CN109682913A - 一种液质联用测定血浆中头孢羟氨苄浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种液质联用测定血浆中头孢羟氨苄浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的混合有机溶剂进行萃取两次，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测。本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为头孢羟氨苄的血药浓度测定提供依据；本方法的血浆标准曲线线性范围为0.1～60ug/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％，适合于测定血浆中头孢羟氨苄的浓度。

Description

一种液质联用测定血浆中头孢羟氨苄浓度的方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种药物的测定方法，特别涉及一种液质联用测定血浆中头孢羟氨苄浓度的方法。
背景技术
头孢羟氨苄(Cefadroxil，CFD)，化学名称为：(6R，7R)-3-甲基-7-[(R)-2-氨基-2-(4-羟基苯基)乙酰氨基]-8-氧-5-硫杂-1-双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸一水合物，分子式：C16H17N3O5S·H2O，分子量为：381.41，结构式为：
头孢羟氨苄是一种杀菌的头孢菌素类广谱抗生素，美国勃列斯多-迈耶公司第一代半合成的头孢菌素类药物，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的感染有效。口服头孢羟氨苄制剂可用于治疗轻度至中度易受感染，如因细菌化脓性链球菌引起的咽喉炎或链球菌扁桃体炎、尿路感染、生殖道感染和皮肤感染，其具有良好的水溶性和一定的脂溶性，口服吸收良好，而且不受胃内食物影响，在肠胃道吸收和尿中消除都比较慢，在感染病灶有较强的分布能力及抗菌作用。因此，头孢羟氨苄制剂的药用经济性高，具有广阔的市场前景。
目前，尚未关于头孢羟氨苄测定方法的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种液质联用测定血浆中头孢羟氨苄浓度的方法，该方法可提高检测的速度、精度和灵敏度。
为实现上述目的，一种液质联用测定血浆中头孢羟氨苄浓度的方法，血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：
(1)血浆样品预处理：
以K2EDTA为抗凝剂，以头孢羟氨苄-d4为内标；于96深孔板中精密加入100uL的血浆样品，加入5uL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后加入5uL的0.02ug/uL的内标头孢羟氨苄-d4溶液，混匀后加入500uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，取上层清液50uL至装有1000uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水：甲酸按照体积比85：15：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测；以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需于冰浴条件下操作；
(2)试样测定：
取10uL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中头孢羟氨苄和内标头孢羟氨苄-d4的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的头孢羟氨苄浓度；
(3)液相色谱条件：
色谱柱：RestekAllure PFPP，5um，柱规格为50×2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：甲醇/甲酸的体积百分比为100/0.1；洗液：乙腈/水的体积百分比为50/50；自动进样器温度为6℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10uL，分析时间3.5min；
(4)质谱条件：
离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为450℃，喷雾气压力为20Psi，辅助加热气压力为20Psi，气帘气压力为20Psi，碰撞气压力为8Psi，去簇电压分别为25eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；碰撞室入口电压分别为10eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；碰撞电压分别为20eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；碰撞室出口电压分别为10eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；
用于定量分析的离子反应分别为：m/z364.1→m/z208.1，其为头孢羟氨苄；和m/z368.2→m/z212.1，其为头孢羟氨苄-d4。
优选的，所述步骤(3)中梯度洗脱的程序为：
优选的，所述步骤(2)中，采用内标法，以头孢羟氨苄和内标头孢羟氨苄-d4的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的头孢羟氨苄的浓度。
优选的，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
取100uL空白血浆10份置于96深孔板中，以贮备液的形式分别添加5uL浓度分别为0.002ug/μL、0.004ug/μL、0.01ug/μL、0.02ug/μL、0.1ug/μL、0.2ug/μL、0.8ug/μL、1.2ug/μL的吡嗪酰胺溶液至最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本中，分别添加5uL体积分数为50％的甲醇水溶液至空白样本和零浓度样本，混匀后分别向最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本、零浓度样本中加入5uL的0.02ug/uL的内标头孢羟氨苄-d4溶液，向空白样本中加入5uL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后分别向10份样本中加入500uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，取上层清液50uL至装有1000uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水：甲酸按照体积比85：15：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后分别作为10份标准样品待检测；以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需于冰浴条件下操作；
分别取10uL标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的头孢羟氨苄和内标头孢羟氨苄-d4的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的头孢羟氨苄的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)预处理方法简便，两步有机溶液萃取，适用于常规测定；
(2)专属性强：在本实验所采用的色谱条件下，头孢羟氨苄保留时间为1.419min左右，内标头孢羟氨苄-d4保留时间在1.416min左右。头孢羟氨苄和内标头孢羟氨苄-d4的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；
(3)灵敏度高：血浆最低定量限为0.1ug/mL，能准确测定血浆中头孢羟氨苄的浓度，灵敏度高，特异性强；
(4)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为头孢羟氨苄的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为0.1～60ug/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％。
附图说明
图1为HPLC-MS/MS法测得的头孢羟氨苄在人血浆中的标准曲线图；
图2为人空白血浆的HPLC-MS/MS图；
图3为人空白血浆加入头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4的HPLC-MS/MS图；
图4为健康受试者口服头孢羟氨苄药物后血浆样品再加入内标头孢羟氨苄-d4的HPLC-MS/MS图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例：人类K2EDTA血浆中头孢羟氨苄浓度的测定
一、实验材料与分析设备
头孢羟氨苄(分析物)：Toronto Research Chemicals或相同、更高等级的标准品
头孢羟氨苄-d4(内标)：Toronto Research Chemicals或相同、更高等级的标准品
使用试剂见下表1：
表1试剂明细
试剂名称 级别 制造商
乙腈 HPLC J.T.Baker
甲醇 HPLC J.T.Baker
甲酸 ACS Adamas
注：亦可使用相同级别或更高级别的试剂
使用分析设备见下表2：
表2使用设备明细
相同的LC/MS/MS系统亦可被使用。
二、液质条件
1、液相色谱条件
色谱柱：RestekAllure PFPP，5um，柱规格为50×2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：甲醇/甲酸的体积百分比为100/0.1；洗液：乙腈/水的体积百分比为50/50；自动进样器温度为6℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10uL，分析时间3.5min。
表3梯度洗脱程序
步骤 总时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
1 0 15 85
2 1 15 85
3 1.1 80 20
4 1.5 80 20
5 1.6 15 85
6 3.5 15 85
2、质谱条件
离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为450℃，喷雾气压力为20Psi，辅助加热气压力为20Psi，气帘气压力为20Psi，碰撞气压力为8Psi，去簇电压分别为25eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；碰撞室入口电压分别为10eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；碰撞电压分别为20eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；碰撞室出口电压分别为10eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；
用于定量分析的离子反应分别为：m/z364.1→m/z208.1，其为头孢羟氨苄；和m/z368.2→m/z212.1，其为头孢羟氨苄-d4。
三、实验过程
1、头孢羟氨苄标准溶液的配制
头孢羟氨苄标准溶液的配制：精密称取头孢羟氨苄(分析物)0.05g，置于10mL容量瓶中，加入体积分数为50％的甲醇水溶液溶解并定容至刻度，摇匀，既得5ug/uL的头孢羟氨苄贮备液，再以体积分数为50％的甲醇水溶液溶依次稀释配制头孢羟氨苄标准溶液，具体稀释浓度见下表4：
表4头孢羟氨苄标准溶液配制浓度
来源溶液(ug/uL) 来源溶液体积(uL) 最终体积(mL) 最终浓度(ug/uL)
5<sup>a</sup> 2400 10 1.2
5<sup>a</sup> 2000 10 1
5<sup>a</sup> 1600 10 0.8
5<sup>a</sup> 400 10 0.2
5<sup>a</sup> 200 10 0.1
5<sup>a</sup> 40 10 0.02
5<sup>a</sup> 20 10 0.01
0.1 400 10 0.004
0.1 200 10 0.002
0.1 600 10 0.006
a：直接从头孢羟氨苄(分析物)制备而成
头孢羟氨苄标准溶液于不使用时储存于塑料容器及冰箱(-20℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。
2、头孢羟氨苄-d4内标标准溶液的配制
头孢羟氨苄-d4内标标准溶液的配制：精密称取头孢羟氨苄-d4(内标)0.002g，置于10mL容量瓶中，加入体积分数为50％的甲醇水溶液溶解并定容至刻度，摇匀，既得0.2ug/uL的头孢羟氨苄-d4贮备液，再以体积分数为50％的甲醇水溶液溶解稀释配制成浓度为0.02ug/uL头孢羟氨苄-d4内标溶液，具体稀释浓度见下表5：
表5头孢羟氨苄-d4标准溶液配制浓度
来源溶液(ug/uL) 来源溶液体积(uL) 最终体积(mL) 最终浓度(ug/uL)
0.2<sup>a</sup> 8000 80 0.02<sup>b</sup>
a：直接从头孢羟氨苄-d4(内标)制备而成
b：用于样本制备步骤
头孢羟氨苄-d4内标标准溶液于不使用时储存于塑料容器及冰箱(-20℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。
3、线性试验
将空白血浆于室温环境放入水浴解冻；转移100uL的空白血浆10份至96深孔板中(每一个标准曲线样本、空白样本-00及零浓度样本-0)，依下表6所列，分别精密加入不同浓度的头孢羟氨苄标准溶液5uL或稀释溶液制备每一个样本并混匀，配成不同浓度的含药血浆，按“血浆样品预处理”操作。计算头孢羟氨苄峰面积As和内标头孢羟氨苄-d4峰面积Ai的比值Y(Y＝As/Ai)，以峰面积比值Y对血药浓度X作回归计算，结果见图1和表7。以平均比值Y对血药浓度X做回归计算，得回归方程Y＝0.870X-0.00329，r＝0.9995，权重系数W＝1/X2，按该方法测得的头孢羟氨苄的血药浓度的最低定量限为：0.1ug/mL。
表6头孢羟氨苄标准曲线配制浓度
b：分析物的稀释溶液：MeOH/H2O＝50/50
表7 HPLC-MS/MS法测得的头孢羟氨苄在人血浆中的标准曲线(n＝12)
4、准确度和精密度
将空白血浆于室温环境放入水浴解冻；转移适当体积的空白血浆至适当的容器并添加头孢羟氨苄标准溶液制备5种不同浓度的含药血浆质控样品(LLOQ、QL、QLM、QM、QH)及一条随行标准曲线，按“血浆样品预处理”操作，质控样品制备如下表8所示。每天做一批及一条随行标准曲线，连续做3天，共三批，第一批和第二批每个浓度分别做6份样品，第三批每个浓度分别做15份样品，计算头孢羟氨苄峰面积As和内标头孢羟氨苄-d4峰面积Ai的比值Y，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，由实测浓度计算批内与批间精密度，实测浓度与加入浓度的比值即为准确度，结果见表9。结果表明，头孢羟氨苄血浆样品批内、批间精密度、准确度小于±15％符合要求。
表8质控样品配制浓度
a：最终体积＝来源溶液体积+血浆体积
依每一分析批所需，分装足够的体积至已标示的样本瓶瓶中并储存于理论温度-80℃。体积可视需要依比例增加或减少。
表9 HPLC-MS/MS法测定血浆中头孢羟氨苄的批内、批间精度和准确度
5、干扰性
六个不同空白血浆样品分别来源不同健康人体，将六个不同空白血浆样品于同一分析批依样本制备步骤制备及分析，来评价不同空白血浆对头孢羟氨苄分析物及内标头孢羟氨苄-d4的干扰。
六个不同来源空白健康人体血浆样本制备分析后，在符合头孢羟氨苄保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的头孢羟氨苄响应的20.0％，结果见表10。结果表明该分析方法对头孢羟氨苄的分析具有专属性。
六个不同来源空白健康人血浆样本制备分析后，在符合内标保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的内标响应的20.0％，见附录中的表11。结果表明该分析方法对内标的分析具有选择性。
表10六个不同来源空白健康人体血浆对头孢羟氨苄分析物的干扰性数据对比表
a：分析物峰面积(选择性样本)/分析物峰面积(标准曲线的LLOQ)×100.0％≤20.0％
b：当“无显著峰值可以被积分(或没有峰)”或“峰面积的保留时间不符合样本中分析物的保留时间”，该区域峰面积认为是零。
表11六个不同来源空白健康人体血浆对头孢羟氨苄-d4的干扰性数据对比表
a：分析物峰面积(选择性样本)/内标峰面积(标准曲线的LLOQ)×100.0％≤20.0％
b：当“无显著峰值可以被积分(或没有峰)”或“峰面积的保留时间不符合样本中分析物的保留时间”，该区域峰面积认为是零。
从表10和表11中可以看出，不同人体的空白血浆对头孢羟氨苄的检测结果没有造成干扰。因此，该方法可以用于检测不同人体血浆中的头孢羟氨苄浓度。
6、人血浆样品检测
(1)取没有给予过头孢羟氨苄的人空白血浆，于96深孔板中精密加入100uL的空白血浆样品，加入10uL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后加入500uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，取上层清液50uL至装有1000uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水：甲酸按照体积比85：15：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测，以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需于冰浴条件下操作；取10uL测试样品进行LC-MS/MS分析，结果如图2所示。
(2)取没有给予过头孢羟氨苄的人空白血浆，于96深孔板中精密加入100uL的空白血浆样品，加入5uL浓度为0.02ug/uL的头孢羟氨苄标准溶液，混匀后加入5uL的0.02ug/uL的内标头孢羟氨苄-d4溶液，混匀后加入500uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，取上层清液50uL至装有1000uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水：甲酸按照体积比85：15：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测，以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需于冰浴条件下操作；取10uL测试样品进行LC-MS/MS分析，结果如图3所示。
(3)采集健康受试者口服头孢羟氨苄药物后的血浆，于96深孔板中精密加入100uL的采集的人体血浆样品，加入5uL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后加入5uL的0.02ug/uL的内标头孢羟氨苄-d4溶液，混匀后500uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，取上层清液50uL至装有1000uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水：甲酸按照体积比85：15：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测，以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需于冰浴条件下操作；取10uL测试样品进行LC-MS/MS分析，结果如图4所示。
综上所述，本发明提供了一种预处理方法简便的血浆中头孢羟氨苄浓度的测定方法，采用两步有机溶液萃取法，适用于常规测定；由上述分析可知，在本实验所采用的色谱条件下，头孢羟氨苄保留时间为1.419min左右，内标头孢羟氨苄-d4保留时间在1.416min左右，头孢羟氨苄和内标头孢羟氨苄-d4的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的头孢羟氨苄的浓度，灵敏度较高，血浆最低定量限为0.1ug/mL；同时，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为头孢羟氨苄的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为0.1～60ug/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％。

Claims (4)

1.一种液质联用测定血浆中头孢羟氨苄浓度的方法，其特征在于：血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：
(1)血浆样品预处理：
以K2EDTA为抗凝剂，以头孢羟氨苄-d4为内标；于96深孔板中精密加入100uL的血浆样品，加入5uL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后加入5uL的0.02ug/uL的内标头孢羟氨苄-d4溶液，混匀后加入500uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，取上层清液50uL至装有1000uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水：甲酸按照体积比85：15：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测；以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需于冰浴条件下操作；
(2)试样测定：
取10uL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中头孢羟氨苄和内标头孢羟氨苄-d4的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的头孢羟氨苄浓度；
(3)液相色谱条件：
色谱柱：RestekAllure PFPP，5um，柱规格为50×2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：甲醇/甲酸的体积百分比为100/0.1；洗液：乙腈/水的体积百分比为50/50；自动进样器温度为6℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10uL，分析时间3.5min；
(4)质谱条件：
离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为450℃，喷雾气压力为20Psi，辅助加热气压力为20Psi，气帘气压力为20Psi，碰撞气压力为8Psi，去簇电压分别为25eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；碰撞室入口电压分别为10eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；碰撞电压分别为20eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；碰撞室出口电压分别为10eV的头孢羟氨苄和头孢羟氨苄-d4；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；
用于定量分析的离子反应分别为：m/z364.1→m/z208.1，其为头孢羟氨苄；和m/z368.2→m/z212.1，其为头孢羟氨苄-d4。
2.根据权利要求1所述的一种液质联用测定血浆中头孢羟氨苄浓度的方法，其特征在于：所述步骤(3)中梯度洗脱的程序为：
3.根据权利要求1或2所述的一种液质联用测定血浆中头孢羟氨苄浓度的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，采用内标法，以头孢羟氨苄和内标头孢羟氨苄-d4的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的头孢羟氨苄的浓度。
4.根据权利要求3所述的一种液质联用测定血浆中头孢羟氨苄浓度的方法，其特征在于：所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
取100uL空白血浆10份置于96深孔板中，以贮备液的形式分别添加5uL浓度分别为0.002ug/μL、0.004ug/μL、0.01ug/μL、0.02ug/μL、0.1ug/μL、0.2ug/μL、0.8ug/μL、1.2ug/μL的吡嗪酰胺溶液至最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本中，分别添加5uL体积分数为50％的甲醇水溶液至空白样本和零浓度样本，混匀后分别向最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本、零浓度样本中加入5uL的0.02ug/uL的内标头孢羟氨苄-d4溶液，向空白样本中加入5uL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后分别向10份样本中加入500uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，取上层清液50uL至装有1000uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水：甲酸按照体积比85：15：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后分别作为10份标准样品待检测；以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需于冰浴条件下操作；
分别取10uL标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的头孢羟氨苄和内标头孢羟氨苄-d4的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的头孢羟氨苄的浓度。
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