CN110702828A - 一种采用hplc-hg-afs法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法 - Google Patents

一种采用hplc-hg-afs法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用HPLC‑HG‑AFS法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法，属于血液样本检测技术领域。为解决现有技术无法测定全血或红细胞内结合砷具体浓度的不足，本发明提供了一种采用HPLC‑HG‑AFS法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法，包括配制AsIII、AsV、DMAV和MMAV四种砷形态的标准溶液，确定HPLC‑HG‑AFS检测条件并绘制四种砷形态的标准曲线，对血液样本进行前处理并测定全血或红细胞中四种砷形态的浓度。本发明采用双氧水使细胞内蛋白结合砷解离，能够明确血细胞内砷形态的代谢及分布特征。

Description

一种采用HPLC-HG-AFS法测定全血或红细胞中四种砷形态浓 度的方法
技术领域
本发明涉及一种测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法，特别涉及一种采用HPLC-HG-AFS法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法及其应用。本发明属于血液样本检测技术领域。
背景技术
砷污染指由砷或其化合物所引起的环境污染，砷和含砷金属的开采、冶炼，用砷或深化合物作原料的玻璃、颜料、原药、纸张生产以及煤的燃烧等过程都可产生含砷废水、废气和废渣，对环境造成污染。大气含砷污染除岩石风化、火山爆发等自然原因外，主要来自工业生产及含砷农药的使用、煤的燃烧。含砷废水、农药及烟尘都会污染土壤，在土壤中累积病，进入农作物组织中；砷和砷化物通过水、大气和食物等途径进入人体，造成危害。
血液内砷浓度最能够直接反映砷在人体内的代谢和分布特征，全血主要成分包含血浆、血清、红细胞和白细胞。血液中药物浓度的测定通常以血浆或血清作为样本，但是已有研究证实大部分砷存在于红细胞内，并且血浆和红细胞中各砷形态所占比例不同。因此有必要测定红细胞内砷浓度，从而清晰地阐明其在人体内的代谢特征和作用机制。
砷在体内以游离态和结合态形式存在，如何有效地提取血细胞内砷形态是方法准确测定的关键与难点。目前测定砷形态的技术手段主要有高效液相联用电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)和高效液相色谱联用氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)，二者的原理和灵敏度各不相同。已有报道利用HPLC-ICP-MS测定人血浆、尿液、脑脊液、唾液、头发和指甲中的砷形态，其中Nguyen等公开报道应用HPLC-ICP-MS测定饮水砷暴露下人血清中AsIII、DMA、MMA和AsV的方法，该方法采用三氯乙酸和乙腈对血清进行蛋白沉淀并利用阴离子色谱柱分离不同砷形态，该前处理方法不能用于血细胞内砷化物的提取，同时HPLC-ICP-MS仪器昂贵、运行成本高、操作复杂，不易普及。HPLC-HG-AFS采用我国自主研发的氢化物发生原子荧光分析技术，具有灵敏度高、元素干扰小，方法简便快速并且易于操作等优点，已经成为食品卫生、饮用水中重金属检测的国家标准方法，在环境保护、水质分析、地质等领域有了很多应用，但是在生物样本测定方面还应用较少。Guo等曾报道一种HPLC-HG-AFS法测定血浆中砷形态的方法，采用高氯酸处理血浆，利用阴离子色谱柱测定AsIII、DMAV、MMAV和AsV，该方法不足之处也在于前处理手段无法完全提取血液中血细胞内的砷。为了解决现有方法存在的缺陷，同时扩大HPLC-HG-AFS法在生物样本测定方面的应用，需要建立一种能够快速、有效测定全血和红细胞内砷形态的方法。
发明内容
为解决现有技术无法测定全血或红细胞内结合砷具体浓度的不足，本发明提供了一种采用HPLC-HG-AFS法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种采用HPLC-HG-AFS法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法，包括如下步骤：
步骤一、配制四种砷形态的标准溶液：
分别配制一定浓度的AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷形态的储备液；将各储备液在2～50ng/mL范围内逐级稀释得到不同浓度的四种砷形态的标准溶液；
步骤二、确定HPLC-HG-AFS检测条件：
高效液相条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150mm×4.1mm，5μm；流速：1.0mL/min；流动相：13mmol/L无水乙酸钠，3mmol/L无水磷酸二氢钠，4mmol/L硝酸钾和0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠组成的混合溶液；
原子荧光光谱条件：原子化器高度：8.0mm；主电流：80mA；辅电流：40mA；屏蔽气流量：900mL/min；载气流量：300mL/min；负高压：300V；泵速：65r/min；还原液：含有质量浓度为3％的KBH4和质量浓度为0.5％的KOH；载流液：体积浓度为10％的HCl；
步骤三、绘制四种砷形态的标准曲线：
在步骤二确定的HPLC-HG-AFS色谱条件下依次将步骤一配制的四种砷形态的标准溶液进样分析，以砷形态的浓度x为横坐标，砷形态峰面积y为纵坐标，进行线性回归，分别绘制四种砷形态的标准曲线方程；
步骤四、处理待测样本：
(1)收集全血样本：将血液样本于EDTA抗凝管中；
(2)收集红细胞样本：收集的全血样本于4℃条件下离心去除上层血浆，剩余部分加生理盐水稀释，再加入等体积淋巴细胞分离液得到中间样本，将中间样本置于4℃条件下离心，所得样本分为四层，提取最底层，得到红细胞样本；
(3)按一定体积比将全血样本或红细胞样本、质量浓度为5％的氨水和步骤二所述流动相充分混匀得到处理液，按一定体积比向所述处理液中加入质量浓度为30％的双氧水，涡旋混匀，得到预处理样本，所得预处理样本室温下静置过夜；
(4)检测前，将过夜的预处理样本于4℃下2000rpm离心10min，取上清液，按一定体积比与质量浓度为20％的高氯酸混匀并置于4℃条件下高速离心，取上清液过0.22μm滤膜得到检测样本；
步骤五、样本的检测与数据处理：
将步骤四所得检测样本按照步骤二确定的HPLC-HG-AFS检测条件进行检测，由保留时间定性，峰面积定量，利用相应砷形态的标准曲线，外标法定量，计算得出血液样本中各砷形态的浓度。
其中，优选的，步骤一所述四种砷形态的储备液浓度均为1000ng/mL，所述四种砷形态的标准溶液中砷形态的浓度均依次为50、30、25、10、5和2ng/mL。
其中，优选的，步骤二所述高效液相的进样体积为100μL。
其中，优选的，步骤三所述四种砷形态的标准曲线方程分别为：
AsIII：Y＝1.178×105+2.184×105X，r2＝0.9996，线性范围为2.00～50ng/ml；
DMAV：Y＝3.714×103+1.778×105X，r2＝0.9986，线性范围为2.00～50ng/ml；
MMAV：Y＝4.527×104+2.287×105X，r2＝0.9969，线性范围为2.00～50ng/ml；
AsV：Y＝1.259×105+1.822×105X，r2＝0.9986，线性范围为2.00～50ng/ml。
其中，优选的，步骤四(2)所述全血样本的离心转速为4000rpm，离心时间为15min；所述稀释为稀释3倍；所述中间样本的离心转速为2000rpm，离心时间为15min。
其中，优选的，步骤四(3)所述全血样本或红细胞样本、质量浓度为5％的氨水和步骤二所述流动相的体积比为100:5:195。
其中，优选的，步骤四(3)所述处理液与质量浓度为30％的双氧水的体积比为3:2。
其中，优选的，步骤四(4)所述预处理样本低速离心的离心转速为2000rpm，离心时间为10min，所述上清液与质量浓度为20％的高氯酸的体积比为450:50。
其中，优选的，步骤四(4)所述高速离心的转速为13200rpm，离心时间为15min。
本发明所述的方法可用于测定健康人体全血或红细胞中AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷形态的浓度，也可用于通过测定AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷形态在人体血液内的浓度来明确其在人体内的代谢特征和作用机制，但所述的方法并不用于疾病的诊断和治疗。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明首先对血液样本的前处理方法进行了优化，采用双氧水使细胞内蛋白结合砷解离，能够有效提取细胞内各砷形态，实现了HPLC-HG-AFS方法对全血和红细胞的测定，弥补了现有方法无法测定细胞内结合砷的不足，可以同时灵敏、快速、准确、低成本的检测全血和红细胞中AsIII、AsV、、DMAV和MMAV四种不同砷形态的浓度，以明确各砷形态的代谢及分布特征。
附图说明
图1为实施例4测定的全血中各砷形态的色谱图；
图2为实施例4测定的红细胞中各砷形态的色谱图；
图3为对比例1未经双氧水处理的全血样本中各砷形态的色谱图；
图4为对比例1经双氧水处理的全血样本中各砷形态的色谱图；
图5为对比例1未经双氧水处理的红细胞样本中各砷形态的色谱图；
图6为对比例1经双氧水处理的红细胞样本中各砷形态的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
本实施例建立了一种HPLC-HG-AFS检测方法。
本实施例使用的仪器与试剂：
仪器：高效液相-氢化物发生-原子荧光联用仪LC-AFS 6500(北京海光仪器有限公司)，超声波清洗仪(美国必能信)，超纯水仪(Thermo Fisher科技有限公司)，多功能低温高速离心机(Eppendorf公司)，千分之一精密电子天平(Sartorius公司)；
试剂：亚砷酸根、砷酸根、一甲基砷、二甲基砷标准溶液均购于中国计量科学院，无水磷酸二氢钠、无水乙酸钠、硝酸钾、乙二胺四乙酸二钠(99.00％，优级纯)均购于国药集团化学试剂有限公司，硼氢化钾(98.00％，优级纯)购于天津化学试剂研究所，氢氧化钾(82.60％，优级纯)购于天津市福晨化学试剂厂，盐酸(35％，优级纯)天津市永大化学试剂开发中心，淋巴细胞分离液和红细胞裂解液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，高纯氩气(100.00％)购于哈尔滨黎明气体有限公司。
本实施例建立的HPLC-HG-AFS检测方法包括如下步骤：
步骤一、配制四种砷形态的标准溶液：
分别配制浓度为1000ng/mL的AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷形态的储备液；将各砷形态的储备液分别用水逐级稀释为浓度50、30、25、10、5和2ng/mL的标准溶液；
步骤二、确定HPLC-HG-AFS检测条件：
高效液相条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150mm×4.1mm，5μm；流速：1.0mL/min；流动相：13mmol/L无水乙酸钠，3mmol/L无水磷酸二氢钠，4mmol/L硝酸钾和0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠组成的混合溶液；进样体积：100μL；
原子荧光光谱条件：原子化器高度：8.0mm；主电流：80mA；辅电流：40mA；屏蔽气流量：900mL/min；载气流量：300mL/min；负高压：300V；泵速：65r/min；还原液：含有质量浓度为3％的KBH4和质量浓度为0.5％的KOH；载流液：体积浓度为10％的HCl；
步骤三、绘制四种砷形态的标准曲线：
在步骤二确定的HPLC-HG-AFS色谱条件下依次将步骤一配制的四种砷形态的标准溶液进样分析，以砷形态的浓度x为横坐标，砷形态峰面积y为纵坐标，进行线性回归，分别绘制四种砷形态的标准曲线方程，如表1所示：
表1
Figure BDA0002200765900000061
由表1可知，各砷形态在2-50ng/mL范围内呈良好线性关系。
步骤四、处理待测样本：
(1)收集全血样本：将血液样本于EDTA抗凝管中；
(2)收集红细胞样本：收集的全血样本于4℃条件下4000rpm离心15min去除上层血浆，剩余部分加生理盐水稀释3倍，再加入等体积淋巴细胞分离液得到中间样本，将中间样本置于4℃条件下2000rpm离心15min，所得样本分为四层，提取最底层，得到红细胞样本；
(3)按照体积比为100:5:195将全血样本或红细胞样本、质量浓度为5％的氨水和步骤二所述流动相充分混匀得到处理液，按体积比为3:2向所述处理液中加入质量浓度为30％的双氧水，涡旋混匀得到预处理样本，所得预处理样本室温下静置过夜；
(4)检测前，将过夜的预处理样本于4℃下2000rpm离心10min，按体积比为450:50取离心上清液与质量浓度为20％的高氯酸混匀并置于4℃条件下13200rpm高速离心15min，取上清液过0.22μm滤膜得到检测样本；
步骤五、样本的检测与数据处理：
将步骤四所得检测样本按照步骤二确定的HPLC-HG-AFS检测条件进行检测，由保留时间定性，峰面积定量，利用相应砷形态的标准曲线，外标法定量，计算得出血液样本中各砷形态的浓度。
实施例2
为验证实施例1提供的HPLC-HG-AFS检测方法的精密度，本实施例进行了加标回收率与重复性实验。
试验方法：分别在4、8、25ng/mL三个加标水平下，取空白全血和红细胞分别加入低、中、高水平砷标液，按实施例1建立的检测方法测定HPLC-HG-AFS方法的回收率及重复性，全血的AsIII+AsV、MMAV、DMAV的加标回收率和精密度(n＝3)见表2，红细胞的AsIII+AsV、MMAV、DMAV的加标回收率和精密度(n＝3)见表3。
表2
Figure BDA0002200765900000071
表3
Figure BDA0002200765900000072
由表2和表3数据可知，砷形态在4、8、25ng/mL三个加标水平下的回收率均在±15％内；一日内重复测定5次，连续测定5天，得到日内和日间精密度均在±15％内。这说明实施例1建立的检测方法精密度和重复性较高，可用于精确的定量分析。
实施例3
为验证实施例1提供的HPLC-HG-AFS检测方法的稳定性，本实施例进行了稳定性实验。
试验方法：分别在4、8、25ng/mL三个加标水平下，取空白全血和红细胞分别加入低、中、高水平砷标液，按实施例1建立的检测方法测定HPLC-HG-AFS方法测定HPLC-HG-AFS方法的室温、冻融和30天长期稳定性，全血的AsIII+AsV、MMAV、DMAV的室温、冻融和长期稳定性(n＝3)见表4，红细胞AsIII+AsV、MMAV、DMAV的室温、冻融和长期稳定性(n＝3)见表5。
表4
Figure BDA0002200765900000081
表5
Figure BDA0002200765900000082
Figure BDA0002200765900000091
由表4和表5数据可知，砷形态在4、8、25ng/mL三个加标水平下的回收率在±15％内，稳定性符合标准。
实施例4
本实施例应用实施例1提供的HPLC-HG-AFS检测方法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度，具体步骤如下：
步骤一、处理待测样本：
(1)收集全血样本：收集血液样本2-3mL于EDTA抗凝管中；
(2)收集红细胞样本：收集的全血样本于4℃条件下4000rpm离心10min，去除上层血浆，剩余部分加生理盐水稀释3倍，再加入等体积淋巴细胞分离液得到中间样本，将中间样本置于4℃条件下2000rpm离心15min，所得样本分为四层，提取最底层，得到红细胞样本；
(3)移液枪精密取100μL全血或红细胞样本于50mL离心管中，加入5μL5％氨水、195μL流动相充分混匀，加入200μL 30％双氧水，涡旋混匀，室温下静置过夜；
本实施例中使用的流动相与实施例1中流动相相同，具体为13mmol/L无水乙酸钠，3mmol/L无水磷酸二氢钠，4mmol/L硝酸钾和0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠组成的混合溶液；
(4)检测前，将过夜的预处理样本于4℃离心机中2000rpm离心10min，取450μL上清液，加入50μL 20％高氯酸，涡旋120s后置于4℃条件下13200r/min离心15min，上清液过0.22μm滤膜，得到检测样本；
步骤二、样本的检测与数据处理
取100μL步骤一所得检测样本按照实施例1提供的HPLC-HG-AFS检测方法进样分析，由保留时间定性，峰面积定量，利用相应砷形态的标准曲线，外标法定量，计算得出血液样本中各砷形态的浓度。
全血样本色谱图见图1，红细胞样本色谱图见图2，经检测其全血样本和红细胞样本中砷形态浓度如表6所示：
表6
由图1和图2可以看出，本实施例提供的检测方法得到的不同砷形态峰形完整、清晰，由图1、图2和表3的对比可以看出，该血液样本中MMAV砷形态主要分布于红细胞中；AsV砷形态在红细胞和血浆中都有分布，但大部分存在于红细胞中；DMAV砷形态则主要分布于血浆中。
本实施例在处理血液样本时先利用淋巴细胞分离液分离得到红细胞，取一定量全血/红细胞加入氨水使细胞破裂，随后加入一定比例双氧水过夜，使红细胞内结合态砷与蛋白解离，隔日用高氯酸进行蛋白沉淀，高速离心后得到上清液进行检测，利用HPLC对不同砷形态进行分离，利用HG-AFS对砷形态定量，从而灵敏、快速、准确、低成本的检测出全血和红细胞中无机砷(AsIII+AsV)、DMAV和MMAV的浓度。
对比例1
本对比例提供了一种未应用双氧水处理血液样本的前处理方法，并应用该方法结合实施例1提供的HPLC-HG-AFS检测方法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度，具体步骤如下：
(1)收集全血样本：收集血液样本2-3mL于EDTA抗凝管中；
(2)收集红细胞样本：收集的全血样本于4℃条件下4000rpm离心10min，去除上层血浆，剩余部分加生理盐水稀释3倍，再加入等体积淋巴细胞分离液得到中间样本，将中间样本置于4℃条件下2000rpm离心15min，所得样本分为四层，提取最底层，得到红细胞样本；
(3)移液枪精密取100μL全血或红细胞样本于50mL离心管中，加入5μL5％氨水、195μL流动相充分混匀，4000rpm离心10min，取450μL上清液，加入50μL 20％高氯酸，涡旋120s后置于4℃条件下13200r/min离心15min，上清液过0.22μm滤膜，得到检测样本；
取100μL检测样本按照实施例1提供的HPLC-HG-AFS检测方法进样分析，由保留时间定性，峰面积定量，利用相应砷形态的标准曲线，外标法定量，计算得出血液样本中各砷形态的浓度。
同时，采用实施例4的方法对相同的血液样本进行全血或红细胞中四种砷形态浓度检测。
图3为本对比例未经双氧水处理的全血样本中各砷形态的色谱图，图4为本对比例经双氧水处理的全血样本中各砷形态的色谱图；图5为本对比例未经双氧水处理的红细胞样本中各砷形态的色谱图，图6为本对比例经双氧水处理的红细胞样本中各砷形态的色谱图。
通过图3和图4的对比可知，仅用HClO4处理的全血样本中DMAV、MMAV和AsV砷形态的浓度均低于经H2O2处理再用HClO4处理的全血样本的浓度，这说明仅用HClO4处理并不能将全血中的各砷形态完全提取出来。
通过图5和图6的对比可知，仅用HClO4处理的红细胞样本中AsIII砷形态的浓度高于经H2O2处理再用HClO4处理的红细胞样本的浓度，这是由于双氧水的氧化作用使AsIII转变为AsV。而仅用HClO4处理的红细胞样本时得到的DMAV、MMAV和AsV砷形态的浓度均低于经H2O2处理再用HClO4处理的红细胞样本的浓度，尤其是主要分布于红细胞中的MMAV和AsV砷形态；这说明仅用HClO4处理并不能将红细胞中的各砷形态完全提取出来。
由此可以充分说明，仅用HClO4处理全血或红细胞得到的各砷形态浓度值偏低，以此为依据进行药效评估存在一定的偏差。而本发明提供的血液样本检测方法采用双氧水过夜处理能够使全血和红细胞内结合态砷与蛋白解离，充分提取全血和红细胞内的结合砷，解决了现有技术无法测定全血或红细胞内结合砷具体浓度的不足。

Claims (10)

1.一种采用HPLC-HG-AFS法测定全血或红细胞中四种砷形态浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、配制四种砷形态的标准溶液：
分别配制一定浓度的AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷形态的储备液；将各储备液在2～50ng/mL范围内逐级稀释得到不同浓度的四种砷形态的标准溶液；
步骤二、确定HPLC-HG-AFS检测条件：
高效液相条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150mm×4.1mm，5μm；流速：1.0mL/min；流动相：13mmol/L无水乙酸钠，3mmol/L无水磷酸二氢钠，4mmol/L硝酸钾和0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠组成的混合溶液；
原子荧光光谱条件：原子化器高度：8.0mm；主电流：80mA；辅电流：40mA；屏蔽气流量：900mL/min；载气流量：300mL/min；负高压：300V；泵速：65r/min；还原液：含有质量浓度为3％的KBH4和质量浓度为0.5％的KOH；载流液：体积浓度为10％的HCl；
步骤三、绘制四种砷形态的标准曲线：
在步骤二确定的HPLC-HG-AFS色谱条件下依次将步骤一配制的四种砷形态的标准溶液进样分析，以砷形态的浓度x为横坐标，砷形态峰面积y为纵坐标，进行线性回归，分别绘制四种砷形态的标准曲线方程；
步骤四、处理待测样本：
(1)收集全血样本：收集血液样本于EDTA抗凝管中；
(2)收集红细胞样本：收集的全血样本于4℃条件下离心去除上层血浆，剩余部分加生理盐水稀释，再加入等体积淋巴细胞分离液得到中间样本，将中间样本置于4℃条件下离心，所得样本分为四层，提取最底层，得到红细胞样本；
(3)按一定体积比将全血样本或红细胞样本、质量浓度为5％的氨水和步骤二所述流动相充分混匀得到处理液，按一定体积比向所述处理液中加入质量浓度为30％的双氧水，涡旋混匀，得到预处理样本，所得预处理样本室温下静置过夜；
(4)检测前，将过夜的预处理样本于4℃下2000rpm离心10min，取上清液，按一定体积比与质量浓度为20％的高氯酸混匀并置于4℃条件下高速离心，取上清液过0.22μm滤膜得到检测样本；
步骤五、样本的检测与数据处理：
将步骤四所得检测样本按照步骤二确定的HPLC-HG-AFS检测条件进行检测，由保留时间定性，峰面积定量，利用相应砷形态的标准曲线，外标法定量，计算得出血液样本中各砷形态的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一所述四种砷形态的储备液浓度均为1000ng/mL，所述四种砷形态的标准溶液中砷形态的浓度均依次为50、30、25、10、5和2ng/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤二所述高效液相的进样体积为100μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤三所述四种砷形态的标准曲线方程分别为：
AsIII：Y＝1.178×105+2.184×105X，r2＝0.9996，线性范围为2.00～50ng/mL；
DMAV：Y＝3.714×103+1.778×105X，r2＝0.9986，线性范围为2.00～50ng/mL；
MMAV：Y＝4.527×104+2.287×105X，r2＝0.9969，线性范围为2.00～50ng/mL；
AsV：Y＝1.259×105+1.822×105X，r2＝0.9986，线性范围为2.00～50ng/mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤四(2)所述全血样本的离心转速为4000rpm，离心时间15min；所述稀释为稀释3倍；所述中间样本的离心转速为2000rpm，离心时间为15min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤四(3)所述全血样本或红细胞样本、质量浓度为5％的氨水和步骤二所述流动相的体积比为100:5:195。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤四(3)所述处理液与质量浓度为30％的双氧水的体积比为3:2。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤四(4)所述预处理样本低速离心的离心转速为2000rpm，离心时间为10min，所述上清液与质量浓度为20％的高氯酸的体积比为450:50。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤四(4)所述高速离心的转速为13200rpm，离心时间为15min。
10.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述的方法用于测定健康人体全血或红细胞中AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷形态的浓度，也用于通过测定AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷形态在人体血液内的浓度来明确其在人体内的代谢特征和作用机制，但所述的方法并不用于疾病的诊断和治疗。
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