CN106501405A - 一种动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其包括以下步骤：样品处理及检测分析和制作标准曲线，并利用样品处理及检测分析过程中获得的检验数据通过标准曲线计算待测样品中头孢菌素类化合物的浓度。该方法利用超高效液相色谱‑四级杆‑轨道阱质谱联用系统，成功建立了一套动物源性食品中头孢菌素类药物残留筛查技术，实现了对动物肌肉组织中44种头孢菌素类药物残留的筛查；另外，该检测方法操作简单、重现性好、分析速度快、分辨率高，分辨率在0.17‑1.23ppm的范围内，全部44种目标物回收率稳定，其回收率在69.20％‑129.00％的范围内，可有效地用于动物源性食品中头孢菌素类药物残留的筛查。

Description

一种动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法

技术领域

本发明涉及药物残留检测技术领域，尤其涉及一种动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法。

背景技术

自上世纪50年代头孢菌素C被发现以来，头孢菌素类药物就成为了一类被频繁使用的抗生素。近年来，在日常生活中常用的头孢类抗生素已经有40多种。该类药物具有抗菌谱广的特点，常用于治疗细菌性感染类疾病。头孢类药物在食源性动物养殖过程中，也常用于治疗和预防动物感染类疾病，但使用头孢类药物可能带来的过敏反应和肾脏毒性不容忽视。当前已经有非常多关于服用该类药物所带来的过敏反应和肾脏毒性的报道。自从上世纪八十年代起就有大量关于头孢类药物对肾脏毒性的研究，ZHANG Zhi-lin等对于头孢曲松和头孢孟多的肾毒性做了研究，并发表论文指出其可能带来的肾脏损伤。而对于头孢类药物的过敏反应，HAI Mei等对头孢类药物皮试反应结果进行分析统计，指出应预防头孢类药物的过敏反应并将其作为关注重点。此外，头孢类抗生素长期在医药领域和动物饲养过程中的过度使用还可能引发超级细菌的产生。

尽管近年来因动物饲养过程中抗生素滥用而引发的食品安全问题已经引起广泛关注，但部分国家依然没有关于治疗和预防食源性动物疾病的饲养标准。对于消费者而言，长期食用含头孢菌素类药物残留的食品可能打乱人体肠道菌群的平衡，引发过敏反应，还会增加人体感染抗药性细菌的风险。于此，欧盟对八种头孢菌素类药物在食品中的最大残留限量MRLs作了规定，美国食品药监局颁布相关标准规定了两种头孢类药物的最大残留限量，声明除了具有最大残留限量的几种头孢类药物之外，其余头孢类药物在食品中均不得检出。此外，头孢类药物可在体内发生代谢，如头孢匹林和头孢噻可在体内转化为去乙酰头孢匹林和去乙酰头孢噻肟，同样具有抗菌活性的代谢物会在体内蓄积。因此，有必要建立一种包含代谢物在内的头孢菌素类药物高通量筛查方法。

查阅相关文献发现，关于头孢类药物的筛查方法很少。传统的头孢菌素类药物检测方法灵敏度低，选择性较差，且无法达到高通量筛查的目的，例如液相色谱-紫外法。当前液相色谱-串联质谱法是食品中的兽药残留分析中应用作为广泛的检测方法。Karageorgou等建立了8种头孢类药物和10种喹诺酮类药物的LC-MS/MS检测方法。Han等建立了蜂蜜中的38种抗生素筛查方法，包括7种头孢菌素在内。我们研究小组已经建立了猪肉中22种头孢类药物残留的LC-MS/MS检测技术，但该方法无法检测油脂含量较高的牛肉和羊肉等样品。此外，LC-MS/MS检测技术虽然提高了方法灵敏度和选择性，但仍存在分辨率低，易出现假阳性检测结果的缺点，因此目前为止的头孢菌素类药物残留检测方法均无法达到对头孢类药物的高通量筛查目的，为人类健康带来了一定的隐患。

发明内容

为克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其耗时短、操作简便、重现性好，具有分辨率高、高灵敏度及高通量的优点，实现了对动物肌肉组织中44种头孢菌素类药物残留的筛查。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其包括以下步骤：

样品处理及检测分析

(1)提取，将待测样品搅碎置于离心管中，加入提取溶剂，涡旋混合后，经超声提取，并经离心后取上层清液；

(2)净化，离心后的上层清液过固相萃取柱，收集流出液，流尽后向固相萃取柱中加入洗脱液洗脱，收集流出的洗脱液，合并收集的流出液和洗脱液，经氮吹浓缩，加乙睛定容，并过滤膜，取过滤后的液体进样至超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中检测分析；

制作标准曲线

将多种头孢菌素类化合物标准品分别置于容量瓶中，加溶解剂溶解并定容，配制成单标储备液；移取相同体积的各单标储备液进行混合，并定容，再加入乙睛逐级稀释，配制成多种浓度的混合标准工作液，注入超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中测定，得到各头孢菌素类化合物的标准曲线；

测定样品中头孢菌素类化合物的浓度

将样品处理及检测分析过程中获得的检验数据通过标准曲线计算待测样品中头孢菌素类化合物的浓度。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述提取溶剂为乙睛与水的混合液，所述混合液中乙睛与水的体积比为2-5:1。

进一步，所述混合液中乙睛与水的体积比为4:1。

进一步，所述混合液添加量满足每克样品中加入混合液的体积为1-3ml。

进一步，所述固相萃取柱为Oasis PRiME HLB固相萃取柱。

进一步，所述洗脱液的有机相为乙腈，水相中含0.1％的甲酸，乙睛与含0.1％甲酸的水的体积比为4-6:1。

进一步，乙睛与含0.1％甲酸的水的体积比为5:1。

进一步，所述超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中采用的色谱柱为SUPELCO Ascentis C8色谱柱。

进一步，所述色谱柱的柱温为20-40℃。

进一步，所述溶解剂为甲醇和水的混合液，甲醇与水的体积比为0.5-1:1。

进一步，所述溶解剂为乙睛和水的混合液，乙睛与水的体积比为3-5:1。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：1、本发明利用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统，成功建立了一套动物源性食品中头孢菌素类药物残留筛查技术，实现了对动物肌肉组织中44种头孢菌素类药物残留的筛查；2、该方法耗时短、操作简便、重现性好，具有高分辨率、高灵敏度及高通量的优点。

附图说明

图1为头孢地尼和头孢唑肟在不同色谱柱下的色谱图；

图2为五种流动相对目标物进行分离的色谱图；

图3为不同提取溶剂下头孢菌素类化合物的回收率的对比图；

图4为三种洗脱液下同一样品的基质效应对比图；

图5为四种肌肉样品的基质效应对比图；

图6为头孢菌素类化合物的提取离子流图；

图7为阳性样品提取离子流图；

图8为阳性样品二级质谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例一

本实施例提供的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其包括以下步骤：

样品处理及检测分析

(1)提取，将待测样品搅碎置于离心管中，加入提取溶剂，涡旋混合后，经超声提取，并经离心后取上层清液；

(2)净化，离心后的上层清液过固相萃取柱，收集流出液，流尽后向固相萃取柱中加入洗脱液洗脱，收集流出的洗脱液，合并收集的流出液和洗脱液，经氮吹浓缩，加乙睛定容，并过滤膜，取过滤后的液体进样至超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中检测分析；

制作标准曲线

将多种头孢菌素类化合物标准品分别置于容量瓶中，加溶解剂溶解并定容，配制成单标储备液；移取相同体积的各单标储备液进行混合，并定容，再加入乙睛逐级稀释，配制成多种浓度的混合标准工作液，注入超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中测定，得到各头孢菌素类化合物的标准曲线；

测定样品中头孢菌素类化合物的浓度

将样品处理及检测分析过程中的检验数据通过标准曲线计算待测样品中头孢菌素类化合物的浓度。

本实施例利用44种头孢菌素类化合物的标准品建立了各头孢菌素类化合物的标准曲线，该44种头孢菌素类化合物具体为：头孢乙腈、头孢特仑酯、头孢卡品酯、头孢唑兰、头孢西酮、头孢米诺、头孢噻肟、头孢他美酯、头孢他啶、头孢洛宁、头孢地尼、头孢地嗪、头孢硫脒、去乙酰头孢匹林、去乙酰头孢噻肟、头孢孟多酯钠、头孢丙烯、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢拉定、头孢匹林、头孢克洛、头孢噻吩、头孢西丁、头孢雷特、头孢匹胺、头孢泊肟酯、头孢妥仑匹酯、头孢甲肟、头孢尼西、头孢孟多、头孢吡肟、头孢曲松、头孢替安、头孢唑肟、头孢克肟、头孢替坦、头孢美唑、头孢哌酮、头孢噻呋、头孢喹肟、头孢匹罗。

根据制作标准曲线的步骤，分别将上述各种头孢菌素类化合物的标准品分别置于各容量瓶中，加溶解剂溶解并定容，配制成单标储备液，于-40℃贮存。并移取相同体积的各单标储备液于容量瓶中进行混合，并定容，配制成一定浓度的混合标准品储备溶液，于-40℃贮存。实验过程中，需每周配制一次，混合标准品储备溶液再加入乙腈逐级稀释，配制成一系列浓度的工作液，注入超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中测定，得到各头孢菌素类化合物的标准曲线。

其中的溶解剂可为甲醇与水的混合液或者乙睛和水的混合液，当标准品为头孢克洛、头孢唑肟和头孢雷特时，以体积比为0.5-1:1的甲醇与水的混合液作为溶解剂，当标准品为其他41种头孢菌素类化合物时，则以体积比为3-5:1的乙腈与水的混合液作为溶解剂。优选地，甲醇与水的体积比为1:1，乙腈与水的体积比为4:1。具体地，本实施例的一个优选实施方式中，标准储备溶液及混合标准溶液的配制如下：

标准储备溶液的配制：准确称取头孢标准品0.01g(精确至0.0001g),头孢克洛、头孢唑肟、头孢雷特以甲醇:水＝1：1(v/v)溶液定容至100mL，其余头孢标准品均以乙腈:水＝4：1(v/v)溶液定容至100mL，配制成100mg/L的标准储备溶液，-40℃贮存。

混合标准溶液的配制：移取各标准储备溶液0.1mL于容量瓶中，定容至10mL，配制成1mg/L的混合标准品储备溶液，-40℃贮存，实验中每周配制一次，混合标准储备溶液使用乙腈逐级稀释，配制成系列工作液。

在样品的处理过程中，精确称取一定质量的待检测的样品，如动物肌肉组织，搅碎置于离心管中，加入提取溶剂，涡旋混合一定时间后，经超声提取一定时间，并离心后取上清液再过固相萃取柱，收集流出液，流尽后向固相萃取柱中加入洗脱液洗脱，收集流出的洗脱液，合并收集的流出液和洗脱液，经氮吹浓缩，并加乙腈定容，并经过滤膜过滤，取过滤后的液体进样至超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中检测分析，得到相应的检测数据，通过标准曲线判断样品中含有的头孢菌素类化合物的种类及含量。

实施例二

为提高本实施例提供的筛查方法的检测全面性和准确率，本实施例分别对不同的样品处理方法进行了对比分析，并对超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统的不同实验条件进行了对比分析，优化本实施例提供的筛查方法，从而可建立一种全面筛选上述头孢菌素类化合物的方法。

为了得到最好的分离效果，本实施例分别对比研究了五种色谱柱、五种流动相对头孢菌素类化合物的分离效果，具体过程如下。

五种色谱柱分别为Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18(1.7μm，2.1×100mm)，Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(1.7μm，2.1×100mm)，phenomenex Kinetex F5100A(2.6μm，3×100mm)，Waters ACQUITY UPLC BEH C8(1.7μm，2.1×150mm)和SUPELCOAscentis C8(10cm×4.6mm，3μm)。分别取相同浓度的混合标准溶液，采用上述五种色谱柱分别进行超高效液相色谱实验，如图1所示，示例性地给出了头孢地尼和头孢唑肟在不同色谱柱下的色谱图。

如图1所示，图1中横坐标为离子生成时间，以分表示，纵坐标为离子相对丰度，以百分比表示。其中的a为phenomenex Kinetex F5 100A色谱柱，b为Waters ACQUITY UPLCBEH HILIC色谱柱，c为SUPELCO Ascentis C8色谱柱，d为Waters ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱，e为Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18色谱柱。图1中，使用Waters ACQUITYUPLC BEH HILIC色谱柱分离目标物时，色谱峰展宽较为严重，会影响定量的准确性；使用phenomenex Kinetex F5 100A色谱柱对目标物进行分离时，检测结果章出现了两个目标峰，这可能是由于目标物在色谱柱中发生了分解；使用Waters ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱和Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18色谱柱时也出现了同样的情况；而SUPELCOAscentis C8色谱柱是最适用于目标物分离的色谱柱，对于头孢类物质色谱峰形的改善、峰宽减小等有很大的帮助。因此，由图1及上述分析可知，SUPELCO Ascentis C8色谱柱更适用于头孢菌素类化合物的分离，因此，本实施例优选地，色谱柱选用SUPELCO Ascentis C8。

再对比五种流动相对相同浓度的混合标准溶液中目标物分离的影响，其中的五种流动相分别为：其中B相均为乙腈，A相分别为水、甲酸水、乙酸水、甲酸铵溶液和乙酸铵溶液，利用五种流动相对目标物进行分离的色谱图如图2所示。

如图2所示，图2中横坐标为离子生成时间，以分表示，纵坐标为离子相对丰度，以百分比表示。其中a为由0.1％甲酸水和乙腈组成的流动相，b为由0.1％乙酸水和乙腈组成的流动相，c为由3mM乙酸铵溶液和乙腈组成的流动相，d为由3mM甲酸铵溶液和乙腈组成的流动相，d为水和乙腈组成的流动相。由图2可知，在使用0.1％甲酸水和乙腈作为流动相时，色谱峰形的改善是十分明显的，这是由于流动相中的甲酸与头孢类物质中的氨基和羧基产生了积极的相互作用，促进了电离过程。相反的，纯水-乙腈作为流动相时的分析结果最差。因此，本实施例优选地，采用0.1％甲酸水和乙腈作为流动相。

另外，为考察不同提取溶剂对样品中头孢菌素类化合物的提取效果的影响，本实施例针对七种不同的提取溶剂对头孢菌素类化合物的提取效果做了对比实验，实验中，选用的七种提取溶剂分别为乙腈，乙腈-水(6:1；v/v)，乙腈-水(5:1；v/v)，乙腈-水(4:1；v/v)，乙腈-水(2:1；v/v)，乙腈-水(1:2；v/v)。

空白肌肉样品采样于养殖场，经用Q-Orbitrap超高分辨质谱分析系统筛查不含头孢菌素类化合物，称取取5.0±0.05g空白样品于50mL离心管中，以每千克空白样品中加入500μg的一定浓度的混合标准工作液为标准，向称取的空白样品中加入混合标准工作液，对应地，在5.0±0.05g空白样品中加入0.5μg的混合标准工作液，并向加标后的样品中加入10mL提取溶剂，涡旋30s，超声提取30min，于8000转离心10分钟后，过0.22μm滤膜，上机检测。根据头孢菌素类化合物的回收率判断提取溶剂对头孢菌素类化合物的提取效果的影响，如图3所示，以满足回收率在60％-120％内的头孢类物质的个数为指标，图3给出了不同提取溶剂对头孢菌素(头孢菌素类化合物)的回收率的影响。

如图3所示，当提取溶剂为乙腈-水(4:1；v/v)时得到最好检测结果。高比例有机溶剂会导致水溶性头孢菌素的回收率较差，且可能更多的将脂肪等物质溶解在提取液里，导致基质效应过大。而提取液中水的比例过高时，肌肉组织中的油脂类物质则在样品上形成保护，阻碍了目标物的提取。此外，水比例过高还会导致肌肉组织中的血液等物质聚集在提取液中，增加检测难度。因此，本实施例优选地，选用乙腈与水的混合液作为提取溶剂，混合液中乙腈与水的体积比为3-5:1，每克样品中加入乙睛-水的混合液的体积为1-3ml，进一步优选地，乙腈与水的体积比为4:1，每克样品中加入乙睛-水的混合液为2ml。

再者，因肉类样品中除了含有较高的脂肪含量外，磷脂类物质也会影响检测结果，前处理过程中样品净化对检测结果的准确性而言十分重要。因此，本实施例利用SPE固相萃取净化处理方法，对比八种不同填料的固相萃取柱对样品进行净化处理，以确定不同固相萃取柱对头孢菌素类化合物的回收率的影响。

其中的八种不同填料的固相萃取柱分别为Oasis HLB，Oasis MAX，Oasis MCX，Oasis PRiME HLB，NH2，C18，SLE和C8八种不同填料的SPE固相萃取小柱做了比较。具体处理过程如下。

称取5.0±0.05g样品于50mL离心管中，加入0.5μg的一定浓度的混合标准工作液，加入10mL乙腈/水溶液，涡旋混合30s，超声提取30min，8000转离心10min，取2ml上清液做SPE固相萃取净化处理。

利用Oasis PRiME HLB及SLE两种填料的固相萃取小柱进行净化处理的过程均为：取2mL上清液上柱，再以乙腈水溶液洗脱，收集两次洗脱液，将洗脱液氮吹浓缩，以乙腈-水溶液(1:4；v/v)定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜，上机检测，计算经Oasis PRiME HLB及SLE两种固相萃取小柱净化处理后的加标样品中头孢菌素类化合物的回收率。

利用Oasis HLB、NH2、C18、C8四种固相萃取小柱进行净化处理的过程均为：取2ml上清液氮吹除乙腈，再以磷酸二氢钠缓冲液定容，取2mL加入缓冲液后的提取液上柱，正己烷净化，再以乙腈洗脱，收集洗脱液，将洗脱液氮吹浓缩，以乙腈水溶液(1:4；v/v)定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜，上机检测，计算经Oasis HLB、NH2、C18、C8四种固相萃取小柱净化处理后的加标样品中头孢菌素类化合物的回收率。

利用Oasis MAX及Oasis MCX固相萃取小柱进行净化处理的过程均为：取2ml上清液氮吹除乙腈，再以磷酸二氢钠缓冲液定容。取2mL加入缓冲液后的提取液上柱，洗脱时Oasis MAX固相萃取柱使用含2％甲酸的乙腈洗脱，Oasis MCX使用含5％氨水的乙腈洗脱，分别收集洗脱液，将洗脱液氮吹浓缩，以乙腈-水溶液(1:4；v/v)定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜，上机检测，计算经Oasis MAX及Oasis MCX两种固相萃取小柱净化处理后的加标样品中头孢菌素类化合物的回收率。

经上述八种固相萃取柱的净化处理后的加标样品中各头孢菌素类化合物的回收率如表1所示。

表1净化优化过程中不同填料SPE小柱对回收率的影响

由表1可知，不同填料的净化过程对44种头孢类药物回收率有很大的影响。OasisHLB柱净化后的回收率为0.00％-275.07％，Oasis MAX柱净化后的回收率为0.00％-368.12％，Oasis MCX柱净化后的回收率为0.00％-765.17％，NH2柱净化后的回收率为0.00％-402.98％，SLE柱净化后的回收率为4.07％-414.31％，C18柱净化后的回收率为0.00％-385.77％，C8柱净化后的回收率为0.00％-381.27％，Oasis PRiME HLB柱净化后的效果最好，回收率为68.59％-128.01％，因此，本实施例优选Oasis PRiME HLB柱作为固相萃取柱。

最后，本实施例对比分析了不同洗脱液对同一样品的基质效应的影响，对比了乙腈，乙腈-水(5:1；v/v)和乙腈-含0.1％甲酸的水(5:1；v/v)溶液对样品基质效应的影响，基质效应分析的具体过程为：取一定浓度的混合标准溶液，加入提取溶剂，并进样至超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中测试，液相条件中的洗脱液分别为上述三种，得到各个头孢菌素类化合物对应的峰面积A；取相同浓度的混合标准溶液加入空白样品中，加入相同量的提取溶剂，并进样至超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中测试，采用相同的洗脱液，得到各个头孢菌素类化合物对应的峰面积B。基质效应即为峰面积B与峰面积A的比值，以百分比表示，由此得到三种提取溶剂下的基质效应，如图4所示。

由图4中可以看出，乙腈-含0.1％甲酸的水(5:1；v/v)溶液更适用于做洗脱液。这可能是由于甲酸改变了洗脱液的酸碱度，能使样品中的磷脂等杂质被吸附在Oasis PRiMEHLB固相萃取柱上，而对头孢菌素类化合物则没有保留。因此，本实施例中的洗脱液为乙睛与含0.1％甲酸的水，其体积比为4-6:1，优选地，乙睛与含0.1％甲酸的水的体积比为5:1。

经过上述对色谱柱、流动相、提取溶剂、固相萃取柱及洗脱液的优化分析，获得优化后的最优的样品前处理过程及超高效液相色谱条件。优化后的样品前处理过程的其中一个实施方式如下：称取5.0±0.05g样品于50mL离心管中，取10mL乙腈-水(4:1；v/v)溶液为提取溶剂，从搅碎的样品中提取目标物，离心后取2mL上清液过PRiME HLB固相萃取柱，流尽后加入2mL乙腈-含0.1％甲酸的水(5:1；v/v)溶液，收集两次流出液，氮吹至小于1mL，取乙腈定容至1mL，过0.2μm微孔滤膜，上机检测。

在利用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统进行检测分析时，其质谱响应信号可能会被基质效应所影响，软电离过程中的质谱响应可能会因为基质效应而增强或者减弱。因此，本实施例比较了鸡肉、猪肉、牛肉、羊肉四种样品的基质效应，以标准曲线定量，基质效应分析的具体过程为：取一定浓度的混合标准溶液，加入一定量的乙腈-水(4:1；v/v)提取溶剂，并进样至超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中测试，得到各个头孢菌素类化合物对应的峰面积A；取相同浓度的混合标准溶液加入空白样品中，加入相同量的乙睛-水(4:1；v/v)提取溶剂，并进样至超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中测试，得到各个头孢菌素类化合物对应的峰面积B。基质效应即为峰面积B与峰面积A的比值，以百分比表示，由此得到的四种样品的基质效应如图5所示。

由图5可以看出，四种肉类的基质效应并没有明显的区别，因此，实验时以一种肉为空白基质做标准曲线。四种肉类空白样品中分别加入50μg/kg混合标准溶液，经前处理后，分别对基质效应进行考察，每种样品做5份平行实验，取5次平行测定的平均结果，计算头孢菌素类化合物的回收率和精密度，结果见表2。由表2可以看出，经前处理后的四种肉类基质效应较小，该法可满足鸡肉，猪肉，牛肉和羊肉中头孢类药物残留的日常检测需求。

表2使用相同标准曲线定量后的回收率(％)和精密度RSD考察表

实施例三

基于实施例二提供的优化条件，本实施例提供了动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法的优选实施方式，以猪肉样本为例，验证本实施例提供的检测方法的可靠性。

优化后的样品前处理过程如下：称取5.0±0.05g样品于50mL离心管中，取10mL乙腈-水(4:1；v/v)溶液为提取液，从搅碎的样品中提取目标物，离心后取2mL上清液过PRiMEHLB固相萃取柱，流尽后，收集流出液，并向PRiMEHLB固相萃取柱中加入2mL乙腈-含0.1％甲酸的水(5:1；v/v)溶液，再收集流出液，氮吹至小于1mL，取乙腈定容至1mL，过0.2μm微孔滤膜，取过滤后的液体进样至超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中进行检测分析。

标准储备溶液的配制：准确称取头孢标准品0.01g(精确至0.0001g),头孢克洛、头孢唑肟、头孢雷特以甲醇:水＝1：1(v/v)溶液定容至100mL，其余头孢标准品均以乙腈:水＝4：1(v/v)溶液定容至100mL，配制成100mg/L的标准储备溶液，-40℃贮存。

混合标准溶液的配制：移取各标准储备溶液0.1mL于容量瓶中，定容至10mL，配制成1mg/L的混合标准品储备溶液，-40℃贮存，实验中每周配制一次，混合标准储备溶液使用乙腈逐级稀释，配制成系列工作液。

优化后的色谱条件：SUPELCO Ascentis C8色谱柱(10cm×4.6mm,3μm)，流动相A为水相，含0.1％甲酸，B为乙腈。梯度洗脱程序：0-1min，95％B；1-8min，95％-5％B；8-9.5min，5％-95％B；9.5-15min，95％B。流速：0.5mL/min；进样体积：5μL；柱温为20-40℃，优选为30℃；样品盘温度：8℃。

其中质谱参数：HESI离子源；鞘气30psi；辅助气10arb；喷雾电压3.5Kv；S-lens电压60V；毛细管温度300℃；辅助气加热温度350℃；正负离子切换采集模式。44种头孢类物质的分子式、离子化方式及质谱信息如表3所示，其中的分辨率为实测质量数与精确质量数的差值再与实测质量数的比值，44种头孢类物质的提取离子流图如图6所示，其中横坐标为离子的生成时间，以分表示，纵坐标为离子的相对丰度，以百分比表示。

表3 44种头孢类物质的分子式、离子化方式、精确质量数及分辨率

由表3分析可知，头孢乙腈是唯一在离子化过程中与铵离子结合的物质，其余头孢类物质均与氢离子结合或失去一个氢离子形成带电基。相比其它头孢类物质，头孢乙腈中含有一个键长较短的腈基，这可能使得头孢乙腈更易与铵离子结合。从图6所示的44个头孢类物质的提取离子图中可以看到，头孢曲松是唯一一个不具备标准色谱峰形的物质。这可能是由于头孢曲松由头孢母核与1,2,4-三嗪环结构结合，从而具有稳定的共轭结构，对其软电离过程造成不利影响。

在筛查方法中，为了确保定性结果的准确度，本实施例使用Full MS/ddMS2二级离子全扫描模式，得到44种头孢类物质的子离子，并以此达到对阳性样品确证的目的。高分辨率的子离子可以使我们更清晰地解析头孢类物质的软电离裂解规律，本实施例中，每种头孢类物质均被选出三个子离子作为其定性离子，例如头孢氨苄的特征子离子为106.06551，158.02692和174.05418(m/z)，头孢噻肟的特征子离子为134.09650，167.02736和396.04297(m/z)，头孢他美酯的特征子离子为241.03880，398.05874，380.04794(m/z)。

本实施例提供的优化后的方法参照欧盟2002/657/EC(2002)标准和美国食品药监局生物分析程序指导手册进行方法验证。验证中每组数据至少取5次平行测定的平均结果。

CCα：等浓度梯度水平五个点加标后，标准曲线上x＝0位置上2.33倍的y值所对应的x即为CCα(α＝1％)。CCβ：取1.64倍的CCα的y值所对应x值(β＝5％)。结果见表4。

44种头孢类物质回收率及精密度验证参照美国食品药监局生物分析程序指导手册，取线性范围内高、中、低三个点进行加标检测，每组数据取6次平行测定的平均结果，包括日间精密度，日内精密度。加标浓度为5μg/kg、50μg/kg、200μg/kg。由表4可以看出，日间和日内检测的回收率分别为69.20％-129.00％和62.90–128.00％。RSD均低于15％。

表4 CCα,CCβ,日间、日内精密度及回收率考察表

依照本实施例优化后的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法对市区采样的270例样品进行筛查,其中有一例疑似样品被检出,如图7、8所示，图7为检出的阳性样品的提取离子流图，图8为阳性样品的二级质谱图，由标准曲线定量，在羊肉样本中检出50.14μg/kg头孢他啶。

综上所述，本发明提供的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其利用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统，成功建立了一套动物源性食品中头孢菌素类药物残留筛查技术，实现了对动物肌肉组织中44种头孢菌素类药物残留的筛查；另外，该检测方法操作简单、重现性好、分析速度快、分辨率高，分辨率在0.17-1.23ppm的范围内，全部44种目标物回收率稳定，其回收率在69.20％-129.00％的范围内，可有效地用于动物源性食品中头孢菌素类药物残留的筛查。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：

样品处理及检测分析

(1)提取，将待测样品搅碎置于离心管中，加入提取溶剂，涡旋混合后，经超声提取，并经离心后取上层清液；

(2)净化，离心后的上层清液过固相萃取柱，收集流出液，流尽后向固相萃取柱中加入洗脱液洗脱，收集流出的洗脱液，合并收集的流出液和洗脱液，经氮吹浓缩，加乙睛定容，并经过滤膜过滤，取过滤后的液体进样至超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中检测分析；

制作标准曲线

将多种头孢菌素类化合物标准品分别置于容量瓶中，加溶解剂溶解并定容，配制成单标储备液；移取相同体积的各单标储备液进行混合，并定容，再加入乙睛逐级稀释，配制成多种浓度的混合标准工作液，注入超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中测定，得到各头孢菌素类化合物的标准曲线；

测定样品中头孢菌素类化合物的浓度

将样品处理及检测分析过程中获得的检验数据通过标准曲线计算待测样品中头孢菌素类化合物的浓度。

2.根据权利要求1所述的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其特征在于，所述提取溶剂为乙睛与水的混合液，所述混合液中乙睛与水的体积比为2-5:1。

3.根据权利要求2所述的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其特征在于，所述混合液中乙睛与水的体积比为4:1。

4.根据权利要求2或3所述的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其特征在于，所述混合液添加量满足每克样品中加入混合液的体积为1-3ml。

5.根据权利要求1至3任一项所述的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其特征在于，所述固相萃取柱为Oasis PRiME HLB固相萃取柱。

6.根据权利要求1至3任一项所述的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其特征在于，所述洗脱液的有机相为乙腈，水相中含0.1％的甲酸，乙睛与含0.1％甲酸的水的体积比为4-6:1。

7.根据权利要求1至3任一项所述的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-四级杆-轨道阱质谱联用系统中采用的色谱柱为SUPELCO Ascentis C8色谱柱。

8.根据权利要求6所述的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为20-40℃。

9.根据权利要求1至3任一项所述的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其特征在于，所述溶解剂为甲醇和水的混合液，甲醇与水的体积比为0.5-1:1。

10.根据权利要求1至3任一项所述的动物肌肉组织中头孢菌素类药物残留快速筛查方法，其特征在于，所述溶解剂为乙睛和水的混合液，乙睛与水的体积比为3-5:1。