CN114277089B

CN114277089B - 一种达比加群的检测试剂及试剂盒

Info

Publication number: CN114277089B
Application number: CN202111604415.6A
Authority: CN
Inventors: 丁重辉; 闫君; 赵文浩
Original assignee: Beijing Succeeder Technology Inc
Current assignee: Beijing Succeeder Technology Inc
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114277089A

Abstract

本申请涉及生物技术领域，具体公开了一种达比加群的检测试剂及试剂盒。所述达比加群的检测试剂主要包括凝血酶0.75‑3 IU/mL，肝素抑制剂0.05‑0.2wt‱。将检测试剂制备成试剂盒，试剂盒可用于临床上达比加群的定量测定，进而指导医生对患者用药。本申请中制备的试剂盒具有高灵敏度、抗干扰能力强和宽检测范围等优点。所述试剂盒的检测范围为（10‑1000ng/mL）。此外，试剂盒还具有产量高，生产成本低，操作性强、重复性高等优点。

Description

一种达比加群的检测试剂及试剂盒

技术领域

本申请涉及生物技术领域，更具体地涉及一种达比加群的检测试剂及试剂盒。

背景技术

新型口服抗凝药(NOAC)通过抑制某一种凝血因子活性发挥抗凝作用。常见的新型口服抗凝药分为直接凝血酶(Ⅱa)抑制剂以及直接活化凝血因子Ⅹ(Ⅹa)抑制剂。新型口服抗凝药与传统口服抗凝药VKA相比，具有抗凝疗效优异、不良反应少、用药方案简单、无需进行常规凝血功能监测等优点。

达比加群酯(Dabigatran Etexilate)是一种新型的口服抗凝药，是达比加群(Dabigatran)的前体药物，属非肽类的凝血酶抑制剂。患者口服达比加群酯后，经胃肠吸收，在体内转化为具有直接抗凝血活性的达比加群。达比加群结合于凝血酶的纤维蛋白特异结合位点，阻止纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，从而阻断血栓形成。虽然达比加群酯导致的出血事件发生率低于传统抗凝药，特别是大出血和颅内出血事件。但近年来，关于患者服用达比加群酯后导致出血事件的报道越来越多，特别是消化道出血事件的发生率较高，给临床用药带来一定的困扰。因此，在调整药物剂量，降低患者用药风险时，仍然需要对血液中达比加群浓度进行检测及监测。

目前，临床上用于检测达比加群的有TT(凝血酶时间)、APTT(活化部分凝血活酶时间)与LC-MS/MS(液相色谱串联质谱)等项目。TT能够最敏感、最直接地反映达比加群的抗凝活性，一般仅用于判断达比加群是否存在。APTT在低浓度的达比加群时基本不改变，在较高药物浓度时和达比加群药物浓度呈线性关系，一般用于紧急情况下出血风险的判断。TT与APTT的两种检测方式都难以定量检测达比加群的浓度。LC-MS/MS虽然是血药浓度检测的“金标准”。但是，LC-MS/MS设备相对昂贵，检测流程繁杂，耗时较长，难以在临床中广泛应用。

鉴于上述原因，需要一种达比加群的试剂盒，使操作更加简便，更加准确地检测出血液中达比加群的浓度，从而使医生更加准确的对患者进行用药。

发明内容

为了更加准确、方便的检测患者血液中达比加群的浓度，本申请提供了一种操作简单、精密度高、灵敏度高、抗肝素性好的达比加群试剂盒。

第一方面，本申请提供了一种达比加群的检测试剂。所述检测试剂包括凝血酶0.75-3IU/mL，肝素抑制剂

优选地，所述检测试剂包括凝血酶0.75-3IU/mL，肝素抑制剂

在日常生活中，人们可能会患有各种各样的疾病，血栓是近年以来最常见的疾病之一。治疗血栓最常用的手段是口服抗凝药，抗凝药能够阻断人体血栓的形成，达到治疗的目的。

达比加群酯是一种新型的抗凝药，在体内转化为具有直接抗凝血活性的达比加群。达比加群结合于凝血酶的纤维蛋白特异结合位点，阻止纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，从而阻断血栓形成。达比加群酯是一种非常安全的药物，具有较低的出血发生率。但是，如果患者肾功能不全，使达比加群在体内逐渐积蓄，提高出血事件的发生率。因此，在调整达比加群酯药物剂量时，为了降低患者用药的风险，仍然需要对患者血液中达比加群的浓度进行检测及监测。

达比加群浓度的测定原理：凝血酶能够使血液中的纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而使血液进行凝固。达比加群可结合于凝血酶的纤维蛋白特异结合位点，阻止纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，从而使凝固时间延长。凝固时间与达比加群的浓度呈正相关，通过建立标准曲线而获得受检血浆中达比加群浓度的方法，能够进行指导医生对患者用药，降低出血事件的发生率。

示例性地，凝血酶的用量为0.75IU/mL、1IU/mL、1.25IU/mL、1.5IU/mL、1.75IU/mL、2IU/mL、2.5IU/mL、3IU/mL。肝素抑制剂的用量为

优选地，肝素抑制剂可以选自甲苯胺蓝、硫酸鱼精蛋白和聚凝胺中的任意一种。

进一步优选地，肝素抑制剂为聚凝胺。

更进一步优选地，肝素抑制剂为

的聚凝胺。

当人体中含有肝素时(肝素用药含量控制在0.3-0.7IU/ml范围)，肝素能与抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅱa同时结合，发挥拮抗凝血因子Ⅱa的作用，延长血液的凝固时间，影响达比加群的检测结果，进而影响用药的剂量。在本申请中，所述检测试剂中加入肝素抑制剂，肝素抑制剂可以阻碍肝素与抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅱa的结合，将肝素对达比加群检测结果的影响降至最低或消除。

肝素是一种高度负电荷的分子，呈强酸性。肝素抑制剂中甲苯胺蓝和硫酸鱼精蛋白呈碱性；聚凝胺是一种多聚阳离子聚合物。甲苯胺蓝、硫酸鱼精蛋白和聚凝胺均可与肝素形成稳定的复合物，从而使肝素失去抗凝能力，进而提高本申请中检测试剂的准确性。从生产工艺角度分析，聚凝胺为白色粉末，易溶于水，适用于大批量的制备试剂盒。甲苯胺蓝为深绿色粉末，溶于水后呈蓝紫色。若将甲苯胺蓝应用于试剂盒的制备，会影响试剂盒产品的外观。硫酸鱼精蛋白微溶于水，其抑制肝素的能力弱于聚凝胺。因此，本申请中肝素抑制剂优选为聚凝胺。

本申请中，所述检测试剂中肝素抑制剂的用量为

随着肝素抑制剂用量的增加，对肝素的抑制能力也随着提高。肝素抑制剂的用量达到

时，对肝素抑制能力达到最高。在检测试剂中继续肝增加素抑制剂的用量时，对肝素的抑制能力变化较小。说明肝素抑制剂的用量为

时，其抗肝素的能力较为优异。

优选地，所述检测试剂还包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸0.5-2wt％，氯化钙0.25-1wt％，甘氨酸1-3wt％，苯甲酸钠0.8-3.2wt‰。

在本申请中，检测试剂还包括其它功能性的组分。4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)作为试剂缓冲液而加入，HEPES不会参与和干扰生物化学反应的过程，具有较好的pH缓冲能力。氯化钙作为辅助型试剂，当凝血酶将纤维蛋白原变为纤维蛋白后，氯化钙能够使纤维蛋白更加稳定，从而产生聚集凝结。甘氨酸为冻干保护剂，能够降低试剂冻干过程中活性成分的损耗。苯甲酸钠为防腐剂，能够延长试剂的使用期限。

在一个具体的实施方案中，所述检测试剂包括凝血酶1.5IU/mL，4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.0wt％，氯化钙0.5wt％，甘氨酸2wt％，聚凝胺

苯甲酸钠1.6wt‰。将采用上述技术方案制备的检测试剂应用到试剂盒的制备中，所述试剂盒具有较高的精密度、灵敏度及较好的抗肝素性性能，并且具有较宽的检测范围。

其中检测试剂的制备方法包括以下步骤：按比例称取以下物质溶于纯化水中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.0wt％，氯化钙0.5wt％，甘氨酸2wt％，聚凝胺

苯甲酸钠1.6wt‰，调节pH为7.4，形成试剂缓冲液，再向该缓冲液中加入凝血酶1.5IU/mL，将该试剂冻干成型，制备成检测试剂。

优选地，所述凝血酶可以选自人凝血酶、牛凝血酶与猪凝血酶中的任意一种。

进一步优选地，所述凝血酶为猪凝血酶。

更进一步优选地，所述凝血酶为1.5IU/mL的猪凝血酶。

凝血酶能够使血液中的纤维蛋白原变为纤维蛋白，进而促进血液凝固。常用的凝血酶包括人凝血酶、牛凝血酶和猪凝血酶。其中猪凝血酶较易获得，更加适合批量化地生产试剂盒。利用猪凝血酶所配检测试剂的性能优于人凝血酶和牛凝血酶。

第二方面，本申请提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本申请中所述的检测试剂，正常血浆，咪唑缓冲液和参考血浆。所述试剂盒用于检测达比加群的浓度。

在本申请中，利用正常血浆与参考血浆配制定标血浆，其中正常血浆中不含有达比加群，参考血浆中含有一定量的达比加群。正常血浆与参考血浆按不同比例混合后，制备成含有不同达比加群浓度的定标血浆。正常血浆使定标血浆之间基本无基质效应，降低基质效应对定标结果的影响。最后，对定标血浆进行测定，并绘制出达比加群浓度与血浆凝固时间的关系曲线，方便医生对患者进行指导用药。

优选地，所述试剂盒的检测范围为(10-1000ng/mL)。

本申请制备的试剂盒能够更好的对血液中达比加群进行检测及监测，具有较高的灵敏度及较宽的检测范围。本申请制备的试剂盒能够检测达比加群浓度为1000ng/mL以下的范围，最低检测范围为10ng/mL。本申请中制备的试剂盒进行重复性的测试，检测结果显示，CV值小于5％，说明本申请制备的试剂盒重复较好，更加准确，更加稳定。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请确定了检测试剂中肝素抑制剂浓度与凝血酶的添加量，能有效地抑制肝素对达比加群检测结果的干扰，使达比加群检测结果更加准确，临床测试结果更具可靠性；

2、本申请采用凝固法检测血液中的达比加群浓度，本申请制备的试剂盒操作简单，适用于绝大多数凝固法检测仪器，适用性强，易于在临床常规应用中广泛推广；

3、本申请制备的试剂盒具有精密度高、灵敏性好和检测范围广(10-1000ng/mL)的优点。

附图说明

图1实施例1的定标曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

原料

本申请中使用的达比加群来自于MedChemExpress(MCE)，货号为HY-10163。

实施例

本申请制备的试剂盒主要应用于全自动凝血测试仪。

实施例1

检测试剂的制备方法包括以下步骤：以检测试剂为100wt％计，按比例称取以下物质溶于纯化水中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.0wt％，氯化钙0.5wt％，甘氨酸2wt％，肝素抑制剂

苯甲酸钠1.6wt‰，余量为纯化水，调节pH为7.4，形成试剂缓冲液，再向该缓冲液中加入凝血酶1.5IU/mL，得到检测试剂。

其中，肝素抑制剂为聚凝胺，凝血酶为猪凝血酶。

实施例2-7与实施例1的区别如表1所示。

表1实施例1-7中各组分的用量

实施例8

实施例8与实施例1的区别在于，实施例8中的凝血酶为人凝血酶。

实施例9

实施例9与实施例1的区别在于，实施例9中的凝血酶为牛凝血酶。

对比例

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于，对比例1中猪凝血酶为0.65IU/mL。

对比例2

对比例2与实施例1的区别在于，对比例2中猪凝血酶为3.5IU/mL。

对比例3

对比例3与实施例1的区别在于，对比例3中不加肝素抑制剂，肝素抑制剂为聚凝胺。

性能检测试验

一、达比加群浓度的检测

参考血浆是通过向正常血浆中加入定量的达比加群制得。利用LC-MS/MS(液相色谱串联质谱)对参考血浆中的达比加群浓度进行赋值，得到已知达比加群浓度的参考血浆。

不同质控水平的血浆制备方法：向已知达比加群浓度的参考血浆中加入正常血浆，利用正常血浆对已知达比加群浓度的参考血浆进行稀释，得到不同质控水平的血浆。利用实施例1-9与对比例1-3制备的检测试剂检测不同质控水平的血浆中达比加群的浓度。质控水平1中达比加群靶值的浓度为502ng/mL；质控水平2中达比加群靶值的浓度为251ng/mL；质控水平3中达比加群靶值的浓度为90.8ng/mL。

检测结果的标准：检测结果与靶值的相对偏差≤±10％，具体检测结果如表2所示。

表2达比加群的浓度(单位：ng/mL)

类别	质控水平1	质控水平2	质控水平3
				靶值	502ng/mL	251ng/mL	90.8ng/mL
实施例1	507.2	255.6	92.6
				实施例2	541.1	268.8	97.2
实施例3	472.5	237.3	86.2
				实施例4	551.4	274.5	99.4
实施例5	507.4	255.9	92.1
				实施例6	508.1	256.4	93.3
实施例7	507.7	256.3	92.9
				实施例8	513.6	260.5	94.5
实施例9	524.4	259.4	95.1
				对比例1	572.5	282.1	111.6
对比例2	447.6	224.9	79.4
				对比例3	669.7	324.5	121.9

注：表2中肝素的浓度为0.5IU/mL。

结合实施例1-9并结合表2可以看出，实施例1-9均符合检测标准，且实施例1-9的检测结果均在±10％范围内，尤其是实施例1的检测结果最接近靶值。

结合实施例1、4、5、6与7并结合表2可以看出，随着聚凝胺用量的逐渐升高，达比加群浓度越接近靶值，说明聚凝胺对肝素的抑制能力越来越强。当聚凝胺用量为

时，达比加群浓度最接近靶值，说明聚凝胺对肝素的抑制能力已经达到最高。

结合实施例1、8与9并结合表2可以看出，凝血酶种属对测试结果无明显影响，考虑到实用性问题，优选猪凝血酶。

二、肝素对达比加群检测结果的影响

肝素能与抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅱa同时结合，发挥抑制凝血因子Ⅱa的作用，使血液的凝固时间延长，从而影响达比加群的检测结果(血液的凝固时间与达比加群的浓度呈正相关)。因此，需要进一步验证不同的肝素浓度对达比加群检测结果的影响。

选择正常血浆进行检测。利用实施例1、4、5、6与对比例3制备的检测试剂进行样本中达比加群浓度的检测，具体检测结果如表3所示。

表3不同肝素浓度下达比加群浓度(单位：ng/mL)

肝素浓度(IU/mL)	实施例1	实施例4	实施例5	实施例6	对比例3
						2.5	4.5	98.9	3.6	4.2	643.3
1	1	21.1	1	0	112.9
						0.5	0	4.9	0	0	32.8
0	0	0	0	0	0

*表3中正常血浆的达比加群浓度为0ng/mL

结合对比例3并结合表3可以看出，对比例3中不含有肝素抑制剂，正常血浆中的达比加群浓度为0ng/mL。但是，随着肝素浓度增大，达比加群浓度逐渐增高。说明肝素的存在能够影响达比加群浓度的检测结果。

结合实施例1、4、5、6与对比例3并结合表3可以看出，在1-2.5IU/mL肝素条件下，实施例5和6中聚凝胺的用量高于实施例1，而实施例5和6中达比加群浓度的检测结果与实施例1相当，说明当聚凝胺的用量为

时，对肝素的抑制能力已经到达最高。

实施例4中聚凝胺的用量低于实施例1，实施例4中达比加群浓度高于实施例1，说明在1-2.5IU/mL肝素条件下，实施例4抗肝素能力不足。

在0-1IU/mL肝素条件下，实施例1、4、5和6所含的聚凝胺具有较好的抗肝素能力。

三、试剂盒的分析性能评估

1、达比加群参考曲线制定：

(1)定标血浆的配制

利用参考血浆与正常血浆配制定标血浆。参考血浆的达比加群浓度为1068ng/mL，使用正常血浆对参考血浆进行稀释，制得不同达比加群浓度的定标血浆，最终定标血浆中的达比加群浓度为1068ng/mL、534ng/mL、267ng/mL、106.8ng/mL、53.4ng/mL、26.7ng/mL、0ng/mL。

(2)定标曲线

定标曲线的具体步骤如表4所示。

表4操作步骤

*注：样本稀释比例为1:10

根据达比加群标准液梯度浓度与所对应秒值，采用多项式定标曲线，定标曲线如图1所示，其定标曲线公式为：y＝0.0006x³-0.039x²+9.1384x-303.68(R²＝1)。

2、检测范围

将实施例1所述的检测试剂制备成试剂盒，测定试剂盒的检测范围。将高活性样本(达比加群含量1000ng/mL)用正常血浆分别按4/5、1/2、1/4、1/10、1/50、1/100的比例进行稀释，共得到7份样本。按照表4的检测方法，将每份样本重复测定2次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程，相关系数r＝0.9993，检测结果如表5所示。

表5检测范围

达比加群靶值(ng/mL)	测值(ng/mL)
		1000	1025
800	778
		500	511
250	256
		100	84
20	22
		10	11
回归方程	y＝1.0109x-3.1557
		r	0.9993

从表5中可以看出，本申请中制备的试剂盒在10-1000ng/mL的线性范围的内相关性较好。

3、灵敏度测定

以正常血浆为空白样本，利用实施例1制备的试剂盒按照表4的检测方法，重复测定20次，

计算空白样本含量的平均值

和标准差(SD)，以空白均值加两倍标准差计算最低检测极限，其结果如表6所示。

表6最低检测极限分析

表6结果显示：本申请中试剂盒检测达比加群的最低检测极限为8.58ng/mL。

4、重复性测定

利用实施例1制备的检测试剂制备成试剂盒。利用所述试剂盒对不同浓度水平的达比加群血浆进行检测，每水平重复测定10次，计算平均值，标准差和变异系数，检测结果如表7所示。

表7检测达比加群测定试剂盒重复性

注：质控水平1范围：427-577ng/mL；质控水平2范围：213-289ng/mL；质控水平3范围：77-104ng/mL。

由表7可知，本申请制备的试剂盒经过重复性检测，CV值小于5％，重复性较好。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。