CN109884205A - 一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于曲司氯铵检测技术领域，公开了一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法，包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制：分别将所述曲司氯铵储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成多个曲司氯铵工作溶液；内标储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为10～20ng·mL^‑1的内标工作溶液；(2)待测血浆样品前处理过程；(3)标准曲线的制作：以曲司氯铵和曲司氯铵‑d8的色谱峰面积比为纵坐标，以曲司氯铵的血药浓度与曲司氯铵‑d8的血药浓度的比值为横坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归制作标准曲线，得回归方程Y＝a+bX；(4)根据回归方程计算待测血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度。本发明采用液相色谱‑质谱/质谱法进行测定，灵敏度高。

Description

一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法

技术领域

本发明属于曲司氯铵检测技术领域，具体涉及一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法。

背景技术

曲司氯铵(trospium chloride)是一种人工合成的具有4个铵基结构的托品酸衍生物，属于副交感神经的阻滞药，作用类似于阿托品，主要通过与内源性神经递质乙酰胆碱竞争性结合突触后膜M-受体而起作用，对有副交感神经支配的器官起着降低副交感神经张力、去除因副交感神经引起的平滑肌痉挛的作用，对胃肠、胆道和泌尿道也有一定作用。本品脂溶性低而不易通过血脑屏障，不会产生中枢神经系统副作用。曲司氯铵临床用于以下症状的治疗：尿频，夜尿症，非激素或器质病变所致膀胱功能紊乱(膀胱刺激、尿急)。和所有的季铵化合物一样，曲司氯铵有较强的水溶性，但口服吸收差，绝对生物利用度约为9.6％，进食后在此基础上继续下降约26％。药物吸收后约85％以原型经肾排泄，其余15％经肝代谢。较低的给药剂量和生物利用度，导致本品血药浓度低，常规分析方法不能满足生物样品的测定要求。目前，已经建立的生物样品中曲司氯铵测定方法有柱前衍生化HPLC结合荧光检测、放射免疫法和GC-MS，但这些方法的检测灵敏度尚需提高。

为此，本发明提出一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法，利用液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法定量检测犬血浆中曲司氯铵的血药浓度，液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法可以克服背景干扰，对复杂样品仍可达到很高的灵敏度，且具有分辨率高、质量范围宽及扫描快等优点，液相色谱串联质谱/质谱法已成为现代分析手段中必不可少的组成部分。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法，利用液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法定量检测犬血浆中曲司氯铵的血药浓度，液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法可以克服背景干扰，对复杂样品仍可达到很高的灵敏度，且具有分辨率高、质量范围宽及扫描快等优点，该方法采用沉淀前处理、LC-MS/MS质谱仪进行测定，操作简单，分离效果好，定性准确，样品分析时间短，检测灵敏度高。

本发明所采用的技术方案为：

一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法包括如下步骤：

(1)标准工作溶液的配制：称取曲司氯铵至玻璃瓶中，加入甲醇，配制成浓度为1～10mg·mL^-1的曲司氯铵储备液，分别将所述曲司氯铵储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成多个曲司氯铵工作溶液，多个曲司氯铵工作溶液的浓度各不相同；称取曲司氯铵-d8至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为1～10mg·mL^-1的内标储备液，用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为10～20ng·mL^-1的内标工作溶液；曲司氯铵工作溶液及内标工作溶液均在-20℃下保存，备用；

(2)待测血浆样品前处理过程：取待测血浆样品，向待测血浆样品中加入步骤(1)的内标工作溶液，然后加入乙腈沉淀剂，涡旋混合，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得待测血浆样品对应的曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱图；

(3)标准曲线的制作：等量取步骤(1)的多个曲司氯铵工作溶液，分别加入到空白血浆样品中，然后加入步骤(1)的内标工作溶液，再加入乙腈沉淀剂，涡旋混匀，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，分别得多个曲司氯铵校正标准溶液，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得一系列具有不同已知浓度的曲司氯铵校正标准溶液的色谱图，以曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱峰面积比为纵坐标，以曲司氯铵的血药浓度与曲司氯铵-d8的血药浓度的比值为横坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归制作标准曲线，得回归方程Y＝a+bX；

(4)待测血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度的计算：根据回归方程计算待测血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度。

进一步地，步骤(2)中的离心条件为：离心温度为4℃，离心速度为4000rpm，离心时间为10min。

进一步地，按照步骤(1)中的曲司氯铵储备液的配制方式，平行配制另一份曲司氯铵储备液，将另一份曲司氯铵储备液分别稀释成浓度为300、200、20和3ng·mL^-1的曲司氯铵工作溶液，分别加入到空白血浆样品中，然后加入步骤(1)的内标工作溶液，再加入乙腈沉淀剂，涡旋混匀，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，分别得四个质控样品，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得四个质控样品的色谱图。

进一步地，液相色谱串联质谱/质谱测定过程的工作条件为：

a.液相色谱条件：2.1×50mm的色谱柱；流动相A为0.1％甲酸和2mM乙酸铵的水溶液；流动相B为乙腈；柱温为30～50℃；流速为0.2～0.8mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；

b.质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式及多反应监测模式；电喷雾电压为4500～5500V；涡旋离子喷雾温度为500～600℃；气帘气的压力为30psi；雾化气的压力为50psi；辅助气的压力为55psi；数据收集时间为3～5min。

进一步地，所述液相色谱条件还包括：自动进样器的清洗溶液为50％的甲醇水溶液；自动进样器的温度为8℃；自动进样器的清洗模式为进样前清洗和进样后清洗；自动进样器的洗针体积为500μL；自动进样器进样针清洗时的浸泡时间为1s；自动进样器的进样体积为20μL。

进一步地，曲司氯铵在质谱条件中对应的监测离子对为392.0/164.2，去簇电压为60V，碰撞能量为45eV。

进一步地，曲司氯铵-d8在质谱条件中对应的监测离子对为400.0/172.2，去簇电压为60V，碰撞能量为45eV。

进一步地，步骤(3)中的曲司氯铵校正标准溶液的数量为8～10个，曲司氯铵校正标准溶液的浓度为0.05～20ng·mL^-1。

本发明的有益效果为：

(1)本发明采用液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法进行定性和定量测定，能够有效提高定性准确度和方法的灵敏度，最低检测限可达到纳克级水平，分析时间短，所需样品量更少；此外，本发明利用校正标样确定标准曲线，提高了检测的精密度和准确度，确保定性定量分析结果可靠；另外，本发明在比格犬血浆样品中加入乙腈沉淀剂，较传统固相萃取前处理方法，操作更简单，处理速度快，引进误差小，分离效果好，检测效率高。

(2)本发明利用随行质控样品确定标准曲线的准确性，利用标准曲线计算得四个质控样品对应的曲司氯铵的血药浓度，对比其实际浓度(理论值)，计算精密度，从而对曲司氯铵的血药浓度的准确度及精密度进行评价。

(3)本发明的定量检测方法可应用于曲司氯铵的药物代谢动力学研究，为曲司氯铵的临床研究奠定技术基础，因此，本发明建立的曲司氯铵的液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)分析方法有助于服务制药企业，缩短其一致性评价的研究周期，高效严谨便捷准确地进行样品分析，有助于老百姓吃到安全、有效又便宜的药。

附图说明

图1是比格犬血浆中曲司氯铵浓度测定的代表性标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。

本发明中需要的实验耗材与仪器分别为：

a.分析天平：XP6百万分之一电子天平，METTLER TOLEDO(梅特勒-托利多)；

b.离心机：型号为5810R的离心机，Eppendorf(艾本德)；

c.超声清洗器：KQ-400DE超声波清洗器，来自于昆山市超声仪器有限公司；

d.移液器：规格为0.5-10μL，2-20μL，20-200μL及100-1000μL，Eppendorf；

e.玻璃瓶及螺旋盖来自于武汉宝因生物科技有限公司，玻璃瓶的规格为1.5mL，4mL，10mL，100mL，500mL，1000mL及2000mL等；

f.96孔板：选用型号为DW-96-22-C的96孔深孔板，来自于上海百赛生物技术股份有限公司；

g.离心处理过程使用的聚丙烯离心管来自于武汉宝因生物科技有限公司，其规格为1.5mL；

h.高效液相色谱泵：LC-20AD，Shimadzu公司；

i.自动进样器：SIL-20ACMP，Shimadzu公司；

j.柱温箱：CTO-20AC，Shimadzu公司；

k.质谱仪：API4000，ABSciex公司。

注：实验耗材可根据实验使用情况和实验室库存情况进行适当调整。

实施例1：

本实施例提供一种实施例一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法包括如下步骤：

(1)标准工作溶液的配制：称取一定量的曲司氯铵至玻璃瓶中，加入甲醇，配制成浓度为1mg·mL^-1的曲司氯铵储备液，标记为S01-1，分别将所述曲司氯铵储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成八个曲司氯铵工作溶液(浓度为1～400ng·mL^-1)，八个曲司氯铵工作溶液的浓度各不相同，八个曲司氯铵工作溶液的浓度分别为400、360、250、100、25.0、5、2和1ng·mL^-1；称取一定量的曲司氯铵-d8至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为1mg·mL^-1的内标储备液，用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为10ng·mL^-1的内标工作溶液；曲司氯铵工作溶液及内标工作溶液均在-20℃下保存，可保存在-20℃的冰箱里，备用。

(2)待测血浆样品前处理过程：取100μL待测血浆样品，待测血浆样品选用比格犬血浆样品(用于测定比格犬血浆样品中的曲司氯铵的浓度，并将该方法应用于曲司氯铵的药物代谢动力学研究，为曲司氯铵的临床研究奠定技术基础。)，向比格犬血浆样品中加入步骤(1)的内标工作溶液，然后加入乙腈沉淀剂，涡旋混合(涡旋混合至少10分钟)，在离心机(以4000rpm的转速进行离心)中于4℃离心10分钟；转移200μL上清液至另一干净的96孔板中，然后加入200μL纯化水，振荡混匀至少3分钟，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得待测血浆样品对应的曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱图。

(3)标准曲线的制作：等量取步骤(1)的八个曲司氯铵工作溶液，分别加入到190μL的空白血浆样品中，然后加入步骤(1)的内标工作溶液，再加入乙腈沉淀剂，涡旋混匀，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，分别得八个曲司氯铵校正标准溶液(八个曲司氯铵校正标准溶液分别标记为Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6、Std7及Std8，八个曲司氯铵校正标准溶液的浓度分别为20、18、12.5、5、1.25、0.25、0.1和0.05ng·mL^-1)，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得一系列具有不同已知浓度的曲司氯铵校正标准溶液的色谱图，色谱图采集和色谱峰积分由软件Analyst software1.6.3(AB Sciex)进行处理，采用Watson LIMS 7.5(Thermo Fisher Corporation，U.S.A)进行线性回归及浓度计算，以曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱峰面积比为纵坐标(Y)，以曲司氯铵的血药浓度与曲司氯铵-d8的血药浓度的比值(X)为横坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归制作标准曲线(图1为比格犬血浆中曲司氯铵浓度测定的代表性标准曲线)；所得的回归方程(Y＝a+bX)即为标准曲线。

其中，空白血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度即为对应曲司氯铵校正标准溶液的浓度。

(4)待测血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度的计算：根据上述的待测血浆样品对应的曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱图计算出待测血浆样品在标准曲线上对应的纵坐标值即曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱峰面积比(对应的)，再根据回归方程计算格犬血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度。

其中，液相色谱串联质谱/质谱(简称LC-MS/MS)测定过程的工作条件为：

a.液相色谱条件：

色谱柱：ACE Excel 5C18-AR(2.1×50mm)；

流动相A：含0.1％甲酸和2mM(其中，mM为浓度单位千分之一摩尔每升的缩写)乙酸铵的水溶液；

流动相B：乙腈；

自动进样器清洗溶液：50％的甲醇水溶液；

柱温箱温度即柱温：40℃；

流速：0.5mL/min；

自动进样器温度：8℃；

自动进样器清洗模式：进样前清洗和进样后清洗；

自动进样器洗针体积：500μL；

自动进样器进样针清洗时浸泡时间：1s；

自动进样器进样体积：20μL。

洗脱梯度见表1

表1：洗脱梯度表

b.质谱条件：

离子化模式：正离子模式，Electrospray Ionization(ESI)

扫描模式：多反应监测(MRM)

电喷雾电压：5000V

涡旋离子喷雾温度：550℃

气帘气种类：氮气，设置：30

碰撞池气体种类：氮气，设置：6unit(中级)

雾化气种类：氮气，设置：50

辅助气种类：氮气，设置：55

数据收集时间：3.3minutes

表2：曲司氯铵和曲司氯铵-d8在质谱条件中对应的监测离子对的参数对比表

注明：停留时间，此处指的是在监测离子对时，每次扫描一对离子对时所停留的时间。

综上所述，分析结果：以曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱峰面积比为纵坐标(Y)，以曲司氯铵的血药浓度与曲司氯铵-d8的血药浓度比值为横坐标(X)，采用加权最小二乘法进行线性回归制作标准曲线(标准曲线的八对坐标点对应的参数表如表3)。曲司氯铵的代表性标准曲线y＝0.00211x+0.0000540(R2＝0.9972)(如图1)，结果表明，曲司氯铵在0.05～20ng·mL^-1范围内线性良好。需要说明的是，空白血浆样品中曲司氯铵的血药浓度即为对应曲司氯铵校正标准溶液的浓度，曲司氯铵-d8的血药浓度是内标物(曲司氯铵-d8)在血浆样品中的终浓度，本次测定分析中曲司氯铵-d8的血药浓度为1ng/mL。因此，根据待测血浆样品对应的曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱图，先计算出待测血浆样品在标准曲线上对应的纵坐标值即曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱峰面积比，再根据回归方程计算格犬血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度。

表3：按照步骤(3)进样后得出八对坐标点对应的参数表

注：1*响应超出接受范围，该值不参与计算

2、每个标曲样品浓度做了2个样品，即有2个坐标点。

应用例：

本应用例对上述实施例中LC-MS/MS测定方法的比格犬血浆中曲司氯铵的血药浓度的准确度、精密度进行评价。按照步骤(1)中的曲司氯铵储备液的配制方式，平行配制另一份曲司氯铵储备液，标记为S01-2，将另一份曲司氯铵储备液分别稀释成浓度为300、200、20和3ng·mL^-1的曲司氯铵工作溶液，分别加入到空白血浆样品中，然后加入步骤(1)的内标工作溶液，再加入乙腈沉淀剂，涡旋混匀，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，分别得四个质控样品，四个质控样品的浓度分别为15ng·mL^-1(HQC)、10ng·mL^-1(MQC)、1ng·mL^-1(GMQC)和0.15ng·mL^-1(LQC)的质控样品进行液相色谱串联质谱/质谱测定，于1日内将每个浓度的样品重复测定6次，得四个质控样品的色谱图。取100μL上述HQC、MQC、GMQC、LQC四个浓度的质控样品各一份，按上述曲司氯铵的代表性标准曲线计算得四个质控样品对应的曲司氯铵的血药浓度，对比其实际浓度(理论值)，计算精密度，准确度和精密度的计算公式分别为：

准确度％＝(同浓度6个测定值的平均值-理论值)/理论值*100％

精密度％＝同浓度6个测定值的标准偏差/同浓度6个测定值的平均值*100％

准确度和精密度的计算结果如表4所示：

表4：四个质控样品对应的精密度对比表

分析批次	LQC	GMQC	MQC	HQC
					准确度(％)	103.3	105.0	99.7	99.3
精密度(n＝6)(％)	3.3	1.3	1.1	1.3

从上表可知，本发明利用液相色谱串联质谱/质谱法对曲司氯铵的血药浓度进行定量检测，检测的精密度和准确度较高。

本发明的比格犬血浆中曲司氯铵的定量检测方法各项指标均符合生物样品分析测定要求，采用本发明能够高效、严谨、便捷、准确的进行样品分析，获得相应的PK参数，缩短曲司氯铵一致性评价的研究周期，研究比格犬血浆中曲司氯铵的药代动力学特征，更好地为制药企业服务，使老百姓吃到安全、有效又便宜的药。

总之，本发明采用液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法进行定性和定量测定，能够有效提高定性准确度和方法的灵敏度，最低检测限可达到纳克级水平，分析时间短，所需样品量更少；此外，本发明利用校正标样及随行质控样品确定标准曲线，提高了检测的精密度和准确度，确保定性定量分析结果可靠。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (8)

1.一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)标准工作溶液的配制：称取曲司氯铵至玻璃瓶中，加入甲醇，配制成浓度为1～10mg·mL^-1的曲司氯铵储备液，分别将所述曲司氯铵储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成多个曲司氯铵工作溶液，多个曲司氯铵工作溶液的浓度各不相同；称取曲司氯铵-d8至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为1～10mg·mL^-1的内标储备液，用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为10～20ng·mL^-1的内标工作溶液；曲司氯铵工作溶液及内标工作溶液均在-20℃下保存，备用；

(2)待测血浆样品前处理过程：取待测血浆样品，向待测血浆样品中加入步骤(1)的内标工作溶液，然后加入乙腈沉淀剂，涡旋混合，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得待测血浆样品对应的曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱图；

(3)标准曲线的制作：等量取步骤(1)的多个曲司氯铵工作溶液，分别加入到空白血浆样品中，然后加入步骤(1)的内标工作溶液，再加入乙腈沉淀剂，涡旋混匀，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，分别得多个曲司氯铵校正标准溶液，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得一系列具有不同已知浓度的曲司氯铵校正标准溶液的色谱图，以曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱峰面积比为纵坐标，以曲司氯铵的血药浓度与曲司氯铵-d8的血药浓度的比值为横坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归制作标准曲线，得回归方程Y＝a+bX；

(4)待测血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度的计算：根据回归方程计算待测血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度。

2.根据权利要求1所述的血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：步骤(2)中的离心条件为：离心温度为4℃，离心速度为4000rpm，离心时间为10min。

3.根据权利要求1所述的血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：按照步骤(1)中的曲司氯铵储备液的配制方式，平行配制另一份曲司氯铵储备液，将另一份曲司氯铵储备液分别稀释成浓度为300、200、20和3ng·mL^-1的曲司氯铵工作溶液，分别加入到空白血浆样品中，然后加入步骤(1)的内标工作溶液，再加入乙腈沉淀剂，涡旋混匀，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，分别得四个质控样品，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得四个质控样品的色谱图。

4.根据权利要求1所述的血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：液相色谱串联质谱/质谱测定过程的工作条件为：

a.液相色谱条件：2.1×50mm的色谱柱；流动相A为0.1％甲酸和2mM乙酸铵的水溶液；流动相B为乙腈；柱温为30～50℃；流速为0.2～0.8mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；

b.质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式及多反应监测模式；电喷雾电压为4500～5500V；涡旋离子喷雾温度为500～600℃；气帘气的压力为30psi；雾化气的压力为50psi；辅助气的压力为55psi；数据收集时间为3～5min。

5.根据权利要求4所述的血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：所述液相色谱条件还包括：自动进样器的清洗溶液为50％的甲醇水溶液；自动进样器的温度为8℃；自动进样器的清洗模式为进样前清洗和进样后清洗；自动进样器的洗针体积为500μL；自动进样器进样针清洗时的浸泡时间为1s；自动进样器的进样体积为20μL。

6.根据权利要求5所述的血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：曲司氯铵在质谱条件中对应的监测离子对为392.0/164.2，去簇电压为60V，碰撞能量为45eV。

7.根据权利要求6所述的血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：曲司氯铵-d8在质谱条件中对应的监测离子对为400.0/172.2，去簇电压为60V，碰撞能量为45eV。

8.根据权利要求1-7任一项所述的血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：步骤(3)中的曲司氯铵校正标准溶液的数量为8～10个，曲司氯铵校正标准溶液的浓度为0.05～20ng·mL^-1。