CN115144513A - 测定生物体中西维来司他浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供测定血浆或组织中西维来司他的分析方法，包括使用标准曲线样品、质控样品和待测样品，添加内标，再添加有机溶剂经蛋白沉淀后使用高效液相色谱质谱串联进行标准曲线的拟合获得回归方程，将待测的例如血浆、肺组织样品按照同法处理，采用回归方程回算待测物的浓度。本方法特定的稳定剂使得检测方法具有检测结果准确、特异性强，精密度和准确度良好，无明显基质效应和稀释效应的优点。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体地说，是一种测定血浆或组织中西维来司他的分析方法，尤其涉及解决了临床及临床前西维来司他浓度的检测方法。
背景技术
急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是常见的危重症，死亡率极高。ALI/ARDS是在严重感染、休克、创伤及烧伤等非心源性疾病过程中，肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)是一种蛋白分解酶，从聚集到肺部的中性粒细胞中游离出来。中性粒细胞弹性蛋白酶能分解肺结缔组织，使肺血管通透性增强，诱发急性肺损伤。
注射用西维来司他钠是NE抑制剂，能选择性抑制NE的活性，减轻其对肺组织的损伤。国内外在ALI/ARDS患者中开展的临床试验结果表明，西维来司他钠能有效降低肺损伤评分，改善肺功能。注射用西维来司他钠由日本小野工业株式会社最先研发，2002年在日本获批。上海汇伦生物科技有限公司研发的注射用西维来司他钠于2020年3月获批在国内上市，用于缓解全身性炎症反应综合征的ALI/ARDS。
现有技术文献1和2中记载了通过液相色谱质谱串联法测定西维来司他人血浆样品的浓度的分析方法。然而，现有技术文献1中提到西维来司他结构不稳定，采用工作液避光处理及前处理经蛋白沉淀后添加缓冲液的方式可用于样品检测，但是该方法并未从根本上解决血浆样品中待测物自身的稳定性问题。现有技术文献2虽报道了西维来司他的浓度测定，但没有对分析方法的稳定性、精密度进行深入具体的研究，而且其没有提及基质样品稳定性的问题，然而基于现有技术文献1可以推知其同意存在类似的稳定性问题。如不能解决西维来司他(包含西维来司他钠等盐的形式)在生物基质中的稳定性问题，分析方法将难于用于临床检测，也难以进行深入的药代动力学研究。
然而，现状是现有的西维来司他血药浓度检测方法中并不能很好的解决待测物在生物基质中稳定性的问题。综上所述，如何开发一种操作简便，通用性好，稳定性好、回收率高、精确性和准确性都好的西维来司他浓度分析方法，是目前亟待解决的技术问题。
现有技术文献：
非专利文献1)王晶,戴晓健,张逸凡,钟大放,吴玉林,陈笑艳(2015)；LC-MS/MS法同时测定人血浆中西维来司他及其代谢物；药学学报,50(10):1318-1323。
非专利文献2)Mingzhou Liu,Jing Zhang,Lingfang Dong,Wenhua Xue,QilinHe,Wenzhong Liang,Xing Liu,Jingying Zhang,Li Gu,Yinghua Feng,Jie Yang,HaiboWang,Yaqin Wang,Kun Li,Yuanlong Li,Weiqin Kong,Xiaojian Zhang,Mengying Yao,Kai Wang,Peizhi Ma,Wei Zhang(2021)；Detection of sivelestat and its metabolitein small volumes of plasma from Chinese ALI/ARDS patients with SIRS via high-throughput UPLC-MS/MS:A pharmacokinetic study；Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis，195，113876。
发明内容
本发明的方法是一种操作简便，通用性好，稳定性好、回收率高、精确性和准确性都好的西维来司他浓度分析方法。相比现有技术的方法，本发明开发了独特的人和动物血浆及生物体组织(特别是肺组织)的前处理方法，基于该方法能够使西维来司他在血浆或组织中充分释放出来，并且几乎不影响西维来司他本身的稳定性。本发明通过采用提前在血浆或组织样品中添加柠檬酸和草酸钾的方式可以获得可靠的分析方法，能准确对西维来司他的浓度进行定量分析。基于这样的前处理方法，本发明使得西维来司他在血浆或组织中的稳定性极大提高。
具体而言，本发明具体提供一种测定生物体中西维来司他浓度的方法，其使用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆或组织中西维来司他浓度，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1获得西维来司他标准曲线的步骤：配制多种浓度的含有空白基质、西维来司他的溶液，与含有作为西维来司他的内标的化合物内标工作液合并，通过蛋白沉淀的方式获得多种浓度的西维来司他标准曲线测定液，利用高效液相色谱-串联质谱法绘制西维来司他标准曲线和回归方程；
S2血浆或组织样本测定步骤：取待测样品，加入含有作为西维来司他的内标的化合物的内标工作液，通过蛋白沉淀的方式获得加入内标后的待测样品溶液，利用高效液相色谱-串联质谱法进行西维来司他的检测，利用西维来司他标准曲线求出西维来司他浓度，
所述空白基质是与待测样品同类型物种的全血经抗凝处理、分离后的血浆或组织经等渗溶液匀浆所得，
所述空白基质在用于S1步骤之前进行以下样品前处理A步骤，待测的样品在用于S2步骤之前进行以下样品前处理A步骤，
样品前处理A步骤：在样品中加入柠檬酸水溶液/生理盐水溶液和草酸钾水溶液/生理盐水溶液，控制样品溶液中柠檬酸浓度为7～15mg/ml，控制样品溶液中草酸钾浓度为6～14mg/ml，混合0.5～5分钟，
西维来司他标准曲线测定液、所述添加内标后的待测物样品溶液在进行高效液相色谱-串联质谱法之前进行以下样品前处理B步骤，
样品前处理B步骤：在样品溶液中加入蛋白沉淀剂乙腈，震摇混合1～20分钟，将上述样品板于2-8℃以下，离心5～15分钟，转移上清液至其他容器，再加入35％～65％的乙腈水溶液稀释4～6倍，混合均匀。
本发明中的所谓西维来司他的浓度是通用化学概念，例如也可以指西维来司他的各种盐化合物的浓度，例如西维来司他钠的浓度也等同于西维来司他的浓度。
在本发明优选的实施方式中，作为西维来司他的内标的化合物为氯代西维来司他XWCl。
在本发明优选的实施方式中，S1步骤中，对于血浆或组织样品，含有空白基质、西维来司他的溶液中西维来司他的浓度在0.5ng/ml～1000ng/ml内选取，优选浓度为1.00ng/ml、2.00ng/ml、5.00ng/ml、20.0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml；内标工作液中，含有25ng/ml～100ng/ml的氯代西维来司他。
在本发明优选的实施方式中，样品前处理A步骤为在样品中加入柠檬酸水溶液/生理盐水溶液和草酸钾水溶液/生理盐水溶液，控制样品溶液中柠檬酸浓度为9～12mg/ml，控制样品溶液中草酸钾浓度为9～12mg/ml，混合0.5～2分钟；进一步优选样品前处理A步骤为在样品中加入500mg/ml的柠檬酸水溶液和250mg/ml草酸钾水溶液，并控制样品溶液中柠檬酸浓度为9～12mg/ml，控制样品溶液中草酸钾浓度为9～12mg/ml，混合0.5～2分钟，
样品前处理B步骤为在样品溶液中加入乙腈，混合8～12分钟，将上述样品板于2-8℃以下，离心8～12分钟，转移上清液至其他容器，然后利用45％～55％的乙腈水溶液稀释4～6倍，混合均匀；进一步优选样品前处理B步骤为取样品50μl，加入50.0μl内标工作液，震摇1分钟，向所有样品中加入400μl的乙腈，振荡混匀至少10分钟；将上述样品置于4℃，4500rpm离心10分钟；转移100μl上清液至另一个干净的96孔聚丙烯板中。添加400μl 50％乙腈溶液，室温下涡旋混匀至少5分钟。
在本发明优选的实施方式中，在S1步骤之前，将经过样品前处理A步骤的空白基质进行冷冻保存，在S2步骤之前，将经过样品前处理A步骤的待测的血浆或组织匀浆液样品进行冷冻保存。
在本发明优选的实施方式中，冷冻保存为-60℃以下低温保存的样品。
在本发明优选的实施方式中，抗凝处理使用肝素钠或者Na2EDTA进行抗凝处理。
在本发明优选的实施方式中，匀浆使用添加柠檬酸和草酸钾溶液的生理盐水处理。
在本发明优选的实施方式中，经过样品前处理A步骤之后的样品溶液的pH值控制在5.0～7.0，进一步优选控制在5.5～6.5。
如果并未特殊说明，本发明中液体与液体含量配比的百分数，例如乙腈水溶液中的含量配比，以体积分数计量。
本发明开发了一种分析方法，其对于西维来司他浓度检测方法通用性强，结果可靠，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明西维来司他浓度定量分析方法，采用HPLC-MS/MS技术并开发出适宜的检测条件；用于检测西维来司他时，灵敏度高、准确率好、分析速度快。
2.本发明优选的实施方式中，能实现血浆或组织中定量下限为：1.00ng/ml，定量上限为：1000ng/ml，为西维来司他的药代动力学研究提供基础，并且适用性广泛，可用于血浆或组织中西维来司他浓度分析。
3.通过预先加入柠檬酸和草酸钾的方式大大提高了西维来司他在血浆或组织中的稳定性，适于利用冷冻等方法预先保存的样品的检测，基于优异的稳定性，保存时间可以较长。
4.本发明采用乙腈作为蛋白沉淀剂，不断优化，与现有技术相比，回收率明显提高。
附图说明
图1为本发明实施例中的西维来司他母离子扫描图。
图2为本发明实施例中的西维来司他子离子扫描图。
图3为本发明实施例中的XWCl母离子扫描图。
图4为本发明实施例中的XWCl子离子扫描图。
图5为本发明实施例中的西维来司他定量下限图。
具体实施方式
以下详细记载本发明的各要素。
本发明具体提供一种测定生物体中西维来司他浓度的方法，其使用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆或组织中西维来司他浓度，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1获得西维来司他标准曲线的步骤：配制多种浓度的含有空白基质、西维来司他的溶液，与含有作为西维来司他的内标的化合物内标工作液合并，通过蛋白沉淀的方式获得多种浓度的西维来司他标准曲线测定液，利用高效液相色谱-串联质谱法绘制西维来司他标准曲线和回归方程；
S2样本测定步骤：取待测样品，加入含有作为西维来司他的内标的化合物的内标工作液，通过蛋白沉淀的方式获得加入内标后的待测样品溶液，利用高效液相色谱-串联质谱法进行西维来司他的检测，利用西维来司他标准曲线求出血浆或组织中西维来司他浓度，
所述空白基质是与待测样品同类型物种的全血经抗凝处理、分离后所得血浆或组织加等渗溶液(例如生理盐水)后所得，
所述空白基质在用于S1步骤之前进行以下样品前处理A步骤，待测样品在用于S2步骤之前进行以下样品前处理A步骤
样品前处理A步骤：在样品中加入柠檬酸水溶液和草酸钾水溶液，控制样品溶液中柠檬酸浓度为7～15mg/ml，控制样品溶液中草酸钾浓度为6～14mg/ml，混合0.5～5分钟，
西维来司他标准曲线测定液、所述添加内标后的待测物样品溶液在进行高效液相色谱-串联质谱法之前进行以下样品前处理B步骤，
样品前处理B步骤：在样品溶液中加入乙腈，混合1～20分钟，将上述样品板于2-8℃以下，离心5～15分钟，转移上清液至其他容器，然后利用35％～65％的乙腈水溶液稀释4～6倍，混合均匀。
本发明为检测血浆或组织中西维来司他浓度的方法，本发明中，利用内标法测定，即用西维来司他及其内标物和空白基质配制标准曲线样品、经稀释液进行蛋白沉淀后，采用HPLC-MS/MS法检测，进样并绘制标准曲线获得回归方程。在浓度与质谱检测信号建立起一一对应的关系之后，取待测浓度的基质添加内标工作液后，采用稀释液沉淀后按照同样的方法处理，采用回归方程计算西维来司他的浓度。
鉴于质谱法通过离子的质荷比的物质的量信息产生电信号，因此本发明的方法可以用于西维来司他的各种盐型的浓度的检测，常见的西维来司他盐型，例如西维来司他钠盐都能很好的利用本发明的方法进行浓度检测。
与现有技术最明显的区别在于，本发明解决了西维来司他的稳定性的问题，并进一步获得了更优异的回收率。在样品中添加柠檬酸和草酸钾的组合，能够提高西维来司他的稳定性到非常高的程度。因此，在本发明的说明书中，有时，也称柠檬酸和草酸钾的组合为“稳定剂”。
现有技术中，在“药学学报Acta Pharmaceutica Sinica 2015,50(10):1318-1323”的文献中曾经记载，“西维来司他结构中含有酯键，血浆中的酯酶、光照、pH均可能影响其稳定性，而导致定量分析结果的偏差。本文在方法建立时重点对药物的稳定性进行了考察。分别将低、高浓度的西维来司他溶液和XWIMP-A溶液各3份置于光照条件下，24h后测定浓度。结果表明，低、高浓度的西维来司他溶液分别降低了22％和18％，同时还有部分XW-IMP-A生成，而XWIMP-A溶液未检测到明显变化。将上述西维来司他和XW-IMP-A工作液置于避光的条件下，结果显示西维来司他和XW-IMP-A溶液均稳定。因此，为了保持待测物的稳定性，本实验的所有操作都在避光条件下进行。另外，实验中也考察了待测物在样品处理过程中pH值对稳定性的影响。经乙腈沉淀蛋白后的上清液以不同pH值为3、5、7和9的缓冲液等体积稀释，室温放置24h后测定其稳定性。结果发现，在pH小于5或大于9体系下待测物响应均不稳定。因此，实验采用5mmol/L醋酸铵水溶液等体积稀释上清液以维持pH值在6～8之间，室温可放置”。然而，本发明人的西维来司他血浆稳定性研究结果表明，本发明的稳定剂柠檬酸和草酸钾的组合似乎并非通过控制pH来使西维来司他获得稳定，本发明中的“样品前处理A步骤：在样品中加入柠檬酸水溶液和草酸钾水溶液，控制样品溶液中柠檬酸浓度为7～15mg/ml，控制样品溶液中草酸钾浓度为6～14mg/ml，混合0.5～5分钟”条件将pH调节到了5.0～7.0之间，与现有技术中的记载的最稳定pH不完全一致，更重要的是，如果使用其他的酸碱缓冲体系，即使将pH调节到了5.0～7.0之间，也并不能提高待测目标物的稳定性，这表示pH并非是影响稳定性的关键要素，柠檬酸水溶液和草酸钾水溶液的稳定剂作用存在其他机理。具体而言，参见后述实施例，本发明在进行对比试验时，使用了甲酸+乙酸铵的组合，同样地将样品pH值调节到柠檬酸和草酸钾组合的pH区间，结果并未获得如本发明技术方案这样优异的稳定性的数据。
进而，本发明的技术方案提高西维来司他的稳定性，并且提高回收率至高于95％的水平的原因是复杂的，并不能简单的以pH值或者化合物本身的酯水解来解释。推测本发明的柠檬酸和草酸钾组合是破坏了造成西维来司他不稳定性的某种蛋白酶，使得西维来司他获得更好的稳定性，并且本发明人经过后述实施例中的方法学实验，证实本发明中使用的稳定剂(柠檬酸和草酸钾组合)不会影响西维来司他在复杂样品中的游离程度，对分析方法的准确性、精密度没有影响。
需要说明的是，后述的实施例中，为了进行方法学的验证，引入了质控样品等辅助样品，来评价本发明的方法的各项参数指标。在应用本发明的技术方案进行西维来司他的血药浓度检测时，仅进行S1步骤获得适合实验室仪器、环境及试剂条件的标准曲线进行检测，无需再考察方法的适用性。
本发明中样品前处理B步骤可以认为是一种蛋白沉淀的生物基质处理方法，本发明的发明人发现，使用纯乙腈作为沉淀剂，使操作便捷，效率更高。血浆或组织的定量下限均为1.00ng/ml，为西维来司他的药代动力学研究提供基础，并且适用性广泛，可用于血浆或组织中西维来司他的浓度分析。
在本发明的实施例中，采用肺组织作为生物体组织的代表进行了研究，证实本发明方法对于组织中西维来司他测定能够实现了很好的技术效果，在其他生物组织中也应具有同级别的优良的灵敏度、准确率、分析效率等。
在本发明优选的实施方式中，样品前处理A步骤为在样品中加入柠檬酸水溶液和草酸钾水溶液，控制样品溶液中柠檬酸浓度为9～12mg/ml，控制样品溶液中草酸钾浓度为9～12mg/ml，混合0.5～2分钟；进一步优选样品前处理A步骤为在样品中加入500mg/ml的柠檬酸水溶液和250mg/ml草酸钾水溶液，并控制样品溶液中柠檬酸浓度为9～12mg/ml，控制样品溶液中草酸钾浓度为9～12mg/ml，混合0.5～2分钟。
在本发明优选的实施方式中，样品前处理B步骤为在样品溶液中加入乙腈，振摇混合1～12分钟，将上述样品板于2-8℃以下，离心8～12分钟，转移上清液至其他容器，然后利用45％～55％的乙腈水溶液稀释4～6倍，混合均匀；进一步优选样品前处理B步骤为取样品50μl，加入50.0μl内标工作液，震摇1分钟，向所有样品中加入400μl的乙腈，振荡混匀至少10分钟；将上述样品置于4℃，4500rpm离心10分钟；转移100μl上清液至另一个干净的96孔聚丙烯板中。添加400μl 50％乙腈溶液，室温下涡旋混匀至少5分钟。
作为西维来司他的内标的化合物，产业界最常见为氯代西维来司他(本发明中，也简称为XWCl)，本发明中也优选使用这种内标物，其相似的化学结构有利于提高方法精密度。西维来司他与XWCl的结构式如下：
本发明中西维来司他浓度检测应用含内标的标准曲线法，本领域人员可以根据自身的实验条件，通过实验设计摸索出适合自身仪器条件的具体的高效液相色谱-串联质谱法参数。
需要说明的是，本发明的重要特征在于前处理方法，通过寻找到合适的稳定剂，合适的、特殊的前处理方法，提高稳定性，使样品回收率稳定，从而开发出了高效、准确、精密度好的检测方法。具体的HPLC-MS参数可以基于本领域人员的经验、所用仪器的特点进行适当选择。
在本发明优选的实施方式中，S1步骤中，对于血浆样品或组织样品，含有空白基质、西维来司他的溶液中西维来司他的浓度在0.5ng/ml～1000ng/ml内选取，优选浓度为1.00ng/ml、2.00ng/ml、5.00ng/ml、20.0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml；内标工作液中，含有25ng/ml～100ng/ml的氯代西维来司他。
虽然并不限定在上述浓度范围内，但是在上述的浓度范围内，本方法体现了良好的精密度、重现性，操作也简便。
在样品前处理中，作为可进行高效液相色谱-串联质谱法进样的溶剂，可以是通常使用的，不损害色谱柱填料质量的溶剂，特别优选为水、甲醇、乙腈，或它们的混合溶剂等，这是由于这类溶剂对于HPLC条件下的色谱柱稳定性友好，如果是其他有机溶剂，出于对于色谱柱寿命的考虑，并不优选使用。也可以配合不同的色谱柱，添加适当的缓冲剂。
需要说明的是，本发明中使用的水，没有特别限制，不会对试验目的造成影响的水均可以使用，例如出于分析化学实验目的，则可以使用分析实验室用水，具体地可以使用一级、二级和三级水，按照配制标准溶液、储备溶液的一般要求，水优选一级水(参见《GBT6682-2008分析实验室用水规格和试验方法》)。本发明中所指的甲醇、乙腈也是指分析纯以上级别的溶剂。
可用于本发明的检测的血样或组织，可以是人或动物的血样或组织，例如临床试验中服药受试者的血样，药代动力学中试验犬、大鼠的血样或肺组织。在本发明可选的实施方式中，抗凝处理使用肝素钠或者EDTA-Na2进行抗凝处理。
作为常用的方法，在S1步骤之前，将经过样品前处理A步骤的空白基质进行冷冻保存，在S2步骤之前，将经过样品前处理A步骤的待测样品进行冷冻保存。在本发明优选的实施方式中，待测的人或动物样品为-20℃以下低温保存的样品，更优选冷冻保存为-60℃以下低温保存的样品。
实施例
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
实施例1开发本发明西维来司他浓度检测方法的总体方法学试验
本发明采取的是HPLC-MS/MS的检测方法，先采取蛋白沉淀的方式获取西维来司他的测试样品，通过HPLC分离，再采用一种西维来司他定量分析方法，步骤如下：
一、实验仪器及材料
a)实验器材
溶剂瓶、96-孔板、移液枪、涡旋混合器、96孔板混匀仪、液体工作站、离心机。
b)仪器
液相色谱：岛津液相色谱仪，含DGU-20A5R在线脱气机、LC-30AD泵、SIL-30AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱；质谱：Triple Quad 5500/QTRAP 6500+，Applied Biosystems/MDS Sciex，Applied Biosystems/MDS Sciex；离子源：电喷雾离子源(ESI)
c)标准品
西维来司他：含量99.9％，2-8℃、避光、干燥保存；
XWCl：含量：97.8％，2-8℃，避光，密封。
d)空白基质
血浆空白基质制备：血浆(抗凝剂肝素钠)，加入一定量的500mg/ml的柠檬酸水溶液和250mg/ml的草酸钾水溶液得到为含10mg/ml柠檬酸和10mg/ml草酸钾的空白血浆。
肺组织空白基质制备：称取空白肺组织于干净的聚丙烯塑料瓶中，向其中加入含10mg/ml柠檬酸和10mg/ml草酸钾稳定剂的生理盐水再使用匀浆仪匀浆，制得空白肺组织匀浆液；空白肺组织与生理盐水的质量体积比为1:4(g/ml)。
溶血空白基质制备：将全血于≤-60℃条件下冷冻至少30分钟，解冻后涡旋至少1分钟后离心(离心力2000×g，4℃，10min)，取上清液与常规空白基质按体积比(1:49，v:v)混合制得溶血空白基质。
高脂血浆空白基质制备：采用20％脂肪乳和高脂餐后空白基质按体积比(1:39，v:v)混合制得高脂血浆空白基质。
e)溶剂及试剂
甲醇、乙腈、甲酸、氢氧化钠、异丙醇、柠檬酸、草酸钾、纯化水。
f)流动相及稀释液
流动相A：0.1％甲酸的水溶液；流动相B：甲醇/乙腈(1/1，v/v)溶液；强洗针液R3：乙腈/异丙醇/甲醇/三氟乙酸(v/v/v/v)＝30/40/30/0.2；弱洗针液R0：乙腈/甲醇/水/甲酸(v/v/v/v)＝40/40/20/0.1；蛋白沉淀剂：乙腈；溶液1：含50％异丙醇的水溶液；溶液2：含50％乙腈的水溶液；溶液3：500mg/ml的柠檬酸水溶液；溶液4：250mg/ml的草酸钾水溶液。
g)样品
含西维来司他的血浆样品或肺组织匀浆样品。
二、实验方法
a)标准品及内标储备液的制备
西维来司他储备溶液：精密称量一定量的西维来司他标准品粉末，置于聚丙烯塑料管中，完全溶解于适量体积的含50％异丙醇的水溶液中，制得浓度为1.00mg/ml的储备溶液，保存于≤-60℃冰箱中。
XWCl储备液：精密称量一定量的西维来司他标准品粉末，置于聚丙烯塑料管中，完全溶解于适量体积的含50％乙腈水溶液中，制得浓度为1.00mg/ml的储备溶液，保存于≤-60℃冰箱中。
b)工作液的制备
在冰浴白光下，用50％异丙醇稀释储备溶液制得同时含西维来司他的标准曲线样品工作溶液、质控样品工作溶液、内标工作溶液。标准曲线样品工作溶液和质控样品工作溶液配制于聚丙烯塑料管中，工作溶液放置于≤-60℃冰箱中保存。
i.标准曲线样品工作溶液配制浓度如下：
| 编号 | 源溶液浓度(ng/ml) |
| C1 | 20000 |
| C2 | 10000 |
| C3 | 4000 |
| C4 | 2000 |
| C5 | 400 |
| C6 | 100 |
| C7 | 40.0 |
| C8 | 20.0 |
ii.质控样品工作液配制浓度配制：
| 编号 | 浓度(ng/ml) |
| DQC | 300000 |
| HQC | 16000 |
| MQC | 8000 |
| GMQC | 600 |
| LQC | 60.0 |
| LLOQ | 20.0 |
iii.内标工作液配制：
| 编号 | 浓度(ng/ml) |
| ISW | 50.0 |
c)标准曲线及质控样品的制备
对于每个浓度水平的标准曲线样品和质控样品的制备过程，例如，在380μl的空白血浆中用移液器加入20.0μl标准曲线工作溶液，混合均匀。可以根据实际情况适当调整体积，标准曲线和质控样品于冰浴白光下制备。
i.标准曲线样品浓度
西维来司他的标准曲线样品浓度：1.00ng/ml(定量下限，LLOQ)、2.00ng/ml、5.00ng/ml、20.0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml(定量上限，ULOQ)。
ii.质控样品浓度
西维来司他的质控样品浓度：定量下限(LLOQ，1.00ng/ml)、低浓度(LQC，3.00ng/ml)、中浓度(GMQC，30.0ng/ml；MQC，400ng/ml)、高浓度(HQC，800ng/ml)。
样品前处理方法
样品前处理于冰浴白光条件下，在96深孔板中进行。
d)检测
i.西维来司他液相色谱条件
ii.西维来司他质谱条件
e)数据处理
| 回归模式 | y＝ax+b，线性回归 | 权重因子 | 1/x<sup>2</sup> |
| y | 化合物与其内标峰面积比值 | x | 化合物标准曲线样品理论浓度 |
三、方法学验证
为了说明本发明方法得实用性，通过线性及范围、精密度和准确度、选择性、基质效应、回收率、稳定性几个维度对此进行评价。
a)线性及范围
批内与批间精密度和准确度分析批中，采用空白基质，按照“二”项“c)”描述，新鲜制备8个浓度水平的标准曲线样品，每个浓度水平2个重复。西维来司他的标准曲线样品浓度：1.00ng/ml(定量下限，LLOQ)、2.00ng/ml、5.00ng/ml、20.0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml(定量上限，ULOQ)。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求对理论浓度与响应值(化合物与内标峰面积比值)进行线性回归，采用最小二乘法对标准曲线所有浓度点进行拟合，权重因子为1/x2。本发明中涉及化合物线性方程、相关系数、线性范围如下表所示：
由上表可知，12个分析批，R2均大于0.99，线性拟合良好。对于西维来司他：定量下限为1.00ng/ml，定量上限为1000ng/ml。
b)批内与批间精密度和准确度
按照本发明中的线性范围，按照“二”项“c)”描述，配制2套标准曲线样品，每个浓度水平质控样品(定量下限(LLOQ，1.00ng/ml)、低浓度(LQC，3.00ng/ml)、中浓度(GMQC，30.0ng/ml；MQC，400ng/ml)、高浓度(HQC，800ng/ml))各6个重复。通过至少3个独立的验证分析批(批内精密度和准确度分析批，至少两天完成，采用空白基质新鲜制备)的质控样品对精密度和准确度进行评估。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算质控样品实测值与理论值的偏差、每个浓度水平质控样品的额变异系数。数据统计如下表所示：
由上表可知，对于西维来司他，在批内，LLOQ QC精密度最大CV为9.8％，准确度偏差范围为2.8％至6.7％，其它QC样品精密度最大CV为7.0％，准确度偏差-0.8％至8.2％。在批间，LLOQ QC精密度最大CV值为7.4％，准确度偏差：5.1％，其它QC样品精密度最大CV为6.1％，准确度偏差1.0％至5.7％。对于西维来司他，准确度在85％～115％之间，精密度CV均在10％以内，说明本方法具有很高的精密度和准确度。
c)选择性
i.空白基质中内源性物质对化合物和内标的干扰
取6个不同来源的常规空白基质、3个不同来源的高脂空白基质、3个不同来源的溶血空白基质，制备的不添加化合物和内标的空白基质样品与相应基质制备的LLOQ样品。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：(1)对照组的LLOQ样品的精密度；(2)单一批次基质中，化合物通道的检出物峰面积占相应基质制备的定量下限样品中化合物峰面积的比，内标通道的检出物峰面积占相应基质制备的定量下限样品中内标峰面积的比。数据统计如下表所示：
由上表可知：常规空白基质、高脂基质和溶血基质中内源性物质对西维来司他的最大干扰依次为：11.0％、5.9％、0.0％，对内标无干扰。说明空白基质中内源性物质对化合物干扰较小。
d)基质效应
测试样品：将常规、高脂、溶血空白基质作为空白样品，按照本发明中的前处理方法，提取转上清复溶后，向其中添加化合物和内标制得低浓度质控样品(LQC)、中浓度质控样品(MQC)和高浓度浓度质控样品(HQC)。
参比样品：将超纯水作为空白样品，按照本上述方法，制得具备相同理论浓度(LQC、MQC及HQC)纯溶液(化合物及内标)测试样品。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：内标归一化基质效应因子(IMF)，即每个浓度每个批次(或来源)基质的测试样品中化合物(或者内标)峰面积除以同浓度参比样品中化合物(或者内标)峰面积均值得化合物(或者内标)的基质效应因子，每个浓度每个批次(或来源)基质的测试样品中化合物基质效应因子除以其内标基质效应因子得内标归一化基质效应因子。数据统计如下表所示：
由上表可知：对于西维来司他，内标归一化基质效应因子在1左右，变异系数最大值为9.1％。说明基质对化合物和内标响应的影响均非常小。
e)提取回收率
i.化合物提取回收率
化合物提取回收率测试样品：采用常规质控样品或者同其制备过程的样品，包含低浓度质控样品(LQC)、中浓度质控样品(MQC)和高浓度质控样品(HQC)(每个浓度各6个重复)，根据样品前处理方法处理，不加入内标溶液，以相应体积稀释剂代替，提取转上清复溶后，加入相应与处理后的内标溶液浓度相当的内标中间溶液。
化合物回收率参比样品：采用与常规质控样品同一批次(或来源)的空白基质作为空白样品，平行制备18份，根据样品预处理方法处理，加入不含化合物和内标的稀释液，在最终的复溶和稀释前，加入相应与处理后的内标溶液浓度相当的内标中间溶液。制得低浓度质控样品(LQC)、中浓度质控样品(MQC)和高浓度质控样品(HQC)(每个浓度各6个重复)。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：使用化合物的提取回收率测试样品峰面积比均值除以化合物的回收率参比样品峰面积比均值。数据统计如下表所示：
由上表可知：不同浓度质控样品的西维来司他回收率在94.8％～99.5％之间，总体的回收率为96.7％，回收率高且平行性好。
ii.内标提取回收率
内标回收率测试样品：由混合空白基质样品平行制备6份，加入内标溶液。根据样品前处理方法复溶和稀释前，加入与中浓度质控样品浓度相当的化合物溶液。如果需要，体积可以适当调整。
内标回收率参比样品：同化合物回收率参比样品的制备方法，但仅选择中浓度质控样品(MQC)，且在最终的复溶和稀释前加入。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：内标回收率测试样品峰面积比的反比(即内标回收率测试样品的内标峰面积除以内标回收率测试样品的化合物峰面积)、内标回收率参比样品峰面积比的反比(内标回收率参比样品的内标峰面积除以内标回收率参比样品的化合物峰面积)、内标回收率测试样品峰面积比的反比均值除以内标回收率参比样品峰面积比的反比均值。数据统计如下表所示：
由上表可知：内标提取回收率为106.0％，具有较高的提取回收率。
f)样品的稳定性
取空白基质，制备低浓度质控样品(LQC)和高浓度质控样品(HQC)，每个浓度各6个重复。考察冰浴白光条件下至少12小时稳定性、≤-20℃条件下和≤-60℃条件下的冻融稳定性。
稳定性样品在规定时间点取出后冰浴白光条件下自然解冻，按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：每个浓度的稳定性测试质控样品的测定浓度变异系数、每个浓度的稳定性测试质控样品的测试浓度均值与其理论浓度的偏差，数据统计如下表所示：
血浆样品冰浴白光47.3小时稳定性：
血浆样品冻融循环稳定性：
由上表可知：对于血浆中的西维来司他，置于透明聚丙烯塑料管，在冰浴白光条件下可稳定存在47.3小时，≤-60℃条件下和≤-20℃条件下冻融循环5次稳定，均可满足样品测定的要求。
肺组织样品冰浴白光下的稳定性：
由上表可知：对于肺组织样品中的西维来司他，在2小时和24小时，低浓度和高浓度质控样品准确度均在95％以上，说明置于透明聚丙烯塑料管，在冰浴白光条件下，西维来司他可以在肺组织中稳定保存至少24小时，可满足样品测定的要求。
比较例1不添加柠檬酸+草酸钾检测西维来司他的血药浓度(不实施样品前处理A步骤)
取未添加柠檬酸和草酸钾的空白血浆制备LQC、HQC样品，放置一定时间后检测其浓度。其它条件不变的情况下，采用本发明中经A步骤处理的空白基质制备标准曲线和质控样品，检测西维来司他在血浆中的浓度，结果见下表：
上表数据显示，血浆样品在冰浴白光条件下，2小时时，LQC准确度降低至92.8％，24小时时，LQC准确度降低至74.5％，HQC准确度数据与LQC基本一致，表明若不添加柠檬酸和草酸钾，西维来司他有降解的趋势，无法在血浆中稳定保存。而实际操作中，考虑到复测和ISR样品测定等因素，在2小时内远远无法支持到完整的样品检测工作，因此迫切需要探索合适的样品处理方法以确保检测样品的浓度更为接近真实值。
比较例2添加甲酸+乙酸铵组合作为稳定剂，将pH值调控到与柠檬酸+草酸钾组合达到的5.0～7.0相同区间。
用甲酸代替柠檬酸，乙酸铵代替草酸钾，并将pH值调控到与之相同的区间，用甲酸溶液和乙酸铵溶液处理后的空白基质制备LQC、HQC样品，放置一定时间后检测其浓度。其它条件不变的情况下，采用经本发明中A步骤处理的空白基质制备标准曲线和质控样品，检测西维来司他在血浆中的浓度，结果见下表：
上表数据显示，在冰浴白光条件下，2小时时，准确度降低至91.5％(HQC)，24小时时，准确度均降低至85％左右，LQC准确度数据与HQC基本一致，表明添加甲酸溶液和乙酸铵溶液作为稳定剂时，西维来司他无法在血浆中稳定保存，而采用方法中的稳定剂，可在血浆中稳定保持至少47.3小时，因此相同pH值下的柠檬酸/草酸钾组合相比甲酸/乙酸铵组合对待测物在血浆中的稳定性优势明显。
比较例3肺组织匀浆液中不添加柠檬酸和草酸钾作为稳定剂
取未添加柠檬酸和草酸钾的空白大鼠肺组织均浆液制备LQC、HQC样品，放置一定时间后检测其浓度。其它条件不变的情况下，采用本发明中经A步骤处理的空白基质制备标准曲线和质控样品，检测西维来司他的浓度，结果见下表：
上表数据显示，在冰浴白光条件下，若肺组织匀浆液不添加稳定剂，4小时时，LQC准确度降低至35.6％，HQC准确度降低至26.6％，表明无稳定剂存在的情况下，相较于血浆，西维来司他在肺组织中降解非常显著，因此急需开发方法使其稳定才可用于检测。
比较例4肺组织中添加双(对硝基苯基)磷酸酯作为稳定剂
用双(对硝基苯基)磷酸酯(BNPP)代替柠檬酸和草酸钾，用经BNPP处理后的大鼠肺组织匀浆液制备LQC、HQC样品，放置一定时间后检测其浓度。其它条件不变的情况下，采用经本发明中A步骤处理的肺组织匀浆液制备标准曲线和质控样品，检测西维来司他在组织中的浓度，结果见下表：
上表数据表明，在肺组织样品中添加双(对硝基苯基)磷酸酯，冰浴白光条件和≤-60℃条件下放置一定时间后，西维来司他在肺组织均浆液中的稳定性有所提高，但准确度仍不到55.0％。而采用添加稳定剂的生理盐水的肺组织均浆液配制的质控样品在冰浴下放置24小时均稳定，可见采用本方法的稳定剂待测物的稳定性优势明显。
综合以上信息，在本发明的稳定剂柠檬酸+草酸钾组合并非基于pH条件提高稳定性，推测是通过破坏基质中的某种蛋白酶提高稳定性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种测定生物体中西维来司他浓度的方法，其使用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆或组织中西维来司他浓度，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1获得西维来司他标准曲线的步骤：配制多种浓度的含有空白基质、西维来司他的溶液，与含有作为西维来司他的内标的化合物内标工作液合并，通过蛋白沉淀方式获得多种浓度的西维来司他标准曲线测定液，利用高效液相色谱-串联质谱法绘制西维来司他标准曲线和回归方程；
S2血浆或组织样本测定步骤：取待测样品，加入含有作为西维来司他的内标的化合物的内标工作液，通过蛋白沉淀方式获得加入内标后的待测样品溶液，利用高效液相色谱-串联质谱法进行西维来司他的检测，利用西维来司他标准曲线求出西维来司他浓度，
所述空白基质是与待测样品同类型物种的全血经抗凝处理、分离后所得血浆或组织加入等渗溶液并匀浆后所得，
所述空白基质在用于S1步骤之前进行以下样品前处理A步骤，待测的样品在用于S2步骤之前进行以下样品前处理A步骤，
样品前处理A步骤：在样品中加入含柠檬酸水溶液/生理盐水溶液和草酸钾水溶液/生理盐水溶液，控制样品溶液中柠檬酸浓度为7～15mg/ml，控制样品溶液中草酸钾浓度为6～14mg/ml，混合0.5～5分钟，
西维来司他标准曲线测定液、所述添加内标后的待测物样品溶液在进行高效液相色谱-串联质谱法之前进行以下样品前处理B步骤，
样品前处理B步骤：在样品溶液中加入乙腈，震摇混合1～20分钟，将上述样品板于2-8℃，离心5～15分钟，转移上清液至其它容器，然后利用35％～65％的乙腈水溶液稀释4～6倍，混合均匀。
2.根据权利要求1所述的测定生物体中西维来司他浓度的方法，其特征在于，
作为西维来司他的内标的化合物为氯代西维来司他XWCl。
3.根据权利要求2所述的测定生物体中西维来司他浓度的方法，其特征在于，S1步骤中，对于血浆或组织样品，含有空白基质、西维来司他的溶液中西维来司他的浓度在0.5ng/ml～1000ng/ml内选取，优选浓度为1.00ng/ml、2.00ng/ml、5.00ng/ml、20.0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml；内标工作液中，含有25ng/ml～100ng/ml的氯代西维来司他。
4.根据权利要求1所述的测定生物体中西维来司他浓度的方法，其特征在于，
样品前处理A步骤为在样品中加入柠檬酸水溶液/生理盐水溶液和草酸钾水溶液/生理盐水溶液，控制样品溶液中柠檬酸浓度为9～12mg/ml，控制样品溶液中草酸钾浓度为9～12mg/ml，混合0.5～2分钟；进一步优选样品前处理A步骤为在样品中加入500mg/ml的柠檬酸水溶液和250mg/ml草酸钾水溶液，并控制样品溶液中柠檬酸浓度为9～12mg/ml，控制样品溶液中草酸钾浓度为9～12mg/ml，混合0.5～2分钟，
样品前处理B步骤为在样品溶液中加入乙腈，混合8～12分钟，将上述样品板于2-8℃以下，离心8～12分钟，转移上清液至其它容器，然后利用45％～55％的乙腈水溶液稀释4～6倍，混合均匀；进一步优选的是样品前处理B步骤为取样品50μl，加入50.0μl内标工作液，震摇1分钟，向所有样品中加入400μl的乙腈，振荡混匀至少10分钟；将上述样品置于4℃，4500rpm离心10分钟；转移100μl上清液至另一个干净的96孔聚丙烯板中。添加400μl 50％乙腈溶液，室温下涡旋混匀至少5分钟。
5.根据权利要求1所述的测定生物体中西维来司他浓度的方法，其特征在于，
在S1步骤之前，将经过样品前处理A步骤的空白基质进行冷冻保存，
在S2步骤之前，将经过样品前处理A步骤的待测的血浆或组织匀浆液样品进行冷冻保存。
6.根据权利要求5所述的测定生物体中西维来司他浓度的方法，其特征在于，冷冻保存为-60℃以下低温保存的样品。
7.根据权利要求1所述的测定生物体中西维来司他浓度的方法，其特征在于，抗凝处理使用肝素钠或者Na2EDTA进行抗凝处理。
8.根据权利要求1所述的测定生物体中西维来司他浓度的方法，其特征在于，使用生理盐水作为等渗溶液进行匀浆处理。
9.根据权利要求1所述的测定生物体中西维来司他浓度的方法，其特征在于，
经过样品前处理A步骤之后的样品溶液的pH值控制在5.0～7.0，进一步优选控制在5.5～6.5。
10.根据权利要求1所述的测定生物体中西维来司他浓度的方法，其特征在于，通过检测西维来司他的碱金属盐类化合物的浓度进行在血浆或组织中西维来司他的检测。
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