CN110646392B - 碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于碳点的双发射比率荧光探针、制备方法及在多巴胺检测中的应用。本发明的荧光探针包括碳点和香豆素，且碳点与香豆素之间通过酰胺键偶联，当用300nm的单一激发光照射该碳点基双发射比率荧光探针时，其在455nm和505nm处分别具有发射峰。本发明的制备方法简单，且得到的探针能够对多巴胺进行精确检测，不仅可以有效消除背景信号的干扰，而且具有灵敏度高、选择性高等优点。

Description

碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用
技术领域
本发明涉及多巴胺检测领域，具体涉及碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用。
背景技术
多巴胺作为一种重要的神经递质，参与中枢神经系统、激素和心血管系统等多种生物过程。许多研究表明，多巴胺含量的失调将导致多种疾病，例如亨廷顿舞蹈症、帕金森症、阿尔兹海默症和精神分裂等多种神经系统的疾病。因此，多巴胺的准确检测对于疾病诊断具有很大的意义。目前检测多巴胺的方法包括色谱法、紫外分光光度法、电化学法、化学发光法和酶法等。然而这些方法都或多或少存在着一些缺陷。例如，对于测试人员的要求较高、检测耗时以及准确性差等。因此，开发一种能够简单操作且快速准确的方法迫在眉睫。
碳点作为近年来备受关注的一种材料，具有原材料价廉易得、水溶性和生物相容性好以及毒性低等优点。碳点表面丰富的含氧结构不但使其能够很好地分散在水溶液中，而且使其具有进一步修饰和应用的潜力。目前开发了很多制备碳点的方法，包括水热法、化学氧化法、电化学氧化法、激光消融法等等。对于碳点的应用则主要集中于检测、生物成像、光催化、光电器件等多个领域。
最近，许多研究者利用碳点对多巴胺进行了检测。例如，CN105675559A公开了一种利用碳点作为荧光探针检测多巴胺的方法。该方法利用多巴胺对荧光碳点的特异性增强的现象，通过制备特定的荧光探针，在碳点表面实现含氮、硼官能团的双功能化，实现了痕量多巴胺的检测，提高了检测灵敏度，从而实现对于浓度低至0.1pM的多巴胺的检测。
再例如，青岛大学在CN106970061 A中公开一种碳点/铜纳米簇复合物比率荧光多巴胺探针的制备方法。首先，制备蓝色荧光发射的碳点，对其表面进行氨基苯硼酸改性，再制备红色荧光发射的牛血清白蛋白稳定铜纳米簇，将二者混合反应制备出双荧光发射的碳点/铜纳米簇复合物，然后向碳点/铜纳米簇复合物水分散液中加入多巴胺，利用荧光光谱仪测定荧光发射光谱，拟合比率荧光峰强度与多巴胺共存浓度之间的线性关系，进而构建基于碳点/铜纳米簇复合物的比率荧光多巴胺探针。该探针的制备工艺简单，制备成本低，产品具有高灵敏性。
再例如，何伟杰等人[Ratiometric fluorescence and visual imagingdetection of dopamine based on carbon dots/copper nanoclusters dual-emittingnanohybrids[J]. Talanta, 2018, 178: 109-115.]，采用碳点和金纳米团簇制备的探针来进行多巴胺的检测。
综上所述，虽然目前已开发许多基于碳点的探针来检测多巴胺，但这些探针主要关注于灵敏度，对于选择性仍需进一步提高。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明进行了深入研究，发现通过使碳点(特别是黄色碳点)和蓝色香豆素偶联，在300 nm激发光激发时，会观察到455 nm和505nm处发射得到的峰，进一步发现多巴胺会同时对碳点和香豆素的这两种荧光产生不同程度的猝灭，基于此可通过碳点和香豆素荧光强度的比值对多巴胺进行定量的检测。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供碳点基双发射比率荧光探针。碳点基双发射比率荧光探针包括碳点和香豆素，且所述碳点与所述香豆素之间通过酰胺键偶联。当用300 nm的单一激发光照射时，所述碳点基双发射比率荧光探针具有在455 nm和505 nm的两个发射峰。
在某些示例性的实施方案中，所述酰胺键通过使带羧基的碳点与带氨基的香豆素经化学反应得到。
在某些示例性的实施方案中，所述带氨基的香豆素为7-氨基-4甲基香豆素。
在某些示例性的实施方案中，所述碳点为具有黄色荧光的碳点，所述香豆素为具有蓝色荧光的香豆素。
本发明的第二方面，提供碳点基双发射比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1) 在第一溶剂中使碳点与二氯亚砜反应得到酰氯化的碳点；
(2) 在第二溶剂中使所述酰氯化的碳点与带氨基的香豆素反应1-24小时得到碳点基双发射比率荧光探针。
在某些示例性的实施方案中，步骤(1)中所述的第一溶剂为乙腈，且其用量为二氯亚砜体积的1.5-3.5倍，所述反应条件包括在100-250℃的反应温度下加热直至碳点完全分散，然后继续加热至第一溶剂蒸干，得到酰氯化的碳点。
在某些示例性的实施方案中，步骤(2)中所述的第二溶剂为无水乙腈，且带氨基的香豆素的添加量足以使所述碳点的重量为所述带氨基的香豆素的重量的10-50倍。
在某些示例性的实施方案中，所述碳点基双发射比率荧光探针的制备方法进一步包括(3)使用处理剂处理所述碳点基双发射比率荧光探针的步骤，其中所述处理剂包括1,3-丙烷磺酸内脂、二氧六环和三乙胺。
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的碳点基双发射比率荧光探针或第二方面的方法得到的碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用。
在某些示例性的实施方案中，本发明的应用包括使碳点基双发射比率荧光探针与多巴胺溶液接触，然后用300 nm的激发光激发，之后测定在320-580 nm之间的发射波长的光谱。
本发明的荧光探针为一种比率型荧光探针，其是荧光检测方法中重要的一种探针。比率型荧光探针将两种荧光物质的比值作为检测信号对目标物进行定量的检测。本发明的比率型荧光探针中碳点和香豆素的荧光强度比值在0-33.6μM的范围内表现出良好的线性关系，从而能够对多巴胺进行精确检测，不仅可以有效消除背景信号的干扰，而且具有灵敏度和准确度高且选择性或特异性好等优点。另外，本发明的比率型荧光探针制备方法简单。
附图说明
图1为一种示例性的碳点基双发射比率荧光探针制备流程示意图。
图2为本发明的碳点基双发射比率荧光探针的荧光图谱。
图3为本发明的碳点基双发射比率荧光探针中加入不同浓度多巴胺的荧光光谱图。
图4为本发明一种示例性碳点基双发射比率荧光探针的荧光强度比与多巴胺浓度的线性关系图。
图5为本发明多巴胺检测中干扰物对多巴胺检测的影响结果。图中，每两个柱组成一组，每组柱中左侧柱为探针+干扰，右侧为探针+干扰+DA。
图6为本发明的碳点基双发射比率荧光探针选择性检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明中，术语“碳点基双发射比率荧光探针”，也可称作“碳点-香豆素的荧光探针”，或者“基于碳点的双发射比率荧光探针”，是指具有两种可检测信号的复合物。与现有复合物不同，此处的碳点基双发射比率荧光探针不仅具有作为无机部分的碳点，而且还具有作为有机部分的香豆素。
本发明中，术语“带氨基的香豆素”是指香豆素上的任意原子或基团被氨基所取代得到的化合物。氨基基团可以直接与下式(I)环状结构的原子连接，也可以与下式(I)结构的3-8位上的取代基中的原子直接连接，对此，本文没有特别限定。在某些实施方案中，氨基通过与氢原子取代而位于式(I)环状结构的3-8位的任意位置。在一分子香豆素中的氨基基团的数量不限定，可以是一个氨基，也可以是两个以上的氨基。
Figure 184170DEST_PATH_IMAGE001
式(I)。
[碳点基双发射比率荧光探针]
本发明的第一方面，提供一种碳点基双发射比率荧光探针，其包括碳点和香豆素，且碳点与香豆素之间通过酰胺键偶联。本发明的碳点基双发射比率荧光探针优选为水溶性的探针，为此可优选通过水溶性处理以提高其水溶性。当用300 nm的单一激发光照射碳点基双发射比率荧光探针时，其在455 nm和505 nm处分别具有发射峰。
本发明中，碳点是指粒径小于10nm，生物兼容性好的荧光碳纳米材料，其结构包括但不限于晶格或非晶格结构。碳点可以使用已知的产品，可者通过已知方法制备得到。具体的合成方法不做特别限定，可以为自上至下合成，也可以通过自下而上合成。其中，自上至下是指通过切割裂解三维或者二维的碳材料形成零维碳点。即，将大尺寸的碳源通过物理或者化学的方法剥离出尺寸很小的碳量子点。自下而上的方法主要是通过小分子或聚合物缩合碳化而得到碳点。如化学氧化法、燃烧法、水热/溶剂热法、微波合成法或模板法等。
在某些实施方案中，本发明使用的碳点为黄色碳点。本发明发现黄色碳点能够避免样品中其他成分，特别是来源于生物的成分的干扰，进一步提高多巴胺的检测特异性和灵敏度。优选地，当用300nm的单一激光照射本发明的黄色碳点时，其具有505nm的单一发射峰。本发明的黄色碳点可通过化学氧化合成。在示例性合成方法中，黄色碳点的合成包括以下步骤：将0.1-1g的碳纤维粉加入到30毫升浓硫酸和浓硝酸的混酸中，保持溶液沸腾，回流0.5-6h；反应结束后用碳酸氢钠将溶液中和至pH 7左右，中和后使用滤膜(例如0.22μm的滤膜)过滤例如两次，把所得到的滤液透析1-10天；将样品冷冻干燥，保存于干燥器中得到本发明的碳点。
本发明中， 香豆素是指具有上式(I)所述环状结构的一类化合物的统称。具体地，本发明的香豆素可以是式(I)所示的化合物，也可以是在式(I)结构的3-8位具有取代基的化合物，其中取代基不特别限定，优选为直链取代基，更优选C1-C8烷基取代基，例如C1-C4烷基取代基或C1-C2烷基取代基。优选地，当用300nm的单一激光照射香豆素时，香豆素具有455nm的发射峰。
在本发明的碳点基双发射比率荧光探针中，碳点与香豆素的摩尔比不特别限定，例如可以是1:1-1:10，优选1:1-1:8，更优选1:1-1:5。在某些实施方案中，碳点与香豆素的摩尔比为1:4。
本发明中，酰胺键是指由羧基与氨基经化学反应而形成的基团。可以是由带有羧基官能团的香豆素和带有氨基官能团的碳点经化学反应形成，也可以是由带有羧基官能团的碳点和带有氨基官能团的香豆素通过化学反应得到。本发明中优选采用带羧基的碳点与带氨基的香豆素经化学反应得到的酰胺键。
本发明中，一分子探针中酰胺键的数量不特别限定。如上所述，酰胺键的数量随着香豆素中氨基的数量以及碳点与香豆素的摩尔比而变化。本领域技术人员可根据需要而自由设定。
制备方法]
本发明的第二方面，提供碳点基双发射比率荧光探针的制备方法，其至少包括以下两个步骤：
(1) 在第一溶剂中使碳点与二氯亚砜反应得到酰氯化的碳点；
(2) 在第二溶剂中使所述酰氯化的碳点与带氨基的香豆素反应1-24小时得到所述碳点基双发射比率荧光探针。
本发明的步骤(1)为得到酰氯化碳点的步骤。在该步骤中，第一溶剂可以为四氢呋喃、二氯甲烷或乙腈。优选地，使用乙腈作为溶剂，其用量一般为二氯亚砜体积的1.5-3.5倍，优选2-3倍。在具体实施方案中，可采用2-10 ml的乙腈作为溶剂。
步骤(1)的反应条件包括在100-250℃的反应温度下加热直至碳点完全分散，继续加热至第一溶剂蒸干。优选地，反应温度为120-200℃，更优选的反应温度为135-160℃。
步骤(2)为获得碳点基双发射比率荧光探针的步骤。其中，第二溶剂为纯溶剂，优选为无水乙腈。本步骤中带氨基的香豆素的添加量与步骤(1)中碳点的重量比优选为1:10-50，优选1:15-40，更优选1:20-30。在具体实施方案中，本步骤中带氨基的香豆素的添加量为0.01-5mg。
步骤(2)的反应条件包括在常温下进行反应，例如1-24小时，优选1-20小时，更优选2-10小时。无水乙腈的量不做特别限定，只要能够用来溶解步骤(1)制备的碳点并使其均匀分散在溶剂中即可。
除了上述步骤(1)和(2)外，本发明的碳点基比率型荧光探针的制备过程中，还优选包括使用处理剂处理步骤(2)得到的荧光探针样品的步骤。本发明的处理剂包括但不限于1,3-丙烷磺酸内脂、二氧六环和三乙胺。优选地，本发明的处理剂由1,3-丙烷磺酸内脂、二氧六环和三乙胺组成。一般情况下，三者的比例为0.05-1g的1,3-丙烷磺酸内脂、10 mL的二氧六环和100-3000 μL的三乙胺，或者其等比例的缩放。
本发明中，在使用处理剂处理步骤(2)得到的荧光探针样品时，优选在水性环境(优选纯水环境)中进行。具体地，需要使步骤(2)得到的荧光探针与处理剂在水中进行反应。为此，需要首先将步骤(2)得到的荧光探针进行溶剂去除步骤，例如，通过将得到的样品进行旋转蒸发以去除溶剂。然后将去除溶剂后的荧光探针分散于水性环境，例如纯水中。
本发明中，处理剂的添加量不特别限定，一般而言，当将用0.5-50 mg的碳点得到的荧光探针溶于1mL纯水时，处理剂的添加量为10-25mL。
本发明的步骤(3)中，处理剂进行处理的反应条件包括35-45℃水浴6-48h。处理剂处理后的荧光探针具有提高的水溶性。优选地，反应条件为水浴38-42℃，更优选39-41℃。反应时间优选10-30小时。示例性反应条件包括40℃的水浴温度和6-48小时的反应时间。
本发明中，在处理剂处理后，还可包括对荧光探针样品蒸发处理过程，目的是为了去除溶剂。本发明的蒸发处理过程可以采用任何已知的方法，在具体实施方案中，采用旋转蒸发去除溶剂。
可选地，在经过处理剂处理并通过旋转蒸发去除溶剂后，还包括对得到的样品再次置于纯水环境中分散，然后使用萃取溶剂去除游离的香豆素，再一次将样品旋转蒸发去除溶剂，最后置于纯水环境中，使用半透膜进行透析的过程。萃取和半透膜处理过程采用通用的方法即可。其中，所用萃取剂为中性有机化合物，如羧酸酯等，在具体实施方案中，使用乙酸乙酯作为萃取剂。使用的半透膜为截留分子量为3500 Dalton的透析袋，在具体实施方案中，使用透析条件为透析7天且每天换4-5次水。
[多巴胺的检测]
碳点基双发射比率荧光探针可用于检测多巴胺。当由本发明的方法制备的碳点基双发射比率荧光探针检测多巴胺时，碳点和香豆素的荧光会被不同程度的猝灭，通过计算两个特征峰的强度比值，从而可以准确对多巴胺进行定量的检测。
在某些实施方案中，本发明的检测(或本发明的应用)包括：将碳点基比率型荧光探针样品分散于磷酸缓冲盐溶液中，取分散后的样品溶液分别加入不同浓度的多巴胺溶液孵育1-10 min，加入到比色皿中进行检测。优选地，激发和发射的狭缝宽度设置为10 nm，在激发光为300 nm下，测定发射波长320-580 nm的光谱。在示例性实施方案中，检测过程中使用的缓冲液为pH 7.2、0.01 M的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，多巴胺溶液浓度为0-2400 μM。
荧光探针的选择性是评价传感系统或探针可行性的关键和必要参数。本发明通过针对一些人类血液中常见的物质来进行对比来研究了本发明的碳点基双发射荧光探针的特异性。具体地，选择性实验为将多巴胺溶液替换为浓度为的尿酸、甘氨酸、L-半胱氨酸、抗坏血酸、丙氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、尿素、氯化钠和氯化钾溶液，优选地，替换溶液的浓度为0.1 M。
实施例1
图1为本发明的一种示例性的碳点基双发射比率荧光探针制备流程示意图。将带有羧基的碳点酰氯化后与带有氨基的香豆素共价偶联在一起，形成碳点-香豆素荧光探针。图2为其荧光图谱。如图2所示，在单一激发光为300 nm时，会同时观察到455 nm和505 nm处的发射峰。
下面详细说明，本实施例的碳点基双发射比率荧光探针的制备。
1. 试剂及仪器
1.1 仪器
透射电子显微镜(TEM)：日本电子（JEOL）JEM1200EX（加速电压120kV）；傅立叶变换红外光谱仪：产品型号为Nicolet iS50，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；荧光分析仪：日立荧光分光光度计F-4700。
1.2 试剂
浓硝酸、浓硫酸、碳酸氢钠、1,4-二氧六环、三乙胺、二氯亚砜、乙酸乙酯购买于成都市科隆化学品有限公司；香豆素、1,3-丙烷磺酸内脂、无水乙腈、盐酸多巴胺、尿酸、甘氨酸、L-半胱氨酸、抗坏血酸、丙氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、尿素、氯化钠、氯化钾购买于阿拉丁化学试剂公司。
2. 制备方法
2.1 碳点的制备
将0.1-1g的碳纤维粉加入到30毫升浓硫酸和浓硝酸的混酸中，保持溶液沸腾，回流0.5-6h。反应结束后用碳酸氢钠将溶液中和至pH 7左右，中和后使用0.22μm的滤膜过滤两次，把所得到的滤液透析7天，将样品冷冻干燥，保存于干燥器中。
2.2 碳点基双发射比率荧光探针的制备
取0.5-50mg的步骤(1)制备得到的碳点，加入2-10ml的乙腈和1-5ml的二氯亚砜，置于100-250℃加热至碳点完全分散，将溶剂完全蒸干后，即可得到酰氯化的碳点,将其分散于无水乙腈中，加入0.01-5 mg溶于无水乙腈的香豆素，置于室温下反应1-24h。
2.3 碳点-香豆素样品的处理
将得到的样品旋转蒸发去除溶剂，分散于1mL的纯水中，加入0.05-1g的1,3-丙烷磺酸内脂、10mL的二氧六环和100-3000μL的三乙胺，40℃水浴反应6-48 h。再次将得到的样品旋转蒸发去除溶剂，分散于1 mL的纯水中，使用乙酸乙酯萃取，去除游离的香豆素，再一次将样品旋蒸蒸发去除溶剂，分散于1mL的纯水中，使用3500 Dalton的透析袋透析7天，每天换4-5次水。
实施例2
本实施例为碳点基双发射比率荧光探针的应用例。具体地，包括以下步骤：
取10-300 μL碳点-香豆素样品分散于PBS（pH 7.2、0.01 M）的碳点-香豆素溶液，分别加入0-2400 μM不同浓度的多巴胺溶液，混合均匀后孵育1-10 min，加入到比色皿中，激发和发射的狭缝宽度都设置为10 nm，在激发光为300 nm下，测定发射波长320-580 nm的光谱。
选择性实验则将多巴胺溶液替换为浓度为0.1 M的尿酸、甘氨酸、L-半胱氨酸、抗坏血酸、丙氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、尿素、氯化钠和氯化钾溶液，在相同的条件下进行测试，灵敏度和选择性的实验均重复三次。
图3为荧光强度比（I505/I455）与多巴胺浓度的关系，当多巴胺浓度为0-33.6 μM时，荧光强度比（I505/I455）与多巴胺浓度呈现出良好的线性关系。图4为最低检测限检测结果，其线性回归方程如图所示，I505/I455=1.02142-0.00419 CDA，相关系数R2是0.992，使用LOD=3N（N是空白的标准偏差）计算多巴胺的最低检测限为5.67 nM。
如图5和图6所示所示，当不存在多巴胺时，空白组和干扰组之间没有明显的差异，这说明干扰物质对该传感系统没有明显的影响，当多巴胺和潜在的干扰物共同存在时，即使各种物质的浓度是多巴胺的5倍以上，但是它们对多巴胺的检测的误差也较小，因此，制备的碳点-香豆素复合探针对于多巴胺的选择性较高。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (9)

1. 碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用，其特征在于，碳点基双发射比率荧光探针包括碳点和香豆素，所述碳点与所述香豆素之间通过酰胺键偶联，当用300 nm的单一激发光照射所述碳点基双发射比率荧光探针时，其在455 nm和505 nm处分别具有发射峰，荧光强度比I505/I455与多巴胺浓度呈现线性关系。
2.根据权利要求1所述的碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用，其特征在于，所述酰胺键通过使带羧基的碳点与带氨基的香豆素经化学反应得到。
3.根据权利要求2所述的碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用，其特征在于，所述带氨基的香豆素为7-氨基-4甲基香豆素。
4.根据权利要求1所述的碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用，其特征在于，所述碳点为黄色碳点。
5.根据权利要求1所述的碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用，其特征在于，所述碳点基双发射比率荧光探针通过以下的制备方法制备得到，所述制备方法包括以下步骤：
(1) 在第一溶剂中使碳点与二氯亚砜反应得到酰氯化的碳点；
(2) 在第二溶剂中使所述酰氯化的碳点与带氨基的香豆素反应1-24小时得到所述碳点基双发射比率荧光探针。
6.根据权利要求5所述的碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用，其特征在于，在步骤(1)中，所述第一溶剂为乙腈，且其用量为二氯亚砜体积的1.5-3.5倍，所述反应条件包括在100-250℃的反应温度下加热直至碳点完全分散，然后继续加热至第一溶剂蒸干，得到所述酰氯化的碳点。
7.根据权利要求5所述的碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用，其特征在于，在步骤(2)中，所述第二溶剂为无水乙腈，且所述带氨基的香豆素的添加量足以使所述碳点重量为所述带氨基的香豆素重量的10-50倍。
8.根据权利要求5所述的碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用，其特征在于，所述制备方法进一步包括(3)使用处理剂处理步骤(2)得到的碳点基双发射比率荧光探针的步骤，其中所述处理剂包括1,3-丙烷磺酸内脂、二氧六环和三乙胺。
9. 根据权利要求1所述的碳点基双发射比率荧光探针在多巴胺检测中的应用，其特征在于，所述应用包括使所述碳点基双发射比率荧光探针与多巴胺接触，然后用300 nm的激发光激发，之后测定在320-580 nm之间的发射波长的光谱。
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