CN105241990A - 一种样品前处理技术结合液质联用测定水环境中10种抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离富集并同时测定水环境中10种抗生素的方法，属于水环境中微量有机污染物质残留安全检测领域。其特征就是水样经固相萃取结合分散液液微萃取（SPE-DLLME）分离富集后，以超高液相色谱—质谱连用仪(UPLC-MS/MS)为检测工具，直接测定水环境（饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水）中10种常见抗生素的含量。这10种抗生素分别为磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、土霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、头孢呋辛酯和替硝唑。本发明对水样品前处理方法和仪器检测条件均进行了考察和优化，建立了最优的SPE-DLLME-UPLC-MS/MS方法，并成功运用于实际样品的测定。与传统方法相比，本方法具有灵敏度高，提取回收率高，适用对象广和对环境友好等优点。

Description

一种样品前处理技术结合液质联用测定水环境中10种抗生素的方法

【技术领域】

本发明涉及测定水中微量有机污染物的检测方法，特别地提供一种新的样品前处理方式和灵敏的检测方式，具体来说是样品前处理技术结合液质联用技术直接测定水样中10种常见抗生素的含量，属于水环境中微量有机污染物质残留安全检测领域。

【背景技术】

抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物，主要用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病，为人类健康事业作出了巨大贡献。但是，近年来抗生素滥用现象十分严重，卫生部曾表示，在中国，患者抗生素的使用率达到70％，是欧美国家的两倍，但真正需要使用的不到20％。此外，抗生素的滥用除了体现在医药行业外，也体现在畜牧业、水产养殖业及工业上。

抗生素的滥用给我国地表水造成了严重的污染。有报道称，已有68种抗生素在我国的地表水环境中被检出，而且被检出抗生素的总体浓度水平与检出频率均较高，其中一些抗生素在珠江、黄浦江等地的检出频率高达100％，有些抗生素检出的浓度高达每升几百纳克，工业发达的国家则小于20纳克。这些在水环境中长期存在的抗生素会诱导微生物的耐药性，并最终通过食物链对人类健康构成潜在威胁，控制水环境中的抗生素已刻不容缓。

样品的前处理是关系到分析结果准确性的关键步骤，有调查显示在整个色谱分析过程中，30％的误差来源于样品前处理。由此可见，要保证分析结果的准确性，必须从样品前处理技术入手。随着人们对于水环境中抗生素问题的日益重视，有关水环境中抗生素残留检测的专利和论文已有公开发表。例如中国专利公开号CN101639466A公开了一种测定水环境中磺胺和抗生素的SPE-HPLC方法；中国专利公开号CN101696964A公开了一种针对水环境中氟喹诺酮的SPE-HPLC-荧光方法；中国专利公开号CN103336080A公开了一种测定水环境中四环素的HLB-HPLC-MS/MS方法；中国专利公开号CN103278587A公开了一种针对水环境中头孢的HLB-HPLC-MS方法等，这些方法的前处理方式主要是以固相萃取为主。水环境中物染污物的种类多，存在形态各异，浓度较低而且环境基质比较复杂，采取固相萃取为前处理方式，可以去除不需要的杂质，降低基质效应。但是，经固相萃取后，样品中待测物的浓度在一定程度上会被稀释，这在一定程度上限制了其使用。

分散液液微萃取(DLLME)是由Rezaee等人于2006年首次提出的前处理方法，具有操作简单，有机试剂用量少，富集倍数大等优点，但是其不适用于环境等复杂基质。

随着水安全标准的日益提高，对于能够快速、灵敏、准确地测定水源中尽可能多的抗生素残留存在迫切需要，也是目前水环境领域中深入研究的重点课题之一。超高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS/MS)是21世纪初发展起来的一种分析技术,它是一种结合了UPLC的高效分离能力与MS/MS的高灵敏度和极强专属性的分离检测技术，具有应用范围广、分离能力强、灵敏度高、分析速度快和自动化程度高等特点,目前已成为有机物分析,特别是药物分析的重要方法之一。

【发明内容】

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种同时测定水环境(饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水)中10种不同结构抗生素的方法。本发明采用固相萃取结合分散液液微萃取作为水环境样品的前处理技术，并利用超高液相色谱-质谱连用为检测器，克服了现有方法有机试剂消耗大、干扰多以及检测限等问题，能够快速检测水环境中磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、头孢呋辛酯和替硝唑10种抗生素的含量，适用对象广，测定结果灵敏，准确，干扰少。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种分离富集并同时检测水环境中10种抗生素的方法，其具体步骤如下：

固相萃取-液液微萃取分离富集条件的优化

选择环境中常见的抗生素(磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、土霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、头孢呋辛酯、替硝唑)，采用单因素试验，对SPE-DLLME水中残留抗生素进行条件考察，包括固相萃取小柱的种类、固相萃取pH值、洗脱剂种类、分散液液微萃取萃取剂和分散剂的种类和用量等，选择最优的条件，得到在最优条件下对抗生素的最大萃取率；

本发明包括如下步骤：

(1)水样的预处理

采集、过滤后的水样加入金属螯合剂Na₂-EDTA，用稀盐酸调节pH至3.0-4.0；

(2)固相萃取(SPE)富集浓缩过程

依次用甲醇和等体积的纯水活化固相萃取小柱，将预步骤(1)中处理过的水样过柱，富集，纯水淋洗，甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹干，得残渣备用；

(3)液液微萃取(DLLME)富集浓缩过程

将步骤(2)中得到的残渣用甲醇溶解，往该样品加入用稀盐酸调节的pH为3.0-4.0的纯水，再分别加入二氯甲烷和体积比为1:1的分散剂甲醇-乙腈，涡旋，超声，离心，去除上层水，下层有机相用氮气吹干，得残渣备用。

(4)超高液相-质谱联用测定水环境中10种抗生素

超高液相色谱分离

有机相为乙腈(B)，水相为体积比为0.1％的甲酸水溶液(A)，采取梯度洗脱程序，其梯度洗脱程序为0-5min，流动相乙腈与0.1％甲酸-水的比例从30：70，改变为70:30；流速为0.2mL·min^-1，柱温为35℃。

质谱检测

离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，锥孔电压：30V，提取离子电压为3kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流速为450L/hr，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测(MRM)；

精密量取乙腈-水(35:65)溶液100μL溶解步骤(3)中的残渣，涡旋后，用0.45μm滤膜过滤，得供试品，进样量10μL。

其中，步骤(1)中水样体积(mL)与金属螯合剂Na₂-EDTA的用量(g)为：1000:1，取水样250-500mL，加入螯合剂Na₂-EDTA(0.1g/100mL水)，所述的酸为稀盐酸；

步骤(2)中固相萃取小柱为聚合物填料萃取小柱，活化固相萃取小柱的甲醇和纯化水的用量为：小柱体积的1-2倍,洗脱用甲醇的用量为：小柱体积的1-2倍；

步骤(3)中二氯甲烷、甲醇-乙腈(1:1)的用量分别为：700-900μL和1100-1300μL；

涡旋时间：1-2min超声时间：4-6min离心转速：3000-5000rpm离心时间：5-8min

具体地，本发明可以采用如下方法制备：

(1)水样的预处理

水样采集后封装冷冻，临用前解冻，过滤，其过滤方式为依次经双层定量滤纸过滤1-4遍(根据水样洁净程度)，0.45μm滤膜过滤1遍；定量取过滤后的水样250-500mL，加入金属螯合剂Na₂-EDTA(0.1g/100mL水)，用稀盐酸调节pH至3.0-4.0；

(2)固相萃取(SPE)富集浓缩过程

依次用小柱体积1-2倍体积的甲醇和等体积的纯水活化聚合物填料萃取小柱，将预步骤(1)中处理过的水样以5-10mL·min^-1过柱，富集完成后用小柱体积的1-2倍的纯水淋洗并将小柱置于真空状态下干燥10min后，用小柱体积的1-2倍的甲醇以流速为1.0mL·min^-1洗脱目标待测物，接收容器为的具塞玻璃离心管，洗脱液在30-35℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣备用。

(3)液液微萃取(DLLME)富集浓缩过程

将步骤(2)中得到的残渣用50μL甲醇溶解，往该样品中加入用稀盐酸调节后pH为3.0-4.0的水5mL，再分别加入萃取剂二氯甲烷700-900μL和体积比为1:1的分散剂甲醇-乙腈1100-1300μL，涡旋1-2min，超声4-6min，在3000-5000rpm下离心5-8min，去除上层水，下层有机相在30-35℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣备用。

(4)超高液相-质谱连用测定水环境中10种抗生素

(4.1)超高液相色谱分离

有机相为乙腈(B)，水相为体积比为0.1％的甲酸水溶液(A)，采取梯度洗脱程序，其梯度程序为0-5min，流动相乙腈与0.1％甲酸-水的比例从30：70，改变为70:30；流速为0.2mL·min^-1，柱温为33-35℃，

(4.2)质谱检测

离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，锥孔电压：30V，提取离子电压为3kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流速为450L/hr，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测(MRM)；

(4.3)精密量取乙腈-水(35:65)溶液100μL溶解步骤(3)中的残渣，涡旋后，用0.45μm滤膜过滤，得供试品，进样量10μL；

(5)10种抗生素含量测定结果的计算

本方法将固相萃取和分散液液微萃取联用，即SPE-DLLME，可以利用SPE去除不需要的杂质，降低基质效应，同时利用DLLME来富集待测物，既提高了选择性，也大大增加了富集倍数。本课题构建的固相萃取-分散液液微萃取前处理方法为前处理技术的开发应用提供了新思路，也为对环境中痕量药物残留的提取、浓缩与分离增加了新方法。

本方法将固相萃取和分散液液微萃取联用既提高了对待测物的选择性，也大大增加了富集倍数，为前处理技术的开发应用提供了新思路，也为对环境中痕量药物残留的提取、浓缩与分离增加了新方法。本方法以超高液相-质谱连用仪为检测定量工具，同时测定了水环境(饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水)中10种不同结构抗生素，与普通的检测方式相比，实现了对抗生素的高选择性和高灵敏度的有效结合，且具有分析速度快、使用范围广等优点。

附图说明

图1.固相萃取小柱种类对10种抗生素回收率的影响；

图2.样品pH对10种抗生素回收率的影响

图3.洗脱剂种类对10种抗生素回收率的影响；

图4.洗脱剂体积对10种抗生素回收率的影响；

图5.萃取剂种类对10种抗生素回收率的影响；

图6.萃取剂体积对10种抗生素回收率的影响；

图7.分散剂种类对10种抗生素回收率的影响；

图8.分散剂体积对10种抗生素回收率的影响。

具体实施方式

本发明采用固相萃取-液液微萃取-超高相液相色谱-串联质谱法实现对水环境(饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水)中10种抗生素进行检测，与传统方法相比，适用范围广，且具有回收率高、灵敏度高、分析速度快等优点。

本发明的具体检测方法如下：

(1)水样预处理

分别收集饮用水，自来水，河水，污水处理厂进出水，依次经双层定量滤纸过滤1-4遍(根据水样的洁净程度)，0.45μm滤膜过滤1遍。定量取过滤后的水样250-500mL，加入金属螯合剂Na₂-EDTA(0.1g/100mL水)，用稀盐酸调节其pH值为3.0-4.0；

(2)固相萃取

聚合物填料萃取小柱使用之前依次用小柱体积1-2倍的甲醇和等体积的纯水淋洗活化。水样以5-10mL·min^-1过柱后，先用小柱体积的1-2倍体积的纯水淋洗萃取柱，再将小柱置于真空状态下干燥10min，最后用小柱体积的1-2倍的甲醇，以1mL·min-1的流速洗脱待测物至具塞玻璃离心管中，洗脱液在30-35℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣。

(3)液液微萃取

用50μL甲醇复溶固相萃取得到的残渣，然后加入用稀盐酸调节的pH为3.0-4.0的水5mL，加入萃取剂二氯甲烷700-900μL，分散剂甲醇-乙腈(1:1)1100-1300μL，涡旋1-2min，超声4-6min，在3000-5000rpm下离心5-8min，去除上层水，下层有机相在30-35℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣。

(4)利用ACQUITY^TM超高液相色谱和MicromassQuattromicro^TM质谱测定水环境中10种抗生素的浓度。

色谱柱：BEHPhenyl(50mm×2.1mm,1.7μm)

流动相：A：0.1％甲酸水B：乙腈

梯度洗脱程序如下：0-5min，流动相乙腈与0.1％甲酸-水的比例从30：70，改变为70:30；流速：0.2mL/min；进样量：10μL

柱温：33-35℃

离子源：电喷雾离子化源(ESI源)

检测方式：多反应离子检测(MRM)

源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃

提取离子电压：3kV；毛细管电压：3kV；锥孔电压：30V；

脱溶剂气流速：450L/hr；

扫描时间：0.1s

10种目标分析物用于定量分析的质谱参数见表1

表110种抗生素的质谱条件

(5)灵敏度及线性范围

用分析天平精密称定磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、土霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、头孢呋辛酯和替硝唑对照品，用色谱级甲醇溶解对照品，稀释成系列浓度的标准溶液，按上述色谱条件进行测定。以浓度为横坐标，响应值为纵坐标进行回归，得到标准曲线。各待测物的标准曲线范围、相关系数、检测限等方法学结果见表2。以信噪比的3倍为方法的检测限，则检测限为0.08-1.67ngmL^-1，灵敏度高；且线性相关系数均在0.99以上，线性关系良好。

表2方法学考察结果

基质效应的计算

采集各水样，按上述步骤(1)、(2)、(3)富集浓缩，按上述步骤(4)测样，得到相应结果A；

B为一定浓度的标准溶液相应结果，则基质效应(ME％)的计算结果为： $ME\left(\%\right)=\frac{D-A}{B}\×100\%,$ 其结果见表3；

绝对回收率(PE％)计算公式为：结果见表4；

表3各待测物在各水样中的基质效应和绝对回收率及各自的RSD(加入的标准溶液浓度为100ngmL^-1)

加标回收率的计算

取污水处理厂进水水样，往该水样中加入一定浓度的各待测物，按上述步骤(1)、(2)、(3)富集浓缩后，按上述步骤(4)测样，得到相应结果C；采集水样按上述步骤上述步骤(1)、(2)、(3)富集浓缩后，往步骤(3)中得到的样品中加入一定浓度的各待测物的标准溶液，按上述步骤(4)测样，得到相应结果D，则回收率(RE％)的计算公式为：本方法考察了3个浓度的回收率，其结果见表4，各待测物的回收率在70％-99％，回收率较高；

表4废水进水中各待测物的回收率

10种抗生素的测定

采用标准曲线法计算各水样中待测物的含量。将收集的各水样，按上述步骤(1)、(2)、(3)富集浓缩，按上述步骤(4)测样，得到响应结果，带入各自标准曲线中计算，结果见表5.

表5水样中各待测物的测定结果(ngmL^-1)

注：“-”代表未检测到

实验结果表明：所建方法成功应用于不同水环境中10种抗生素的测定。

为了证明本实验建立的SPE-DLLME-UHPLC-MS/MS方法具有广泛的应用性，与其他已发表的检测抗生素的方法进行比较，比如固相萃取-高效液相法、分散液液微萃取-高效液相法等。如表6所示，与其他方法相比，本实验建立的方法的富集倍数(1763～4990)较高，检测限在0.08～1.67ng·mL^-1之间，灵敏度也较好。此外，由于本实验建立的方法消耗水样的体积相对较少、实验操作过程简单，整个实验过程所需时间适中。

表6SPE-DLLME与其他方法的比较

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

为了证明本实验建立的SPE-DLLME-UHPLC-MS/MS方法具有广泛的应用性，现进行了SPE-UHPLC-MS/MS方法以及DLLME-UHPLC-MS/MS方法，两个试验，并比较了三个试验的结果。

检测方法：1)SPE-UHPLC-MS/MS：依次用小柱体积1-2倍体积的甲醇和等体积的纯水活化聚合物填料萃取小柱，将预步骤(1)中处理过的水样以5-10mL·min^-1过柱，富集完成后用小柱体积的1-2倍的纯水淋洗并将小柱置于真空状态下干燥10min后，用小柱体积的1-2倍的甲醇以流速为1.0mL·min^-1洗脱目标待测物，接收容器为的具塞玻璃离心管，洗脱液在30-35℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣，100μL流动相复溶，过滤，进样分析。液质分析条件同本发明方法。2)DLLME-UHPLC-MS/MS：将预步骤(1)中处理过的水样取5mL，用稀盐酸调节为pH为3.0-4.0，再分别加入萃取剂二氯甲烷700-900μL和体积比为1:1的分散剂甲醇-乙腈1100-1300μL，涡旋1-2min，超声4-6min，在3000-5000rpm下离心5-8min，去除上层水，下层有机相在30-35℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣，100μL流动相复溶，过滤，进样分析。液质分析条件同本发明方法。

结果：1)各目标分析物在线性范围内线性关系良好，相关系数为0.9981～0.9999；方法检出限为0.10～2.45ng·L^-1；10种抗生素类药物的加标平均回收率为76.68％～98.31％，相对标准偏差(n＝3)为2.39％～11.05％，富集倍数EF为1962～4792。2)各目标分析物在线性范围内线性关系良好，相关系数为0.9984～0.9997；方法检出限为0.10～2.30ng·L^-1；10种抗生素类药物的加标平均回收率为76.38％～102.4％，相对标准偏差(n＝3)为0.48％～5.35％，富集倍数EF为39～46。

Claims (9)

1.一种样品前处理技术结合液质联用测定水环境中10种抗生素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)水样的预处理

采集、过滤后的水样加入金属螯合剂，用酸调节pH至3.0-4.0；

(2)固相萃取富集浓缩过程

依次用等体积的甲醇和纯水活化固相萃取小柱，将步骤(1)中处理过的水样过柱，富集，纯水淋洗，甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹干，得残渣备用；

(3)液液微萃取富集浓缩过程

将步骤(2)中得到的残渣用甲醇溶解，往该样品加入pH为3.0-4.0的水，再分别加入二氯甲烷和体积比为1:1的甲醇-乙腈作分散剂，涡旋，超声，离心，去除上层水，下层有机相用氮气吹干，得残渣备用；

(4)超高液相色谱-质谱联用测定水环境中10种抗生素

超高液相色谱分离

有机相为乙腈(B)，水相为体积比为0.1％的甲酸水溶液(A)，采取梯度洗脱程序，流速为0.2mL·min-1，柱温为35。

质谱检测

离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，锥孔电压：30V，提取离子电压为3kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流速为450L/hr，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测。

将步骤(3)中的残渣用初始流动相复溶，过滤，进样；

(5)10种抗生素含量测定结果的计算。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的10种抗生素为磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、土霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、头孢呋辛酯和替硝唑。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的水环境是指饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水中的水。

4.如权利要求1-3任何一项所述的方法，其特征在于，

步骤(1)中的金属螯合剂为Na₂-EDTA，其用量为：取水样250-500mL，加入螯合剂Na₂-EDTA(0.1g/100mL水)，所述的酸为稀盐酸。

5.如权利要求1-4任何一项所述的方法，其特征在于，(所涉及的用量建议使用比例)

步骤(2)是所述的固相萃取小柱为聚合物填料萃取小柱。

6.如权利要求1-5任何一项所述的方法，其特征在于，活化固相萃取小柱的甲醇和纯化水的用量为：小柱体积的1-2倍,洗脱用甲醇的用量为：小柱体积的1-2倍。

7.如权利要求1-6任何一项所述的方法，其特征在于，

步骤(3)中二氯甲烷、甲醇-乙腈的用量分别为：700-900μL和1100-1300μL。

8.如权利要求1-7任何一项所述的方法，其特征在于，

步骤(4)中，其梯度洗脱程序为：0-5min，流动相乙腈与0.1％甲酸-水的比例从30：70，改变为70:30。

9.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，

(1)水样的预处理

水样采集后封装冷冻，临用前解冻，过滤，其过滤方式为依次经双层定量滤纸过滤1-4遍(根据水样洁净程度)，0.45μm滤膜过滤1遍；定量取过滤后的水样250-500mL，加入金属螯合剂Na₂-EDTA(0.1g/100mL水)，用稀盐酸调节pH至3.0-4.0；

(2)固相萃取富集浓缩过程

依次用小柱体积1-2倍的甲醇和等体积的纯水活化聚合物填料萃取小柱，将预步骤(1)中处理过的水样以5-10mL·min^-1过柱，富集完成后用小柱体积的1-2倍纯水淋洗并将小柱置于真空状态下干燥10min后，用小柱体积的1-2倍体积的甲醇以流速为1.0mL·min^-1洗脱目标待测物，接收容器为具塞玻璃离心管，洗脱液在30-35℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣备用；

(3)液液微萃取富集浓缩过程

将步骤(2)中得到的残渣用用50μL甲醇溶解，往该样品加入用稀盐酸调节的pH为3.0-4.0的水5mL，再分别加入萃取剂二氯甲烷700-900μL和分散剂甲醇-乙腈(1:1)的1100-1300uL，涡旋1-2min，超声4-6min，在3000-5000rpm下离心5-8min，去除上层水，下层有机相在30-35℃水浴条件下，用氮气吹干，得残渣备用；

(4)超高液相-质谱连用测定水环境中10种抗生素

超高液相色谱分离

有机相为乙腈(B)，水相为体积比为0.1％的甲酸水溶液(A)，采取梯度洗脱程序，其梯度洗脱程序为0-5min，流动相乙腈与0.1％甲酸-水的比例从30：70，改变为70:30；流速为0.2mL·min^-1，柱温为33-35℃，

质谱检测

离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，锥孔电压：30V，提取离子电压为3kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流速为450L/hr，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测；

精密量取乙腈-水(35:65)溶液100μL溶解步骤(3)中的残渣，涡旋后，用0.45μm滤膜过滤，得供试品，进样量10μL；

(5)10种抗生素含量测定结果的计算。