CN105424825B - 一种分离富集测定水环境中12种残留药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离富集并同时测定水环境中12种残留药物的方法，属于水环境中微量有机污染物质残留安全检测领域。水样经固相萃取结合超声辅助分散液液微萃取（UA‑DLLME）分离富集后，以超高液相色谱—质谱连用仪(UPLC‑MS/MS)为检测工具，直接测定水环境（饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水）中12种常用药物的含量。这12种抗生素分别为酮洛芬、环丙沙星、替硝唑、托芬那酸、磺胺嘧啶、舒林酸、萘普生、磺胺甲恶唑、氯霉素、头孢呋辛酯、吡罗昔康、甲芬那酸。本发明对水样品前处理方法和仪器检测条件均进行了考察和优化，建立了最优的UA‑DLLME方法，并成功运用于实际样品的测定。与传统方法相比，本方法具有灵敏度高，提取回收率高，适用对象广和对环境友好等优点。

Description

一种分离富集测定水环境中12种残留药物的方法

【技术领域】

本发明涉及一种分离富集测定水环境中衡量残留药物的检测方法，特别地提供一种新的样品前处理方式和灵敏的检测方式，具体来说是样品前处理技术结合液质联用技术直接测定水样中12种常用药物的含量，属于水环境中微量有机污染物质残留安全检测领域。

【背景技术】

抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物，主要用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病，为人类健康事业作出了巨大贡献。但是，近年来抗生素滥用现象十分严重，卫生部曾表示，在中国，患者抗生素的使用率达到70％，是欧美国家的两倍，但真正需要使用的不到20％。此外，抗生素的滥用除了体现在医药行业外，也体现在畜牧业、水产养殖业及工业上。

非甾体抗炎药是一类不含有甾体结构的抗炎药具有抗炎、抗风湿、止痛、退热和抗凝血等作用，在临床上广泛用于骨关节炎、类风湿性关节炎、多种发热和各种疼痛症状的缓解。目前非甾体抗炎药是全球使用最多的药物种类之一。全世界大约每天有3000万人在使用。

抗生素和非甾体抗炎药的滥用给我国地表水造成了严重的污染。有报道称，已有68种抗生素在我国的地表水环境中被检出，而且被检出抗生素的总体浓度水平与检出频率均较高，其中一些抗生素在珠江、黄浦江等地的检出频率高达100％，有些抗生素检出的浓度高达每升几百纳克，工业发达的国家则小于20纳克。这些在水环境中长期存在的抗生素会诱导微生物的耐药性，并最终通过食物链对人类健康构成潜在威胁，控制水环境中的抗生素已刻不容缓。

样品的前处理是关系到分析结果准确性的关键步骤，有调查显示在整个色谱分析过程中，30％的误差来源于样品前处理。由此可见，要保证分析结果的准确性，必须从样品前处理技术入手。随着人们对于水环境中抗生素问题的日益重视，有关水环境中药物残留检测的专利和论文已有公开发表。例如中国专利公开号CN101639466A公开了一种测定水环境中磺胺和抗生素的SPE-HPLC方法；中国专利公开号CN101696964A公开了一种针对水环境中氟喹诺酮的SPE-HPLC-荧光方法；中国专利公开号CN103336080A公开了一种测定水环境中四环素的HLB-HPLC-MS/MS方法；中国专利公开号CN103278587A公开了一种针对水环境中头孢的HLB-HPLC-MS方法等，这些方法的前处理方式主要是以固相萃取为主。水环境中物染污物的种类多，存在形态各异，浓度较低而且环境基质比较复杂，采取固相萃取为前处理方式，可以去除不需要的杂质，降低基质效应。但是，经固相萃取后，样品中待测物的浓度在一定程度上会被稀释，这在一定程度上限制了其使用。

超声辅助分散液液微萃取(UA-DLLME)是由Rezaee等人于2006年首次提出的前处理方法，具有操作简单，有机试剂用量少，富集倍数大等优点，操作简单、快速，污染少等优点。

随着水安全标准的日益提高，对于能够快速、灵敏、准确地测定水源中尽可能多的抗生素残留存在迫切需要，也是目前水环境领域中深入研究的重点课题之一。超高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS/MS)是21世纪初发展起来的一种分析技术,它是一种结合了UPLC的高效分离能力与MS/MS的高灵敏度和极强专属性的分离检测技术，具有应用范围广、分离能力强、灵敏度高、分析速度快和自动化程度高等特点,目前已成为有机物分析,特别是药物分析的重要方法之一。

【发明内容】

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种同时测定水环境(饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水)中12种药物的方法。本发明采用超声辅助分散液液微萃取作为水环境样品的前处理技术，并利用超高液相色谱-质谱连用为检测器，克服了现有方法有机试剂消耗大、干扰多以及检测限等问题，能够快速检测水环境中酮洛芬、环丙沙星、替硝唑、托芬那酸、磺胺嘧啶、舒林酸、萘普生、磺胺甲恶唑、氯霉素、头孢呋辛酯、吡罗昔康、甲芬那酸12种药物的含量，适用对象广，测定结果灵敏，准确，干扰少。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种分离富集并同时检测水环境中12种药物的方法，其具体步骤如下：

超声辅助分散液液微萃取的条件的优化

选择环境中常见的药物(酮洛芬、环丙沙星、替硝唑、托芬那酸、磺胺嘧啶、舒林酸、萘普生、磺胺甲恶唑、氯霉素、头孢呋辛酯、吡罗昔康、甲芬那酸)，采用单因素试验，对UA-DLLME水中残留药物提取进行条件考察，包括萃取溶剂的种类和体积、分散剂的种类和体积、涡旋时间和超声时间等，选择最优的条件，得到在最优条件下对抗生素的最大萃取率；

本发明包括如下步骤：

(1)水样的预处理

采集、过滤后的水样用0.1-0.3mol/L HCl调至pH 3.0-4.0，移取至12mL玻璃离心管内；

(2)超声辅助分散液液微萃取(UA-DLLME)富集浓缩过程

将步骤(1)得到的样品中分别加入二氯甲烷和体积比为2:1-1:2的分散剂甲醇-乙腈，涡旋，超声，离心，去除上层水，下层有机相用氮气吹干，得残渣备用。

(3)超高液相-质谱连用测定水环境中12种药物

超高液相色谱分离

有机相为乙腈(B)，水相为体积比为0.05-0.3％的甲酸水溶液(A)，采取梯度洗脱程序，其梯度程序为0-4min:35％-65％B；4-5min:65％B；5-7min,65％-35％B；流速为0.2-0.4mL·min^-1，柱温为30-35℃，

质谱检测

离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流速为700L/hr，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测(MRM)；

精密量取乙腈-水(2:1-1:2)溶液100μL溶解步骤(2)中的残渣，涡旋后，用0.22μm滤膜过滤，得供试品，进样量5μL。

其中，步骤(1)中水样用量为：5ml

步骤(2)中二氯甲烷、甲醇-乙腈的用量分别为：800μl，1200μl

涡旋时间：1-5min 超声时间：5-10min 离心转速：4000-10000rpm 离心时间：5-15min

具体地，本发明可以采用如下方法制备：

(1)水样的预处理

水样采集后封装冷冻，临用前解冻，过滤，其过滤方式为依次经定量滤纸双层过滤1-4遍，0.45μm滤膜过滤1-3遍；定量取过滤后的水样5ml,用0.1-0.3mol/L酸调至pH 3.0-4.0，移取至12mL玻璃离心管内；

(2)超声辅助分散液液微萃取(UA-DLLME)富集浓缩过程

将步骤(1)中得到的样品中分别加入一定萃取剂二氯甲烷800μL和体积比为2：1-1：2的分散剂甲醇-乙腈1200μL，涡旋1-5min，超声5-10min，在4000-10000rpm下离心10min，去除上层水，下层有机相在35-40℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣备用。

(3)超高液相-质谱连用测定水环境中12种药物

(3.1)超高液相色谱分离

有机相为乙腈(B)，水相为体积比为0.05-0.3％的甲酸水溶液(A)，采取梯度洗脱程序，其梯度程序为0-4min:35％-65％B；4-5min:65％B；5-7min,65％-35％B；流速为0.2-0.4mL·min^-1，柱温为30-35℃，

表1.梯度洗脱程序

(3.2)质谱检测

离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流速700L/hr，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测(MRM)；

(3.3)精密量取乙腈-水(2:1-1:2)溶液100μL溶解步骤(2)中的残渣，涡旋后，用0.22μm滤膜过滤，得供试品，进样量5μL；

(4)12种药物含量测定结果的计算

本方法将超声应用于超声辅助分散液液微萃取，即UA-DLLME，可以利用DLLME来富集待测物，同时利用超声来提高提取效率，大大增加了富集倍数，简化了样品前处理的步骤。本课题构建的超声辅助-分散液液微萃取前处理方法为前处理技术的开发应用提供了新思路，也为对环境中痕量药物残留的提取、浓缩与分离增加了新方法。

本方法将超声的防御和分散液液微萃取联用既简化了样品前处理的步骤，也大大增加了富集倍数，为前处理技术的开发应用提供了新思路，也为对环境中痕量药物残留的提取、浓缩与分离增加了新方法。本方法以超高液相-质谱连用仪为检测定量工具，同时测定了水环境(饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水)中12种药物，与普通的检测方式相比，实现了对药物的高提取效率和高灵敏度的有效结合，且具有分析速度快、使用范围广等优点。

附图说明

图1.样品pH对12种药物回收率的影响

图2.萃取剂种类对12种药物回收率的影响；

图3.萃取剂用量对12种药物回收率的影响；

图4.分散剂种类对12种药物回收率的影响；

图5.分散剂用量对12种药物回收率的影响。

图6.涡旋(提取)时间对12种药物回收率的影响；

图7.超声时间对12种药物回收率的影响。

具体实施方式

本发明采用超声辅助分散液液微萃取-超高相液相色谱-串联质谱法实现对水环境(饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水)中12中药物进行检测，与传统方法相比，适用范围广，且具有回收率高、灵敏度高、分析速度快等优点。

本发明的具体检测方法如下：

(1)水样预处理

分别收集饮用水，自来水，河水，污水处理厂进出水，依次经定量滤纸双层过滤2-3遍，0.45μm滤膜过滤2遍(是否过滤)。而后量取过滤后的水样5mL，用0.1mol/L HCl调至pH3.0-4.0，移取至12mL玻璃离心管内；

(2)超声辅助分散液液微萃取富集浓缩过程

将步骤(1)的样品中分别加入二氯甲烷800ul和体积比为1:1的分散剂甲醇-乙腈1200ul，涡旋1min，超声5min，在4000rpm下离心10min，，去除上层水，下层有机相用在35℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣备用。

(3)利用Waters Acquity^TM超高液相色谱和Xevo^TM Triple Quadrupole MS/MS质谱系统测定水环境中12种药物的浓度。

色谱柱：ACQUITYBEH Phenyl(50mm×2.1mm,1.7μm)

流动相：A：0.1％甲酸水B：乙腈

梯度如下：0-4min:35％-65％B；4-5min:65％；5-7min,65％-35％；流速：0.2mL/min；进样量：5μL

柱温：35℃

离子源：电喷雾离子化源(ESI源)

检测方式：多反应离子检测(MRM)

源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃

毛细管电压：3kV；

脱溶剂气流速：700L/hr；

扫描时间：0.1s

12种目标分析物用于定量分析的质谱参数见表2

表2 12种抗生素的质谱条件

(4)灵敏度及线性范围

用分析天平精密称定酮洛芬、环丙沙星、替硝唑、托芬那酸、磺胺嘧啶、舒林酸、萘普生、磺胺甲恶唑、氯霉素、头孢呋辛酯、吡罗昔康、甲芬那酸对照品，用色谱级甲醇溶解对照品，稀释成系列浓度的标准溶液，按上述色谱条件进行测定。以浓度为横坐标，响应值为纵坐标进行回归，得到标准曲线。各待测物的标准曲线范围，线性系数，定量下限，见表3。据表格可知，本方法的定量限低于0.1ng mL^-1，灵敏度高，且线性相关系数均在0.99以上，线性关系良好。

表3各待测物线性范围及定量下限

基质效应的计算

采集各水样，按上述步骤(1)、(2)富集浓缩，按上述步骤(3)测样，得到相应结果A；B为一定浓度的标准溶液相应结果，则基质效应(ME％)的计算结果为：其结果见表4；

绝对回收率(PE％)计算公式为：结果见表4；

表4各待测物在各水样中的基质效应和绝对回收率及各自的RSD(加入的标准溶液浓度为100ng mL^-1)

加标回收率的计算

采集污水处理厂进水样，往该水样中加入一定浓度的各待测物，按上述步骤(1)、(2)、(3)富集浓缩后，按上述步骤(3)测样，得到相应结果C；采集水样按上述步骤上述步骤(1)、(2)富集浓缩后，往步骤(3)中得到的样品中加入一定浓度的个待测物的标准溶液，按上述步骤(3)测样，得到相应结果D，则回收率(RE％)的计算公式为：本方法考察了3个浓度的回收率，其结果见表5，各待测物的回收率在70％-99％，回收率较高；

表5废水进水中各待测物的回收率

12种药物的测定

采用标准曲线法计算各水样中待测物的含量。将收集的各水样，按，按上述步骤(1)、(2)富集浓缩，按上述步骤(3)测样，得到响应结果，带入各自标曲中，结果见表6.

表6各水样中个待测物的测定结果

注：“-”代表没有检测到

实验结果表明：所建方法成功应用于不同水环境中12种药物的测定。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种分离富集测定水环境中12种残留药物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)水样的预处理

采集、过滤后的水样，用酸调节pH至3.0-4.0；

(2)超声辅助分散液液微萃取富集浓缩过程

在步骤(1)中得到的样品中分别加入二氯甲烷和分散剂甲醇-乙腈，涡旋，超声，离心，去除上层水，下层有机相用氮气吹干，得残渣备用；

(3)超高液相-质谱联用测定水环境中12种药物

超高液相色谱分离

流动相B为乙腈，流动相A为体积比为0.1％的甲酸水溶液，采取梯度洗脱程序，流速为0.2-0.4mL·min^-1，柱温为30-35℃；色谱柱：ACQUITY BEH Phenyl，50mm×2.1mm,1.7μm；

质谱检测

离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流速为700L/hr，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测；

将步骤(2)中的残渣用初始流动相复溶，过滤，进样；

(4)12种药物含量测定结果的计算；

所述的12种药物为酮洛芬、环丙沙星、替硝唑、托芬那酸、磺胺嘧啶、舒林酸、萘普生、磺胺甲恶唑、氯霉素、头孢呋辛酯、吡罗昔康、甲芬那酸；

步骤(2)中甲醇-乙腈的体积比为1：1；

步骤(2)中二氯甲烷、甲醇-乙腈的用量为：2：3

步骤(3)中，其梯度程序如下：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水环境是指饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水中的水。

3.如权利要求1-2任何一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的所述的酸为0.1-0.3mol/L盐酸。

4.如权利要求1-2任何一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的涡旋时间为1-5min，超声时间为5-10min，离心转速4000-10000rpm，离心时间为5-15min.。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

(1)水样的预处理

水样采集后封装冷冻，临用前解冻，过滤，其过滤方式为依次经定量滤纸双层过滤1-4遍，0.45μm滤膜过滤1-3遍；定量取过滤后的水样5mL，用稀盐酸调节pH至3.0-4.0；

(2)超声辅助分散液液微萃取UA-DLLME富集浓缩过程

在(1)的样品中分别加入二氯甲烷800μL和体积比为1:1的分散剂甲醇-乙腈1200μL，涡旋1min，超声5min，在4000rpm下离心10min，去除上层水，下层有机相在35℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣备用；

(3)超高液相-质谱连用测定水环境中10种抗生素

超高液相色谱分离

流动相B为乙腈，流动相A为0.1％的甲酸水溶液，采取梯度洗脱程序，其梯度程序为0-4min:35％-65％B；4-5min:65％B；5-7min,65％-35％B；流速为0.2mL·min^-1，柱温为35℃，质谱检测

离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流速为700L/hr，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测；

精密量取体积比为1:1的乙腈-水溶液100μL溶解步骤(2)中的残渣，涡旋后，用0.22μm滤膜过滤，得供试品，进样量5μL；

(4)12种药物含量测定结果的计算。