比为1:3；将纳米复合物分散在10毫升二次蒸馏水中，加入10毫克双(3-吡啶甲基)胺，5毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和5毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温下磁力搅拌反应6小时，反应结束后采用离心分离、乙醇洗涤、真空干燥处理，制得改性的纳米复合物，其中双(3-吡啶甲基)胺的质量浓度为5毫克/毫升；配制改性纳米复合物的水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下加入氯化铜形成均质溶液，然后加入环丙沙星，继续搅拌10分钟再形成均质溶液，其中改性纳米复合物质量浓度为3毫克/毫升，氯化铜摩尔浓度为1～100微摩尔/升，环丙沙星的摩尔浓度为1～100微摩尔/升；分别测定不同的环丙沙星摩尔浓度下，改性纳米复合物与铜离子均质溶液的荧光发射光谱，拟合硅量子点与碳量子点荧光发射峰强度比率ISiQDs/ICQDs与环丙沙星摩尔浓度CCIP之间的线性关系，构建环丙沙星比率荧光探针，其中检测环丙沙星的浓度范围为1～150毫摩尔/升，环丙沙星的检测极限为1毫摩尔/升。
实施例3：
本实施例中的硅量子点制备与碳量子点制备的具体工艺步骤同实施例1，将制备的硅量子点溶于10毫升二次蒸馏水，加入20毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和20毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温下磁力搅拌30分钟，充分混合后加入溶解了碳量子点的水溶液10毫升，在避光处搅拌反应6小时，反应结束后采用离心分离、乙醇洗涤、真空干燥处理，得到碳量子点/硅量子点纳米复合物，其中碳量子点与硅量子点的质量浓度比为1:5；在纳米复合物分散的10毫升二次蒸馏水中，加入10毫克双(3-吡啶甲基)胺，5毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和5毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温下磁力搅拌反应6小时，反应结束后采用离心分离、乙醇洗涤、真空干燥处理，制得改性的纳米复合物，其中双(3-吡啶甲基)胺的质量浓度为5毫克/毫升；配制改性纳米复合物的水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下加入氯化铜形成均质溶液，然后加入环丙沙星，继续搅拌10分钟再形成均质溶液，其中改性纳米复合物质量浓度为5毫克/毫升，氯化铜摩尔浓度为1～150微摩尔/升，环丙沙星的摩尔浓度为1～150微摩尔/升；分别测定不同的环丙沙星摩尔浓度下，改性纳米复合物与铜离子均质溶液的荧光发射光谱，拟合硅量子点与碳量子点荧光发射峰强度比率ISiQDs/ICQDs与环丙沙星摩尔浓度CCIP之间的线性关系，构建环丙沙星比率荧光探针，其中检测环丙沙星的浓度范围为1～150毫摩尔/升，环丙沙星的检测极限为1毫摩尔/升。
实施例4：
本实施例涉及到实施例1制备的环丙沙星比率荧光探针的应用，将其用于生物样品如人血清中环丙沙星的高效检测，环丙沙星摩尔浓度检测范围为0.1～100毫摩尔/升，环丙沙星检测极限可达0.1毫摩尔/升，环丙沙星检测回收率99.5～100.5％，相对标准偏差1～2％；与现有技术相比，如先前文献Talanta,2012,94,240–245和Sens.Actuators B,2017,243,14–21，它们均采用了单一荧光信号探针，而非双信号比率荧光探针检测环丙沙星，对人血清样品中环丙沙星的检测回收率为99.15～100.71％，相对标准偏差为1.7～2.9％；相比现有技术，本发明比率荧光探针的检测回收率更高，相对标准偏差更低，且制备工艺简单，制备成本低，产品灵敏度高，能够发展成为一种新颖的环丙沙星比率荧光探针，适用于不同生物样品中环丙沙星的高效检测。

Claims (6)

1.一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)制备硅量子点：0.5克乙二胺四乙酸二钠加入10毫升通氩气饱和的二次蒸馏水中，再加入2毫升3-氨基丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌充分混合10分钟，混合液转至反应釜中，在160℃下反应40分钟，产物冷却至室温，采用孔径为0.2微米的微滤膜过滤，滤液采用截留分子量1000道尔顿的透析袋透析处理以清除残余未反应实验原料，将透析袋中溶液倒出，旋转蒸发去除90％溶剂，然后冷冻干燥得到硅量子点干样，研磨成粉末备用；
(2)制备碳量子点：将0.1克苯二胺和1毫升质量浓度85％的磷酸加入40毫升二次蒸馏水中，混合物转至反应釜中在180℃下反应4小时，产物冷却至室温，采用孔径为0.2微米的微滤膜过滤，滤液采用截留分子量1000道尔顿的透析袋透析处理以清除残余未反应实验原料，将透析袋中溶液倒出，旋转蒸发去除90％溶剂，然后离心分离，用乙醇洗涤，真空干燥得到碳量子点备用；
(3)制备碳量子点/硅量子点纳米复合物：将步骤(1)制备的硅量子点溶于10毫升二次蒸馏水中，加入20毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和20毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温下磁力搅拌30分钟，充分混合后加入溶解了步骤(2)制备的碳量子点的水溶液10毫升，在避光处搅拌反应6小时，反应结束后再分别采用离心分离、乙醇洗涤和真空干燥处理，得到碳量子点/硅量子点纳米复合物；
(4)制备改性的纳米复合物：将步骤(3)制得的纳米复合物分散在10毫升二次蒸馏水中，加入10毫克双(3-吡啶甲基)胺，5毫克氮-羟基琥珀酰亚胺和5毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨)丙基-碳二亚胺盐酸钠，在室温下磁力搅拌反应6小时，反应结束后再分别采用离心分离、乙醇洗涤和真空干燥处理，制得改性的纳米复合物；
(5)将步骤(4)制得的改性纳米复合物配制成水溶液，在室温和缓慢磁力搅拌下，在水溶液中加入氯化铜形成均质溶液，然后再加入环丙沙星，继续搅拌10分钟形成改性纳米复合物与铜离子的均质溶液；
(6)测定不同的环丙沙星摩尔浓度下，改性纳米复合物与铜离子均质溶液的荧光发射光谱，拟合硅量子点与碳量子点荧光发射峰强度比率与环丙沙星摩尔浓度之间的线性关系，构建成环丙沙星比率荧光探针。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的硅量子点尺寸为1～5纳米。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的碳量子点尺寸为1～5纳米。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的碳量子点与硅量子点的质量浓度比为1:1～1:10。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的改性纳米复合物质量浓度为1～10毫克/毫升，氯化铜摩尔浓度为0.1～150微摩尔/升，环丙沙星的摩尔浓度为0.1～150微摩尔/升。
6.根据权利要求1所述的一种基于纳米复合物的环丙沙星比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述的检测环丙沙星的浓度范围为0.1～150毫摩尔/升，环丙沙星的检测极限为0.1～1毫摩尔/升。
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